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475Cerecedo-Mercado DA, et al. Estudio ultraestructural de las plaquetas de pacientes con HPN. Rev Invest Clin 2006; 58 (5): 475-486

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Revista de Investigación Clínica / Vol. 58, Núm. 5 / Septiembre-Octubre, 2006 / pp 475-486

Estudio ultraestructural de las plaquetasde pacientes con hemoglobinuria paroxística nocturna

Sara Vega,* Elba Reyes-Maldonado,* Jorge Vela-Ojeda,**Moisés Xolotl-Castillo,** Laura Montiel-Cervantes,** Doris A. Cerecedo-Mercado***

* Depto. Morfología, Escuela Nacional de Ciencias Biológicas, IPN.** Servicio de Hematología, UMAE Hospital de Especialidades CMN “La Raza”, IMSS.

*** Lab. Hematobiología, Escuela Nacional de Medicina y Homeopatía, IPN.

ARTÍCULO ORIGINAL

RESUMEN

Introducción. La hemoglobinuria paroxística nocturna(HPN) es una anemia hemolítica caracterizada por hemólisisintravascular, citopenias y trombosis venosa. Estudios pre-vios en pacientes con HPN han revelado anormalidades pla-quetarias; sin embargo, no se ha determinado su asociacióncon el desarrollo clínico de la enfermedad. Material y méto-dos. En el presente estudio se comparó la morfología y el pa-trón de distribución de actina, miosina, tubulina y P-selectinaen plaquetas en reposo y activadas provenientes de 22 pa-cientes con HPN y de individuos sanos por microscopia elec-trónica de transmisión e inmunofluorescencia. Resulta-dos. La ultraestructura de las plaquetas de individuos conHPN en reposo y activadas en suspensión con diferentes ago-nistas (ADP, colágena y trombina) mostró cambios morfoló-gicos que sugirieron la presencia de plaquetas activadas circu-lantes. Las estructuras desarrolladas durante el proceso deadhesión (formación de filopodios, lamelipodios), así como elpatrón de distribución de actina, miosina, tubulina y P-selecti-na, no se modificaron en las plaquetas de los pacientes conHPN en relación con el testigo. Conclusión. Los cambiosmorfológicos en plaquetas en reposo fueron relacionados conla expresión de P-selectina, por lo que se sugiere su determina-ción como un parámetro indicativo de un posible riesgo trom-bótico.

Palabras clave. Plaquetas. Activación. HPN. Citoesqueleto.Trombosis.

Ultrastructural studyof platelets patients withparoxysmal nocturnal hemoglobinuria

ABSTRACT

Introduction. Paroxysmal nocturnal hemoglobinuria(PNH) is a hemolytic anemia characterized by intravascularhemolysis, cytopenias and venous thrombosis. Previousstudies in patients with PNH have shown platelet abnormal-ities; however, their association with the clinical develop-ment of the sickness has not still been determined. Materialand methods. In this study, we compared the morphologyand distribution pattern of actin, myosin, tubulin and p-se-lectin in resting and activated platelets from 22 PNH pa-tients and healthy donors by transmission electron microsco-py and immunofluorescence. Results. The PNH plateletultrastructure of resting and activated with different ago-nists (ADP, collagen and thrombin) showed morphologicalchanges which suggested the presence of circulating plate-lets. The developed structures during the adhesion process(filopodia and lamellipodia formation), as well as the pat-tern distribution of actin, myosin, tubulin and p-selectin inPNH platelets were not modified in relation to control plate-lets. Conclusion. Morphological changes in resting plateletswere related with p-selectin expression suggesting its deter-mination as thrombosis indicator.

Key words. Platelets. Activation. PNH. Cytoskeleton. Throm-bosis.

INTRODUCCIÓN

La hemoglobinuria paroxística nocturna (HPN)es una enfermedad clonal de la célula tallo hemato-

poyética que genera células sanguíneas defectuosas.Esta alteración es secundaria a una mutación somá-tica del gen pig-A (phosphatidylinositol glycan classA), que ocasiona cambios en la síntesis de la molécu-

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plaquetaria,21,22 ya que la fracción C5b-9 produce laformación de vesículas plaquetarias y la generaciónde trombina.23 Asimismo, se ha descrito que las pla-quetas de los pacientes con HPN muestran un incre-mento en la expresión de marcadores de activación24

probablemente por su continua exposición al ADPproveniente de la lisis de eritrocitos.25 Sin embargo,los estudios relacionados con la fisiología de las pla-quetas de estos pacientes no han correlacionado conlas manifestaciones clínicas de la enfermedad. Envirtud de que durante la función plaquetaria se invo-lucran cambios estructurales, el estudio de éstos enlas plaquetas HPN podría contribuir a explicar eldesarrollo de los procesos trombóticos en estos pa-cientes. En el presente estudio se caracterizó la ul-traestructura de plaquetas de pacientes con HPN enpresencia y ausencia de activadores plaquetarios; ladistribución de los principales componentes del ci-toesqueleto y gránulos citoplásmicos por inmu-nofluorescencia mientras que por citometría de flujose evaluó la expresión de P-selectina. Los resultadosobtenidos no mostraron cambios en la redistribu-ción del citoesqueleto y gránulos citoplásmicos enplaquetas de pacientes con HPN en reposo ni duran-te el proceso de adhesión a sustrato en relación conlos controles. Sin embargo, se encontraron diferen-cias en la respuesta ante diversos agonistas, los cualesno guardaron relación con los parámetros de labo-ratorio indicativos de hemólisis activa. Se sugiereque la determinación de P-selectina en las plaquetasde los pacientes con HPN podría ser un indicador deriesgo de trombosis.

MATERIAL Y MÉTODOS

Pacientes

Se incluyeron 22 pacientes adscritos al área deHematología del Hospital de Especialidades del CMN“La Raza” con diagnóstico de HPN. Éste fue deter-minado mediante las pruebas de Ham, sacarosa einulina y confirmado por la evaluación de algunosmarcadores de superficie (CD55, CD59) por citome-tría de flujo. Asimismo, se incluyeron 10 individuossanos como control, quienes aceptaron participar enel estudio y cuyas muestras se procesaron en formaparalela a las de los pacientes.

Estudios de laboratorio

A su ingreso al estudio, tanto a los pacientes deHPN como a los testigos incluidos en el presente es-tudio se les realizaron biometría hemática completa

la de glucosilfosfatidilinositol (PIG), a la que estruc-turalmente se anclan proteínas reguladoras con acti-vidad lítica del complemento (C).1 La disminución deestas proteínas en la membrana de los eritrocitos lasconvierte en estructuras muy susceptibles a la lisispor la acción del C,2,3 por ello, esta enfermedad seconsidera como una anemia hemolítica adquirida ca-racterizada por hemólisis intravascular, citopenias yuna alta incidencia de trombosis venosa.4

La magnitud de la hemólisis intravascular por Cdepende del grado de las deficiencias ya sea parcial ototal de DAF (Decay Accelerating Factor, CD55), yMIRL (membrane inhibitor of reactive lysis, CD59),que impide el ensamble de los complejos de la C3convertasa (C4b2a y C3bBb) y (C5b-9), respectiva-mente.5 Se estima que en México la HPN tiene unaincidencia de dos casos en 100,000 habitantes/año si-milar a lo reportado en Tailandia y China.6

La mayoría de los pacientes con HPN cursancon eventos trombóticos que constituyen la mayorcausa de muerte.7 Sin embargo, la evaluación de losniveles y estados funcionales de las proteínas involucra-das en la patogénesis de las trombosis venosas (proteí-na C, proteína S, y antitrombina), así como lasmutaciones del factor V Leiden, no han reveladoninguna diferencia entre pacientes HPN e individuossanos.8,9

Las plaquetas son estructuras celulares anuclea-das cuya función es la de formar un tapón hemostá-tico sobre cualquier discontinuidad producida en elendotelio vascular. El citoesqueleto es un componen-te celular crítico para la regulación e integración delas funciones plaquetarias como el cambio de forma,adhesión, agregación, exocitosis y retracción, dispa-rados cuando las plaquetas entran en contacto consubstancias liberadas por el daño tisular. El ci-toesqueleto plaquetario está formado por una redde filamentos de actina,10,11 de un anillo marginal demicrotúbulos,12 moléculas de miosina13 y proteínasde unión a actina tales como α-actinina, vinculina,talina, espectrina y tropomiosina.14-16 La actina de-termina el cambio de la forma discoide, involucrandola formación de filopodios y lamelipodios;17 mientrasque el anillo de microtúbulos se modifica fragmen-tándose o disminuyendo su diámetro.18,19 La miosinase asocia con filamentos de actina para formar ungel de actomiosina, responsable de la centralizaciónde los organelos en una zona conocida como granu-lómero; mientras que su asociación con α-actininagenera la fuerza tensorial necesaria para la adhe-sión y la retracción plaquetaria.20

En los pacientes con HPN, la regulación anormaldel C puede desencadenar los procesos de activación


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Este documento es elaborado por Medigraphic

(Cell-Dyn) y LDH (deshidrogenasa láctica) métodoautomatizado (Abbot Diagnostics).

Obtención de plaquetas en suspensión

Bajo consentimiento previo se obtuvieron plaque-tas a partir de sangre periférica por punción venosade pacientes con HPN y de individuos sanos. Lasangre se mezcló inmediatamente con anticoagu-lante de citratos conteniendo dextrosa a pH 6.5 (93mM de citrato de sodio, 70 mM de ácido cítrico y140 mM de dextrosa), en una proporción de nuevepartes de sangre y una de anticoagulante. Las pla-quetas se separaron de la sangre total por centri-fugación a 100 g por 10 minutos a temperaturaambiente, el plasma rico en plaquetas se combinócon un volumen igual de anticoagulante citratado yse centrifugó a 400 g durante 10 minutos a tempe-ratura ambiente. El paquete plaquetario se resus-pendió y se lavó con solución Tyrode (ácido cítrico36 mM, KCl 5 mM, MgCl 1 mM, NaCl 103 mM,glucosa 5 mM) dos veces, se mantuvieron a 37 °Cdurante 60 minutos, con el fin de que las plaquetasactivadas por los lavados regresaran a un estado dereposo.

Activación de las plaquetas en suspensión

La suspensión de plaquetas se incubó con los ago-nistas ADP, colágena o trombina a una concentraciónfinal de 10µ M, 2 µg/mL y 1.0 U/mL, respectivamente,durante 10 minutos a temperatura ambiente. Poste-riormente se fijaron por la adición de un volumenigual de glutaraldehído al 5% en Tyrode durante60 minutos a temperatura ambiente y se procesa-ron para microscopia electrónica de transmisión(MET).

Procesamiento deplaquetas para corte fino y MET

Las plaquetas tanto en reposo como activadas ensuspensión y previamente fijadas con glutaraldehí-do, se lavaron dos veces con Tyrode, se posfijaroncon tetraóxido de osmio al 1% a 4 °C en el mismo re-gulador por 30 minutos y se tiñeron toda la nochecon acetato de uranilo acuoso al 2%. Los paquetescelulares se deshidrataron en concentraciones cre-cientes de etanol y se incluyeron en resina SPURR.Se obtuvieron cortes finos y se contrastaron con ace-tato de uranilo y citrato de plomo. Se observaron yfotomicrografiaron en un microscopio electrónico detransmisión JEOL JEM-1010 a 70 kV.

Adhesión plaquetaria y fijación

Las plaquetas se sedimentaron sobre cubreobjetosde vidrio durante 20 minutos. Posteriormente, se eli-minaron aquellas no adheridas mediante dos lavadoscon PBS. Las plaquetas adheridas se fijaron y per-meabilizaron con una mezcla de 2% p-formaldehído,0.05% de glutaraldehído y 0.04% de NP40 en la solu-ción estabilizante del citoesqueleto, PHEM (100 mMPIPES, 5.25 mM HEPES, 10 mM EGTA, 20 mMMgCl2) por 20 minutos.

Inmunofluorescencia

Las plaquetas en reposo y las adheridas, fijadasy permeabilizadas fueron incubadas con 0.1 mg/mLde faloidina FITC para teñir filamentos de actina(Sigma Chemical Co, St. Louis MO), así como conlos anticuerpos dirigidos contra miosina (Cat sc-6956, Santa Cruz Biotechnology, Inc., California)desarrollado en ratón, beta-tubulina (Cat sc-9104,Santa Cruz Biotechnology, Inc., California) desarro-llado en conejo y P-selectina (Cat sc-6941, SantaCruz Biotechnology, Inc., California) desarrolladoen cabra, diluidos en PBS conteniendo albúminabovina al 0.1%. Después de dos horas, la reacciónfue revelada con el anticuerpo secundario corres-pondiente. Los cubreobjetos se montaron en Vec-tashield para su observación en un microscopio deepifluorescencia marca Olympus BX41 utilizandoun objetivo UPIanFI 100X con apertura numéricade 1.30. Se evaluaron al menos 20 campos por cadalaminilla.

Determinación deP-selectina por citometría de flujo

A una concentración de 500 plaquetas/mm3 en re-poso y activadas con ADP (10 mmol) provenientesde individuos sanos y a una concentración similar deplaquetas en reposo de pacientes con HPN se adicio-naron 10 µL del anticuerpo dirigido contra CD62P(Dako North America, Inc, Carpintería, CA), marca-do con isotiocianato de fluoresceína, se mezcló e in-cubó durante 20 minutos a temperatura ambienteen la oscuridad. Transcurrido el tiempo se adiciona-ron 500 µL de solución PBS/EDTA 9 mmol (soluciónsalina de fosfatos/ácido etilendiaminotetraacético).Posteriormente se procedió a la adquisición y análi-sis de datos de las muestras en un citómetro de flujoFACS calibur (Becton Dickinson, San José, CA) quecuenta con el programa CellQuest (versión 3.2.2Apple System 7.6.1).


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Análisis estadístico

De acuerdo con los hallazgos morfológicos deriva-dos de las observaciones realizadas por microscopiaelectrónica, los 22 pacientes incluidos en el estudiofueron agrupados en dos categorías. Los parámetrossanguíneos registrados para cada grupo de pacientesfueron evaluados estadísticamente para determinarla existencia de diferencias significativas empleando laprueba t-Student (concentración de plaquetas yLDH), así como la prueba U de Mann-Whitnney(porcentaje de reticulocitos y P-selectina). Se deter-minó el valor de p con 95% de confianza, empleandoel programa Sigma Stat 2.03.

RESULTADOS

Características clínicasy datos de laboratorio

En el cuadro 1 se muestra la distribución de lospacientes de acuerdo con su edad y sexo. De los22 pacientes estudiados nueve correspondieron alsexo femenino y 13 al sexo masculino, cuyas edadesfluctuaron entre 24 y 74 años. La mayor incidenciade la enfermedad (10 pacientes) se presentó en lacuarta década de la vida de los cuales tres corres-pondieron a individuos del sexo femenino y siete alsexo masculino; seguida de cinco pacientes (dos delsexo femenino y tres del sexo masculino) entre los41 y 50 años de edad. También se incluyeron en elestudio tres pacientes (dos mujeres y un hombre)en la tercera década de la vida, así como otros dospacientes (hombres) cuyas edades fluctuaron entrelos 51 a 60 años de edad. En la séptima y octava dé-cada de la vida, quedó incluida una paciente, res-pectivamente.

La historia clínica de los pacientes incluidos enel presente estudio reveló que la manifestaciónclínica por la que acudieron para su atención médi-

ca, correspondió al síndrome anémico en los 22 casose incluso pancitopenia. Asimismo, se determinó lapresencia de otros síntomas asociados como orinasoscuras, cefalea, hemorragia (epistaxis y metrorra-gias), dolor de cabeza y dolor abdominal; mientrasque la biometría hemática practicada a todos los pa-cientes a su ingreso presentó pancitopenia en dos deellos (Cuadro 2).

Cabe señalar que el análisis de los expedientes clí-nicos mostró que algunos pacientes del sexo mascu-lino por cuestiones laborales estuvieron expuestosa agentes químicos como solventes, pesticidas ymateriales de construcción; mientras que sólo unapaciente fue diagnosticada después del parto. Sinembargo, en la mayoría de los casos no fue posibledeterminar algún antecedente que pudiera estar re-lacionado con la aparición de la enfermedad.

El diagnóstico de HPN fue confirmado mediantela cuantificación de CD55 y CD59 por citometría deflujo (datos no mostrados). A cada paciente le fuepracticada una biometría hemática con la cual seevaluó la concentración de hemoglobina, número de

Cuadro 1. Distribución de los pacientes con HPN de acuerdo con laedad y el sexo.

Intervalo de edad No. de casos(años) Mujeres Hombres Total %

21-30 2 1 3 13.631-40 3 7 10 45.441-50 2 3 5 22.751-60 - 2 2 9.161-70 1 - 1 4.671-80 1 - 1 4.6Total 9 13 22 100

Cuadro 2. Distribución de los pacientes con HPN de acuerdo con la ma-nifestación clínica inicial.

Manifestación clínica Asociación No. de casos

Exclusivamente 6Orinas oscuras 6

Síndrome anémico Cefalea 3Hemorragia 3Pancitopenia 2Cefalea y dolor abdominal 2

Total 22

Cuadro 3. Distribución de los pacientes de acuerdo con algunos pará-metros sanguíneos.

Parámetro Valor límite No. de casos

Hemoglobina Mujeres < 12.0 7(g/dL) > 12.0 3CN = 12.2-18.1 Hombres < 13.6 6

> 13.6 6

Reticulocitos (%) > 3 18CN = 1-3 < 3 4

Leucocitos (x103/mm3) < 4.5 12CN = 4.5-10.5 > 4.5 10

Plaquetas (x103/mm3) < 150 6CN = 150-450 > 150 16

LDH (U/L) > 460 18CN = 230-460 < 460 4


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eritrocitos, leucocitos y plaquetas, así como el por-centaje de reticulocitos. Adicionalmente, se identifi-có la presencia de eventos hemolíticos mediante lacuantificación de la enzima deshidrogenasa láctica(LDH). En el cuadro 3 se encuentran registrados losparámetros antes mencionados utilizados para eldiagnóstico de HPN obtenidos en el momento de larealización de este estudio; asimismo, se indica elnúmero de pacientes cuyos valores están por debajode los límites considerados como normales.

De los 22 pacientes estudiados, siete del sexo fe-menino presentaron valores de hemoglobina meno-res a 12 g/dL, mientras que para seis del sexo mas-culino, la concentración de hemoglobina fue menorde 13.6 g/dL. El porcentaje de reticulocitos fue ma-

yor de 3% en 18 de los casos, lo cual reflejó una re-generación activa de los eritrocitos. Los leucocitosse encontraron disminuidos por debajo de 4.5 X 103/mm3 en 12 de los pacientes mientras que la concen-tración de las plaquetas circulantes menor a 150 X103/mm3 se encontró sólo en seis pacientes. Diecio-cho pacientes presentaron lisis activa reflejada enuna concentración mayor de 460 U/L de LDH.

Distribución topográfica de los filamentosde actina, moléculas de miosina y tubulina en

plaquetas en reposo y adheridas a vidrio

Con el fin de determinar si las plaquetas prove-nientes de los pacientes con HPN presentaban cam-

Figura 1. Distribución topográficade filamentos de actina, moléculas demiosina y tubulina en plaquetas en repo-so y adheridas.

Panel A. Las plaquetas de indivi-duos sanos en reposo (insertos) y adhe-ridas fueron procesadas para técnicasde inmunofluorescencia para marcar fila-mentos de actina (a), moléculas de mio-sina (b) y moléculas de tubulina (c).

Panel B. Las plaquetas de pacien-tes con HPN en reposo (insertos) y ad-heridas fueron procesadas para técnicasde inmunofluorescencia para marcar fila-mentos de actina (a, d, g), moléculasde miosina (b, e, h) y moléculas de tu-bulina (c, f, i). Las flechas en Aa y Bdseñalan los filamentos de actina organi-zados en haces radiales. En Bb y Bi se-ñalan las moléculas de miosina y tubulinarespectivamente rodeando el granulóme-ro. Escala = 5 μm.


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bios en la distribución de los diferentes elemen-tos del citoesqueleto, se procesaron plaquetas en re-poso y adheridas a vidrio para ser observadas pormicroscopia de fluorescencia. Los resultados fueroncomparados con muestras provenientes de indivi-duos sanos procesadas simultáneamente.

Las plaquetas de individuos sanos, en reposo,mostraron filamentos de actina localizados en uncore central, así como alrededor de la membranacitoplásmica (Figura 1A a, inserto). Las moléculasde miosina presentaron una distribución citoplásmi-ca homogénea (Figura 1A b, inserto), mientras quelas moléculas de tubulina se encontraron constitu-yendo un anillo marginal delimitando la forma de laplaqueta (Figura 1A c, inserto).

En las plaquetas adheridas a vidrio obtenidas apartir de los 10 donadores sanos, se observó la pre-sencia de filamentos de actina organizados en hacesradiales que se formaron a partir de la zona delgranulómero (Figura 1a, flecha); asimismo, los bor-des de la membrana se observaron decorados con fila-mentos de actina, los cuales son poco evidentes en lazona del citoplasma (Figura 1A a). Las moléculas demiosina se encontraron constituyendo el anillo con-tráctil que rodea la zona del granulómero (Figura 1Ab, flecha), así como alrededor de la membrana plas-mática. Adicionalmente, el anillo marginal de micro-túbulos se disoció para permitir la extensión de laplaqueta, y las moléculas de tubulina fueron redistri-buidas permaneciendo alrededor del granulómero (Fi-gura 1A c, flecha) y de la membrana plasmática.

Las plaquetas en reposo provenientes de los 22pacientes con HPN (Figura 1B a-c insertos), mos-traron una distribución de filamentos de actina,miosina y tubulina similar a la de las provenientesde individuos sanos. Los filamentos de actina perma-necieron en el citoplasma a manera de conglomera-dos citoplásmicos (Figura 1B a,d,g, insertos), mientrasque las moléculas de miosina conservaron su distri-bución homogénea en la zona del citoplasma (Figura1B b,e,h, insertos), así como el anillo marginal demicrotúbulos (Figura 1B c,f,i, insertos).

Las plaquetas HPN adheridas a vidrio, presenta-ron filamentos de actina en la zona del granulómerocon haces radiales dirigidos hacia el citoplasma y enla zona de avance del lamelipodio (Figura 1B d, fle-cha); mientras que las moléculas de miosina (Figura1B h) y de tubulina (Figura 1B i) se observaron ro-deando al granulómero (flechas) y a la membranacitoplásmica.

En general, las imágenes de inmunofluorescenciade las plaquetas de los pacientes con HPN con lasque se determinó la distribución de los elementos del

citoesqueleto (actina, miosina y tubulina), no revela-ron diferencias en relación con las plaquetas de losindividuos sanos tanto en estado de reposo como ad-heridas a vidrio.

Relación del grado deactivación y función plaquetaria

Dentro de los cambios incluidos en el proceso deactivación, se encuentran la centralización de losgránulos citoplásmicos con la consecuente liberaciónde su contenido hacia el sistema canalicular abierto.Se ha considerado que durante estos eventos, losgránulos también pueden migrar hacia la membranacitoplásmica para liberar su contenido por exocito-sis.26 La secreción de algunos de los componentes delos gránulos pueden expresarse en las membranasde las plaquetas (citoplásmica y sistema canalicularabierto), como ocurre con la P-selectina.

Para evaluar el grado de activación de las plaque-tas de los 22 pacientes con HPN, se determinó la ex-presión de P-selectina (CD62P) como un marcadorde la activación plaquetaria, así como la distribución delos gránulos citoplásmicos en comparación con lasplaquetas de los 10 individuos sanos.

La P-selectina se observó como un componentede los gránulos citoplásmicos, por lo que la marcase localizó en el centro de las plaquetas en reposotanto de individuos sanos (Figura 2A a inserto)como de pacientes con HPN (Figura 2B a-f inser-tos). Sin embargo, durante la adhesión los gránulosfueron redistribuidos pudiéndose localizar tanto enel granulómero (Figura 2A a,c, flechas), como dis-persos en el citoplasma de las plaquetas sanas. LaP-selectina también pudo observarse delimitando lazona de la membrana citoplásmica.

Las plaquetas de pacientes con HPN presentaronuna distribución de este marcador similar a la des-crita para las plaquetas sanas. La Figura 2B mues-tra la localización de la P-selectina en las plaquetasque mantuvieron los gránulos centralizados en elárea del granulómero, así como en el citoplasma.También pudieron observarse plaquetas con losgránulos ubicados en la zona de la membrana cito-plásmica (no mostrados). Los diferentes patrones dedistribución de los gránulos citoplásmicos observa-dos en las plaquetas control, no se ven modificadasen relación con los observados en las plaquetas enestudio. Asimismo, la intensidad y distribución de lafluorescencia observada en ambos tipos de muestrases similar, por lo que esta metodología no permitiódiscriminar el grado de activación entre las plaque-tas sanas y con HPN.


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Ultraestructurade plaquetas de pacientes con HPN

Con el fin de caracterizar la ultraestructura de lasplaquetas en reposo y activadas en suspensión condiferentes agonistas (ADP, colágena y trombina),las plaquetas provenientes de pacientes con HPN seprocesaron para su análisis por microscopia electró-nica de transmisión. Las plaquetas provenientes deindividuos sanos fueron tratadas y procesadas si-multáneamente como control.

Los agonistas empleados en el presente estudio(ADP, colágena y trombina) se caracterizan por dis-parar diferentes rutas de señalización, por lo que loscambios morfológicos generados, disparados por ellostambién lo son. Estas diferencias son estadísticamen-te significativas, lo que permite discriminar la acciónde cada uno de los agonistas antes mencionados.27

Las plaquetas en reposo de los pacientes y las delos individuos testigo fueron procesadas en presenciade glutaraldehído para disminuir al máximo la activa-ción plaquetaria provocada por los procesos de obten-ción y purificación (centrifugación); sin embargo,aproximadamente 80% de las plaquetas observadasmostraron una morfología discoide típica con gránu-los dispersos en el citoplasma (Figura 3A a), mientras

que el restante 20% presentó algunos signos indicati-vos de una ligera activación como lo son la extensiónde filopodios cortos (Figura 4A a, flecha).

La activación con ADP genera la formación defilopodios largos y delgados, así como una amplifica-ción moderada del sistema canalicular abierto (Figu-ra 4A b). Los cambios morfológicos producidos porla activación con colágena generaron la formaciónde filopodios cortos y anchos, y una amplificación delsistema canalicular abierto (SCA) en ocasiones im-perceptible (Figura 4A c). La activación con trombi-na indujo los cambios morfológicos más drásticos delos tres agonistas empleados, estos cambios incluyenla formación de numerosos filopodios, que ademástienen la característica de ser delgados y largos; elSCA se observó amplificado dando al citoplasma delas células el aspecto de tener numerosas vacuolas(Figura 4A d).

De acuerdo con las observaciones hechas a partirde las imágenes de plaquetas de HPN obtenidas porMET, se clasificaron a los pacientes en dos grupos:Un primer grupo de 14 pacientes cuyas plaquetaspresentaron una morfología tanto en condiciones dereposo como activadas con los agonistas, similar ala observada en las plaquetas provenientes de los 10individuos sanos (Figura 4B a-l). El segundo grupo

Figura 2. Expresión de P-selecti-na en plaquetas en reposo y adheridas.Plaquetas control (panel A) y de HPN(panel B) fueron procesadas en repo-so (insertos) y en adhesión para inmu-nofluorescencia, empleando el anti-cuerpo dirigido contra P-selectina yrevelado con un anticuerpo secundariomarcado con FITC. Escala = 5 μm.


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incluyó a las plaquetas de ocho pacientes cuyos cam-bios morfológicos observados por efecto de los ago-nistas fueron más evidentes y más drásticos (Figura3B a-l).

Grupo 1Las plaquetas en reposo de pacientes con HPN del

grupo 1 tratadas con glutaraldehído al 0.05%,mostraron mayores indicios de activación que lasplaquetas testigo, como fueron la pérdida de la formadiscoide, desarrollo de extensiones cortas de la mem-brana y una ligera amplificación del sistema cana-licular abierto, e incluso se observó la presencia demicrovesículas procoagulantes (Figura 4B a, flecha).

Las plaquetas tomadas de pacientes con HPN yactivadas con los diferentes agonistas, presentaron

diversos grados de activación observándose imáge-nes muy similares a las de las plaquetas considera-das como testigo.

La activación de las plaquetas de HPN con ADP10 µM produjo la formación de esferas compactas,formación de dos a tres filopodios largos y angostos,amplificación del SCA y la dispersión de los gránuloscitoplásmicos a la periferia de la membrana (Figura4B b, f, j, flecha en f).

La activación plaquetaria con colágena 2 µM ge-neró redondeo de las estructuras discoides, con laformación de dos a tres filopodios cortos y gruesos,amplificación del SCA y dispersión de los gránuloscitoplásmicos. Algunas plaquetas conservaron la for-ma discoide o permanecieron redondeadas sin la ex-tensión de filopodios (Figura 4B g flecha).

Figura 3. Ultraestructura de pla-quetas en reposo y activadas conADP, colágena y trombina.

Panel A. Micrografías de plaque-tas provenientes de individuos sanos.Plaquetas en reposo (a) y activadascon ADP (b), colágena (c) y trombina(d) fueron procesadas para MET.

Panel B. Micrografías de plaque-tas provenientes de diferentes pacien-tes con HPN. Plaquetas en reposo (a,e, i) activadas con ADP (b, f, j), co-lágena (c, g, k) y trombina (d, h, l).Las imágenes son representativas delas observadas a partir de ocho pacien-tes incluidos en el grupo 2. Las flechasen B a, e, i señalan la amplificacióndel SCA en plaquetas con aparente for-ma discoide. En Bc y Bk señalan lapérdida de redondeo y la amplificacióndel SCA, respectivamente, en las pla-quetas de pacientes con HPN activa-das con colágena. Escala = 1 μm.


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La activación con trombina 1 U/mL al igual quecon las plaquetas control, produjo los cambios másdrásticos en las plaquetas de HPN, observándose laformación de múltiples filopodios heterogéneos en for-ma y tamaño, que deformaron el cuerpo de la plaque-ta. La amplificación del SCA le dio al citoplasma laapariencia de estar vacuolado, mientras que los gránu-los se encontraron dispersos (Figura 3B d,h,l).

Grupo 2Una proporción importante de las plaquetas en

reposo de HPN del grupo 2, aun cuando fueron tra-tadas con glutaraldehído al 0.05% al igual que a lasplaquetas testigo, presentaron importantes cambiosestructurales como resultado de la activación, comola pérdida de la forma discoide y la formación de filo-podios cortos. Es importante hacer notar que la am-

plificación del SCA fue evidente incluso en aquellasplaquetas con aparente forma discoide (Figura 3B a,e, i flechas).

El tratamiento de plaquetas de HPN con ADP ge-neró cambios morfológicos profundos y más drásticosque los observados para las muestras testigo. Fuemuy característica la presencia de estructuras sinforma definida con numerosos filopodios heterogé-neos en forma y tamaño; la formación de estructurasesféricas se observó en baja proporción. Adicional-mente, fue muy evidente la amplificación del SCA,que en muchas ocasiones ocupó gran parte del cito-plasma (Figura 3B b, f, j).

La comparación de las imágenes obtenidas a par-tir de las plaquetas de HPN activadas con colágenay las plaquetas testigo tratadas bajo estas mismascondiciones, reveló cambios morfológicos sutiles so-

Figura 4. Ultraestructura de pla-quetas en reposo y activadas conADP, colágena y trombina.

Panel A. Micrografías de plaque-tas provenientes de individuos sanos.Plaquetas en reposo (a) y activadascon ADP (b), colágena (c) y trombina(d) fueron procesadas para MET.

Panel B. Micrografías de plaque-tas provenientes de diferentes pacien-tes con HPN. Plaquetas en reposo (a,e, i), activadas con ADP (b, f, j), co-lágena (c, g, k) y trombina (d, h, l).Las imágenes son representativas delas observadas a partir de los 14 pa-cientes incluidos en el grupo 1. La fle-cha en Aa señala un filopodio cortocomo signo indicativo de una ligera acti-vación. En Bg señala una plaqueta ac-tivada con colágena sin la extensión defilopodios. Escala = 1 μm.


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bre todo en el redondeo de las estructuras y en laamplificación del SCA (Figura 3B c, g, k flecha).Mientras que los cambios más drásticos se observa-ron durante la activación con trombina, ya que tan-to las plaquetas de HPN como las testigo, tratadascon este agonista presentaron cambios morfológicossimilares a los ya descritos anteriormente y que in-cluyeron la formación de numerosos filopodios lar-gos con pérdida de la forma esférica, la amplificacióndel SCA y la dispersión de los gránulos en todo elcitoplasma (Figura 3B d, h, l).

Condiciones que favorecenla activación de las plaquetas de los pacientes

con hemoglobinuria paroxística nocturna

En el cuadro 4 se muestran los valores de reticu-locitos (%) y de deshidrogenada láctica (U/L) encon-trados en los dos grupos en que se dividieron a lospacientes. Los valores elevados de ambos paráme-tros son indicativos de una hemólisis activa, loscuales fueron evaluados estadísticamente.

En el grupo 1, en el que se ubicó a 14 pacientes, elporcentaje de reticulocitos y plaquetas presentó unamediana de 8.7 y 179.5, respectivamente, mientrasque las correspondientes a los pacientes del grupo 2para reticulocitos fueron de 3.5 y 173.5 para plaque-tas, cabe señalar que ninguno de estos parámetrosfue estadísticamente significativo. La media de laconcentración de LDH para los pacientes del grupo 1fue de 3,441.6 y 1,224.5 U/L para el grupo 2; el aná-lisis estadístico reflejó significancia con un valor deP de 0.014 (Cuadro 4).

Para evaluar la posible preactivación de las plaque-tas circulantes provenientes se cuantificó la expre-sión de P-selectina en plaquetas en reposo en ambosgrupos de pacientes; los resultados se compararoncon los obtenidos a partir de plaquetas en reposo y ac-tivadas de individuos sanos (n = 10). En el cuadro 5se muestran los valores de P-selectina para las pla-quetas de individuos sanos en reposo y activadas(7.27 y 38.5, respectivamente), mientras que paralas del Grupo 1 correspondió a 15.6 y 28.1 para elgrupo 2. La evaluación estadística de los valores de P-selectina antes mencionados mostró diferencias signifi-cativas (p < 0.001) entre las plaquetas control (reposoy activadas), entre las del grupo 1 y el control activa-do, así como entre el grupo 1 y grupo 2 (Cuadro 5).

DISCUSIÓN

La trombosis es la complicación más importanteque compromete la vida del paciente con HPN.7 Losestudios encaminados a determinar la causa que des-encadena esta complicación incluyen el aumento dela concentración del activador del plasminógeno, asícomo la presencia de micropartículas procoagulan-tes25 y la circulación de plaquetas activadas;23,24 sin

Cuadro 5. Valores de P-selectina de las plaquetas en reposo de los pacientes de los grupos 1 y 2 y su comparación estadística con las plaquetas con-trol en reposo y activado.

P-selectina Media ± DS Comparación de valores de P- Valor de(%) selectina entre grupos p

Pq. reposoMedia ± DS 7.27 ± 0.7 C. reposo y C. activado < 0.001

Pq. activadasMedia ± DS 38.5 ± 9.54 Grupo 1 (reposo) y C. activado < 0.001

Pq. grupo1 (reposo)Media ± DS 15.6 ± 0.65 Grupo 2 (reposo) y C. activado 0.075

Pq. grupo 2 (reposo)Media ± DS 28.1 ± 5 Grupo1 (reposo) y Grupo 2 (reposo) < 0.001

Cuadro 4. Resultados de laboratorio de los pacientes de los grupos 1 y 2.

Parámetro Valores de Grupo 1 Grupo 2 Valorreferencia de p

Reticulocitos 1-3% 8.7 3.5 0.101(%)

Plaquetas 150-450 179.5 173.5 0.946(X103/mm3)

LDH 230-460 3441.6 1224.5 0.014(U/L)


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embargo, los cambios morfológicos y metabólicosdisparados durante los procesos de activación enplaquetas de pacientes con HPN no han sido deter-minados.

El análisis ultraestructural realizado en el pre-sente estudio mostró que algunos pacientes conHPN tenían plaquetas circulantes que fueron mássensibles a la activación con agonistas (ADP, colá-gena y trombina). No obstante que la distribuciónde actina, miosina, tubulina y gránulos citoplásmi-cos no fueron modificadas; las diferencias ultraes-tructurales correlacionaron con los altos niveles deexpresión de P-selectina determinada por citometríade flujo en comparación con plaquetas en reposo yactivadas provenientes de individuos sanos.

Se sabe que proteínas del citoesqueleto como laactina, la miosina y la tubulina se reorganizan du-rante los procesos de activación,28,29 participando ac-tivamente en los procesos de contracción y adhesióna substrato vía integrina β1.11 Sin embargo, las pla-quetas de los pacientes con HPN no mostraron unadeslocalización de los elementos del citoesqueleto en-sayados, ni influyeron en la capacidad de adhesión asustrato. Esto sugiere que la disminución de proteí-nas de anclaje en la membrana de plaquetas de pa-cientes con HPN no afectó la capacidad de adhesiónde éstas.

La ultraestructura de las plaquetas de individuossanos activadas con diferentes agonistas, ya ha sidocaracterizada previamente estableciéndose diferen-cias significativas en el número y dimensiones de losfilopodios.27 Las observaciones hechas por microsco-pia electrónica de las plaquetas de HPN activadascon diferentes agonistas (ADP, colágena y trombina)permitieron clasificar a los pacientes estudiados endos grupos (grupo 1 y grupo 2, Figuras 3 y 4). Lamorfología de las plaquetas del grupo 1 fue similar ala de los testigos, mientras que la del grupo 2 corre-lacionó con estudios previos en los que se ha obser-vado un aumento en la sensibilidad a la agregaciónplaquetaria inducida por trombina, sugiriendo quelas plaquetas de los pacientes con HPN se encontra-ron hiperreactivas.30 La ultraestructura observadaen las plaquetas de HPN pertenecientes al grupo 2,sugirió estados de preactivación, que fueron corro-borados mediante la determinación de P-selectinapor citometría de flujo en estado de reposo, no obs-tante que los pacientes del grupo 1 pudieron haberpresentado una mayor activación plaquetaria porcursar con episodios hemolíticos más pronunciados(Cuadro 4). Estudios previos han mostrado que elproceso de adhesión de las plaquetas de pacientescon HPN está reducido31 y que son refractarias a la

acción del ADP, similar a lo observado en otrosprocesos hemolíticos en los que el grado de lisis esinversamente proporcional a la adhesividad plaque-taria.32 Asimismo, la hiporreactividad plaquetaria seha atribuido a mecanismos compensatorios entreuna acción constante del complemento y una res-puesta a la hiperestimulación crónica.31

La hiporreactividad plaquetaria observada para elgrupo 1 no estuvo acorde con la concentración de és-tas en sangre en comparación con los pacientes delgrupo 2, quienes presentaron una cantidad ligera-mente disminuida y una mayor reactividad de susplaquetas circulantes. Sin embargo, los cambiosobservados en la función plaquetaria no estarían de-pendiendo directamente de la cantidad de las plaque-tas circulantes, ya que la disminución entre ambosgrupos de pacientes no resultó significativa ni fuetan marcada como lo observado en otros estudios.31

Los pacientes con HPN que acuden a la clínicade HPN del Hospital de Especialidades del CMN“La Raza” no han presentado trombosis, lo cualpodría estar determinado por condiciones raciales,la naturaleza heterogénea de las plaquetas, asícomo por las altas concentraciones de ADP libera-do de la lisis de glóbulos rojos que estimulan la li-beración de óxido nítrico (NO) y que representa unpotente vasodilatador e inhibidor de la adhesiónplaquetaria.33

La HPN es una enfermedad con una incidenciabaja;6,34 sin embargo, ninguno de los estudios reali-zados puede explicar la ausencia de trombosis en lapoblación mexicana; por lo que las perspectivas de es-tudio deberán encaminarse a evaluar el NO, así comoel papel del endotelio vascular en estos trastornos.

Si bien, la severidad de un proceso hemolítico estáen relación con los niveles séricos elevados de LDH,es importante considerar que la presencia de hemog-lobina libre interfiere en la determinación de LDH,creatincinasa y aspartato aminotransferasa, entreotros, arrojando valores elevados falsos.35 Por estarazón y de acuerdo con nuestros resultados sugeri-mos la determinación de P-selectina en pacientes conHPN como un parámetro más confiable para identi-ficar hiperactividad plaquetaria y un posible riesgotrombótico.

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Dra. Doris A. Cerecedo-MercadoLaboratorio de HematobiologíaEscuela Nacional de Medicina y HomeopatíaWilfrido Massieu Helguera 239Col. La Escalera07320, México, D.F.Tel.: 5729 6300 Ext. 55531Fax: 5729 6300 Ext. 55532Correo electrónico: [email protected]

Recibido el 27 de febrero de 2006.Aceptado el 4 de agosto de 2006.

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