ÍNDICE

- Justificación, antecedentes y marco teórico

- ¿Qué son las Chlorellas? ¿Por qué nos interesa estudiar las microalgas?

- La cinética de crecimiento en microalgas.

- Objetivo

- Método

- Método empleado para la obtención de cepas de Chlorellas a partir del suelo.

- Método empleado para la determinación del indice de Margalef.

- Método empleado para la determinación de la cinética de crecimiento.

- Resultados

- Resultados del método empleado para la obtención de cepas de Chlorellas a partir del suelo.

- Resultado del método empleado para la determinación del indice de Margalef.

- Resultado del método empleado para la determinación de la cinética de crecimiento.

- Conclusiones

- Agradecimientos

- Bibliografía

JUSTIFICACIÓN, ANTECEDENTES Y MARCO TEÓRICO

Qué es Chlorella y por qué nos interesan estudiar las microalgas

Chlorella (nombre común clorela) es un género de algas verdes unicelulares del filoChlorophyta. Tienen forma esférica midiendo de 2 a 10 μm de diámetro y no poseenflagelo. Chlorella contiene los pigmentos verdes fotosintetizadores clorofila-a y -b en suscloroplastos. A través de la fotosíntesis se multiplica rápidamente, requiriendo sólodióxido de carbono, agua, luz solar y pequeñas cantidades de minerales. Chlorella es unorganismo experimental ampliamente utilizado en los laboratorios. Su uso permitió a OttoHeinrich Warburg ganar el premio Nobel de Medicina en 1931 por sus estudios sobre lafotosintesis. En 1961, Melvin Calvin recibió el premio Nobel de química por su estudiosobre la asimilación del CO2 en plantas usando Chlorella en sus investigaciones (Figura 1).

Figura 1. La fotografía muestras varias células algales del genero Chlorella.

Chlorella presenta una eficiencia fotosíntetica que puede alcanzar el 8%(comparables con otros cultivos como la caña de azucar). Además presenta una altaproporción de nutrientes esenciales para el ser humano (figura 2).

Figura 2. Composición general por cada 100 gramos de Chlorella.

Estas características hicieron que los cultivos de Chlorella se vieran a fines de ladécada de 1940 como una posible solución a la crisis mundial de alimentos. Finalmente sedemostró que la eficiencia fotosíntetica de Chlorella disminuye hasta reducirse a losvalores similares de un cultivo tradicional (aproximadamente un 2,5%) cuando en vez deusar iluminación artificial es expuesta a la luz solar. Esto unido a otros problemas técnicoscomo el uso de agua carbonatada que se requiere para su cultivo y que encarece suproducción, así como los procesos complejos que se requieren para su cosecha hizo que seabandonase esta idea (Belasco, 1977).

En la actualidad el uso de la Chlorellas se esta extendiendo a campos muy diferentes(figura 3)

Figura 3. Principales áreas de utilización de las microalgas (Forján et al. A. Al 2014).

Algunos estudios realizados en animales demostraron que la administración deClorela puede tener efectos antitumorales y de control de la hipertensión (Tanaka et al.,1990; Miyazawa et al., 1988; Konishi et al., 1985). Otra línea de investigación usa lasClorelas para la obtención de biodiesel a partir del aceite que se obtiene de sus cultivos(Han Su et al., 2009). Por último su capacidad para crecer en medios con altos niveles denitratos y fosfatos hace que sea utilizada como un filtro verde a la hora de tratar aguasresiduales.

Como ejemplo podemos citar el proyecto llevado a cabo por el departamento de launiversidad que llevó nuestro proyecto. Este proyecto recibe el nombre de Life PlusIntegral Carbon.

Cinética de crecimiento.

En la actualidad los cultivos masivos de algas tienen lugar en lagunas de oxidacióncuando se trata de depurar aguas residuales y en fotobiorreactores cuando se trata deobtener alimentos o compuestos de alto valor económico (figura 4). Los fotobiorreactoresdeben permitir el control de los parámetros que aseguren una alta productividad comoson: el pH, la taxa de oxígeno y dióxido de carbono, los macro y micronutrientes, lasalinidad, la temperatura, la aireación que permitan la homogenización del medio, la luz yla concentración de células.

Figura 4. La fotografía de la izquierda muestra una laguna de oxidación. La fotografía de la derecha muestradiferentes modelos de fotobiorreactores.

Hay que tener en cuenta que el crecimiento algal se rige por la ley del mínimo, esdecir, el factor limitante del crecimiento es aquel que está presente en cantidades máspróximas al mínimo crítico necesario para la microalga. Es importante conocer lascondiciones óptimas y los límites de tolerancia de una microalga para todos o el mayornúmero de parámetros (Cañizares.1994). Para conocer el valor óptimo de estos parámetrosantes de iniciar un cultivo a escala industrial se experimenta con cultivos estáticos. Uncultivo estático es un recipiente que contiene una población de algas en unas condicionesdeterminadas. En un cultivo estático se observa que las algas presentan una cinética decrecimiento estándar que es común a todas las especies y es independiente del volumendel medio donde es cultivada. Este patrón estándar presenta las siguientes fases (Figura 5)(Fogg y Thake, 1987):

Lag o fase de adaptación: en donde no ocurre incremento en el número de células,pudiendo incluso llegar a disminuir en número con respecto al inoculo inicial.

Exponencial: una vez adaptadas al medio de cultivo, las microalgas comienzan amultiplicarse de forma exponencial.

Declinación: El aumento del número de células produce una disminución de losnutrientes, cambios en el pH y alteración de otros factores que provocan una disminuciónen la tasa de división celular.

Estacionaria: No se aprecia una división celular neta, es decir, se mantiene constante latasa entre la natalidad y la mortalidad.

Muerte: La tasa de mortalidad supera a la tasa de natalidad.

Los cultivos estáticos nos permiten averiguar cuáles son las condiciones másóptimas para mantener crecimiento exponencial en las poblaciones de algas a escalaindustrial.

Figura 5. Curva representativa de crecimiento de un cultivo estático de microalgas (Modificado de Fogg yThake, 1987). 1.- Fase de adaptación; 2.- Fase de crecimiento exponencial; 3.- Fase de declinación relativa decrecimiento; 4.- Fase estacionaria; 5.- Fase de muerte.

OBJETIVO

El objetivo del proyecto es obtener un cultivo puro de Chlorella sp. a partir dediferentes muestras y estudiar su cinética de crecimiento así como algunos factores decultivo que pueden afectar a la misma. La finalidad última de estas cepas extraídas delsuelo, sería hacerlas crecer en agua residual para incorporar CO2 y nutrientes y finalmenteretornarlas al suelo como biofertilizantes.

MÉTODO

El método seguido consta de varias etapas:

- Obtención y purificación de las algas a partir de diferentes muestras tomadas en elcampo.

- Determinación del índice de Margalef.

- Determinación de la cinética de crecimiento.

Método empleado para la obtención de algas a partir de muestras de suelo.

Se tomaron muestras de cuatro localidades distintas donde trabajos anteriores noshabían indicado la presencia de Chlorella. Estas localidades son:

a) Aldea del Obispo (Salamanca). Fecha 5 de octubre de 2015. Coordenadas 40º42'30,7''N6º47'45,1''W. Agua de la fuente del pueblo

b) Torrecilla del Pinar (Segovia). Fecha 10 de octubre de 2015. Coordenadas 41º22'15,2''N4º02'24,1''W. Tierra del pinar

c) Burgos (Burgos). Fecha 30 de septiembre de 2015. Coordenadas 42º 20´35,1'' N 3º39´44,9''W. Arena de la playa de Fuentesblancas

d) Burgos (Burgos). Fecha 30 de septiembre de 2015. Coordenadas 42º21´14,2'' N 3º39´59,6''W- Suelo del Instituto.

A partir de estas muestras se realiza una siembra en tres medios diferentes:

1) BG 11 (Grobbelaar, 2013) (Figura 6) este medio se caracteriza por tener todos los macroy micronutrientes que necesita un alga para su desarrollo.

2) BG 11 sin NO3 este medio que no tiene fuente de nitrógeno se emplea para favorecer eldesarrollo de aquellas algas o cianobacterias que son capaces de fijar nitrógeno del aire.

3) BG 11 + DOC que es un extracto que contiene moléculas orgánicas que algunas algasrequieren para su desarrollo como son vitaminas.

Composición del medio BG11

K2HPO4 (1mL); NaNO3 (10 mL); MgSO4 (1mL); CaCl2 (1mL);Na2CO3 (1mL); Na2SiO3 (1mL); ácido cítrico + EDTA (Etilen-diamino-tetraacético, sal disódica) + cloruro férrico (1mL); silicato (1mL); Micronutrientes (1mL); Agua destilada (enrasar a 1L)

Figura 6. Composición del medio BG11 (Grobbelaar J.U. 2013). Este medio es esterilizado en un autoclaveantes de su uso.

En el laboratorio, se utiliza una cabina de flujo laminar, se coge 4 placas de 12pocillos esterilizadas y en cada una de estas echamos 0’5 ml de cada muestra de suelo conayuda de una pipeta automática. Después con una pipeta de doble enrase echamos 3’5 mlde un tipo de medio diferente de forma que en cada placa hubiera 4 pocillos con el mismomedio, en la primera fila de pocillos echamos BG11, en la segunda BG11 sin NO 3 y en latercera BG11 +DOC (Figura 6). Las cuatro placas se mantienen a temperatura constante yestán expuestas a las variaciones naturales de luz (figura 7).

Figura 7. La fotografía muestras las cuatro placas de doce pocillos. De izquierda a derecha: MB es la muestrade Torrecilla del Pinar; MC, Instituto; MD, Fuentesblancas y MA, Aldea del Obispo. Cada columna de laplaca presenta el encabezamiento del medio BG11, BG11 - NO3

2 y BG 11 + DOC. El experimento se inició el 1de octubre de 2015.

Cuando las algas se desarrollan en los pocillos, utilizando asas de siembra se haceun replicado de las algas a placas de Petri. Las placas de Petri contienen como medio decultivo BG 11. En este caso al BG 11 se le añade 11 g de agar por litro. El medio fueesterilizado en un autoclave a 120º C durante dos horas. Después de sacarlo del autoclavese deja atemperar hasta alcanzar una temperatura de 50º, para echarlo a continuación enunas placas de Petri también esterilizadas. Una vez solidificado se usa una cabina de flujolaminar para replicar las muestras. Es importante cambiar el asa de siembra siempre ycuando cambiemos de muestra. Una vez que se tienen preparadas las placas se meten enuna cámara climática ( marca Ibercex) a una temperatura de 25 ºC y con un fotoperiodo de16:8 horas de luz: oscuridad y un nivel de iluminación PAR (radiación fotosintéticamenteactiva) de 100 micromol m-2 · s-1 (Figura 8).

Figura 8. Fotografía del interior de la cámara climática. Se observan las placas de Petri. La letra A indica quecorresponde a Aldea del Obispo. Observar que cada placa se encuentra envuelta en papel parafinado paraevitar la pérdida de agua.

Cuando las algas se han desarrollado sobre las placas Petri, pasamos a tomarmuestras para observarlas al microscopio y poder determinar si realmente tenemos elgénero Chlorella en nuestros cultivos (figura 9).

Figura 9. En la fotografía se muestra el microscopio óptico utilizado en la determinación de las algas. Es unmicroscopio marca Leica de cuatro objetivos de 10 x 10, 4, 10, 40 y 100 aumentos así como la posibilidad dezoom digital de hasta x3 aumentos.

A partir de los cultivos que dan positivo en la presencia de Chlorellas se hace unnuevo replicado en placas de Petri con BG 11 y se cultivan en cámaras climáticas. Trasvarios replicados obtenemos cepas puras de Chlorella sp.. Finalmente empleamos estascepas en un cultivo en un medio líquido de BG 11 que se emplea para las fases posterioresdel método, dividiendo este cultivo en dos muestras Chlorella 1 y Chlorella 2 que sediferencian en que la primera tenía una aireación continua y la segunda una aireaciónintermitente. Con el término aireación nos referimos a la renovación del CO2, el que latiene continua tiene más concentración de CO2 que el que la tiene intermitente.

Método empleado para la determinación del índice de Margalef.

El índice Margalef se obtiene a partir del cociente entre el valor de la absorbancia delos carotenos de un extracto algal y la absorbancia de la clorofila a de dicho extracto. Estecociente nos da una idea del estado de madurez del cultivo de algas. Cuando el valor delíndice es bajo (alrededor de 2) indica que se trata de un cultivo joven con altaproductividad por unidad de biomasa y cuando es alto (de 5 a 7) se trata de un cultivomaduro con baja tasa de renovación (Margalef, 1983).

Para conseguir los pigmentos cogemos catorce muestras de Chlorella 1 y 2 que seencontraban en los borboteadores durante veinte días. Para ello, centrifugamos lasmuestras durante dos minutos, y así conseguiremos el pelet. Después con una pipetaautomática retiramos el líquido sobrante y añadimos metanol. Finalmente las dejamos enel frigorífico durante toda la noche. Al día siguiente cogemos con la pipeta automática unmililitro de cada muestra y lo añadimos en una cubeta para medir la longitud de onda a(figura 10):

– 750 nm: turbidez de la muestra

– 665 nm: clorofila a

– 430 nm: carotenoides

Figura 10. La fotografía muestra el espectofotometro utilizado en el proyecto. Delante de el se situan lasceldas que contienen los extractos de algas.

Método empleado para la elaboración de la Cinética del Crecimiento

Una vez que tenemos nuestro cultivo puro de Chlorellas y que el índice Margalefnos indica que se trata de un cultivo joven con alta productividad procedemos adeterminar cómo será su cinética de crecimiento. Para ello, el primer paso consiste endeterminar la concentración de células algales que tenemos en nuestro cultivo. Para elloechamos 10 microlitros de muestra de Chlorella que tenemos en un tubo Falcon en lacámara Neubauer. Después enfocamos la muestra en el microscopio y una vez localizadoel área de contaje, calculamos el número de células por celda y apuntamos el resultado. Lacámara de Neubauer nos da el número de células por mililitro (figura 11).

Figura 11. Plantilla que se puede observar en la cámara de Neubauer. Dependiendo del número de célulasque se cuenten en cada área, indicada por números, se utiliza un índice de transformación para calcular lascélulas por mL.

Figura 12. Gráficas de absorbancia a 750 y a 680 de los cultivos de Chlorella 1 y 2.

A continuación construimos una recta patrón donde relacionamos la concentración dealgas (nº de células/mL) con la absorbancia de la turbidez medida en unespectrofotómetro a 750 y 680 Para ello hacemos diluciones de nuestro cultivo en BG 11en las siguientes proporciones:

mL de BG 11 mL de cultivo de Chlorellas 2 01,9 0,11,8 0,21,5 0,51 1

0,5 1,50 2

Estas gráficas (figura 12) nos sirven para conocer cuántas células hay por mililitro enfunción de la turbidez en cualquier momento.

A lo largo de catorce días se toma la absorbancia a 750 y 680 nm de dos cultivos deChlorella que designaremos como Chlorella 1 y Chlorella 2. Ambos cultivos se diferencianporque en uno el borboteador que genera corriente dentro del cultivo y lo oxigenabafuncionaba a un régimen distinto del otro. Los valores obtenidos se ajusta en una gráficadonde se expresa en el eje de la Y el nº de células/ mL y en el eje de las X los días. Pararealizar los ajustes estadísticos a los valores de la gráfica empleamos una curva logísticaque se obtiene a partir de la ecuación de Verhulst (figura 13). Estos ajustes nos losrealizaron en la universidad utilizando el programa informático SPSS v.18.

Figura 13. La gráfica muestra la función logística o curva en forma de S. Es una función matemática queaparece en diversos modelos de crecimiento de poblaciones. El crecimiento inicial es aproximadamenteexponencial y al cabo de cierto tiempo aparece la competencia por algún recurso crítico que hace que la tasade crecimiento disminuya hasta deternerse en la madurez. La gráfica de la función logística responde a laecuación de Verhulst (1838) donde P0 es la población inicial, e es la constante de Euler, t es el tiempo, K escapacidad de carga o población máxima que puede crecer en él y r es la tasa de crecimiento característico decada especie.

RESULTADOS

Resultado al método empleado para la obtención de algas a partir de muestras desuelo.

Tras treinta días a condiciones ambientales se produce un cambio de color en lospocillos que denotan el crecimiento de algas en su interior (figura 14).

Figura 14. En la fotografía se pueden observar los pocillos donde han crecido algas. De izquierda a derecha:MA, Aldea del Obispo; MB es la muestra de Torrecilla del Pinar; MC, Instituto y MD, Fuentesblancas Cadacolumna de la placa presenta el encabezamiento del medio BG11, BG11 menos NO3

2- y BG 11 mas DOC.

A partir de las algas crecidas en los pocillos se hacen replicas en placas de Petri queson cultivadas en cámaras climáticas en las condiciones descritas sobre un medio sólidoformado solo por BG 11 y 10 % de agar. Tras dos semanas de cultivo se obtiene elresultado que se muestra en la figura 15.

Figura 15. La fotografía muestra las placas Petri cultivadas en la cámara climática. Aunque el medio decrecimiento es el mismo, las letras escritas en las tapas designan los pocillos de los que se tomo una muestrapara hacer la réplica.

A continuación se procede a observar las diferentes colonias al microscopio paraidentificar las microalgas formadoras de las colonias (figura 16).

Figura 16. Las fotografías muestran en la parte superior izquierda una colonia de algas filamentosas, a suderecha una diatomea (Navicula sp.). En la parte inferior izquierda Chlorellas sp. y a la derecha la foto de unparamecio ciliado que se alimenta de microalgas.

De las colonias de Chlorellas se hacen sucesivos replicados hasta obtener cultivospuros.

Resultado del método empleado para la determinación del índice de Margalef.

A partir de dos cultivos puros que designaremos como Chlorella 1 (Chl-1) yChlorella 2 (Chl-2) se procede a seguir el crecimiento del cultivo durante veinte díastomando catorce muestras. Cada día se toma una muestra para analizar la absorbancia delos diferentes tipos de pigmentos en el espectrofotómetro (figura 17).

MuestraAbsorbancia Pigmentos Relación Margaleff

750 665 652 430 [Chla] (mg/L) Abs 430/Abs 665Inoculo 0,002 0,169 0,099 0,340 1,90372 2,012Chl_1_1 0,001 0,026 0,017 0,111 0,27144 4,269Chl_2_1 0,003 0,050 0,032 0,149 0,5202 2,980Chl_1_2 0,000 0,090 0,052 0,202 1,02848 2,244Chl_2_2 0,003 0,074 0,044 0,191 0,81156 2,581Chl_1_3 0,002 0,133 0,075 0,274 1,52164 2,060Chl_2_3 0,003 0,071 0,043 0,184 0,77056 2,592Chl_1_4 0,003 0,126 0,073 0,278 1,41536 2,206Chl_2_4 0 0,071 0,042 0,198 0,8024 2,789Chl_1_5 0,003 0,279 0,155 0,454 3,2224 1,627Chl_2_5 0,008 0,148 0,086 0,242 1,62632 1,635Chl_1_6 0,002 0,374 0,207 0,634 4,34204 1,695Chl_2_6 0,006 0,164 0,093 0,289 1,84484 1,762Chl_1_7 0,003 0,423 0,233 0,722 4,9156 1,707Chl_2_7 0,002 0,208 0,115 0,354 2,40924 1,702Chl_1_8 0,005 0,380 0,212 0,678 4,37388 1,784Chl_2_8 0,002 0,188 0,105 0,325 2,16644 1,729Chl_1_9 0,004 0,476 0,266 0,851 5,49192 1,788Chl_2_9 0,004 0,185 0,105 0,324 2,10116 1,751Chl_1_10 0,034 0,546 0,321 0,975 5,93172 1,786Chl_2_10 0,002 0,148 0,084 0,268 1,69 1,811Chl_1_11 0,004 0,451 0,253 0,823 5,193 1,825Chl_2_11 0,002 0,187 0,108 0,342 2,12224 1,829Chl_1_12 0,004 0,492 0,275 0,882 5,677 1,793Chl_2_12 0,007 0,186 0,109 0,336 2,05856 1,806Chl_1_13 0,004 0,470 0,263 0,852 5,41908 1,813Chl_2_13 0,003 0,181 0,105 0,340 2,04184 1,878Chl_1_14 0,077 0,588 0,363 1,018 5,92416 1,731Chl_2_14 0,005 0,191 0,112 0,358 2,1298 1,874

Figura 17. En la tabla se muestran los distintos valores de absorbancia registrados a lo largo de 14 días. Apartir de estos datos se puede calcular utilizando diferentes fórmulas una estima de la concentración depigmentos en la muestra de agua (Clesceri et al., 1998). En la columna de la derecha se muestra el índiceMargalef.

Calculamos el indice Margalef como el valor de la absorbancia de los carotenoidesdividido por la absorbancia de la clorila a y podemos ver como los valores oscilan duranteel periodo experimental entorno a un valor próximo a dos lo que nos quiere decir queestamos manejando dos cultivos que se encuentran en una fase joven con una altaproductividad por unidad de biomasa o lo que es lo mismo en la fase de crecimientoexponencial condición indispensable para estudiar su cinética (figura 18).

Figura 18. Variaciones de los valores del Índice de Margalef en una cinética de crecimiento.

Resultado del método empleado para la elaboración de la Cinética delCrecimiento

Una vez que conocemos que nuestros dos cultivos se encuentran en una fase activade crecimiento pasamos estudiar su cinética de crecimiento.

Utilizando la recta patrón de turbidez y registrando la absorbancia durante losveinte días que dura el experimento obtenemos el número de células/mL que hay cadadía del ensayo en nuestro cultivo. A continuación en la universidad nos ajustaron lospuntos de los valores observados a la función logística de la ecuación de Verhulstobteniendo la gráfica de la cinética de crecimiento (figura 19).

Figura 19. Gráficas de las cinéticas de crecimiento a 680 de los cultivos de Chlorella 1 y 2.

Parámetro EstimaciónK 5,749E+05

r 3,629 E+05

Parámetro EstimaciónK 1,188E+06

r 3,933E+05

Figura 20. Tablas con los parámetros K y r de cada una de las gráficas.

La capacidad de carga (K) depende de las condiciones de crecimiento y como Chlorella 1 yChlorella 2 han tenido condiciones distintas su capacidad de carga es diferente, en cambiola tasa de crecimiento (r) que característica de cada especie es parecida ya que se trata de lamisma especie (figura 20).

CONCLUSIONES

A lo largo de este proyecto hemos podido demostrar la presencia del microalgaChlorella sp. en los suelos arenosos de Torrecilla del Pinar (Segovia) y el agua de la fuentepública de Aldea del Obispo (Salamanca). Además se pudo detectar la presencia de otrasespecies que fueron descartadas para nuestro estudio. El motivo del mismo fue centrarnosen un alga que tuviera aplicación como biofertilizante de suelo. Como Chlorella era la másabundante que encontramos presente en una alta concentración en las muestras de suelo y aguaempleadas con ella realizamos los sucesivos procesos de réplica conducentes a la obtención de uncultivo puro, utilizando siempre como medio el BG11. Una vez obtenido este cultivo fue nuestroobjetivo demostrar como los procesos de tratamiento en los cultivos de algas afectan a la cinética decrecimiento de las mismas. Para ello empleamos dos cultivos de Chlorella que tenían similaresíndices de Margalef, es decir, eran cultivos con una alta productividad por unidad de biomasa. Auno de ellos le pusimos un borboteador (figura 21) con una aireación continua y el otro tenía unaaireación intermitente. Durante veinte días se hizo un seguimiento de ambos cultivos llegando a laconclusión que el borboteador forma parte de la ley de mínimos que mencionábamos en laintroducción limitando el crecimiento del cultivo en el de bajo régimen frente al de alto.

Figura 21. La fotografía muestra el modelo de borboteador empleado en los cultivos de algas.

AGRADECIMIENTOS

Este proyecto no se podría haber realizado sin la estimable ayuda del profesor JuanCarlos Rad Moradillo promotor del trabajo. Su labor no terminó ahí, sino que además nosexplicó el manejo del instrumental de laboratorio y nos ayudó en los cálculos posteriores.Tampoco queremos olvidar a Rajae Kholsi que amablemente nos cedió unas fotografías demicroscopio para ilustrar el trabajo y fue una compañera más en el laboratorio. Por últimoal profesor Luis de Benito Aparicio por su paciencia a la hora de corregir los sucesivosborradores que este proyecto ha ido generando. A todos muchas gracias.

BIBLIOGRAFÍA

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INTERNET

- https://es.wikipedia.org/wiki/Funci%C3%B3n_log%C3%ADstica