Proyecciones del diagnosticoultraestructural de apoyoen el Hospital MéxicoManuel F. Sigarán*Fernando Brenes P. **Jorge VargasMarin***

RESUMENDurante los últimos cinco años se ha estado

empleando la ultraestructura morfológica simplepara el estudio de lesiones tumorales y degenera­tivas de pacientes en el Hospital México. Para eUose utilizan los microscopios electrónicos de la Uni­versidad de Costa Rica, siendo preparados entera­mente los especímenes en Patología Experimentaldel Centro de Docencia e Investigación de la CajaCostarricense de Seguro Social.

A través de esa experiencia se ha encontradomayor utilidad de la Ultraestructura para tumoresde tejidos blandos, tumores endocrinos, patologíahepática viral y de depósito y patología renal.Se considera necesario vigorizar el programanaciente de inmunoperoxidasas, ya que es un armadiagnóstica de valor incalculable; además de sertécnica de bajo costo con material elaboradolocalmente y que es utilizable tanto a nivel demicroscopía óptica como electrónica, lo que redun­daría en gran beneficio para el paciente. Otratecnología a desarrollar es la de MicroscopíaOptica de Alta Resolución (MOAR) mediante lacual, algunos especímenes hasta ahora tributarioscasi exclusivamente de Microscopía Electrónica,dan resultados satisfactorios, con el ahorroconsiguiente.

+ Resultados preliminares parcialmente presen­tados en Primeras Jornadas de Investigación,Universidad de Costa Rica, Dic. 1981.

* Patología Experimental y Servicio de Anato­mía Patológica, Hospital México. Cátedra dePatología General, Facultad de Medicina,Universidad de Costa Rica.

** Servicio Anatom ía Patológica, Hospital México.Cátedra de Patología General, Facultad deMedicina. Universidad de Costa Rica.

*** Servicio Anatomía Patológica, Hospital México.Cátedra de Patología General, Facultad deMedicina. Universidad de Costa Rica.

INTRODUCCION

Con el advenimiento y comercializaciónde las resinas epóxicas, la resolución de loscortes ultra finos para Microscopía Elec­trónica (M-E) aumentó significativamente.Entre otros artificios, fue eliminada la distor­si6n de los tejidos de hasta un 25 %, acarreadapor el material de inclusión más popular enaquel tiempo: el metacrilato. Fue así que eluso de esta tecnología en laboratorioshistopatológicos se incrementó y popularizó,aún en países pobres con recursos limitados.

En el año 1977, en el Hospital México fueiniciado este programa de di.agnóstico ultra­estructural (17), proporcionando entoncesservicio en escala limitada a ese Centro, asícomo a otros hospitales del área metropoli­tana, hospitales que ya cuentan ahora con supropio laboratorio de ultramicrotomía.

En el presente trabajo se expondrá laimportancia de esta tecnología, así corno susindicaciones, sus limitaciones y las perspec­tivas para aumentar su certeza diagnósticacon la ayuda de inmunocitoquímica.

I) IMPORTANCIA DE LA TECNOLOGIA

En los principales centros médicosuniversitarios del mundo, la MtcroscopíaElectrónica (M-E) diagnóstica es ya unatécnica de rutina utilizada en múltiples tiposde lesiones. Así, en Patología Renal es de usorutinario, combinándola con inmunofluo­rescencia. Tiene también clara indicación enel diagnóstico diferencial de tumores de

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tejidos blandos, neoplasmas endocrinos, enenfermedades de depósito de patologíahepática, tal como la enfermedad de Wilsony las hepa topatías causadas por virus'.Esto último dentro de un proyecto conjuntoentre la Universidad de Costa Rica y elHospital México de la C.C.S.S.

En enfermedad de Wilson ha sido de granutilidad, especialmente en casos sospechososen los cuales la tinción para demostrarcobre no es concluyente. Sternlieb yScheinberg (19) han descrito cambiospatognomónicas en organeles citoplásmicosdel hepatocito. Cambios tales como pero­xisomas gigantes, cuerpos densos que contie­nen cobre y alteraciones de la densidad de lamatriz mitocondrial y en la forma de éstas.Estos cambios han permitido diagnósticos enalgunos casos en etapas tempranas e iniciar eltratamiento respectivo con el consiguientebeneficio para el paciente.

En relación con hepatopatías por virus B,se han estudiado principalmente los casoscrónicos. Se han observado partículas virales,tal como el antígeno "core" dentro delnúcleo en casos de hepatitis crónica activa(Fig.l). También se ha observado el antígeno

.de superficie en el citoplasma en forma detúbulos.

En tumores endocrinos se ha estadoempleando este instrumento satisfactoria­mente, tomando como parámetros diagnósti­cos los organeles citoplásmicos necesariospara manufactura, empaque, almacenamientoy secreción de hormonas (J ,5). De tal modo,uno de los objetivos logrados hasta elmomento ha sido la mayor precisión en eldiagnóstico de tumores hipofisiarios, estable­ciéndose una clasificación funcional (15).En este Centro se ha seguido esa clasificación,encontrando acuerdo casi completo morfo­lógico funcional (18), basándose al momentocasi exclusivamente en el tamaño de losgránulos secretores (14). A manera de ejem­plo se puede citar, siempre en hipófisis, laclasificación clásica de la variedad "cromófo­bos" funcionales, pues poseen gránulos secre­tores no demostrables aún con histoquímicapor poca sensibilidad a nivel de MicroscopíaOptica (MO), siendo visibles únicamente conM-E.

La indicación precisa de la U1traestructuraen el estudio de carcinoide es clara, ya que laM-O no es siempre satisfactoria, basándose

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muchas veces en parámetros subjetivos. Enconsecuencia, a nivel ultraestructural es indis­pensable encontrar gránulos citoplásmicosde morfología y densidad variable (porejemplo, en diana) o en forma de palillo detambor (1).

Otra indicación clara de esta tecnologíaradica en la detem1inación de la histogenesisde tumores. Se ha estimado que la M-E esaplicable a un ocho por ciento de tumores queson recibidos en Patología de un hospital, enlos cuales la M-O con las tinciones especialessea de resultados ambiguos (6). Bajo basespuramente morfológicas, el M-E propor­ciona valiosa ayuda para diferenciar uncarcinoma anaplásico de un sarcoma anaplá­sico, al encontrar en el primer caso estruc­turas semejantes a desmosomas, micro­túbulos, microfi\amentos u otros organelescitoplásmicos de célula epitelial. También sele utiliza para diferenciar carcinomas escamo­sos poco diferenciados de adenocarcinomasal encontrar en el último microvellosidadesapicales y lumen tubular (3).

Situación común que se presenta en loslaboratorios de Anatomía Patológica consisteen aquella por la cual, después del examenrutinario de determinada pieza quirúrgica,hay aspectos que no pueden resolverse solocon microscopía óptica convencional. Enconsecuencia se hace necesario procesar paraM-E tejidos ya fijados usualmente enformalina ácida, obteniendo resultados pocohalagüeños, ya que gran número de marcascitoplásmicas se pierden. Por consiguiente, esmuy deseable por lo menos fijar rutinaria­mente los tejidos en formalina neutra amorti­guada en fosfatos o en formol neutro. Espreferible tomar de la pieza fresca unapequeña muestra representativa para fijaradecuadamente en glutaraldehido al 2.5 porciento, amortiguando en fosfatos y a 4<2C (letemperatura. En caso de no contar con esefijador en calidad de microscopía electrónica,se puede preparar el fijador recomendado porMcDowell y Trump (11) a base de glutaral­dehido y formalina comercial, debiendotener presente que el tejido debe ser hastade 2 mm de espesor y que se debe mantenera 4ºC en el refrigerador.

En algunas ocasiones puede ocurrir que elinterés para examén ultraestructural seconcentre en un solo micronódulo que estáen un bloque de parafina o en el corte

histológico ya montado y teñido en elportaobjetos de vidrio. Sin embargo, enambos casos es posible rescatar la estructuraa estudiar (4), tal como puede ser apreciadoen la figura 2, en el cual se reconocen clara·mente los gránulos secretores.

n) VARIANTES CON TEJIDOSINCLUIDOS EN RESINAS EPOXICAS

a) Microscopía Optica rle Alta Resolución(MOAR).El objetivo primario de esta técnica es

para obtener cortes "gruesos" de 0.5 a 1micra (/1) de espesor, con superficie tangrande como 1.3x1.0xO.2 cm y que luegopuedan ser usadas para cortes finos a estudiarultraestructuralmente (8). El aumento de laresolución de los tejidos, conducirá a bajarlos costos en el procesamiento de las mues­tras y a acortar el tiempo de examen de losmismos. Valga el ejemplo de poder observaren MüAR la fusión de los podocitos en nefro­patía lúpica (8). Sin embargo, debe aclararseque el MüAR aún no puede competir con lahistología convencional en parafina, por sermayor su costo y por la dificultad paraemplear todas las tinciones usadas rutinaria­mente en tejidos incluidos en parafina (2,10).En este Centro se está iniciando su empleocon resultados alentadores, empleando Epon812 (Fig. 3).

b) Inrnunocitoquímica.

Con el empleo del cultivo de tejidos y decélulas, el uso de animales de laboratoriocomo los ratones desnudos atímicos y con lainmunoperoxidasa se ha incrementado demanera importante el área de trabajo de lapatología diagnóstica y de la patologíaexperimental. En condiciones satisfactoriasde trabajo, esta tecnología es también tribu­taria de microscopía electrónica con énfasishacia las inrnunoperoxidasas, la cual seconsidera tan sensible como el radío-inrnuno­ensayo. La peroxidasa del nabo ("horseradish peroxidase") tiene como ventajas serelectrodensa y de muy alta resolución y almarcar con ella anticuerpos contra antígenosespecíficos es posible localizar en la célulalos productos densos, resultado de la unióndel antígeno tisular con el anticuerpomarcado.

El espectro diagnóstico de la inmunocito­química es sumamente amplio, siendo usado

casi rutinariamente en centros médicosuniversitarios para el diagnóstico diferencialde cáncer (7). La técnica está limitada única­mente por la obtención de los antisuerosespecíficos para determinada proteína anti­génica.De tal modo se ha podido demostrarel antígeno de superficie de la hepatitis viralB en el citoplasma del hepatocito con técnicaya descrita (9). Es así que se demostró supresencia dentro del sistema del "retículoendoplasma granular (Fig. 4). Además,habiéndose demostrado que la saliva deportadores del virus de la hepatitis B es infec­tante (12), se aplicó la técnica a glánduhs sali­vales de un portador, demostrando su presen­cia en cisternas del retículo endoplasmarugoso de células mucosas y serosas.

Como ya fue dicho antes, se está tratandode establecer una clasificación morfo­funcional en tumores endocrinos, específi­camente en hipófisis. Sin embargo, tal obje­tivo sólo puede ser alcanzado plenamentehasta lograr obtener los antisueros especí­ficos para marcar los gránulos con las dife­rentes hormonas (13). Puede ocurrir que enestos tumores haya granos de diferentes tama­ños en la misma célula (Fig. 5) 10 que bienpodría corresponder a tumores secretores deotras tantas hormonas aún no diagnosticadosen Costa Rica. En tales casos, la única maneramicroscópicamente sería marcándolos con suantígeno específico, el cual puede ser produ­cido en mamíferos de laboratorio.

A manera de infonnación se ha encontradoque el complejo de proteína estructural, laqueratina, es un excelente marcador para eldiagnóstico diferencial en muchos tipos detumores, como el carcinoma escamoso, meso­telioma, carcinoma transicional, sirviendo supresencia para determinar la histogenesis(16). Siguiendo esas indicaciones, se estáiniciando la obtención del antígeno purifi­cado, el cual será inyectado a conejos recep­tores para la producción de anticuerpos yrealizar la técnica de Peroxidasa­Antiperoxidasa (PAP).

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NOTALas fotografías electrónicas fueron toma­

das en los microscopios electrónicos detransmisión Hitachi HU-12A y H-300 de laUnidad de Microscopía Electrónica de laUniversidad de Costa Rica. Los especímenesfueron procesados en Patología Experimentaldel Centro de Docencia e Investigación de laC.C.S.S.

Los tejidos fueron fijados. en gl u t aral­dehido amortiguado en Fosfatos al 2.5 %;incluidos en Araldita y/o Epon 812 y teñidoscon acetato de uranil y citrato de plomo.

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Hepatocito de un caso de hepatitis crónica per­sistente por virus "B", en cuyo núcleo se en­cuentran condensaciones (Aumento de 4000 X)En el recuadro se aprecian varias esferas huecasde 24 mm de diámetro, correspondientes a par­ticulas "core" del virus. (Aumento de 75000 X)

Ganglio linfático incluído en resina epóxica ycortada a una micra de espesor, pudiendo ser a­preciadas claramente células Iinfoides en diver­sos grados de maduración. Tinción de hemato­xilina-eosina. Aumento original 1000 X

Tumor carcinoide extraído, del bloque de para­fina. A pequeño aumento se ven varias célulastumorales redondeadas con el citoplasma pre­sentando moderada granulación. Aumento de4000 X El recuadro del ángulo inferior-derechopresenta varios gránulos polimorficos de estetipo de células. Aumento 30000 X.

Porción de citoplasma de un hepatocito (en casode hepatitis crónica activa) parasitado con antí­geno de superficie marcado con "peroxidasa denabo" enzima que le vuelve discernible con elM-E. Es notable la abundancia de retículo endo­plasma granular con la presencia de partículasvirales. Tejido sin teñir, técnica de inmuno-pe­roxidasa-indirecta. Aumento de 15 000 X

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a. -Adenoma hipofisiario cuyas células presentanmoderada granularidad citoplámica irregular. Au­mento 3000 X.5b. -Porción de citoplasma de célula tumoral cuyonúcleo está en el borde izquierdo de la fotografía.Puede notarse la variedad de los gránulos secretoresen cuanto a su diámetro y densidad. Aumento30.000 X.

AGRADECIMIENTOLos autores agradecen al personal de

Patología Experimental la colaboración yelentusiasmo con que fueron procesadas' a lo

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largo de todo el procediluiento el materia!aquí presentado. A la Sra. Vera V. Muñozpor su paciencia y amabilidad en la correcciónmecanográfica de nuestros errores.