PROTOCOLO DE ESTABLECIMIENTO IN VITRO DE SEGMENTOS …
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PROTOCOLO DE ESTABLECIMIENTO IN VITRO DE SEGMENTOS NODALES DE ARÁNDANO AZUL ( Vaccinium corymbosum L.) CV BILOXI. ANNGY YURANIET RIBÓN BARRAGAN INGRY JOHANNA BERNAL PÉREZ UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOSÉ DE CALDAS FACULTAD DE CIENCIAS Y EDUCACIÓN LICENCIATURA EN BIOLOGÍA BOGOTA D.C. 2020
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PROTOCOLO DE ESTABLECIMIENTO IN VITRO DE SEGMENTOS NODALES
DE ARÁNDANO AZUL (Vaccinium corymbosum L.) CV BILOXI.
ANNGY YURANIET RIBÓN BARRAGAN
INGRY JOHANNA BERNAL PÉREZ
UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOSÉ DE CALDAS
FACULTAD DE CIENCIAS Y EDUCACIÓN
LICENCIATURA EN BIOLOGÍA
BOGOTA D.C.
2020
PROTOCOLO DE ESTABLECIMIENTO IN VITRO DE SEGMENTOS NODALES
DE ARÁNDANO AZUL (Vaccinium corymbosum L.) CV BILOXI.
ANNGY YURANIET RIBÓN BARRAGAN
INGRY JOHANNA BERNAL PÉREZ
Trabajo de grado para optar por el título de Licenciadas en Biología
LUIS FRANCISCO BECERRA G
DIRECTOR DEL TRABAJO DE GRADO
UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOSÉ DE CALDAS
FACULTAD DE CIENCIAS Y EDUCACIÓN
LICENCIATURA EN BIOLOGÍA
BOGOTÁ D.C.
2020
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AGRADECIMIENTOS
En primer lugar expresamos nuestra gratitud a Dios, por la vida, la salud y permitirnos
alcanzar esta meta.
A la Universidad Distrital Francisco José de Caldas, por abrirnos las puertas, darnos la
oportunidad de ser parte de ella y llevar a cabo nuestra formación profesional como docentes
investigadoras.
Al Grupo de Investigación de Biología Molecular y genética de la conservación, adscrito al
proyecto curricular de Licenciatura en Biología, por abrirnos las puertas y generar un espacio
académico donde obtuvimos grandes aprendizajes y experiencias.
A nuestro director, el profesor Luis Francisco Becerra, por ofrecernos los espacios físicos
necesarios y su conocimiento, al profesor Juan Camilo Dumar por su guía en la fase de
análisis estadísticos y al profesor Luis Armando Quevedo (Evaluador), por sus muchos
aportes en este trabajo.
Al señor Camilo Lozano de la Empresa grinfamily SAS y a todo el personal de la finca Los
eucaliptos por su apoyo a esta investigación, al suministrarnos los insumos necesarios para
está investigación.
A nuestras familias por todo el apoyo incondicional, motivación y paciencia que nos
brindaron durante todo nuestro proceso de formación profesional, sin estos no hubiésemos
contado con la fortaleza y ánimo para preservar y lograr llegar donde estamos.
Finalmente, agradecemos a nuestros amigos, compañeros, profesores y demás personas que
hicieron parte y enriquecieron este proceso formativo e investigativo de forma directa como
indirecta; pues su compañía y vivencias compartidas contribuyeron en nuestro crecimiento y
preparación personal y profesional.
3
TABLA DE CONTENIDO
LISTADO DE TABLAS /FIGURAS……………………………………………………..…7
RESUMEN……………………………………………………………………………..…….8
ABSTRACT………………………………………………………………………….......….9
INTRODUCCIÓN……………………………………………………………………...…..10
PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA……………………………………………..…..12
OBJETIVOS…………………………………………………………………………..........14
JUSTIFICACIÓN………………………………………………………………….….…....15
1. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA……………………………………………………...….18
1.1 Antecedentes del Cultivo in vitro en Vaccinium corymbosum ….…………………...18
1.2 Generalidades del Cultivo in vitro ………………………………….….……………..20
1.2.1 Micropropagación …………………………………………………………………...22
1.2.1.1 Establecimiento del cultivo in vitro …………………...………………………….23
1.2.1.2 Multiplicación……………………………………………………………………....24
1.2.1.3 Enraizamiento……………………………………………………………………...25
1.2.1.4 Adaptación………………………………………………………………………….26
1.3 Condiciones ambientales in vitro para la incubación………………………………. 26
1.4 Medios de Cultivo……………………………………………………………………....28
1.4.1 Reguladores de crecimiento…………………………………………………….….. 30
1.4.1.1 Tipos de reguladores de crecimiento……………………………………….…….. 31
1.4.1.1.1 Auxinas………………………………………………………………………..…..31
1.4.1.1.2 Giberelinas………………………………………………………………...……...32
4
1.4.1.1.3 Citoquininas……………………………………………………………….……..32
1.4.1.1.4 Ácido Abscísico…………………………………………………………….…… 33
1.4.1.1.5 Etileno………………………………………………………………...…………..34
1.5 Propagación de especies leñosas……………………………………………..……….34
1.6 Vaccinium corymbosum ……………..…..…………………………………...………..36
1.6.1 Ecofisiología………………………………………………………………….……... 36
2. DISEÑO METODOLÓGICO………….…………………………………..………….38
2.1 Tipo de investigación……………………………………………….……..….……….38
2.2 Definición de la población ………………………………………..………….……….38
2.3 Definición de las variables …………………………………………………………...38
2.4 Análisis estadístico ………………………………………………………….…..…….39
2.4.1 Análisis estadístico: ANOVA y prueba de Tukey ………………………………....39
2.5 Fases de trabajo ………………………………………………………………...…….40
2.5.1 Fase I: Selección del Material Vegetal ………………………………....………….40
2.5.2 Fase II: Fase de laboratorio ....……………………………..……………….……...42
2.5.3 Fase III: Comparación y Análisis Estadísticos …...……………………..………...43
3. DISCUSIÓN DE RESULTADOS ……………………………………………………...45
3.1 Fase de campo …………………………………………………………….…………...45
3.2 Fase de laboratorio …………………………………………………………………...46
3.2.1 Selección del Medio de cultivo ……………………………………………………...47
5
3.2.2 Protocolo de desinfección……………………………………….…………………...50
3.2.3 Estimulación de brotación mediante choque térmico……….………………….....56
3.2.4 Reguladores de crecimiento de tipo Citoquinina…………………………………..59
3.2.4.1 Variable de Longitud del tallo ……………………………………………………61
3.2.4.2 Variable de Nùmero de Hojas .…………………………………………………....64
3.2.4.3 Variable de Nùmero de Nudos …………………………………………………....68
4. CONCLUSIONES ……………………………………………………………………...71
5. RECOMENDACIONES …………………………………....………………………….72
6. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ……………………………………………….73
7. ANEXOS ……………………………………………………………………………….88
6
LISTADO DE TABLAS Y FIGURAS
FIGURA 1: Finca “Los Eucaliptos”...................................................................................42
FIGURA 2: Plantas Madre ................................................................................................43
TABLA 1: Relación de tratamientos de reguladores de crecimiento de tipo citoquinina...44
FIGURA 3: Obtención del segmento nodal de Vaccinium corymbosum ………………...55
GRÁFICA 1. Medias de Longitud......................................................................................62
FIGURA 4: Plántulas cultivadas en medios suplementados con citoquininas…………....64
GRÁFICA 2. Medias de Número de Hojas……………………………………………….65
FIGURA 5: Plántulas obtenidas a las 5 semanas de cultivo ……………..……………….67
GRÁFICA 3. Medias de Número de Nudos……………………………………...……….69
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RESUMEN
En los últimos años la demanda y producción de arándano (Vaccinium corymbosum) ha
aumentado enormemente debido a sus múltiples beneficios, propiedades nutricionales y
antioxidantes y su versatilidad como producto, lo que ha generado un gran interés económico.
Con el fin de satisfacer la creciente demanda de arándanos, el cultivo in vitro ha sido visto
como el enfoque más apropiado para tener altos volúmenes de material vegetal, además las
técnicas de cultivo in vitro ofrecen la posibilidad de desarrollar plantaciones con alta calidad
genética como fitosanitaria, a través de la evaluación de protocolos de desinfección y
establecimiento. De acuerdo con lo anterior, el objetivo de este trabajo es proponer un
protocolo para el establecimiento in vitro de segmentos nodales de Vaccinium corymbosum
que permita el desarrollo y crecimiento de los mismos, partiendo de la estandarización del
medio de cultivo con suplementos nutricionales que aceleren y faciliten el proceso de
brotación y crecimiento, definiendo protocolos de desinfección y siembra que reduzcan la
contaminación y oxidación de los explantes y garanticen procesos asépticos y determinando
las condiciones de incubación del medio de cultivo. Por ello, se realizarán diferentes
tratamientos de desinfecciòn, de medios de cultivo y de estimulación de la brotación por
medio de choques térmicos, con el fin de definir el protocolo más eficaz y viable para la
obtención de plántulas que puedan dar paso a investigaciones posteriores y procesos de
micropropagación vegetal.
PALABRAS CLAVE: V. corymbosum, cultivo in vitro, segmentos nodales, Protocolo de
desinfección, brotación por choque térmico, citoquininas
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ABSTRACT
In recent years the demand and production of blueberries (Vaccinium corymbosum) has
increased enormously due to its multiple benefits, nutritional and antioxidant properties and
its versatility as a product, which has generated great economic interest. In order to meet the
growing demand for blueberries, in vitro cultivation has been seen as the most appropriate
approach to have high volumes of plant material, in addition in vitro cultivation techniques
offer the possibility of developing plantations with high genetic quality as phytosanitary,
through the evaluation of disinfection protocols and establishment. According to the above,
the objective of this work is to propose a protocol for the establishment in vitro of nodal
segments of Vaccinium corymbosum that allows the development and growth of the same,
starting from the standardization of the culture medium with nutritional supplements that
accelerate and facilitate the process of sprouting and growth, defining protocols of
disinfection and sowing that reduce the contamination and oxidation of the explants and
guarantee aseptic processes and determining the conditions of incubation of the culture
medium. Therefore, different treatments of disinfection, culture media and stimulation of
sprouting by means of thermal shocks will be carried out, in order to define the most effective
and viable protocol for obtaining seedlings that can give way to later investigations and
vegetable micropropagation processes.
Key words: V. corymbosum, in vitro culture, nodal segments, disinfection protocol, thermal
shock sprouting, cytokinins.
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INTRODUCCIÓN
La producción de arándano ha experimentado un considerable crecimiento en las últimas
décadas debido a las múltiples propiedades y beneficios que aporta a la salud, siendo valiosas
por sus frutos comestibles y por ser una excelente fuente de nutrientes, además contienen
fibras dietéticas, antioxidantes (vitamina C, betacaroteno, ácido fólico, antocianinas), y
agentes antifúngicos, como antocianósidos y ácido benzoico. ( Ostrolucka et al., 2007).
Es así como ha surgido la necesidad de incrementar la producción y expandirla a mayor
cantidad de regiones, por lo tanto, se piensa en el cultivo in vitro de tejidos vegetales, como
un medio para este fin; el cual a pesar de sus diferentes retos, como el control de la oxidación
y contaminación, ofrece una herramienta que permite ahorrar tiempo y dinero, así como el uso
de materiales de fácil acceso. Además, gracias a los avances en biotecnología vegetal es
posible acelerar el proceso de crecimiento y desarrollo, dependiendo del tipo de explante que
se utilice, todo en espacios reducidos. Estas ventajas están dadas por el control de los factores
que favorecen estos procesos, característicos de Vaccinum corymbosum cv Biloxi, dentro de
los que se destacan: la concentración de nutrientes, concentración de hormonas, intensidad
lumínica, horas de luz, temperatura, pH, humedad relativa, suministro de oxígeno, entre otros.
(Pedroza-Manrique, 2008)
Teniendo en cuenta esto y al analizar anteriores trabajos sobre arándano se ha evidenciado
que presenta buen desarrollo. Por lo tanto, el establecimiento de un cultivo in vitro permitiría
aumentar rápidamente el número de plantas existentes, garantizando la disponibilidad de
material para respaldar las demandas de la agricultura.
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En este sentido, esta investigación busca plantear un protocolo de establecimiento in vitro de
arándano, variedad Biloxi, a partir de de segmentos nodales provenientes de plantas maduras,
los cuales se sembraran bajo diferentes tratamientos de desinfección, medio de cultivo y
condiciones de incubación; todo esto con el fin de determinar qué protocolo de desinfección
es efectivo para la descontaminaciòn de los explantes, bajo qué medio de cultivo llevar la
propagación, con qué suplementos nutricionales y en qué condiciones de incubación se
generan plántulas que puedan dar paso a procesos de micropropagación.
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PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
El arándano (Vaccinium corymbosum) es una baya originaria de América del Norte, donde
crece en forma silvestre como arbusto perenne. Pertenece a la familia de la Ericáceas y
presenta altas perspectivas de crecimiento en el mercado internacional, debido a sus
características nutricionales que la han convertido en un producto muy apetecido. (Romero,
2016)
De acuerdo con lo anterior la producción y mercado del arándano es altamente competitiva
porque se concentra principalmente en las regiones frías del Hemisferio Norte y se enfoca en
lograr abastecer durante todo el año la demanda mundial. (Romero, 2016)
En el 2014 se reportó un volumen de producción de 585 mil toneladas. Este número ha ido en
aumento en los últimos años tras la diversificación de países productores y exportadores entre
los cuales figuran Estados Unidos y Canadá con el 40% de la producción, luego Chile con
23%, Polonia, Países Bajos y España 17%, Argentina 4% y Perú 3%. (Romero, 2016)
Con estos datos se demuestra la necesidad de que más países incursionen en este mercado y
expandan la producción. Teniendo en cuenta esto, Colombia ha buscado en la última década,
introducir diferentes variedades de interes economico con el fin de aumentar la producción a
nivel nacional y satisfacer oportunamente la demanda. Aunque estas acciones han mostrado
resultados, se requiere plantear e implementar métodos de producción masiva fáciles de
manejar, aplicables en el contexto colombiano, rentables y que garanticen frutos de alta
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calidad.
Teniendo en cuenta lo anterior, se recomienda el cultivo in vitro como el enfoque más
apropiado para disponer de altos volúmenes de material de siembra (Litwinczuk, 2013) y bajo
excelentes condiciones fitosanitarias y de calidad. Está tecnica puede ser muy efectiva una
vez se han determinado protocolos que garanticen la viabilidad de las plantas propagadas,
dado que según varios autores la habilidad de regeneración in vitro de esta especie es
altamente dependiente del genotipo de la variedad que se emplea (Jiménez & Abdelnour,
2018).
Por lo tanto es necesario estandarizar protocolos para el establecimiento, multiplicación y
enraizamiento de explantes producidos in vitro, con el fin de generar así una metodología de
propagación masiva.
De acuerdo con con todo lo anterior surge la pregunta de investigación: ¿Cúal es el protocolo
más adecuado para el establecimiento in vitro de segmentos nodales de Vaccinium
corymbosum?
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OBJETIVOS
GENERAL
● Proponer un protocolo de establecimiento in vitro a partir de segmentos nodales de
Arándano (Vaccinium corymbosum) cv. Biloxi, que permita el desarrollo de estos.
ESPECÍFICOS
● Establecer un protocolo de establecimiento in vitro que de cuenta del proceso
de desinfección, estandarización de medio de cultivo con los respectivos
suplementos nutricionales y la definición de condiciones horas luz/oscuridad y
temperatura para la incubación de los explantes
● Comparar el efecto de dos reguladores de crecimiento que propicien el
desarrollo de los explantes y permita la obtención de plántulas in vitro
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JUSTIFICACIÓN
El arándano en los últimos años ha aumentado su consumo por su múltiples cualidades, como
alta capacidad antioxidante, diurética y antibacteriana (García & García, 2013). Por lo tanto
esta fruta debe ser completada dentro de la seguridad alimentaria, la cual plantea que los
estados deben garantizar que toda su población, especialmente la siguiente generación, tenga
en todo momento, acceso físico y económico a suficientes alimentos, de buena calidad y
nutritivos para satisfacer sus necesidades alimenticias, sus preferencias y así llevar una vida
sana. (FAO, 2006).
Según un estudio realizado en la Universidad de ciencias ambientales y aplicadas, alrededor
de todo el mundo el arándano se ha posicionado como una de las frutas más
apetecidas en el mercado nacional e internacional, es aquí en dónde radica la importancia de
mantener una producción constante en el transcurso del año para incentivar su cultivo.
(Bustillo, 2018)
Teniendo en cuenta el éxito que ha demostrado su implementación en varios países
latinoamericanos, Colombia ha traído plantas de Estados Unidos y Chile, con el fin de
cultivarlas, es así como inicia en Colombia el cultivo de arándano y se genera la necesidad de
implementar cultivos con bajos requerimientos de horas/frío, para lograr adaptarlo y dar lugar
a buenas posibilidades de producción.
Los mayores índices de plantaciones comerciales en el país están en los departamentos de
Cundinamarca y Boyacá, y se están haciendo algunas pruebas en Antioquia, con el fin de
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aumentar el número de hectáreas sembradas, el cual se estima actualmente en 50 hectáreas
aproximadamente.
Está necesidad ha despertado el interés de establecer cada vez más plantaciones, sin embargo,
la propagación vegetativa utilizada tradicionalmente en arándano no es una opción para la
producción masiva de material de siembra, porque se requeriría una gran cantidad de plantas
madre, debido a la pobre habilidad de enraizamiento de las estacas (Ostroluka et al., 2007).
En ese sentido, el cultivo de células y tejidos vegetales, ofrece múltiples oportunidades
agrícolas debido a que aprovecha las propiedades totipotentes de las plantas, permitiendo
regenerar una nueva planta completa a partir del desarrollo de células, tejidos u órganos
vegetales, sin importar su función o posición; bajo condiciones asépticas, controladas y libres
de microorganismos, al implementar diferentes metodologías y técnicas con este fin (Street
1977) (Calva y Ríos 1999), convirtiéndose de esta manera en una herramienta esencial para la
producción masiva de material de siembra.
Además, este método ofrece diversas ventajas entre las que cabe mencionar el uso de
pequeñas cantidades de material vegetal inicial para generar grandes lotes de plantas,
producción durante todo el año, plantas con alta calidad fitosanitaria, uso de menores espacios
físicos y la oportunidad de llevar a cabo mejoramiento genético. (Castro Fernández, 2016).
Por ende, mediante este trabajo se busca estandarizar un medio de cultivo con suplementos
nutricionales y hormonales que permita el desarrollo de los explantes, y determinar
condiciones de incubación que aceleren y faciliten el proceso de brotación y crecimiento de
16
segmentos nodales de Vaccinium corymbosum variedad Biloxi, garantizando de esta manera
la obtención de material para posteriores etapas de micropropagación.
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1. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
1.1 Antecedentes del Cultivo in vitro en Vaccinium corymbosum
El cultivo in vitro de arándano ha cobrado gran fuerza en los últimos años puesto que presenta
mayores rendimientos y ventajas respecto a la producción tradicional, esto ha impulsado la
realización de investigaciones y proyectos que tienen como fin estandarizar y optimizar la
propagación in vitro de diferentes especies y variedades del género Vaccinium, por lo cual
existe amplia bibliografía y referencias sobre el cultivo in vitro de arándano.
En este orden de ideas, Marcotrigiano y McGlew (1991) diseñaron un sistema de
micropropagación, evaluando la influencia de la formulación de sales de los medios Woody
Plant Medium (WPM), Anderson, Gamborg (B-5) y Murashige & Skoog (MS) en los brotes
de arándano, todos estos suplementados con 2iP, IBA y GA 3 a diferentes concentraciones. Su
investigación tuvo como resultado que los mejores medios para la propagación de arándano
son WPM y Anderson porque el primero presenta mayor número de brotes por explante y el
segundo plántulas de tamaño uniforme y más verdes mientras que el medio MS presentó
explantes cortos con hojas cloróticas y nodos comprimidos. En cuanto a las hormonas
vegetales concluyeron que el uso de 2IP a bajas concentraciones permite la propagación de
germoplasma elite.
De forma similar Ružić, et al (2012) desarrollaron pruebas comparativas con los medios de
cultivo Murashige y Skoog (MS) y Anderson modificado (mAN) para la multiplicación de
brotes in vitro de tres variedades de Vaccinium corymbosum. Todos los medios contenían
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zeatina sola o combinada con AIB. A partir de estos ensayos encontraron que el medio AN es
más adecuado para la multiplicación in vitro de arándano, pues el medio MS inducia necrosis
en tallos y hojas y presentaba proliferación lenta; además AIB en bajas concentraciones junto
con zeatina en medio AN permitía la multiplicación eficazmente.
Además, Cappelletti, Sabbadini & Mezzetti (2016) en su investigación encontraron que el
cultivo in vitro del género Vaccinium depende de la disponibilidad de protocolos eficaces y
específicos para el genotipo y de la correcta combinación de hormonas (auxina y citoquinina),
por lo cual realizaron ensayos de proliferación de brotes comparando los efectos de
2-isopenteniladenina (2iP) y TDZ, y experimentos de organogénesis directa e indirecta
utilizando TDZ como alternativa a la zeatina.
Así mismo, Castro-Fernández (2016) en su estudio optimizo el cultivo in vitro de la variedad
Brigitta y evaluó la actividad antioxidante. Al comparar la diferencia entre el medio WPM y
el medio M&S a 1/3, ambos con 2ip, estudiar la respuesta al reducir la concentración de 2ip y
evaluar la influencia de AIB y Zea al añadirse en el medio de cultivo, concluyó que el medio
de cultivo más adecuado para la producción es el WPM, al permitir el desarrollo de plantas
más vigorosas comparado con M&S 1/3 que presentó menor lignificación y hojas más
pequeñas. En cuanto a los reguladores de crecimiento se encontró que 2ip produce mayor
longitud de los brotes y cantidad de hojas, en concentraciones elevadas hay etiolación y en
concentraciones bajas hay menor número de brotes pero de mayor tamaño y vigor con hojas
grandes. Por último la adición de Zea junto a 2ip provocó un aumento en el número de brotes,
pero la mayoría de ellos mostraron hojas muy pequeñas y tallos finos.
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También Jiménez-Bonilla y Abdelnour-Esquivel, (2018) llevan a cabo la micropropagación
de arándano nativo de Costa Rica (Vaccinium consanguineum), al establecer un protocolo de
desinfección y la eficacia de tres reguladores del crecimiento en WPM al 50%. Fue así como
determinaron que la desinfección más eficiente fue mediante la combinación de jabón
enzimático e hipoclorito de sodio. Además observaron que la mejor forma para estimular la
brotación y multiplicación es someter los explantes a un choque térmico de 5ºC por 15 días,
en conjunto con citoquininas, las cuales son efectivas en determinadas concentraciones.
Finalmente Fan et al., (2017) cultivaron brotes axilares en tres medios: MS, WPM y
Anderson y obtuvieron que el número medio de brotes producidos por explante a partir del
medio de Anderson fue mayor en comparación por lo tanto tomaron este medio y evaluaron la
influencia del pH del medio para concluir que un rango de pH de 4.5 a 5.5 no tenía efectos
significativo en la inducción de brotes, sin embargo, el número medio de brotes en medio con
un pH de 6 si disminuyo. Finalmente valoraron la influencia en la inducción de los brotes al
suplementar el medio con citoquininas y auxinas encontrando que las mejores son Zeatina y
ANA.
1.2 Generalidades del cultivo in vitro
La producción de alimentos en cantidad y calidad suficiente para la creciente población
mundial es un importante reto para este siglo. Para responder esta demanda de productos
agrícolas, el cultivo in vitro representa una alternativa a los métodos tradicionales, al permitir
aumentar a gran escala la productividad, eficiencia y la calidad de los productos, obteniendo
de esta forma grandes rendimientos (Amaro, 2018)
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El cultivo in vitro aprovecha la propiedad totipotente de las plantas, dicha propiedad permite
que cualquier célula vegetal, sin importar su función o posición, pueda mediante división
celular, iniciar el desarrollo de nuevas células y originar diferentes tipos de células, hasta
generar un órgano y una nueva planta completa. Todo este proceso se denomina
diferenciación celular (Calva & Pérez, 2005).
Por lo tanto, el cultivo vegetal in vitro, supone cultivar células vegetales, seleccionando y
controlando artificialmente, las diferentes condiciones que propicien el desarrollo celular y la
producción masiva de plantas (Calva & Pérez, 2005). Es así como está herramienta o método
de cultivo, se basa en dos principios: la asepsia y el control de los factores fisicoquímicos que
influyen en el crecimiento y desarrollo de las plantas, los cuales pueden ser reproducidos en
condiciones de laboratorio (Castillo, 2004).
Dentro del cultivo in vitro existen diferentes tipos de técnicas, entre las más empleadas por la
industria se encuentran: la micropropagación, los cultivos de células en suspensión, la
obtención de plantas libres de patógenos, el mejoramiento genético vegetal, la obtención de
metabólicos vegetales secundarios y la conservación de germoplasma (Pedroza-Manrique,
2008). Todas estas aplicaciones tienen un enfoque específico, por lo cual es necesario
conocerlos muy bien y elegir una determinada técnica o sistema de cultivo, que sea acorde
con el objetivo que se busque alcanzar, porque de esto depende el tipo de células, tejidos u
órganos vegetales que se van utilizar, su inoculación y el resultado final. (Mroginski & Roca,
1991).
21
1.2.1 Micropropagación
De acuerdo con Pedroza-Manrique (2008), la micropropagación o propagación masiva de
material vegetal, tiene como finalidad multiplicar plantas vegetativamente de forma asexual.
Por esta razón, ha jugado un papel muy importante en el desarrollo de la agricultura en los
últimos años, considerando que ha permitido obtener plantas de interés comercial, mediante
diferentes técnicas y procesos de clonación, que tras las diferentes fases de micropropagación
y la interacción de los factores involucrados, generan grandes lotes de plantas mediante la
multiplicación ilimitada, en corto tiempo y a costos más bajos, frente a los medios
tradicionales de cultivo.
El procedimiento en general consiste en seleccionar un material madre, el cual puede ser un
fragmento de tejido u órgano vegetal, llamado explante, para ser inoculado en un medio de
cultivo gelificado y bajo condiciones artificiales controladas, que permitan y favorezcan la
proliferación de brotes y la inducción de morfogénesis, es decir, el desarrollo del explante
hacia la formación de callo o hacia la diferenciación en un tejido organizado que producirá
órganos o embriones. (Calva & Pérez, 2005). A este proceso, le sigue la ramificación y
desarrollo de vástagos, que serán multiplicados, luego enraizados y preparados para su
aclimatación (Pedroza-Manrique,2008).
En pocas palabras la micropropagación comprende cuatro grandes etapas: El establecimiento
del cultivo, el desarrollo y multiplicación de los explantes, el enraizamiento de las plántulas y
la adaptación a condiciones ex vitro. (Olmos, Luciani & Galdeano, 2010).
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Teniendo en cuenta todo lo anterior, antes de desarrollar la propagación, es necesario conocer
los factores que pueden afectar el desarrollo de la especie a trabajar, como son: el estado
fisiológico de la planta, el tipo de explante a inocular, las condiciones medioambientales, los
requerimientos nutricionales, el balance hormonal requerido, el tipo de medio de cultivo, el
número de subcultivos y el modo de aclimatación de las plántulas propagadas.
(Pedroza-Manrique,2008)
1.2.1.1. Establecimiento del cultivo in vitro
Es la etapa inicial de la micropropagación in vitro y tiene como finalidad establecer cultivos
de explantes viables y bajo total asepsia (Olmos et al, 2010), por lo cual es fundamental
estandarizar metodologías que garanticen la desinfección y esterilidad del tejido vegetal, los
equipos, materiales a emplear y áreas en las cuales se va llevar a cabo el proceso de cultivo y
así evitar la contaminación con microorganismos, pues éstos pueden destruir los explantes,
retrasar su desarrollo al competir con ellos o generar modificaciones en el medio que afectan
negativamente la sobrevivencia y desarrollo del material vegetal. (Cuevas & Salaverría,
2004).
La selección del material madre o del explante es por lo tanto, el primer paso para el
establecimiento. Esta decisión estará orientada a lograr el objetivo propuesto y deberá ser
acorde con la especie a trabajar, teniendo en cuenta que existe una variabilidad en las
respuestas in vitro según el genotipo de la planta (Mroginski & Roca, 1991). En consecuencia,
el éxito de la etapa dependerá en gran medida del tipo de explante y su capacidad de
regeneración. Debido a esto se recomienda usar tejidos meristemáticos jóvenes provenientes
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de yemas axilares o adventicias, embriones o semillas; aunque es importante mencionar que,
el uso de yemas adventicias puede generar una mayor tasa de variación somaclonal frente a
los otros tejidos mencionados (Olmos et al, 2010).
Adicionalmente el sistema de cultivo a utilizar también tendrá una alta incidencia en el
establecimiento puesto que determinará el medio de cultivo y las condiciones ambientales de
incubación, y la interacción de estos, a su vez determinará la respuesta in vitro de los
explantes (Mroginski & Roca, 1991).
1.2.1.2 Multiplicación
La multiplicación in vitro tiene como finalidad aumentar el número de propágulos o de
plántulas ya establecidos in vitro, por lo cual es la etapa más importante para el proceso de
propagación y la que va a definir la calidad genética del cultivo. (Pedroza-Manrique,2008)
Está etapa se lleva a cabo mediante subcultivos que presentan un adecuado balance hormonal,
permitiendo hacer multiplicación ilimitada de los explantes hasta generar la cantidad de
plantas esperadas (Amaro, 2018)
Existen diferentes vías de propagación que permiten realizar la multiplicación, entre las
cuales están la multiplicación de brotes de yemas terminales, axilares o laterales, que
generalmente toma como material inicial meristemas; la organogénesis directa, en la cual se
forma un brote del explante; la organogénesis indirecta, donde el brote se obtiene a partir de
un callo que se formó a partir del explante; la embriogénesis somática, que consiste en la
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formación de embriones a partir del explante o de un callo; los órganos de perennidad, que
permiten realizar propagación vegetativa; el microinjerto, que busca clonar plantas libres de
patógenos y el cultivo de embriones y esporas, que busca generalmente establecer bancos de
germoplasma y cultivar semillas que bajo condiciones naturales muy difícilmente se
desarrollarían (Pedroza-Manrique,2008) ( Krikorian, 1991).
1.2.1.3 Enraizamiento
Las plántulas obtenidas in vitro necesitan pasar por el proceso de desarrollo radicular, es así
como se destina esta etapa para la diferenciación del sistema radial, aunque en ciertas
ocasiones puede darse en paralelo a la etapa de multiplicación (Amaro, 2018). El
enraizamiento va a jugar un papel importante al permitir que la plántula empiece a hacer
absorción de nutrientes y esto a su vez, facilitará y permitirá el trasplante y adaptación de la
plántulas a condiciones ex vitro.
En este momento de la micropropagación, se recomienda disminuir la concentración de sales
o generar cambios en la composición nutricional del medio y cambiar el balance hormonal,
preferiblemente en un aumento de auxinas y la disminución o hasta completa eliminación de
citoquininas exógenas, aunque esto dependerá de la especie y variedad que se esté cultivando
(Pedroza-Manrique,2008) (Villalobos & Thorpe, 1991).
25
1.2.1.4 Adaptación
Es la etapa final de la micropropagación y tiene como objetivo la adaptación de las plántulas
al medio ambiente natural, por lo cual cuanta con tres momentos: la aclimatación, el periodo
de invernadero y trasplante en campo (Pedroza-Manrique,2008).
En el acondicionamiento las vitroplantas se acostumbran durante un corto periodo de tiempo y
en un ambiente controlado, al cambio de humedad e intensidad lumínica, el cual se debe ir
dando gradualmente (Amaro, 2018)., además las plántulas son sacadas del medio de cultivo y
colocadas en sustratos estériles que fortalezcan el sistema radicular
Luego son llevadas a condiciones de invernadero donde inicialmente se simulan las
condiciones in vitro y siempre cuidando que las plantas no se vayan a sobrecalentar y desecar,
este proceso va hasta el completo desarrollo de estomas y cutícula.(Pedroza-Manrique,2008)
Finalmente las plantas son transplantadas a campo. La metodología de este proceso,
dependerá de la especie y variedad trabajadas
1.3 Condiciones ambientales in vitro para la incubación
Al diseñar protocolos de micropropagación, es primordial tener en cuenta y no dejar de lado
los factores ambientales en los que se encontrara el cultivo, en razón de que en el cultivo in
vitro las plantas se están exponiendo a condiciones muy diferentes de las naturales, como son
26
los ambientes herméticos con baja disponibilidad de luz y alta humedad relativa y en medios
gelificados que funcionan bajo el principio de la nutrición heterótrofa. (Cañal et al, 2001).
Algunas de las condiciones a tener en cuenta durante el desarrollo del cultivo in vitro son: 1)
el tipo de recipiente donde se inoculan los explantes, porque condiciona la composición
gaseosa y el intercambio de gases en el interior del cultivo, lo cual puede repercutir en la
diferenciación celular (Righetti et al., 1990), 2) Las fuentes de hidratos de carbono, 3) la
composición y la concentración mineral de los medios de cultivo, 4) El pH, va a determinar la
asimilación de los nutrientes, por lo tanto el ideal se encontraría en un rango de 5 y 6.5 (Ginés
& Mariscal Sancho, 2002) (Segretín, 2003) 5) La consistencia del medio de cultivo, 6) la
disponibilidad de agua y nutrientes 7) las condiciones de la cámara de crecimiento, dentro de
las que se encuentran la temperatura, la intensidad y duración de la luz, que son vitales para la
iniciación y estimulación del desarrollo celular, 8) El balance de fitorreguladores de
crecimiento que puede inhibir o facilitar los procesos fisiológicos de la planta. (Cañal et al,
2001) (Pedroza-Manrique,2008) (Hughes, 1981)
Estas condiciones se integran y tienen una gran influencia en las respuestas fisiológicas que
las vitroplantas van a mostrar durante su cultivo y pueden llegar a afectar el crecimiento y
desarrollo de estas durante el proceso, por lo cual es menester determinar y evaluar la
incidencia de estas sobre la especie a trabajar
27
1.4 Medios de cultivo Vegetal
Para lograr exitosamente la propagación in vitro de una especie vegetal, es menester
determinar los recursos a utilizar para llevar a cabo el cultivo in vitro. En consecuencia se
han diseñado medios de cultivo en los cuales se encuentran los elementos necesarios para
favorecer el crecimiento y desarrollo de los explantes (Llorente, 2002) (Amaro, 2018)
(Gamborg & Phillips, 2013).
Un medio de cultivo consiste en un caldo nutritivo compuesto principalmente por sales
inorgánicas, una fuente de carbono, vitaminas, aminoácidos y otros compuestos adicionales
como agentes antioxidantes, ácidos orgánicos, compuestos nitrogenados y extractos vegetales.
Todos estos, junto con los reguladores de crecimiento o fitohormonas, suplen los
requerimientos nutricionales y garantizan el desarrollo del explante. Adicionalmente, los
medios de cultivo pueden tener una consistencia sólida, semisólida y liquida, la cual
dependerá del uso de un agente gelificante (Osuna & Saucedo, 2011) (Gamborg & Phillips,
2013) (Mroginski & Roca, 1991).
El tipo y cantidad de sales minerales empleadas en el medio de cultivo, son elegidas de
acuerdo con los requerimientos específicos de cada especie y a su vez estas diferencias de
composición van a definir las diferentes formulaciones. Sin embargo se han establecido los
compuestos básicos que deben formar las soluciones minerales, los cuales, se ha comparado
están involucrados en los procesos fisiológicos del metabolismo, del crecimiento y de la
reproducción celular. Estas sales se han dividido en dos grandes grupos de macronutrientes
28
(N, P, K, S. Ca y Mg) y micronutrientes (Fe, B, Mn, Zn, Cu, Mo, y Co) (Roca & Mroginski,
1991) (Llorente, (2002) (Krikorian, 1991)
Respecto a las sales inorgánicas es fundamental conocer los requerimientos específicos de
nitrógeno, pues este elemento incide en el crecimiento vegetal y la producción de metabolitos,
en consecuencia la concentración de nitratos y amonios, va a afectar proporcionalmente el
costo energético necesario para su asimilación, por lo tanto, es recomendable usar
concentraciones reducidas con algunas determinadas plantas (Krikorian, 1991) (Ertola,
Giulietti & Castillo, 1995).
Debido a que las plantas in vitro no realizan nutrición autótrofa, deben añadirse azúcares o
fuentes de carbono al medio, para suplir la energía e incrementar el potencial osmótico, que
posibilitan el crecimiento, desarrollo y diferenciación celular. Generalmente los azúcares
utilizados son la sacarosa, glucosa y en algunos casos la fructosa, pero el más recomendado
por su fácil y natural asimilación es la sacarosa en proporción de 2 al 4 % (p/v) (Llorente,
2002) (Segretín, 2003) (Mroginski & Roca, 1991) (Gamborg & Phillips, 2013)
Normalmente la mayoría de medios de cultivos contienen vitaminas B1, B2, B6, vitamina H,
vitamina E, ácido fólico, ácido nicotínico, entre otras, pero todas estas, la vitamina B1 o
tiamina es la más importante, al estar involucrada en la diferenciación celular (Gamborg,
Miller & Ojima, 1968) (Segretín, 2003)
También los medios de cultivo pueden estar compuestos por agentes gelificantes, que le van a
dar consistencia. Estos deben no obstaculizar la absorción y asimilación de los nutrientes por
29
parte del explante, tener una naturaleza pura y una concentración adecuada, para que no se
vea afectado el cultivo, por lo tanto el gelificante más recomendado y usado es el Agar en una
proporción del 0,6 al 1 % por litro de medio (Mroginski & Roca, 1991). (Veitía et al., 2012).
1.4.1 Reguladores de crecimiento
El funcionamiento de los organismos pluricelulares demanda mecanismos de regulación que
permitan la coordinación de las actividades en las células, tejidos y órganos. (Segura, 2013).
Es así como las fitohormonas, hormonas vegetales o reguladores del crecimiento vegetal, son
moléculas orgánicas producidas por las células vegetales en muy bajas concentraciones
internas y en puntos específicos, con la función de regular los fenómenos fisiológicos de las
plantas y la respuesta a estímulos como la exposición y cambios de luz, temperatura y
humedad y desencadenar o inducir una expresión morfogenética (Srivastava, 2002) (Wain
1980).
Estas características generaron interés por su estudio y con el tiempo se identificaron y
comprendieron sus efectos, llegando a la conclusión de que interactúan entre ellas y pueden
accionar en conjunto o secuencialmente. Además sus respuestas pueden ser múltiples a lo
largo del tiempo y van a depender de la especie vegetal, del órgano donde se expresen, de la
etapa de desarrollo en la cual esté la planta, de las concentraciones producidas, de la acción de
otras fitohormonas y los factores ambientales. (Llorente, 2002 citando a Salisbury & Ross,
1994). (Jordán & Casaretto, 2006).
30
1.4.1.1 Tipos de reguladores de crecimiento
Las hormonas vegetales a pesar de ser pocas en comparación con las hormonas animales, se
encuentran en todas las plantas, sin importar su hábitat, forma de vida y ciclo de vida. Estos
compuestos con actividad reguladora del crecimiento de las plantas son auxinas, citoquininas,
giberelinas, ácido abscísico, etileno, brasinoesteroides, poliaminas, ácido jasmónico, el ácido
salicílico, strigolactonas, turgorinas, sistemina y fitosulfoquinas, pero las cinco primeras son
las clases principales y más importantes, mientras tanto, las demás van a accionar muy
limitadamente en muy pocos procesos y en especies específicas (Gamborg & Phillips, 2013)
(Seeta et al., 2002) (Jordán & Casaretto, 2006)
1.4.1.1.1 Auxinas
La primera persona en evidenciar su existencia, fue Darwin, al realizar ensayos con ápices de
coleoptilos de avena y observar la respuesta de crecimiento a la exposición de luz, tras
diferentes experimentos a lo largo del tiempo, finalmente Fritz Went, logró aislarla y
comprobar su acción promotora del crecimiento vegetal. Esto hace que sean uno de los
primeros grupos de hormonas vegetales en ser encontrados y descritos. (Jordán & Casaretto,
2006)
Las auxinas son fitohormonas naturales. El ácido indol acético AIA es la forma más
predominante y se encuentra principalmente en puntos donde se esté llevando a cabo división
celular y expansión celular, por lo tanto se relaciona con los procesos de elongación,
formación de raíces, inducción de floración, diferenciación vascular, tropismos e inducción
31
de dominancia apical (McSteen & Zhao,2008) (Gamborg & Phillips, 2013)(Jordán &
Casaretto, 2006)
1.4.1.1.2 Giberelinas
Las giberelinas son fitohormonas definidas por su estructura química diterpenoide y no por su
actividad biológica, debido a que existen más de 100, pero muy pocas son activas
biológicamente (Jordán & Casaretto, 2006)
Las giberelinas biológicamente activas, median un sinnúmero de procesos fisiológicos como
la germinación de semillas, el crecimiento de tallo, el desarrollo de fruto sin fecundación, la
expansión foliar, la elongación radicular, la floración y la liberación de enzimas (Aguilar,
Melgarejo, & Romero, 2007 citando a Ueguchi-Tanaka et al., 2007), mientras que las no
bioactivas se ubican en los tejidos, actuando como precursoras de las formas bioactivas o
como metabolitos desactivados. (Aguilar, Melgarejo, & Romero, 2007)
1.4.1.1.3 Citoquininas
Las citoquininas son derivados de las purinas, por lo cual se clasifican químicamente en
isoprenoides y aromáticas y según su origen en Naturales o Artificiales. Existen tres formas
principales: la kinetina, zeatina y benzilaminopurina (Aguilar, Melgarejo, & Romero, 2007
citando a Sakakibara 2006).
32
Son responsables de la división celular, la formación y crecimiento de brotes axilares, la
inducción de organogénesis y androgénesis, la germinación de semillas, la maduración de
cloroplastos, la diferenciación celular, la inhibición de la dominancia apical, el retardo de la
senescencia, la transducción de señales y se ha reportado que aumentan la demanda de
transporte de savia elaborada a nivel del floema. Se encuentran en los sistemas conductores
floema y xilema luego de su síntesis en los tejidos meristemáticos (Jordán & Casaretto,
2006)(Aguilar, Melgarejo, & Romero, 2007 citando a Klee y Estelle 1991, Sakakibara 2006).
1.4.1.1.4 Ácido Abscísico
El ácido abscísico o ABA está muy involucrado en respuestas al estrés, al permitir la
adaptación a condiciones de sequía, frío y salinidad, generando efectos en diferentes procesos
fisiológicos que pueden variar según el tejido y la fase de desarrollo vegetal, por ejemplo,
media la inducción de síntesis de proteínas, lo cual ayuda a que el embrión tenga tolerancia a
la deshidratación y acumule proteínas de almacenamiento (Aguilar et al., 2007) (Roncancio &
Pereira, 2009).
Se caracteriza por ser antagonista de auxinas, citoquininas y giberelinas, al inhibir el
crecimiento y elongación vegetal, activar la dormancia de yemas y semillas y la abscisión y
senescencia de hojas. También regula las relaciones hídricas y promueve el crecimiento
radical y el cierre de estomas, durante estrés hídrico (Aguilar et al., 2007) (Roncancio &
Pereira, 2009, citando a Li et al., 2006) (Martínez-Aguirre, 2000).
33
1.4.1.1.5 Etileno
El etileno es un compuesto hormonal gaseoso sintetizado por gran parte de las plantas. Se
caracteriza por estimular la maduración de frutos y regular procesos como la germinación de
las semillas al romper la dormancia, cambiar el ángulo de crecimiento de ramas y brotes, la
expansión celular en hojas y la expansión lateral, la senescencia de hojas y flores, la abscisión
de hojas y frutos y la floración de algunas especies. (Llorente, 2002) (Jordán & Casaretto,
2006)
1.5 Propagación de especies leñosas
La propagación hace referencia al aprovechamiento de los tipos de reproducción: el sexual y
el asexual, para reproducir genotipos o combinaciones de estos, hasta obtener poblaciones con
características seleccionadas. Hay que tener en cuenta que la reproducción sexual genera
genotipos variados y evita problemas causados por la endogamia, mientras que la asexual
permite multiplicar organismos y poblaciones seleccionadas y mantener cultivos que no
generan semillas viables, al reproducir partes vegetativas como los tallos, ramas, hojas, raíces;
que facilitan el mantenimiento de un genotipo (Escobar, Zuluaga, & Osorio, 2002).
Teniendo en cuenta lo anterior, las plantas leñosas a lo largo de la historia han sido
propagadas con métodos vegetativos, mediante el enraizamiento de estacas, el uso de injertos,
bulbos, brotes laterales entre otros. Estas técnicas han sido efectivas hasta cierto punto, puesto
que obtener plantas con un material genético de buena calidad, es bastante complejo por su
largo ciclo de vida y la alta variabilidad genética que presentan. Además en una gran cantidad
34
de especies se ha observado que la edad de la planta donante afecta la propagación vegetativa
tradicional, en consecuencia la propagación in vitro se ha convertido en una herramienta muy
eficiente y con múltiples ventajas para desarrollar protocolos de multiplicación de
especímenes y genotipos con características deseables, logrando el mejoramiento de
individuos productivos y resistentes de patógenos y la clonación de híbridos en poco tiempo
(Caso, 1992) (Olmos et al, 2010).
El método más utilizado para propagar in vitro especies leñosas es la brotación de yemas
adventicias, cultivando explantes de ápices de vástagos, yemas laterales y segmentos nodales,
obtenidos de áreas basales de la planta que tengan carácter juvenil. Además se debe tener en
cuenta que la inducción de brotación de las yemas adventicias requiere el uso de citoquininas
y generalmente se aconseja manejar medios reducidos en sales minerales y en especial de
nitrogeno.(Olmos et al, 2010)
Finalmente es necesario saber que la propagación in vitro de leñosas presenta un gran reto: el
control de la la oxidación de los explantes. Este fenómeno se da principalmente en las fases
iniciales del cultivo, debido al estrés oxidativo al cual los tejidos se ven sometidos, lo cual
desencadena la producción celular de radicales libres, fenoles generados por la polifenol
oxidasa y múltiples alteraciones fisiológicas, morfológicas y genéticas, que pueden generar
oscurecimiento de los tejidos vegetales y del medio de cultivo hasta conducir al daño y muerte
celular. (Olmos et al, 2010) (Azofeifa, 2009).
35
1.6 Vaccinium corymbosum
El arándano es una planta originaria de Norteamérica contando con tres especies de
importancia económica: arándano bajo (Vaccinium angustifolium Alton), arándano ojo de
conejo (Vaccinium ashei Reade) y arándano alto (Vaccinium corymbosum L.) (Buzeta, 1997).
Pertenece a la familia Ericácea, subfamilia Vacciniaceae, subgénero Cynacoccus (Pritts et al.,
1992).
Es un arbusto perenne, leñoso, que llega alcanzar en su madurez tres metros de altura. Posee
hojas alternas, que varían de 1 a 8 cm de largo, son de forma lanceolada u ovalada y de color
verde pálido (Buzeta, 1997). Las flores son pedunculadas, axilares o terminales y se abren
solitarias o en racimo; son de color blanco. La corola es esférica de color verde y sobresale el
estigma. La flor tiene de diez a ocho estambres que están insertados en la base de la corola
(Buzeta, 1997). El fruto es una baya esférica que va de 1.5 cm a 0.7 cm de diámetro. Su color
depende de la variedad y tiene secreciones cerosas, así mismo se presenta en diferentes
colores como azules, negros y morados. Algunos frutos contienen hasta 100 semillas al
interior del endocarpio. (Muñoz, 1988).
1.6.1 Ecofisiología
En Colombia especies de arándano son cultivadas en alturas comprendidas aproximadamente
entre los 2200 y 3400 metros sobre el nivel del mar (García, Ciordia & García, 2007). La
temperatura ideal para el cultivo del arándano es de entre 12 y 18 ℃; la precipitación debe ser
de entre 1500 – 2500 mm y con una humedad relativa de entre 80 y 90 por ciento. Este fruto
36
sufre bastante en época de heladas, al tener quemazón grave en los tallos, hasta el punto que
hay que cortarlos del todo y esperar la salida de nuevos brote. En cuanto al PH prefieren los
suelos ácidos de 4 a 5. El arándano tiene un requerimiento de horas frío de entre 650 – 850
horas bajo 7.2 ℃ ( Mora, 2010).
37
2. DISEÑO METODOLÓGICO
2.1 Tipo de investigación
Esta investigación es de tipo cuantitativo-experimental (Ferré, & Rius, 2002), la
experimentación es secuencial y el diseño completamente aleatorio. El procedimiento es
hipotético-deductivo, al iniciar con la formulación de una hipótesis derivada de la teoría, que
definió la operacionalización de las variables experimentales, bajo condiciones controladas,
generando datos medibles que podrán ser recolectados y procesados estadísticamente para su
interpretación y análisis de significancia o relación entre las variables (Monje, 2011).
2.2 Definición de la población
Se trabajaron 60 unidades experimentales, entendidas como los frascos con medio de cultivo
Anderson, cada uno de los cuales contenía 2 segmentos nodales. De las 60 unidades
experimentales se destinaron 30 unidades para cada tratamiento y se llevaron a cabo 3
repeticiones para cada uno.
2.3 Definición de las variables
En está investigación se evaluaron tres variables dependientes, las cuales son las variables
respuesta y están determinadas o son causadas por el efecto de la variable independiente
(Villasís-Keever & Miranda-Novales, 2016).
38
Teniendo en cuenta esto, las variables dependientes corresponden a longitud del tallo, el
número de hojas y el número de nudos, y los tratamientos aplicados son la variable
independiente, la cual el investigador puede manipular y de las que se evaluará su efecto
durante el experimento (Villasís-Keever & Miranda-Novales, 2016).
2.4. Análisis estadístico:
Para el procesamiento de datos y análisis estadístico de estos, se utilizó un ANOVA (Análisis
de la varianza) y una prueba de Tukey con un nivel de significancia del 5%.
2.4.1 Análisis estadístico: ANOVA y prueba de Tukey
El modelo estadístico ANOVA compara varios grupos o poblaciones de una variable
dependiente con el fin de contrastar la igualdad de sus medias y la variabilidad de dichas
medias con la variabilidad de los elementos dentro del grupo poblacional (Falco, 2009). Los
conjuntos o grupos comparados deben ser obtenidos de forma aleatoria y ser afectados por
una variable independiente o un tratamiento específico, que puede influir en el valor que tome
la variable dependiente.
Para realizar el análisis de la varianza es necesario fijar un nivel de significancia que tiene
como objetivo rechazar o aceptar la hipótesis nula, es decir, permite determinar si existen o no
diferencias significativas entre los grupos comparados (Such et al, 2013). Este análisis
permitió comparar y evaluar las existencia de diferencias significativas entre los tratamientos
planteados para la obtención de plántulas in vitro de arándano Vaccinium corymbosum L.
39
La prueba de Tukey, es una prueba de comparación múltiple posterior al ANOVA, también
conocida como una prueba post hoc, la cual utiliza la diferencia crítica del número de
comparaciones para realizar todas las comparaciones entre las medias (Fallas, 2012). Esta
prueba permitió comparar las medias de las respuestas para cada tratamiento para determinar
si podían ser agrupadas en grupos homogéneos.
2.5 Fases de trabajo
La investigación constó de tres fases: Fase I: Selección del Material Vegetal, Fase II: Fase de
laboratorio y Fase III: Comparación y análisis Estadísticos.
2.5.1 Fase I: Selección del Material Vegetal
La consecución del material vegetal, se logró mediante una asociación con el Sr. Camilo
Lozano propietario de la finca productora de arándano azul variedad biloxi, “Los eucaliptos”
(Figura 1), la cual se encuentra ubicada en el kilómetro 7.5 de la vía Cajicá-Zipaquirá, el cual
suministró el material vegetal en su totalidad.
Allí se seleccionaron los explantes de plantas maduras, al tomar porciones de tallos jóvenes
con presencia de varios nudos desarrollados, que se hallaran presentes en las zonas basales de
la planta (Figura 2). Estos tallos fueron transportados, en una solución de ácido ascórbico al 1
% masa sobre volumen (m/v) para evitar la oxidación de los tallos, al laboratorio de
Biotecnología Vegetal de la Universidad Distrital Francisco José de Caldas, sede Macarena A,
40
donde se realizó el proceso de desinfección de los tallos antes de proceder a la obtención de
los segmentos nodales para su siembra y cultivo in vitro.
Figura 1: Finca “Los Eucaliptos”. Se muestra: A. Finca los eucaliptos ubicada kilómetro
7.5 de la vía Cajicá-Zipaquirá. B. Invernadero con camas de cultivo de arándano
41
Figura 2: Plantas Madre: Se observan las plantas madres de las cuales se extrajeron los
tallos jóvenes de las regiones basales
2.5.2 Fase II: Fase de laboratorio
Con el fin de estandarizar el protocolo de establecimiento in vitro se llevaron a cabo
diferentes ensayos, los cuales tuvieron como finalidad determinar todas las metodologías
adecuadas que permitirán la obtención de plántulas viables.
Estos ensayos corresponden a los procesos iniciales dentro del establecimiento in vitro:
selección del método de desinfección, selección del medio de cultivo con suplementos
nutricionales necesarios y definición de las condiciones de incubación de los explantes
respectivamente.
42
Finalmente para la obtención inicial de vitroplantas se evaluó la acción hormonal de las
citoquininas en el establecimiento y desarrollo de los segmentos nodales, mediante la
comparación de dos reguladores de crecimiento de tipo citoquinina en Medio Anderson
(Anderson, 1975), sembrando 30 unidades experimentales cada una con dos segmentos
nodales de Vaccinium corymbosum L, se realizaron tres repeticiones, para un total de 360
segmentos nodales. No se tuvo en cuenta un tratamiento control debido a que en pruebas y
ensayos experimentales realizados con anterioridad, las explantes no presentaron un
desarrollo óptimo sin presencia de reguladores de reguladores de crecimiento.
Una vez se completaron 5 semanas posteriores al proceso de choque térmico de los explantes,
se observó el desarrollo de estos, evaluando la longitud del tallo, el número de nudos y el
número de hojas.
Tratamiento Medio Citoquinina
1 Medio Anderson + 2 ml/L de L-cisteína Zeatina 2 mg/L
2 Medio Anderson + 2 ml/L de L-cisteína 2-IP 0,5 mg/L
TABLA 1: Relación de tratamientos de reguladores de crecimiento de tipo citoquinina:
Se muestran los tratamientos de reguladores de crecimiento de tipo citoquinina, aplicados para
las unidades experimentales, mostrando la concentración de citoquininas empleadas en
miligramos por litro (mg/L.)
2.5.3 Fase III: Comparación y Análisis Estadísticos
43
Se evaluó la efectividad de cada tratamiento, de acuerdo con el análisis estadístico ANOVA y
la prueba de Tukey, los cuales analizaron cada uno de los datos respuesta obtenidos de las
variables dependientes con respecto al tratamiento y las repeticiones realizadas, evaluando la
longitud del tallo, el número de nudos y el número de hojas tras 5 semanas de cultivo luego
del choque térmico, para conocer el rendimiento de cada tratamiento mediante las diferencias
significativas entre ellos y determinar cuál es el efecto de los tratamientos evaluados en el
desarrollo y crecimiento de la planta, con respecto a las variables dependientes trabajadas.
Este análisis se realizó en el programa estadístico Statistix 8.0
44
3. DISCUSIÓN DE RESULTADOS
3.1 Fase de campo
En cuanto a la colecta de material vegetal se estableció que la obtención de los segmentos
nodales se realizaria a partir plantas adultas de los cultivares de la finca “Los Eucaliptos”, las
cuales correspondieron a el cultivar biloxi (V. corymbosum L.). De estas se tomaron tallos
jóvenes y poco lignificados, tal como recomienda Bonilla & Esquivel (2013), con el fin de
facilitar el corte y evitar daño mecánico al explante. El corte se realizó de forma diagonal al
tallo, siempre en la región basal y con tijeras de poda que únicamente se emplearon con este
fin y que fueron desinfectadas con antelación a cada corte con alcohol al 76% e hipoclorito de
sodio al 2%. Las medidas de los tallos obtenidos oscilaron entre 25 a 30 cm de longitud.
Una vez colectado el material vegetal con los parámetros establecidos anteriormente, se
empleó una solución con ácido ascórbico al 1% (m/v) en el cual se llevó a cabo la suspensiòn
total de los tallos en tubos falcon para el posterior transporte al laboratorio de biotecnología
vegetal. El ácido ascórbico evita y ralentiza la oxidación temprana de los explantes (Azofeifa,
2009). Dicho método se planteó teniendo en cuenta lo establecido por Zúñiga (2012), quien
propuso que las alternativas como el humedecimiento o atomización generan un estado de
oxidación temprana en la mayoría de los explantes, por lo tanto, se suspendieron totalmente,
para garantizar que las yemas tanto axilares como apicales presentes en los segmentos de tallo
tomados, no se verían afectadas y deterioradas durante el transporte del material. Además los
explantes fueron refrigerados y almacenados antes de realizarse el proceso de desinfección y
45
obtención de los segmentos nodales para la posterior siembra, esto con el fin de conservar y
preservar los tejidos vegetales.
3.2 Fase de laboratorio
El trabajo en el laboratorio consistió en cuatro etapas específicas, en primer lugar se llevó a
cabo la etapa de selección y preparación de medios cultivo, teniendo en cuenta los
requerimientos nutricionales de la especie trabajada y los diferentes suplementos de control de
oxidación que se abordarán en la siguiente sección, dichos medios se disponían con
anterioridad a la obtención y colecta de los tallos, eran sellados con papel aluminio y
esterilizados en autoclave a 121°C y 15 libras de presión durante 20 minutos. Por último eran
almacenados en el refrigerador hasta el momento de la siembra. En segundo lugar se abordó
la etapa de descontaminación de los diferentes utensilios de laboratorio e implementos de
seguridad, como de los espacios del laboratorio de biotecnología vegetal empleados para la
siembra, mediante un proceso de limpieza, desinfección y esterilización, que tenía como fin
disminuir las fuentes de contaminación y prevenir índices de recontaminación en el cultivo.
Luego se dispuso a llevar a cabo la tercera etapa que consistió en el manejo del material
vegetal para la siembra luego de colectado en campo, esta metodología aborda la
descontaminación y eliminación de agentes y partículas presentes en los tallos y el despojo de
las hojas con el fin de dejar accesibles las yemas para el consecutivo corte de los segmentos
nodales que fueron inoculados en los medios de cultivo preparados con anterioridad. Una vez
realizada la siembra, se procedió a ejecutar la etapa de incubación de los segmentos
inoculados, dicha incubación se caracterizó por la exposición inicial de los explantes a un
choque térmico que tenía como fin estimular la brotación de las yemas presentes en los
46
segmentos nodales para luego ser incubados en condiciones de cámara de crecimiento. Esta
etapa será explicada con más detalle más adelante.
3.2.1 Selección del Medio de cultivo
Para llevar a cabo exitosamente procesos de establecimiento in vitro de tejidos vegetales, es
fundamental conocer los requerimientos minerales y nutricionales de la especie a trabajar,
para así elegir un medio de cultivo con una composición acorde a las necesidades de la planta
y que favorezca el crecimiento y desarrollo de los explantes.
Teniendo en cuenta lo anterior, se realizaron múltiples ensayos preliminares con el fin de
encontrar el medio de cultivo adecuado para el establecimiento de los segmentos nodales. Es
así, como inicialmente se probó el medio tradicional para cultivo de tejidos vegetales
Murashige & Skoog (M&S) (Murashige & Skoog, 1962), ajustado a un pH de 5,7 y sin
reguladores de crecimiento (Resultados no reportados). Considerando los resultados
observados con este medio, se evidencio que los explantes presentaron desarrollo lento,
necrosis y clorosis; lo cual concuerda con los resultados obtenidos tanto por Marcotrigiano &
McGlew (1991) y Ružić, et al (2012) quienes encontraron que el medio M&S genera brotes
cortos con hojas cloróticas, induce necrosis en tallos y hojas y presentaba proliferación lenta.
Por todo esto, se descartó el uso del medio M&S para el establecimiento de los explantes.
Posteriormente y de acuerdo con los resultados de investigaciones realizadas por otros
autores, se encontró que entre los medios más recomendados para la propagación de
arándanos se alude principalmente al medio WPM (Wolfe et al., 1983; CÜCE & SÖKMEN,
47
2015, Castro Fernández, 2016), y al medio Medio Anderson, los cuales en diversos estudios
comparativos, se ha encontrado que pueden tener una eficacia similar entre sí para el
establecimiento y cultivo in vitro de Arándano (CÜCE, & SÖKMEN, 2015; Mohamed et al.,
2018). Esto debido a que, como menciona Marcotrigiano y McGlew (1991) dichos medios de
cultivo presentan varias similitudes a nivel de composición mineral y sus concentraciones
molares son muy cercanas, teniendo proporciones de NH +4 -N : NO -3 -N y diferenciándose
porque las sales de Anderson contienen 200 μM Fe +2 en contraste con las 100 μM en WPM.
Además, ambos medios son recomendados para la propagaciòn de arándanos porque manejan
bajas concentraciones iónicas, condición que es importante en las especies del género
Vaccinium, las cuales se desarrollan en suelos con bajo pH y bajo estado nutricional (Strik &
Vance, 2015; Debnath (2009).
Sin embargo, algunos autores recomiendan el Medio Anderson para la iniciación de brotes en
Vaccinium corymbosum L, sobre el medio WPM (Gajdošová, et al., 2009; Ružić, et al., 2012;
Ostrolucká et al., 2007; Fan et al., 2017). Razón por la cual fue imprescindible hacer un
estudio comparativo previo entre los medios de cultivo mencionados para de esta manera
determinar cual pudiese ser más efectivo para la propagación.
Dicho ensayo comparativo de los medios de cultivo Woody Plant Medium (WPM) (Lloyd y
McCown, 1980) y medio Anderson (Anderson, 1975), se llevó a cabo sin reguladores de
crecimiento. Se manejo un pH de 5.0 a 5.2, debido a que el arándano es una planta acidófila y
aunque en el cultivo in vitro el pH es moderadamente ácido y oscila entre 5.7 y 5.8, para
procesos de cultivo in vitro de arándano se recomienda emplear medios de cultivo con pH con
mayor carácter ácido (Rodríguez-Beraud & Morales-Ulloa, 2015), además según estudios
48
realizados por varios autores tras comparar el efecto del pH en varios valores, se evidencio
que las plántulas presentan mejor comportamiento, mejores índices de proliferación de
brotes y regeneración, en pH 5.0 a 5.3 (Ostrolucká et al., 2004; Toro Cano, 2009). Por lo
tanto, se disminuyó el pH del medio de cultivo a un rango de 5.0 a 5.2.
A causa de que los explantes trabajados con anterioridad, evidenciaron altos niveles de
oxidación en los tejidos, también se adiciono un suplemento antioxidante de acuerdo con lo
descrito por Reyes & Byron (2001), planteándose tratamientos para cada medio de cultivo: 3
ml/L de L-cisteína + 150 mg/L de Ácido Ascórbico, 2 ml/L de L-cisteína, 200 mg/L de Ácido
Ascórbico y Testigo (Resultados no reportados). Estos tratamientos tuvieron como fin
determinar si alguno de estos antioxidantes pueden disminuir la tasa de oxidación de los
explantes, debido a que este problema es un fuerte obstáculo en el cultivo in vitro de especies
leñosas generando ennegrecimiento de los tejidos, disminuyendo la viabilidad y causando la
muerte de los explantes (Toro Cano, 2009), por lo tanto la oxidaciòn es un gran limitante del
establecimiento y en las primeras fases de desarrollo in vitro. Está condicion es reportada por
algunos autores (Jiménez-Bonilla & Abdelnour-Esquivel, 2018; Angulo et al., 2015).
Finalmente se determinó que el medio de cultivo más adecuado para la iniciación de los
explantes, fue el Medio Anderson suplementado con 2 ml/L de L-cisteína, al presentar el
mayor índice de brotación, esto podría deberse según lo planteado por Cuevas & Salaverría
(2004), a que este aminoácido pudo haber inducido el desarrollo de los explantes al ofrecer
nitrógeno orgánico, pero no se observó una actividad antioxidante por parte de la L-cisteína,
porque este no previene la oxidación sino que actúa en la rápida remoción de las quinonas.
(George & Sherrington, 1984).
49
Adicionalmente se encontró que los explantes desarrollados en medio WPM generaron callo y
a pesar de que había apertura del brote en las primeras semanas, este no se desarrolló con el
tiempo y el crecimiento del callo continuaba. Este desarrollo celular pudo haberse dado
debido a que los explantes por ser juveniles, tienen una gran plasticidad genética y altos
niveles de actividad meristemática; características que se acrecientan en condiciones in vitro
(Pedroza-Manrique, 2008). El callo obtenido se caracterizó por ser de color amarillo claro y
friable. Se realizaron múltiples subcultivos, buscando la adecuada composición nutricional y
el balance de hormonas, con el objetivo de regenerar brotes; pero los callos obtenidos
finalmente murieron por necrosis. Estas observaciones estarían de acuerdo a lo propuesto por
Debnath (2007) citando a (Zimmerman y Broome, 1980; Litwiñczuk & Szczerba, 1998;
Nickerson & Hall, 1976) quienes afirman que la formación de callos es un problema en el
cultivo in vitro de arándano, al formarse de manera no deseada en la base de los explantes y
en algunos casos impide el éxito de la producción de brotes a partir de este. También es
importante tener en cuenta que el desarrollo de callo implica tomar la vía de organogénesis
indirecta la cual presenta alto riesgo de variación somaclonal en los explantes, que puede
generar cambios no deseados y no ventajosos. (Pedroza-Manrique, 2008)
3.2.2 Protocolo de desinfección
El proceso más importante previo al establecimiento del cultivo es la formulación idónea en la
aplicación de agentes desinfectantes, así como los tiempos en los que se someten los
explantes al proceso de desinfección. En condiciones in vitro algunos microorganismos
como bacterias y hongos encuentran un ambiente óptimo para desarrollarse, por lo cual una
50
desinfección no exitosa obstaculiza el progreso de la propagación (Mikropavai-Rošana et
al., 2009; Yildiz, 2012).
Con el fin de disminuir los incidentes de contaminación es importante tratar aquellos factores
que se puedan mantener controlados, la desinfección del instrumental es fundamental para
prevenir tales procesos y consiste en someter todos los utensilios utilizados para la
propagación in vitro a un proceso de esterilización, tal como plantea Correa & Mejía (2013).
Este procedimiento consistió en efectuar un lavado de los instrumentos de laboratorio
(pinzas, cuchillas, mangos) en una solución jabonosa por 10 minutos, la cual, luego fue
retirada con abundante agua, posteriormente, junto con los demás implementos de
bioseguridad (bata, guantes, gorro, y tapabocas) se envolvieron en papel y se llevaron a la
autoclave, a 121°C y 15 libras de presión durante 20 minutos y finalmente al horno de secado,
a 70°C, durante 12 horas. Por último, antes de la siembra todo el material instrumental fue
sometido a 5 minutos de irradiación con rayos ultravioleta, dentro de la cámara de flujo
laminar. (Baracaldo & Velasco, 2018).
También, se deben tener en cuenta los contaminantes o patógenos introducidos en el área de
trabajo, así como las condiciones de asepsia del laboratorio, por ende para la desinfección de
los espacios a utilizar en el Laboratorio de Biotecnología Vegetal de UDFJC se emplearon,
sobre toda la extensión del mismo, incluyendo mesones, ventanas, cámaras de flujo laminar,
puertas, paredes, techo y suelo, limpiezas con soluciones jabonosas y desinfecciones con
aspersiones de Alcohol al 70%, NaClO al 2% y posteriormente de Benlate al 4%.
51
Y finalmente el fin de contrarrestar la contaminación de los tejidos, una vez se contó con el
material vegetal en el laboratorio, fue necesario establecer un protocolo de desinfección que
garantizará la eliminación de microorganismos y partículas que se encontraran presentes en
los explantes, mediante la selección y uso de un agente desinfectante que cumpliera su
función sin ocasionar el daño o muerte del explantes, debido a que según Azofeifa (2009),
algunos agentes químicos utilizados en la desinfección de explantes pueden ser muy
agresivos, al punto de dañar el explante o matarlo antes de llevarlo al cultivo, por lo tanto es
indispensable tener en cuenta si la tasa de necrosis que presenta el explante es alta, haciendo
inviable el agente descontaminante.
Es así cómo se compara la acción desinfectante del Hipoclorito de Sodio (NaClO) a diferentes
concentraciones 0.05%, 0.1%, 0.2% y 1.5%, dado que es el más comúnmente empleado y el
protocolo de desinfección propuesto por (Jiménez-Bonilla & Abdelnour-Esquivel, 2016)
llevado a cabo con diferentes concentraciones de Cloruro de Mercurio (HgCl2) 0.05%, 0.1%,
0.2% y 1.5%, en cada uno se evalúa las tasas de contaminación y oxidación presentadas para
determinar el rendimiento de los desinfectantes (Resultados no reportados).
La desinfección realizada con Hipoclorito de sodio no fue eficaz en su objetivo, porque en
bajas concentraciones se evidenció contaminación fúngica y bacteriana, mientras que en altas
concentraciones no se presentó contaminación pero sí alta necrosis de los explantes. Estas
observaciones confirman que existe una fuerte dificultad para establecer in vitro material
vegetal proveniente de campo (George et al., 2008).
52
Por otro lado, los resultados obtenidos con HgCl2 en cuanto al índice de contaminación,
muestraron que HgCl2 al 0,1% por 5 mnts, presentó el más bajo índice de oxidación de los
tejidos y el mayor porcentaje de desinfección, lo cual concuerda con lo reportado por
Jiménez-Bonilla & Abdelnour-Esquivel (2016), al encontrar que el uso de cloruro de mercurio
en bajas concentraciones y períodos cortos de contacto con el material usado, fue más
efectivo, tanto para la disminución de las miniestacas oxidadas, como para la contaminación,
Ibarra et al (2019), quienes al emplear Cloruro de Mercurio HgCl2 al 0,1% durante 5 min
obtuvieron bajos porcentajes de contaminación y por García et al, (2015), los cuales
realizaron un tratamiento con cloruro de mercurio al 0,1% por 1 min, en el medio M&S, que
fue efectivo para el control de contaminantes, obteniéndose en promedio un control de la
contaminación del 80 al 100%. Todos estos resultados y otros tratamientos similares con
rendimientos efectivos para desinfectar plátano Marqueño (Martínez et al., 2008) y Aloysia
tryphilla (Bedoya et al, 2016), confirman lo postulado por Niubó et al., (2004) al afirmar que
el HgCl2 tiene gran acción bacteriostática y fungicida en concentraciones mayores a 0,004%.
Es así como, el HgCl2 viene siendo utilizado con éxito en forma de solución desinfectante, en
muchas especies forestales y leñosas, con serios problemas de contaminación (Zibbu & Batra,
2010).
Es necesario tener en cuenta que al someter a los explantes a altas concentraciones de HgCl2,
la necrosis de los explantes aumento, lo cual está de acuerdo con Méndez (2014) que plantea
que con el incremento de la concentración del HgCl2 también aumentó el porcentaje de
oxidación y por ende la mortalidad de los explantes usados en su investigación.
De acuerdo a todo lo anterior se plantea el siguiente el protocolo de desinfección:
53
1. Cubrir en su totalidad los explantes con una solución de Tween 20 y Benlate al 1% en
agua destilada estéril.
2. Realizar agitaciones constantes por aproximadamente 30 minutos.
3. Realizar lavados con agua destilada estéril hasta retirar los residuos y espuma.
4. Cubrir los explantes con una solución de HgCl2 al 0,1% y Tween 20
5. Agitar constantemente por 5 minutos.
6. Realizar tres enjuagues con agua destilada estéril de 3 minutos cada uno para eliminar el
HgCl2 de los explantes
7. Mantener los explantes en un recipiente limpio y cerrado con una solución de agua
destilada estéril para el momento de la siembra.
Cuando se garantiza que el área de siembra, todos los instrumentos y equipos a utilizar y los
explantes a inocular, cuentan con unas condiciones de total asepsia y esterilidad se procede a
efectuar la siembra del material en los medios de cultivo
La extracción de la porción vegetal a sembrar, se realizó dentro de las cámaras de flujo
laminar, las cuales contaban con la presencia de 3 mecheros de alcohol para conservar la
54
esterilidad del ambiente, se emplearon cajas de petri estériles para la realización de los cortes
de los explantes los cuales fueron divididos en segmentos nodales, cada uno de 0,3 a 0, 7 cm
de largo, y cortados de acuerdo a lo establecido por (Zuñiga, 2012) a 1.0 cm por debajo del
meristemo y a 0.3 cm por encima, mediante el uso de cuchillas estériles con sus respectivos
mangos (Figura 3).
Figura 3: Obtención del segmento nodal de Vaccinium corymbosum: a) Planta madre, b).
Extracción de hojas para obtener estacas, c) Estacas, d) Segmento nodal de 0,3 a 0,7 cm.
55
Los segmentos nodales extraídos se colocaron a manera horizontal, cuya parte media hacia la
base tuvo contacto con el medio de cultivo, esto se estableció debido al trabajo realizado por
(Debnath, 2005) el cual deja en evidencia que la estimulación y desarrollo de yemas axilares
varía dependiendo de la posición de los explantes en el medio de cultivo., esto se presenta
debido a que la posición horizontal de los explantes permite que las yemas axilares queden en
contacto directo con los nutrientes y reguladores de crecimiento del medio de cultivo,
(Debnath, 2005 citando a Rache & Pacheco, 2010). Una vez realizada la inoculación del
explante en los medio de cultivo, se procede a realizar el sellado mediante papel aluminio
inmediatamente después de ser flameado y posteriormente con papel vinipel.
3.2.3 Estimulación de brotación mediante choque térmico
El arándano se caracteriza por crecer en diversos climas debido a los diferentes procesos de
adaptación a los que ha sido sometido, pero según la especie y la variedad puede requerir de
400 a 1.100 horas de frío, en las cuales la planta debe estar expuesta a horas acumuladas
donde la temperatura sea menor a 7.2 °C ( Mesa Torres, 2015 citando a Bowen, 1986). En el
caso de Vaccinium corymbosum variedad biloxi al ser generada como híbrido y encontrarse
particularmente en zonas templadas, tiene bajos requerimientos de horas frío de mínimo 400
horas (Retamales & Hancock, 2011).
Teniendo en cuenta estas condiciones de desarrollo y tomando como base el trabajo realizado
por Jiménez-Bonilla & Abdelnour-Esquivel (2018), donde evaluaron el efecto de choques
térmicos en la estimulación de la brotación in vitro de yemas de Vaccinium consanguineum;
56
se planteó un ensayo con el objetivo determinar las condiciones de incubación ideales para
estimular la brotación y disminuir el tiempo de apertura de los brotes
Se diseñaron tres tratamientos: el primero consistió en incubar los explantes luego de la
siembra a una temperatura de 23ºC +/- 2 y 24 oscuridad total; el tratamiento dos, manejó una
temperatura de 4ºC y oscuridad total; y finalmente el tratamiento tres fue testigo o control en
temperatura de 23ºC +/- 2 y fotoperiodo 12/12, los tres tratamientos se llevaron a cabo por 19
días y luego todos se dejaron en la cámara de crecimiento en condiciones de 50% de
humedad, 23 grados centígrados, fotoperiodo 12/12 y 55.5 µmol m -2 s -1 ó 3 mil lux de
intensidad lumínica. (Resultados no reportados)
Tras el tiempo de incubación se observa que con el tratamiento 4ºC y total oscuridad, se
evidenció mayor frecuencia de apertura de las yemas presentes en los segmentos nodales, esto
estaría acorde a los resultados obtenidos por Silva, et al., (2006), quienes encontraron que
tratamientos de incubación en frío aumentan el porcentaje de brotación de los explantes,
superando los resultados generados por tratamientos de incubación sin frío. Adicionalmente
estos tratamientos en frío a 4ºC y en oscuridad, también han sido aplicados por otros
investigadores con resultados exitosos de brotación (Debnath, 2007 citando a Orlikowska,
1986). Este fenómeno biológico se conoce como la endodormancia, la cual es muy frecuente
en plantas frutales y esencial para la supervivencia de plantas leñosas. La endodormancia se
caracteriza por ser una etapa en la cual las yemas no consiguen brotar aunque se encuentren
en temperaturas favorables, dado que deben acumular frío y luego calor, para dar paso a la
brotación. (Chaar & Astorga, 2012; De Carvalho et al., 2010)
57
También Faquim, Silva & Carvalho, (2007) argumentan que ciertas especies tienen necesidad
de frío para que se de rotura de la dormancia y brotación completa, es así como el choque
térmico puede estimular el metabolismo celular, considerando que el desarrollo vegetativo de
los brotes ocurre cuando las condiciones ambientales son ideales, por lo tanto, la baja
temperatura y el estrés hídrico son factores con una directa influencia en la capacidad de
brotación por que pueden ayudar a restablecer un nuevo flujo de crecimiento vegetal.
Es necesario aclarar que el tratamiento de 23ºC y total oscuridad, también generò alta
frecuencia de apertura de yemas presentes en los segmentos nodales, pero transcurridas 8
semanas del cultivo, los explantes no se desarrollaron y fueron descartados debido que
presentaban altos niveles de oxidación en los tejidos.
Además se observó que tras los 19 días de incubación en frío los explantes, tardaron más de 8
semanas en desarrollarse, por lo cual se realizó nuevamente este ensayo disminuyendo el
tiempo de incubación en frío a 8 días y se logró obtener brotación de explantes luego de tres
semanas de a partir del momento en que los explantes se encontraban en condiciones de
luminosidad y temperatura del tratamiento control.
Con respecto a la oscuridad varios autores recomiendan el establecimiento y la incubación de
los explantes en bajas intensidades de luz, estas condiciones favorecen la iniciación de los
explantes y ayudan a disminuir la oxidación (Hu y Wang, 1983; Jiménez 1998; Israelí et
al.,1995). Adicionalmente, varios autores en sus investigaciones han encontrado que los
brotes de arándano presentan mejor desarrollo y mayor vigor cuando son propagados en
condiciones de bajas intensidades lumínicas o de total oscuridad, pues en el género Vaccinium
58
la intensidad lumínica tiene una gran incidencia en el desarrollo inicial de los explantes
(Zhang et al., 2004; Debnath, 2004; Debnath, 2007; Toro Cano, 2009; Gajdošová, et al.,
2009).
Esto explica el porqué se evidencio que los explantes que se incubaron en condiciones de
oscuridad sobrevivieron, a diferencia de los que se incubaron en luz, y además presentaron
menor porcentaje de oxidación. Adicionalmente George & Sherrington (1984), plantean que
la luz incrementa y favorece que los tejidos realicen síntesis y oxidación de fenoles. Cabe
resaltar que aunque inicialmente la oxidación disminuyo, una vez los explantes se encontraron
en condiciones de luminosidad y temperatura del control, volvió a aumentar hasta acabar
totalmente con los explantes.
3.2.4 Reguladores de crecimiento de tipo Citoquinina
Teniendo en cuenta todos los ensayos preliminares realizados se estableció el medio de
cultivo Anderson + 2 ml/L de L-cisteína como el más óptimo para el establecimiento in vitro
del Arándano, pero con todos los ensayos preliminares descritos anteriormente también se
encontró que las plantas no llegaban a completar el desarrollo para su establecimiento in vitro,
había brotación y apertura de la yema producto del choque térmico, pero el explante se
oxidaba, el brote no presentaba una formación adecuada y transcurrido un tiempo moría.
Es por esto que se hizo menester el uso de reguladores de crecimiento que permitieran el
establecimiento exitoso y la obtención de plántulas que pudieran llegar a procesos de
multiplicación y múltiples trabajos han demostrado que el uso de citoquininas en el cultivo in
59
vitro, permite interrumpir la dominancia apical, promover la brotación e inducir la
proliferación de yemas, pero es fundamental encontrar la concentraciones correctas y
adecuadas y el tipo de citoquinina a usar (Toro Cano, 2009)
Por lo tanto, se evaluó inicialmente el efecto de dos reguladores de crecimiento de tipo
citoquinina: Zeatina y 2-ip en diferentes concentraciones (Resultados no reportados). Estas
concentraciones se evaluaron teniendo en cuenta lo propuesto por varios autores, al evidenciar
como altas concentraciones hormonales pueden causar efectos antagónicos en el tejido y por
ende afectar el desarrollo de la planta (Van Staden et al, 2008) por lo tanto, en el caso de
citoquininas se recomienda usar bajas concentraciones para estimular la proliferación de
tejidos, debido a que concentraciones elevadas desencadenan tallos pequeños que no elongan,
tallos con hiperhidrosis, deformaciones en las hojas y neoformaciones de yemas sobre callos
(Chamorro, 2007; Van Staden et al, 2008)
Además Jiménez, (2018) en su investigación sobre micropropagación de arándano y otras
bayas recomienda el uso de citoquininas, en especial 2-IP y Zeatina, en el medio de cultivo,
debido a que favorecen la brotación y multiplicación, y existe amplia literatura y autores que
reportan el uso de zeatina y 2IP con resultados exitosos, debido a que ambas son citoquinas,
las cuales se caracterizan por la producción de brotes y promover la brotación de yemas. Entre
estos protocolos generalmente se utiliza solo zeatina o solo 2ip (Debnath, 2006; Tetsumura et
al,. 2008) Hay pocos autores que empleen también una auxina como parte del protocolo de la
propagación de Vaccinium (Meiners, 2007).
60
Por lo tanto, comparó el efecto de Zeatina 2 mg/L y 2-ip (6-γ,γ-dimetilalilaminopurina ) a 0.5
ml/ L. De este último ensayo se tomaron el conjunto de registros de datos, tras 5 semanas de
transcurrido el choque térmico, en cada una de las tres repeticiones del ensayo, observando y
registrando la longitud del tallo, el número de nodos y el número de hojas. Para la
elaboración del análisis estadístico se tomó el registro de 180 unidades experimentales, las
cuales corresponden a 360 segmentos nodales. Cabe resaltar que se obtuvieron 80 registros de
cada una de las variables de los 360 explantes totales sembrados, esto debido a que no todos
los explantes mostraron desarrollo y algunos presentaron contaminación y/o necrosis en los
tejidos, por lo tanto, fueron descartados y no se tuvieron en cuenta.
En esta investigación a pesar de usar estos reguladores de crecimiento dentro de las
concentración recomendadas, no se encontraron diferencias estadísticas significativas entre
los resultados arrojados por el análisis de varianza para estas dos hormonas en cada una de las
variables analizadas, de tal manera que se lograse determinar cuál de las dos hormonas es más
eficaz en la obtención de plántulas in vitro.
3.2.4.1 Variable de Longitud del tallo
Transcurridas cinco semanas luego del choque térmico, no se observaron diferencias
significativas para la variable longitud de tallo entre plántulas obtenidas a partir del cultivo in
vitro de segmentos nodales en los dos tratamientos empleados, dicha observación fue
corroborada con los resultados obtenidos a través del análisis de la varianza (ANOVA)
(P: 0,0572) (Ver anexo 2. A). Este valor p (P-value) debe ser menor de 0.05 para arrojar
diferencias significativas entre los tratamientos. A pesar de que no hay diferencias
61
significativas entre los tratamientos, las medias de longitud de tallo de las plántulas obtenidas
para cada tratamiento, muestran que el tratamiento dos presenta mejores resultados para esta
variable con respecto al tratamiento uno.
GRÁFICA 1. Medias de Longitud: La gráfica de barras relaciona las medias de cada uno de
los tratamientos con respecto a la variable de longitud.
Al evaluar las medias obtenidas, se observó que la media de longitud del tratamiento dos
(2-ip) es de 1,29 (cm) mientras que el tratamiento uno, tiene una media de 0,99 (cm) ( Ver
gráfica 1 ), estos resultados permiten inferir que para la variable longitud tallo, aunque ambos
62
tratamientos evaluados influenciaron y permitieron la elongación de las yemas presentes en
los segmentos nodales, no generaron longitudes mayores, y en el caso del tratamiento dos, que
mostró una mayor elongación del tallo respecto a la zeatina, la media de longitud se encuentra
muy por debajo al contrastarse con otras medias reportadas,pues Debnath (2009), obtuvo y
reportó plántulas promedio de 5 cm al cultivarlas en hormona 2-ip.
Por otro lado estos resultados difieren a lo reportados por otros autores, pues se ha reportado
que la zeatina genera brotes de mayor longitud, por ejemplo Angulo et al (2015) reportaron
longitudes por encima de 2,5 cm para brotes cultivados en diferentes concentraciones de
zeatina.
También es necesario tener en cuenta que tras el seguimiento de las plántulas se observó que
la zeatina promovió de forma precoz el desarrollo de botones florales y a su vez las plántulas
expuestas a 2-ip presentaban con el tiempo, coloraciones pardas,(Ver imagen 4) esto se podría
explicar debido a que 2-ip genera fitotoxicidad en las plántulas y además a largo plazo los
brotes expuestos a esta hormona presentan coloraciones parduscas y hojas con manchas cafes
y rojizas (Jaakola et al., 2001), por lo cual se recomienda el uso de este regulador, en bajas
concentraciones.
63
FIGURA 4: Plántulas cultivadas en medios suplementados con citoquininas: A: Se
observan plántulas en 2-ip con presencia de oxidación en las hojas B. Plántulas influenciadas
por zeatina las cuales presentan el desarrollo de botones florales
3.2.4.2 Variable de Nùmero de Hojas
Transcurridas las cinco semanas no se encontraron diferencias significativas entre los dos
tratamientos evaluados para la variable número de hojas, esto fue corroborado con los
resultados obtenidos en el análisis multivariante de varianza (ANOVA) al obtener un valor p
de 0,3814 (Ver anexo 3. C), el cual es mayor a 0.05, por lo tanto, se puede concluir que
ambas hormonas ejercen un efecto similar en el desarrollo de hojas de las plántulas obtenidas.
64
Sin embargo al observar las medias resultantes, el tratamiento dos presenta una media de 9,8
para número de hojas mientras el tratamiento uno muestra una media de 8,7 (Ver gráfica 2).
GRÁFICA 2. Medias de Número de Hojas: La gráfica de barras relaciona las medias de
cada uno de los tratamientos con respecto a la variable de número de hojas.
Estos valores contradicen lo reportado diversos autores quienes quien al realizar esta misma
comparación obtuvieron mayor proliferación de brotes in vitro con zeatina frente a lo
obtenido con la 2-ip (Chandler & Draper, 1986; Debnath & McRae, 2001; Ostrolucká et al.,
2004; Zhidong et al., 2006) concuerdan con lo propuesto por varios autores que manifiestan
65
que explantes expuestos a 2-ip, presentan mayor elongación, mayor longitud en brotes
nuevos, crecimiento más robusto y hojas de mayor tamaño y en mayor cantidad. (Debnath &
McRae, 2001; Debnath & McRae, 2005; Gómez, 2013; Scorza et al, 1984; Marcotrigiano &
McGlew, 1991; Smagula & Harker, 1997).
Es así como estas ,medias permiten inferir que el tratamiento con 2ip puede mostrar mejores
resultados tanto para la variable longitud tallo, como para la variable número de hojas
comparado con el tratamiento con Zeatina, por esto que Esquivel (1991) cuestiona el uso de
Zeatina en cultivos in vitro de gran escala, pues dicha hormona tiene un alto valor de compra,
no genera mayor rentabilidad y eficiencia sobre la 2-ip, debido a que las plantas bajo la
influencia de dicha hormona son menos vigorosas que las obtenidas con 2ip, pero también es
importante tener en cuenta que la zeatina es menos fitotóxica que la 2-ip, puesto que es una
hormona natural (Jordán & Casaretto, 2006) y las plantas expuestas a este regulador en esta
investigación, muestran mejores características fenotípicamente hablando, pues presentan
mejor aspecto y coloración, y seria por dicha razón que Reed, et al (1991), la recomiendan
para la iniciación de brotes, además Toro Cano (2009) también argumenta que en
contraposición a la zeatina la hormona 2-ip genera brotes con retraso en el crecimiento.
66
FIGURA 5 Plántulas obtenidas a las 5 semanas de cultivo: Fotografías a las 5 semanas de
cultivo correspondientes al Ensayo de reguladores de crecimiento de tipo de citoquinina para
los 2 tratamientos. A: Tratamiento 1 (Zeatina); B: Tratamiento 2 (2-ip)
Por otro lado todos los trabajos mencionados han empleado el uso de herramientas
estadísticas como la ANOVA para determinar si la concentración de reguladores de
crecimiento afecta el desarrollo de los explantes por lo cual es importante mencionar que
Hine-Gómez & Abdelnour-Esquivel (2013) afirman que medios suplementados con 2-ip en
concentraciones menores a 2,5 mg/L, generan brotes con mayor longitud, vigor y cantidad de
hojas, mientras altas concentraciones generan brotes etiolados, esta conclusión es importante,
debido que aunque no hubo etiolación en los explantes, los brotes presentaron oxidación, a
pesar de emplearse bajas concentraciones de la hormona.
67
3.2.4.3 Variable de Nùmero de Nudos
Al cabo de cinco semanas de cultivo posteriores al choque térmico, respecto a la variable
número de nudos, no se encontraron diferencias significativas entre los tratamientos
evaluados, esto fue corroborado con los resultados obtenidos en el análisis multivariante de
varianza (ANOVA) al obtener un P de 0,2168, valor que supera el valor de significancia de
0.05, por lo que se entiende que para la variable número de nudos no hay diferencias entre los
tratamientos evaluados. Esto se debe a que las citoquininas regulan muchos puntos dentro del
crecimiento y desarrollo de las plantas, pues están implicadas en la división celular, en la
iniciación de brotes al promover la organogénesis y pueden reducir la dormancia apical
(Jordán & Casaretto, 2006).
Sin embargo, las medias obtenidas para cada tratamiento si son diferentes, debido a que el
tratamiento uno tiene una media de nudos de 2,6 mientras el tratamiento dos de 3,3 (Ver
gráfica 3), por lo tanto, nuevamente el regulador 2-ip presenta valores más altos para la
variable de número de nudos la cual a su vez está muy relacionada con la variable de número
de hojas.
68
GRÁFICA 3. Medias de Número de Nudos: La gráfica de barras relaciona las medias de
cada uno de los tratamientos y su respectiva repetición con respecto a la variable de número
de nudos.
Varias investigaciones reportan que la adición de 2-ip incrementa la capacidad de regenerar
brotes, pues los explantes cultivados en bajas concentraciones muestran mayor tasa de
brotación (Ostrolucká et al, 2004; Jiménez, 2017), pues es la más activa de las citocininas
(Calva & Pérez, 2005) además la 2iP es un estímulo eficaz en la proliferación de brotes
(Debnath y McRae 2001).
69
En este punto, cabe añadir que la respuesta de la especie trabajada a las distintas
concentraciones del 2-iP va a depender en gran medida de los niveles endógenos de
citoquinina que posea el tejido cultivado (Castro-Restrepo & Álvarez-Guzmán, 2013). Las
citoquininas son sintetizadas en las raíces, allí son transportadas por el haz vascular,
favoreciendo el desarrollo de brotes, la multiplicación celular y la expansión de las hojas,por
lo tanto, al ser vitroplantas en establecimiento in vitro y no poseer raíces, dichos reguladores
no son sintetizados de forma natural por lo cual deben ser adicionados como suplemento al
medio de cultivo (Hoyos, Perea, & Velasco, 2008).
70
4. CONCLUSIONES
Teniendo en cuenta que toda esta investigación tenía como finalidad proponer un protocolo de
establecimiento in vitro de segmentos nodales de arándano azul, de todo el proceso
experimental realizado se concluye:
● El protocolo definido para la extracción, transporte, desinfección, siembra en medio
de cultivo e incubación de segmentos nodales de arándano, permitió establecer y
obtener plántulas in vitro
● Se empleó la adición de reguladores de crecimiento de tipo citoquinina: zeatina y 2-ip,
los cuales demostraron ejercer influencia en la brotación de las yemas presentes en los
segmentos nodales
● El uso de la citoquinina 2ip al 0,5 mg/L del Tratamiento 2 mostró ser más beneficiosa
que el Tratamiento 1 suplementado con 2mg/L de Zeatina. En este caso las tres
variables dependientes: longitud de tallo, número de hojas y número de nudos
presentaron medias superiores con el T2 respecto a las medias obtenidas con el T1,
razón por la cual se concluye que el T2 presenta las mejores características de
regeneración de plántulas de arándano azul.
71
5. RECOMENDACIONES
● Se aconseja evaluar el efecto antioxidante del PVP (Polivinil pirrolidona), ya sea en el
medio de cultivo o en el proceso de pre- desinfección y post- desinfección, con el fin
de determinar si puede funcionar como una alternativa en la disminución de la
oxidación el cultivo in vitro de arándano
● En futuras investigaciones se puede evaluar el efecto de concentraciones más bajas de
las hormonas Zeatina y 2-ip y el efecto de usarlas combinadas, con el fin de establecer
si ejercen mejores respuestas a las obtenidas.
72
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87
7. ANEXOS
ANEXO 1: PROTOCOLO DE ESTABLECIMIENTO IN VITRO DE SEGMENTOS
NODALES DE ARÁNDANO AZUL (Vaccinium corymbosum L.) CV BILOXI
FASE DE CAMPO
La fase de campo se desarrolló en un invernadero, ya que como menciona Baracaldo (2018)
esto no sólo facilita el control de las condiciones de humedad de las plantas donantes, sino
que además permite aislarlas de posibles agentes contaminantes. El primer paso se refiere a la
selección de las plantas madre las cuales deben ser juveniles puesto que poseen menos
lignificación de los tejidos facilitando los posteriores cortes, además deben presentar la mejor
apariencia posible tal como no presentar signos de lesiones por enfermedades, agentes
patógenos o daños mecánicos. El segundo paso consiste en la obtención de los explantes por
medio de cortes, se recomienda llevarlo a cabo con una tijera de poda exclusiva para este fin,
el corte se dispone desde la región basal de la planta de manera diagonal al tallo. El tercer
paso es la la preparación del material vegetal para su transporte mediante el corte de los tallos
en segmentos más pequeños que oscilaron entre 20 cm a 30 cm. El cuarto paso es almacenar,
se dispuso a sumergir totalmente los explantes en tubos falcon de 15 ml con una solución con
ácido ascórbico al 1% (m/v) ya que posee propiedades antioxidativas que evitan y ralentiza la
oxidación temprana de los explantes. Por último, el transporte de los explantes debe realizarse
en frío para preservar de manera óptima los tejidos, en este caso se trasladó el material al
laboratorio de biotecnología vegetal de la Universidad Distrital Francisco José de Caldas.
88
FIGURA 1. FASE DE CAMPO. Muestra el paso a paso del proceso de selección del
material vegetal madre para obtención de segmentos nodales de Vaccinium corymbosum L.)
CV BILOXI.para cultivo in vitro.
FASE DE LABORATORIO
2. PROTOCOLO DE DESINFECCIÓN
El proceso más importante previo al establecimiento del cultivo in vitro es la formulación
idónea en la aplicación de agentes desinfectantes y antioxidantes, puesto que los materiales
89
experimentales deben ser suficientemente fuertes para eliminar los microorganismos pero
provocar el menor daño posible al material vegetal. El primer paso consiste en retirar todas las
hojas de los tallos con el fin de disminuir índices de contaminación. Preparar un solución
jabonosa utilizando TWEEN al 20%. y Benlate al 1% en agua destilada estéril. Agregar los
tallos y la solución al recipiente se recomienda que el recipiente sea amplio para favorecer el
contacto de los agentes desinfectantes con todos los explantes y dejar actuar durante 30
minutos realizando agitaciones constantes para generar abundante espuma. El cuarto paso es
descartar la solución jabonosa, teniendo precaución de no dejar caer los explantes fuera del
recipiente que los contiene. Realizar 3 lavados con agua estéril para retirar la espuma y
residuos, y posteriormente descartar el agua destilada. Posteriormente se adiciona a los
explantes una solución de HgCl2 al 0,1% (v\v) y Tween 20%, la cual debe cubrirlos,
manteniéndolos en agitación constante por 5 minutos. Al finalizar el tiempo (es importante
llevar un control de los tiempos), se descarta la solución. El séptimo paso consiste en realizar
tres lavados con agua destilada, para retirar los residuos de los agentes químicos empleados
para desinfectar, estos deben realizarse con una agitación constante En el octavo paso,
descartar el agua estéril y llevar los explantes a un nuevo recipiente limpio y con una
solución de agua destilada estéril y sumergir los explantes y cerrar el recipiente. (Ver Figura
2)
90
FIGURA 2: FASE DE LABORATORIO: Muestra la primera parte del proceso para el
manejo de la planta en el laboratorio. En este caso el protocolo de desinfección aplicado para
establecer el cultivo in vitro de Vaccinium corymbosum L.) CV BILOXI.
3. PREPARACIÓN DEL MEDIO
Para la elaboración del medio de cultivo, el primer paso consiste en la preparación de las
soluciones de micro y macronutrientes indicadas en la tabla de composición para medio AN
(soluciones de la A – H) (Ver anexo 3). Una vez preparadas las soluciones se determina el
volumen de medio de cultivo que se desea preparar, (en este caso 1000mL). Posteriormente
en un Erlenmeyer verter 800 mL de agua destilada y agregar a este los volúmenes indicados
por solución en anexo 3. Preparar una solución de L-cisteína de 100 mg/100 ml con el fin de
disminuir la oxidación de los explantes, agregar 2 ml/L de esta solución de L-cisteína al
91
Erlenmeyer. Pesar 30 gr de sacarosa y adicionarla al Erlenmeyer. Agregar con una
micropipeta la citoquinina correspondiente, ya sea 2 mg/L de Zeatina o 0.05 ml/L de 2ip.
Empleando un pH-metro, ajustar el pH de la solución a 5,0 (±0,2) y posterior a ello aforar a
1000 mL y llevar a la plancha de calentamiento. Simultáneamente pesar 6 gr de Phytagel.
Cuando inicie el proceso de ebullición en el Erlenmeyer adicionar el Phytagel, con ayuda de
un agitador, mezclar vigorosamente hasta disolver y cambie algunas propiedades físicas de la
mezcla. Servir el medio en los frascos de vidrio, aproximadamente hasta una altura de 1 cm),
alrededor de 15 ml por frasco. Con papel aluminio sellar muy bien los frascos para
posteriormente auto clavarlos a 121°C y 15 libras de presión durante 20 minutos. Almacenar
en un refrigerador hasta el momento de la siembra. (Ver Figura 3)
FIGURA 3. PREPARACIÓN DEL MEDIO (para 1000mL). Se evidencia el paso a paso
para la elaboración del medio de cultivo AN.
92
4. SIEMBRA
Con el fin de disminuir los incidentes de contaminación en la siembra es importante tratar
aquellos factores como la desinfección del instrumental y del laboratorio y consiste en
someter todos los utensilios utilizados para la propagación in vitro a un proceso de
esterilización. Se realizaron cuatro limpiezas con diferentes soluciones. En primer lugar, toda
el área de trabajo debe ser limpiada utilizando una solución jabonosa (Cámara de flujo
laminar, piso, y demás superficies). En segundo lugar, desinfectar nuevamente toda el área de
trabajo con Alcohol al 70% y dejar reposar. Repetir el proceso de desinfección con NaClO al
2% y dejar reposar. Nuevamente desinfectar el área en su totalidad con Benlate al 4% y dejar
reposar. Agregar los instrumentos de laboratorio como las pinzas, mangos de bisturí, gorro,
bata, guantes, y tapabocas en un solución jabonosa por 10 minutos y enjuagar con agua
estéril. Seguidamente empacar las instrumentos de laboratorio en bolsas de papel individuales
las cuales deben estar selladas, para ser llevadas al horno a una temperatura de 121°C y 15
libras de presión durante 20 minutos. Secar en el horno de secado a 70°C durante 12 horas.
Llevar todo el material a la cámara de flujo laminar, papel absorbente, una caja de Petri
dentro de la cual se manipulara el material vegetal, un frasco grande de vidrio para depositar
residuos de papel aluminio y restos de material vegetal, un rollo pequeño de papel vinipel y
papel aluminio cortado en cuadros, un atomizador con alcohol al 96%, otro frasco de vidrio
con alcohol al 96% para esterilizar las cuchillas, los frascos con el medio de cultivo y dos
mecheros (uno a cada lado de la estructura para observación) los cuales ayudarán mantener la
esterilidad del ambiente. Posteriormente se someten los instrumentos e indumentaria a luz
ultravioleta por 5 minutos, se recomienda tener especial cuidado con no someter los explantes
a los rayos ultravioleta, ya que son mutágenos y pueden modificar la genética del explante.
93
Transcurridos los 5 minutos, apagar la luz ultravioleta y encender la cámara de flujo laminar.
Antes de iniciar la siembra la persona/s deben colocarse la indumentaria de Bioseguridad,
inicialmente el operador debe ponerse el tapabocas, luego, proceder a colocarse la bata y por
último los guantes, es importante desinfectar las manos con un poco de alcohol antes de entrar
al laboratorio y manipular la indumentaria. Encender los mecheros de etanol (96%), y
constantemente rociar un poco de etanol con un aspersor sobre la zona de trabajo y dentro de
la cámara de flujo laminar, esterilizando así la superficie constantemente, al igual que las
manos, rociando etanol al 70% sobre éstas y frotándose constantemente durante la siembra.
Encender los mecheros y flamear la caja de petri, las cuchillas y las pinzas. Para la sustracción
del segmento nodal, colocar el tallo en la caja de petri, y con una mano usando la pinza sujetar
el tallo haciendo presión hacia la base y una vez identificado el segmento nodal, realizar el
corte con la otra mano que sujetara la cuchilla previamente flameada, estos segmentos deben
ser de aproximadamente 0,3 a 0,7 cm con el fin de evitar procesos de oxidación. Llevar los
segmentos nodales con ayuda de la pinza (NOTA: LOS EXPLANTES NO DEBEN SER
MANIPULADOS CON LAS MANOS, ÚNICAMENTE CON LAS PINZAS), a los
frascos que contienen el medio de cultivo y colocarlo de manera que no quede totalmente
sumergido en el medio, levantando levemente el papel aluminio para evitar el contacto con el
ambiente, en esta ocasión sembrando 2 segmentos nodales por cada frasco, además es
importante trabajar siempre cerca del mechero y estar flameando continuamente los utensilios
de trabajo. Una vez extraídos y sembrados los 2 segmentos nodales, se procede a cubrir el
frasco con papel vinipel y posteriormente con papel aluminio flameado, asegurándose que
quede bien cubierto, y finalmente se rotula.
,
94
FIGURA 4: PROTOCOLO DE SIEMBRA: Proceso de manejo de la especie durante la
siembra para establecimiento in vitro.
5. CHOQUE TÉRMICO
El arándano se caracteriza por crecer en diversos climas debido a los diferentes procesos de
adaptación a los que ha sido sometido, pero según la especie estas condiciones pueden variar
y oscilan entre 400 a 1.100 horas de frío, en las cuales la planta debe estar expuesta a horas
acumuladas donde la temperatura sea menor a 7.2 °C. Una vez teniendo los frascos de medio
de cultivo con los segmentos nodales sembrados y sellados desinfectar la nevera en su
totalidad con Alcohol al 70%. Almacenar los medios en la nevera a 4 °C en total oscuridad,
95
por un periodo de 8 días. Transcurridos los ochos días, se trasladan los medios al fitotron
aplicando condiciones de humedad del 50%, temperatura de 23 °C, fotoperiodo de 12/12 y
55.5 µmol m-2 -1 (3000 lux). Revisar constantemente presencias de contaminación ya sea por
hongos o bacterias y/o oxidación en los segmentos nodales y descartar para evitar
propagación. (Ver Figura 5)
FIGURA 5. CHOQUE TÉRMICO. Proceso de condiciones específicas para activar los
división celular en los segmentos nodales.
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ANEXO 2: ANÁLISIS DE LA VARIANZA (ANOVA)
A. TABLA DE ANÁLISIS DE LA VARIANZA (ANOVA) PARA VARIABLE DE
LONGITUD DE TALLO
Análisis de varianza para Longitud de tallo.: Variable dependiente: Longitud de tallo.
Factor: Tratamiento.
97
B. TABLA DE ANÁLISIS DE LA VARIANZA (ANOVA) PARA VARIABLE DE
NÚMERO DE NUDOS
Análisis de varianza para Número de nudos: Variable dependiente: Número de nudos.
Factor: Tratamiento.
98
C. TABLA DE ANÁLISIS DE LA VARIANZA (ANOVA) PARA VARIABLE DE
NÚMERO DE HOJAS
Análisis de varianza para Número de hojas: Variable dependiente: Número de hojas.
Factor: Tratamiento.
99
D. TUKEY HSD TEST DE COMPARACIÓN PARA VARIABLE DE LONGITUD
Test de comparación Tukey HSD para Longitud: Variable dependiente: Longitud. Factor:
Tratamiento.
E. TUKEY HSD TEST DE COMPARACIÓN PARA VARIABLE DE NUDOS
Test de comparación Tukey HSD para Número de Nudos: Variable dependiente: Número
de Nudos. Factor: Tratamiento.
100
F. TUKEY HSD TEST DE COMPARACIÓN PARA VARIABLE DE HOJAS
Test de comparación Tukey HSD para Número de Hojas: Variable dependiente: Número
de Hojas. Factor: Tratamiento.
101
ANEXO 3: TABLA DE COMPOSICIÓN MINERAL DEL MEDIO DE CULTIVO
EMPLEADO
Tabla de Componentes para Medio AN Anderson (Anderson, 1975)
102
