Proteínas Periféricas extracción y purificación

Proteínas Periféricas

Las proteínas asociadas a las membranas plasmáticas cuyas cadenas de aminoácidos no cruzan completamente la membrana plasmática se denominan periféricas.

Existen 3 tipos de anclaje a la membrana:

a) inserciones que sólo ocupan la monocapa externa o la interna, anclándose a la membrana.

b) por interacciones eléctricas con proteínas o lípidos ya sea cargas positivas o negativas. Por lo general son proteínas hidrosolubles.

c) por unión covalente de la proteína con lípidos de membrana o con un ácido graso.

Tipos de extracción de Proteínas Periféricas

La disociación de proteínas de membranas se pueden realizar con múltiples métodos entre choques electrostáticos o de pH.

Altas concentraciones salinas: disminuye interacciones electrostática entre la proteína y la membrana lipídica.

Ion caostropico: eliminar las interacciones hidrofobicas.

Alto PH: para interrumpir estructuras sin desnaturalización de la bicapa lipídica.

Proteína Periférica de membrana “Espectrina”

La Espectrina es una proteína periférica de membrana. unión relativamente débil. Se encuentra en la cara citoplasmática. supone el 25% de las proteínas periféricas. Cada hematíe contiene unas 250 mil copias de Espectrina. Posee 2 cadenas la alfa y la beta. la que la cadena alfa es ligeramente más pesada y grande que la

beta. siempre dimerizada formando una doble cadena.

Espectrina y asociación con otras proteínas de membrana.

Protocolo de extracción y purificación de Espectrina.

Separación de eritrocitos de la sangre:

50 ml de sangre humana se adiciona una solución 1 mM de EDTA

- Usar 3 tubos de centrífuga de 15 ml.

- Añadir a cada tubo 10 ml de Percoll 57%

- Dejar caer con suavidad 1.50 ml de la mezcla sangre/citrato-ácido cítrico en cada tubo, en la superficie del Percoll.

-Se procede a centrifugar a 1600rpm, por 30 minutos a 4°C, el pellet en el fondo del tubo corresponde a eritrocitos separados de los demás componentes celulares de la sangre.

Obtención de las membranas de eritrocitos ”ghost”

Para la obtención de los estromas se incubo durante 30min.en hielo (-4°C) Con una solución salina 5mM de NaPO4/1mMedta/155mMNaCl,pH-7.6 y 0,4mMdi-isopropilfluorofosfato (iPr2FP) (0.0075%, wt/vol).

Los estromas o vesículas son lavados en solución salina 5mM de

NaPO4/1Mmedta/155mMNaCl,pH-7.6

Se resuspende luego de lavar, nuevamente con solución salina 5mM de NaPO4/1Mmedta/155mMNaCl,pH-7.6 y 0,4mMdi-isopropilfluorofosfato (iPr2FP) (0.0075%, wt/vol). Se incuba por 30 minutos a 37°C.

Luego de incubar se procede a centrifugar a 19,000 rpm para obtener un pellet de las proteínas periféricas.

Electroforesis y Western Blot