PRUEBA DE FRAGILIDAD OSMOTICAMtodo de Dacie

FINALIDAD: 1. Determinar con la mayor precisin posible la fragilidad osmtica de la muestra de un paciente mediante el mtodo de Dacie.2. Graficar una curva de fragilidad osmtica con los datos obtenidos durante la prctica.3. Asociar resultados patolgicos a patrones observables en una curva de FO

INTRODUCCIN:La fragilidad osmtica mide la habilidad de los glbulos rojos de incrementar su volumen cuando son sometidos a soluciones hipotnicas de cloruro de sodio (NaCI) de concentraciones variables. Es la prueba ms utilizada para el diagnstico de la Esferocitosis Hereditaria Y Talasemias. Los esferocitos tienen una relacin superficie-volumen disminuida, tienen una capacidad disminuida para aumentar su volumen y se lisan a una concentracin de sales ms elevada que las clulas normales. Estos glbulos presentan un aumento en la fragilidad osmtica: son ms frgiles que lo normal, por lo contrario los eritrocitos de individuos que sufren de talasemia, son menos frgiles que lo normal por lo tanto la prueba esta disminuida.

PRINCIPIO: En esta prueba cuando los eritrocitos son puestos en una serie de soluciones hipotnicas de NaCl, el agua entra a las clulas hasta que alcanzan un equilibrio. Mientras esto sucede la clula va incrementando su volumen hasta que es lisada porque no puede contener el volumen.

La muestra es pipeteada en una serie de tubos con diferentes concentraciones de solucin salina y el sobrenadante de estos es medido. La concentracin de hemlisis en cada tubo es comparado contra rangos normales para su diagnstico.

La sensibilidad de esta prueba puede incrementarse con la preincubacin de las clulas. Se utiliza la misma metodologa excepto, que la prueba es efectuada con sangre estril que ha sido incubada por 24 horas a 37 C.

REACTIVOS:1. Solucin Stock de cloruro de sodio buferado, pH 7.4a. 90 g de NaClb. 13.66 g de Fosfato de sodio dibsica (Na2HPO4.2H20)c. 2.43 g de Fosfato de sodio monobsico (NaH2PO4.2H2O)Esto se disuelve en 1 L de agua destilada

2. Las soluciones de trabajo se obtienen colocando en un frasco volumtrico de 100 ml los siguientes volmenes de la solucin stock y diluyendo con agua destilada a 100 ml.

Concentracin % ml de solucin stock

0.101.0

0.202.0

0.303.0

0.353.5

0.404.0

0.454.5

0.505.0

0.555.5

0.606.0

0.656.5

0.707.0

0.757.5

0.808.0

0.858.5

-Rotule cada frasco con la debida concentracin y guarde a 4 C. Descarte cuando se contamine.

MUESTRA:3. Sangre venosa fresca con EDTA o Heparina4. Sangre completa con EDTA o heparina pre-incubada 24 horas, preparada de la siguiente manera: Homogenice bien la muestra y pipetee 2 ml de sangre en un tubo plstico estril. Selle el tubo e incbelo en bao mara durante 24 horas.

PROCEDIMIENTO:1. Obtenga de 2-3 ml de sangre anticoagulada del paciente. 2. Rotule 14 tubos y agregue 5 ml de cada concentracin del NaCl a cada tubo.3. Coloque 0.05 ml de sangre anticoagulada en cada tubo y mezcle.4. Deje los tubos a temperatura ambiente por 30 minutos.5. Resuspenda suavemente y centrifugue as 3,000 g / 10 minutos.6. Lea en el espectrofotmetro el sobrenadante de cada tubo (540 nm longitud de onda).7. Use el sobrenadante del tubo 0.85% como blanco y el tubo de 0.1% como el que representa el 100% de hemlisis.

CLCULOS:

% Hemlisis = DO del sobrenadante de cada tubo X100 DO del tubo con 100% de hemlisis

Con los datos obtenidos se construye una curva, en el eje de las x el % de NaCl y en y el % de hemlisis

Ejemplo de curva de fragilidad osmtica

VALORES DE REFERENCIA:Un glbulo rojo normal, bicncavo comienza a mostrar hemlisis a una concentracin de 0.45 y su hemlisis se encuentra completa a 0.30.

Concentracin de NaCI% de hemlisis a 25C% de hemlisis incubada

0.2010091-00

0.3097-10080-100

0.3590-9972-100

0.4050-9065-100

0.455-4554-96

0.500-536-88

0.55005-70

0.60000-40

0.65000-19

0.70000-09

0.85000-00

INTERFERENCIASOtras enfermedades tambin resultan con fragilidad incrementada o disminuda como ser: Hemoglobina S, Anemia hemoltica inmune, deficiencia severa de hierro, Piropoiquilocitosis hereditaria, Estomatocitosis hereditaria y otras condiciones que alteren el volumen del eritrocito como quemaduras.

BIBLIOGRAFA1. Manual de Hematologa II, Dra. Miriam Salgado2. Hematology clinical principles and applications, Fourth edition, B. Rodak.3. Clinical Hematology and Fundamentals of Hemostasis, Third Edition, D. Harmening.4. Hematology 1 and 2 Laboratory Manual, G. Fritsma.