Proceso que cuenta con varias etapas cuyo objetivo es lograr la concentración diferencial de una proteína o molécula de interés

Métodos de Baja

resolución

Precipitación con sales, solventes, temperatura o pH

Métodos de Alta

Resolución

Métodos cromatográficos: filtración en gel, intercambio iónico, afinidad

Métodos electroforéticos: electroforesis no desnaturalizante, desnaturalizante

Características Procedimiento

Solubilidad 1. Salting in2. Salting out

Carga iónica 1. Cromatografia de intercambio iónico

2. Electroforesis

Polaridad 1. Cromatografía de adsorción2. Cromatografía en papel3. Cromatografía en fase reversa4. Cromatografía interacción

hidrófoba

Tamaño molecular 1. Dialisis y ultrafiltración2. Electroforesis en gel3. Cromatografía de filtración en

gel4. Ultracentrifugación

Especificidad de unión 1. Cromatografía de afinidad

Sal más usada: Sulfato de Amonio

Solubilidad de las proteínas en Sulfato de Amonio

FibrinogenoMioglobina

Lactato deshidrogenasa 1.1.1.27

Homogenización

1) 100 g de pechuga de pollo troceado (sin grasa ni tejido conectivo)2) Licuar en frío (3 Vol de Amortiguador por gramo de tejido, 3

pulsos/3 seg.)3) Filtrar mezcla en gasa. Tomar fracción cero (F0)4) Centrifugar a 7,000 rpm 4° C 10 min. 5) Decantar sndnte y tomar fracción 1 mL (F1)6) Guardar fracciones a -20°C

Precipitación por salado

1) 25 mL del sndnte en vaso de pp. 2) Agitar en hielo y añadir lentamente 8.15 g de sulfato de amonio

(55 % de saturación)3) Centrifugar a 4°C a 10,000 rpm 10 min. 4) Registrar volumen y tomar 1 mL fracción 2 (F2) Guardar a -20°C5) Realizar segunda precipitación para llegar a 75 %, repetir pasos 2 y

36) Descartar el sndante 7) Resuspender botón o pellet en 1 mL de agua8) Distribuir en 3 tubos, uno de ellos con 1 mL. Guardar a -20°C

pH solución> pI= proteína carga(-) por desprotonación.pH solución< pI= proteína carga(+) por protonaciónpH solución =pI =proteína carga(0) precipitado insoluble

CromatografíaEs un conjunto de técnicas basadas en el principio de retención selectiva, cuyo objetivo es separar los distintos componentes de una mezcla, permitiendo identificar dichos componentes.

Volumen de columna

Muestra aplicada

Matriz

Tapónporoso

Eluyente

Eluyente Proteínas separadas

Matriz de la columna. Sustancia que está empapada de solvente y que se empaqueta en la columna. También se denomina fase estacionaria o lecho de la columna.

Fase Móvil. Solución Tamponada que se hace pasar a través de la columna. Longitud del dispositivo en el que se empaqueta la columna: Es importante en algunos tipos de cromatografía como la de filtración en gel y poco importante en otras como la cromatografía de afinidad.

Volumen de la columna. Volumen total de gel que se empaqueta en una columna cromatográfica.

Volumen muerto de la columna. Cantidad de solvente que tiene que atravesar la columna para asegurar que se ha reemplazado completamente.

MASA

TAMAÑO

Å

Å

kDa

PRINCIPIO: Tamaño de partícula y masa

molecular. Mayor masa molecular eluye primero El gel retiene particuas de menor

masa molecular

APLICACIONES

Desalado de proteínas

Purificación de proteínas

Determinación del peso molecular de las proteínas

TIPOS DE MATRIZGRANULOS DE UN

MATERIAL ESPONJOSO E HIDRATADO

Dextranos con enlaces cruzados

Agarosa Poliacrilamida

En esta práctica se utilizará el gel dextrano.

FASE ESTACIONARIA

Tipo Peso molecularLímite de

fraccionamiento (daltons)

Agua retenida(g/g gel sec)

Volumen de gel hidratado (ml/g

gel seco)

G10 Hasta 700 1.0 2

G15 Hasta 1500 1.5 3

G25 1000 - 5000 2.5 5

G50 1500 - 30 000 5.0 10

G75 3000-80 000 7.5 12-15

G100 4000 - 150000 10.0 15-20

G150 5000 – 400 000 15.0 20-30

G200 5000 – 800 000 20.0 30-40

Las proteínas son moléculas cargadas

• De

• Suma de las cargas de las cadenas laterales de los aminoácidos

• Dependen de: pH y pKa; ambiente que los rodea

Cromatografía de intercambio iónico

Intercambio aniónico

Fase estacionaria cargada positivamente

Intercambio catiónico

Fase estacionaria cargada negativamente

GRADIENTE DE CONCENTRACIÓN

Cromatografía de Afinidad

Utiliza la alta especificidad entre las moléculas biológicas para separar componentes específicos de mezclas complejas.

75

50

37

25

kDa Pellet

W. Succinogenes30 kDa

M. Genitalium28 kDa

Flo

w

Wash

Pu

r. P

rot.

Pellet

Flo

w

Wash

Pu

r. P

rot.

IOJAP

VENTAJAS:No hay restricción por volumen. EspecificidadPureza del producto final

DESVENTAJAS:Precio (alto) Condiciones de elución drásticasLigando específico no disponible o inadecuado

Métodos espectrofotométricos

Ventajas de la técnica RápidaPrecisa Versátil Fácil de usar Eficiente en costo

MÉTODO VENTAJAS DESVENTAJAS

Método de Absorción No se pierden las muestras

Interfieren compuestos que absorben en el UV

MÉTODOS COLORIMÉTRICOS

Biuret Específico para proteínas, muestra pocas interferencias es barato

Poca sensibilidad 1 a 6 mg/mL

Lowry Tiene bastante sensibilidadde 0,1-1 mg/mL.

No todas las proteínas reaccionan igual. Muestra interferencias con detergentes no iónicos, sulfato de amonio

Bradford Muy sensible0,5 -1,4 mg/mL

Muestra interferencias con detergentes