PRUEBAS COLORIMÉTRICAS PRELIMINARES
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PRUEBAS COLORIMÉTRICAS PRELIMINARES
Para las pruebas colorimétricas (Figura 3) se realizaron 4 soluciones
stock de 10 ml con agua destilada (H2O) y 10 ml ácido clorhídrico (HCl)
al 10 %, a estos se les agrego 0.05 g del extracto metanólico hojas de
Hamelia patens; a 40 ml de etanol (EtOH) se le agrego 0.20 g del mismo
extracto, y a 15 ml de cloroformo (CHCl3) se le agrego 0.75 g del mismo
extracto.
Alcaloides:
Se tomo 10 ml de la solución stock de HCl al 10 %, se agito y se calentó
en baño María por 10 minutos a 70 °C, después se enfrío y se filtro hasta
que el filtrado fue completamente transparente. El filtrado se ensayo
con los reactivos para alcaloides; Mayer, Dragendorff, Wagner y Hager,
usando 2 gotas de cada reactivo. Se considero como positiva, las
pruebas en las que apareció un turbidez o precipitado rojo, blanco a
crema, marrón, o naranja.
Saponinas
La prueba se realizo con agua caliente
Se tomo 5 ml de la solución stock H2O y se calentó de 15 a 30 minutos a
100°C, luego se agitó vigorosamente durante 3 a 5 minutos. La
formación de espuma con apariencia de panal de abeja, se estableció
por unos 30 minutos. Se considera positiva la prueba si presenta
espuma. (Domínguez, 1973)
Taninos
De la solución stock H2O, a 3 ml del extracto acuoso, se le adicionaron
de 1 a 2 gotas de solución de cloruro férrico al 10%. Una coloración azul
nos indicaría la posible presencia de taninos hidrolizables, y coloración
verde de taninos condensados. Para su confirmación se dividió el resto
del extracto acuoso en tres partes iguales y se adiciono en cada uno:
solución de gelatina, solución de gelatina y sal, y solución salina.
La aparición de precipitado blanco en los tubos con soluciones de
gelatina y de gelatina-sal son resultados positivos para test de taninos.
Pero si también aparece en la solución salina se considera negativo.
Saponinas
En Rosenthaler
A 1 ml del stock EtOH, se le añadió una gota del reactivo de Rosenthaler
y una gota de ácido sulfúrico concentrado. Las saponinas de triterpenos
pentacíclicos dan color violeta (Fragoso, 2001)
Flavonoides
a) Shinoda con HCl concentrado
A un tubo con 2 ml del stock EtOH se le agrego un trocito de viruta de
magnesio amalgamado y unas gotas de ácido clorhídrico concentrado.
La aparición de colores que van del rojo profundo a magneta nos
indicaría la presencia de una flavanona o dihidroflavanol.
Dihidrochalconas y otros flavonoides no reaccionaron. (Fragoso, 2001).
b) Shinoda con HCl diluido
Se coloco en un tubo de ensaye, 2 ml del stock EtOH y algunos
fragmentos de magnesiog, también se agregaron por las paredes del
tubo, unas gotas de HCl diluido.
c) Pew´s
A un tubo con 2 ml del stock EtOH se le agrego polvo de zinc y unas gota
de ácido clorhídrico 5 N. Solo los dihidroflavonoles reaccionaron para dar
colores que van del rojo púrpura al rojo cereza. Flavononas,
dihidrochalconas y otros flavonoides dieron coloración rosa o café.
(Fragoso, 2001)
d) Hidróxido de sodio
A un tubo con 2 ml del stock EtOH diluido se le agregaron unas gotas de
hidróxido de sodio diluido. La aparición de colores amarillo o naranja se
considero indicativa de la presencia de flavonoides, según Fragoso,
2001.
Taninos
Se tomo del stock EtOH alícuotas de 1 mL para las pruebas con cloruro
férrico (al 10%), y 0.5 ml de las soluciones de gelatina, gelatina y sal, y
salina.
Los taninos hidrolizables y condensados se diferenciaron según el color o
precipitación con sales férricas; los hidrolizables dieron coloración y
precipitados azul-negruzcos y los taninos condensados dieron
precipitados pardo-verdoso, según Fragoso, 2001)
Cumarinas
En un tubo de ensayo se coloco 2 ml del stock EtOH, se introdujo en su
interior papel de filtro impregnado en solución diluida de NaOH al 5 % y
se llevo a baño de María a 100ºC por algunos minutos. Se removió el
papel de filtro y se examino bajo luz UV, siendo la fluorescencia amarilla
indicativa de la presencia de cumarinas.
Glucósidos cianogenéticos
La presencia de ácido cianhídrico en este grupo de compuestos pudo
observarse por su reacción con picrato de sodio.
Reacción de Grignard
Se coloco 4 ml del stock EtOH en un tubo de ensaye junto con 1 ml de
cloroformo y una tira de papel impregnado con reactivo de Grignard en
la boca del tubo. Se calentó de 30 a 35°C y se observo la coloración que
aparece en el papel. Un color rojo o rosa se considero positivo. (Fragoso,
2001)
Glucósidos cardiotónicos y lactosas sesquiterpénicas
a) Baljet
A 3 mL del stock EtOH se le adiciono de 3 o 4 gotas de reactivo de
Baljet, si se forma coloración anaranjada o roja obscura se considera
positiva según Fragoso, 2001.
b) Cloruro de Antimonio
El cloruro de antimonio se disuelve en cloroformo y se añade unas gotas
al extracto etanólico, la aparición de un color violeta azulado se
considera positiva. (Fragoso, 2001)
Triterpenos
Se tomo 10 ml del stock CHCl3 y se filtró con algodón.
a) Reacción de Liebermann-Burchard.
A 1 ml de extracto en cloroformo, se le agregó 1 ml de anhídrido
acético por las paredes del tubo de ensaye y se dejó reposar en frío. La
aparición de colores rojo, rosa, verde, púrpura o azul en la interface
cuando se añade 1 o 2 gotas de ácido sulfúrico concentrado, se
considera positiva.
b) Reacción de Salkowski:
A 1 ml del extracto de cloroformo se le adicionó una gota de ácido
sulfúrico concentrado (1 ml de H2SO4) por las paredes del tubo de
ensaye.
Glucósidos cardiotónicos
A 10 ml del stock EtOH se le adiciono 5 ml de solución de acetato de
plomo al 10% y 4 ml de agua destilada. Se calentó la mezcla a baño
María durante 10 min. Y se filtró con algodón. Después se agito el
filtrado con 20 ml de CHCl3, se separo la capa clorofórmica en 6 tubos de
ensayo, y se llevo a sequedad.
A los tubos se les adiciono lo siguiente:
- al primer tubo 1 ml de reactivo de Baljet. (Coloración roja, naranja-
rojiza o violeta con cardenólidos).
- al segundo 1 ml de reactivo de Kedde. (Coloración rosa o azul-violeta al
visible indican cardenólidos, los bufadienólidos no reaccionan. El color se
atenúa en pocos minutos).
- al tercero: 1 ml de reactivo de Raymond-Marthoud (anillo lactónico de
los cardenólidos). Igual coloraciones que reactivo de Baljet.
- en el cuarto se realizo a reacción de Keller-Kiliani. (ácido acético
glacial, 1 gota de cloruro férrico al 5% en metanol y ácido sulfúrico
concentrado) Coloraciones intensas.
- en el quinto se realizo la reacción de Liebermann-Burchard (1 mg de
muestra/pocas gotas de ácido acético + 3 ml anhídrido acético/ácido
sulfúrico (50:1)). Coloración verde, azul verdoso, vía rojo al azul.
- en el sexto se realizo la reacción de Salkowski (núcleo esteroidal).
Coloración amarilla-rojo sangre.
Derivados antracénicos libres
Se tomo 5 ml del stock CHCl3, se dividió en 2 tubos de ensayo, se agito y
dejo 15 min en reposo.
a) Reacción de Borntraeger
En el 1er. tubo se agrego 1 ml de solución de NaOH al 5% en agua.
Coloración rojiza en la fase acuosa, indico presencia de antraquinonas.