PROTEÍNAS I (Ensayos de reconocimiento de proteínas)

Objetivo: El objetivo de esta experiencia es extraer proteínas de algunas sustancias para luego reconocer su naturaleza proteica. Para esto utilizaremos los ensayos de Biuret y Xantoproteico y ciertas muestras de leche, gelatina, clara de huevo, aspartamo y glicina.

Materiales:                                 Reactivos utilizados: Vaso de Bohemia                      Leche descremada en polvoVarilla de vidrio                         GelatinaMechero                                    Clara de huevoSoporte                                     EdulcoranteTela metálica                             Acido etanoicoGradilla                                      NaOH Tubo de ensayo                       CuSO4 Termómetro                              Ácido nítrico concentradoPapel de filtro                            Agua

Ensayo de Biuret:

Está hecho de hidróxido potásico (KOH) y sulfato cúprico (CuSO4), junto con tartrato de sodio y potasio (KNaC4H4O6·4H2O). El reactivo, de color azul, cambia a violeta en presencia de proteínas, y vira a rosa cuando se combina con polipéptidos de cadena corta.  El Hidróxido de Potasio no participa en la reacción, pero proporciona el medio alcalino necesario para que tenga lugar.

Consiste en tratar una proteína o péptido con Cu++ en medio alcalino, produciéndose una coloración violácea por formación de un complejo de coordinación entre el Cu++ y los pares electrónicos libres de los nitrógenos de los grupos amino de la unión peptídica. Son necesarias por lo menos dos uniones peptídicas para que tenga lugar la reacción.

La reacción del biuret no es una reacción específica para proteínas. Eso hace que un resultado positivo con este reactivo deba ser cuidadosamente evaluado para descartar los resultados falsos positivos

Un resultado negativo de la reacción del biuret sobre una muestra problema no necesariamente indica la ausencia de proteínas, ya que puede ocurrir a) que no existan proteínas o péptidos en la muestra (ni tampoco otras sustancias no proteicas

biuret positivas), b) que existan una o más sustancias interferentes en la muestra que impidan que se produzca la reacción (lo que daría lugar a un resultado falso negativo). Esto puede descartarse (o evitarse) si conozco de antemano la composición aproximada de la muestra. Por ejemplo, si deseo determinar el contenido de péptidos generados por una reacción de hidrólisis ácida, los H+ del medio interferirán con la reacción del biuret, ya que ésta necesita de un medio alcalino para la formación del complejo con Cu++. En este caso la interferencia puede eliminarse alcalinizando el medio antes de realizar el ensayo (en caso contrario obtendría un falso negativo como resultado) y c) Que existan péptidos, pero a una concentración inferior al límite de sensibilidad del método. Todo método permite determinar la presencia de un compuesto sólo si la concentración del mismo es superior a cierto valor. Existen métodos mucho más sensibles que el biuret (ver más abajo).

¿Cómo se lleva a cabo la reacción de Biuret? 

La Prueba de Biuret es un ensayo general para las proteínas. Cuando una proteína reacciona con el cobre (II) sulfato (azul), la prueba positiva es la formación de un complejo de color violeta.

Ensayo de Xantroproteíco:

Esta reacción se usa para detectar la presencia de proteínas solubles en una solución. Se realiza mediante el uso de HNO3 concentrado que, en presencia de proteínas o aminoácidos con restos aromáticos torna la solución de un color amarillo oscuro.  

Los anillos fenilo que contengan un grupo activante pueden ser nitrados produciendo un compuesto Amarillo. La producción de un producto coloreado Amarillo al añadir ácido nítrico es una prueba para la presencia de tirosina o triptófano en una proteína. La adición de base fuerte hace que el color se torne más oscuro hacia anaranjado. Las manchas amarillas en la piel causadas por ácido nítrico son el resultado de la reacción xantoproteíca. La reacción xantoproteica se puede considerar como una sustitución electrofilica aromática de los residuos de tirosina de las proteínas por el acido nítrico dando un compuesto coloreado amarillo a pH acido.

¿Cómo se lleva a cabo la reacción xantoproteica? 

Se representa  la producción de un producto de color amarillo en la adición de ácido nítrico.realizado en un ensayo para detectar la presencia de tirosina y triptófano en una proteína.

CASEINA:

La caseína (del latín caseus, "queso") es una fosfoproteína (un tipo de heteroproteína) presente en la leche y en algunos de sus derivados (productos fermentados como el yogur o el queso). En la leche, se encuentra en la fase soluble asociada al calcio (fosfato de calcio) en un complejo que se ha denominado caseinógeno.

A diferencia de muchas otras proteínas, incluso del queso, las caseínas no precipita por acción del calor. Por el contrario, precipita por la acción de una enzima proteasa presente en el estómago de los mamíferos llamada renina y forma un precipitado denominado paracaseína. Si la precipitación se realiza por la acción de ácidos, se le llama caseína ácida. En la elaboración de los quesos tienen lugar ambos tipos de precipitaciones. Cuando se emplea la enzima tripsina, la caseína se hidroliza a una molécula fosfatada llamado pepto.

Otro dato interesante, utilizado para separar las caseínas del resto de las VACAS proteínas lácteas mediante su precipitación, es que su punto isoeléctrico (pI) promedio es de 4,6. A este pH, las caseínas se encuentra en su punto de menor solubilidad debido a la reducción de las repulsiones intermoleculares, por lo que precipitan (vulgarmente se dice que coagulan). Ahora bien, el pI es diferente para cada una de las fracciones caseínicas, ya que varía entre el 4,44-4.97 para la αs1-caseína y el 5,3-5,8 en la variante genética B de la κ-caseína.

Comenzamos por colocar una punta de espátula de leche en polvo y le

agregamos agua para luego calentarla hasta aproximadamente 40 grados,

agitando siempre con una varilla de vidrio. Luego adicionamos ácido etanoico

2,0M (gota a gota) agitando en forma continúa hasta coagulación total.

Separamos el coagulo de caseína del suero. Secamos cuidadosamente la

caseína con papel de filtro. Por último lo dividimos en dos partes y las

colocamos cada una en un tubo de ensayo.

En el

tubo 1, practicamos el ensayo de Biuret: este consiste en agregar 20 gotas de NaOH al 10% y luego agregamos 3 gotas de CuSO4al 1%. Como el color de ésta es violeta por lo tanto podemos decir que existen  por lo menos dos enlaces peptídicos.

 En el tubo 2, realizamos el ensayo Xantoproteico, que consiste en agregarle al

solido 10 gotas de HNO3 concentrado. El producto coloreado de Amarillo es

una prueba de la presencia de tirosina o triptófano en la caseína. 

GELATINA:

La gelatina es una mezcla coloide (es decir, una sustancia semisólida), incolora, translúcida, quebradiza e insípida, que se obtiene a partir del colágeno procedente del tejido conectivo de animales hervidos con agua. También existe una gelatina vegetal conocida como agar-agar. La gelatina es una proteína compleja, es decir, un polímero compuesto por aminoácidos. Como sucede con los polisacáridos, el grado de polimerización, la naturaleza de los monómeros y la secuencia en la cadena proteica determinan sus propiedades generales. Una notable propiedad de las disoluciones de esta molécula es su comportamiento frente a temperaturas diferentes: son líquidas en agua caliente y se solidifican en agua fría.

Al ser proteína en estado puro, ésa es su mayor propiedad nutritiva: proteína (84-90%), sales minerales (1-2%) y agua (el resto). La gelatina se utiliza en la fabricación de alimentos para el enriquecimiento proteínico, para la reducción de hidratos de carbono y como sustancia portadora de vitaminas.

La gelatina cuaja cuando está a la temperatura ambiente, a 18 °C o menos, pero siempre por encima del punto de congelación. Si se le calienta a 27 °C, poco a poco se convertirá en una mezcla acuosa; si se le enfría, volverá a cuajar. Este comportamiento está determinado por un ingrediente especial que cuaja la mezcla: la grenetina, que está hecha de colágeno, proteína fibrosa que se encuentra en el tejido conjuntivo del cuerpo

Realizamos una solución de clara de huevo y agua y utlizamos la técnica pasada para la búsqueda de presencia de proteínas. 

En el tubo 1 se practico la reacción de biuret. La muestra se torna color violeta entonces estamos en presencia de por lo menos dos enlaces peptídicos.

En el tubo 2 se practico la xantoproteica. La muestra resulta

incolora es decir que da negativa y deducimos que la gelatina  no presenta tirosina o triptófano.

La ovoalbúmina es la principal proteína de la clara del huevo (60-65% del peso de la clara de huevo). Pertenece a la superfamilia proteínica de las serpinas, aunque a diferencia de la mayoría de éstas la ovoalbúmina no es capaz de inhibir cualquier peptidasa. La función biológica de la ovoalbúmina es desconocida, aunque se presume que sea una reserva de proteínas para la cria del ave. Otros autores señalan la capacidad que posee la ovoalbúmina de anular las enzimas digestivas y por esta razón señalan que es un mecanismo protector contra las bacterias exteriores agresoras al huevo. La ovoalbúmina (y, de hecho, toda la clara del huevo, también llamada albumen) no forma parte del óvulo original ni de sus cubiertas, sino que se forma por secreciones (mayoritariamente proteicas) del epitelio del oviducto durante su paso por él.

Rompimos un huevo separando

la clara de la yema. Colocamos

la clara en agua y

homogeneizamos. Colocamos

parte de la solución en dos tubos

de ensayo y realizamos los

ensayos mostrados

anteriormente.

Tubo 1 Biuret positivo: presenta por lo menos dos o más enlaces peptidicos.

Tubo 2 Xantoproteica positivo: presencia de tirosina o triptófano en la ovoalbúmina.

ASPARTAMO:

El aspartamo o aspartame, es un edulcorante no calórico descubierto en 1965 por la multinacional farmacéutica G.D. Searl and Company El aspartamo es estable cuando se encuentra seco o congelado, pero se descompone y pierde su poder edulcorante con el transcurso del tiempo, cuando se conserva en líquidos a temperaturas superiores a 30 º. El aspartamo es de 150 a 200 veces más dulce que el azúcar. Todos los edulcorantes se clasifican con respecto a la sacarosa o azúcar común, por lo que el valor de 200 veces se obtiene al compararlo con diluciones hechas en laboratorio de sacarosa (dulzura relativa = 100) al 15%. El aspartamo es el metiléster de dos aminoácidos naturales, el ácido aspártico y la fenilalanina, que se hidroliza liberando ambos aminoácidos y metanol, que es oxidado a formaldehído por el alcohol deshidrogenasa, presente en muchos tejidos. La presencia de restos de formaldehído en muchos tejidos demuestra que la hidrólisis no tiene lugar, al menos en su totalidad, en el intestino, sino que se produce en los tejidos, liberando formaldehído (o su producto de oxidación, ácido fórmico) en ellos, tal como ya fue demostrado a finales de los noventa 8 , el llamado "Estudio Barcelona". El metanol es también tóxico por sí mismo, dándose la circunstancia que la ingesta máxima permitida de aspartamo puede liberar una cantidad de metanol por encima de la dosis máxima diaria permitida para este alcohol.

Ambos ensayos dan negativos por lo tanto no presenta enlaces peptidicos y tampoco presenta tirosina o triptófano

GLICINA:

La glicina o glicocola (Gly, G) es uno de los aminoácidos que forman las proteínas de los seres vivos. En el código genético está codificada como GGT, GGC, GGA o GGG. Es el aminoácido más pequeño y el único no quiral de los 20 aminoácidos presentes en la célula. Su fórmula química es NH2CH2COOH y su masa es 75,07. La glicina es un aminoácido no esencial. Otro nombre (antiguo) de la glicina es glicocola. La glicina actúa como neurotransmisor inhibidor en el sistema nervioso central. Fue propuesta como neurotransmisor en 1965.

La glicina se utiliza -in vitro- como medio gástrico, en disolución 0,4 M, amortiguada al pH estomacal para determinar bioaccesibilidad de elementos potecialmente tóxicos (metales pesados) como indicador de biodisponibilidad.

La glicina no es esencial en la dieta humana, ya que el propio cuerpo se encarga de sintetizarla. Todas las células tienen capacidad de sintetizar glicina. Hay dos vías para sintetizarla: la fosforilada y la no-fosforilada. El precursor más importante es la serina. La fosfoserina fosfatasa, desfosforila a la fosfoserina hasta serina. La enzima serina hidroximetil transferasa da lugar a la glicina a partir de la serina. La glicina usada como neurotransmisor es almacenada en vesículas, y es expulsada como respuesta a sustancias. Industrialmente se prepara mediante una reacción de un solo paso entre el ácido cloroacético y el amoníaco.

ClCH2COOH + NH3 → H2NCH2COOH + HCl.

La reacción da negativa en ambos casos y pos lo tanto deducimos que la glicina no presenta enlaces peptidicos y tampoco presenta tirosina o triptófano.

TABLA DE RESULTADOS

MUESTRA            BIURET         XANTOPROTEICO 

Caseína                     +                            +Gelatina                     +                            -Ovoalbúmina            +                            +Aspartamo               -                              -Glicina                       -                             -

Errores sistemáticos y asistemáticos de la práctica tenidos en cuenta son:

En el transcurso de la práctica, las mediciones fueron a ojo y con un gotero, por lo que no fue utilizada una pipeta graduada. Esto trae con sigo errores ya que la medida exacta de reactivo fue tomada con un error mínimo para todos los casos y así con las muestras.También la limpieza de los tubos de ensayo puede llevar a errores, ya que a pesar de que los tubos fueron previamente limpiados, podrían haber tenido algún residuo.Otro factor del error a tener en cuenta es a la temperatura a la que llevamos la gelatina que pudo no haber alcanzado para reaccionar completamente. Otro factor pudo haber sido el estado de los reactivos o muestras, como por ejemplo la leche que pudo haber estado en mal estado.

PROTEÍNAS 2: diálisis

FUNDAMENTO TEÓRICO:

La purificación de proteínas consiste en tomar una alícuota del precipitado y dializar mediante el flujo selectivo de materia de una zona de mayor concentración a otra de menor concentración con ayuda de presión osmótica, es decir, separando dos disoluciones de concentraciones diferentes por una membrana semi permeable (una membrana que permite el paso selectivo de las moléculas del disolvente, pero impide el paso de compuestos de mayor peso molecular).De ésta manera se puede concentrar un producto o separarlo de una mezcla de moléculas. Es necesario realizar éste paso a baja temperatura y en agitación constante, ya que la diálisis es un proceso molecular que depende exclusivamente de los movimientos aleatorios de las moléculas individuales

Materiales:

DializadorVaso de BohemiaGelatina en soluciónAgNO3 (Nitrato de Plata)

NaOH  al 10%CuSO4 al 1 %

¿Qué criterio se utiliza para determinar si el ensayo de biuret resulta positivo o negativo?

El criterio para determina si la muestra de estudio resulta positiva o negativa ,se debe a que el reactivo, de color azul, cambia a violeta en presencia de proteínas, y vira a rosa cuando se combina con polipéptidos de cadena corta, por lo cual si la solución final nos da una coloración violeta , se refiere a que se ha detectado una presencia de proteínas o mejor dicho de enlaces peptidicos.

¿Para qué es necesario el Nitrato de Plata en este práctico?

Como dijimos con antes, la solución que se coloca en el instrumento tiene además de proteínas, sales y el nitrato de plata diriamos que es un determinador de sales en una solucion .

El cloruro de plata es un sólido blanco, y su formación determina que el ensayo sea positivo o negativo

En agua, tanto el nitrato de plata como el cloruro de sodio de disocian de la siguiente manera:

Reacción:

AgNO3           (Ag +) + (NO3-)  (ac)

         Catión Plata     Anión Nitrato

NaCl          (Na+) + ( Cl -) (ac)

          Catión  Sodio  Anión Cloruro

Luego:

(Ag+) (ac) + (Cl-)  (ac)      AgCl (s)

                                           

Procedimiento de la práctica:

Colocamos una solución dentro del dializador (ovoalbumina y NaCl) y, tomando dos pequeñas muestras, la testeamos en busca de sales y proteínas (realizamos práctica con AgNO3 y ensayo de Biuret, ambos de los cuales fueron positivos. Luego, colocamos el instrumento dentro de un vaso de Bohemia con agua, y luego de un tiempo, se tomo pruebas de biuret y AgNO3 dentro y fuera del dializador.

Azul - proteinas y rojo - sales

BIURET AgNO3

INTERIOR + +

EXTERIOR - +

Baso de Bohemia que contenía agua destilada:

a) Biuret: NEGATIVOb) AgNO3: POSITIVO

A partir de esto, podemos ver que el AgNO3 nos dio positivo, por lo tanto denotamos la presencia de sales, que anteriormente no había dentro del vaso de bohemia. El ensayo de Biuret nos dio negativo, lo que quiere decir que no hay proteínas en la muestra. Esto prueba que las proteínas no atravesaron la membrana semi-permeable del dializador.

Muestra dentro del dializador:

a) Biuret: POSITIVOb) AgNO3: POSITIVO

Una vez obtenidos estos datos, podemos afirmar que el ensayo de AgNO3 dio positivo. La concentración de sales de la muestra bajó considerablemente. Como ya dijimos anteriormente, las proteínas de la muestra no pudieron atravesar la membrana semi-permeable del dializador, razón por la cual el ensayo de Biuret aplicado en esta muestra dio positivo. La diálisis funcionó.