1. Tema 4. Protenas: funciones biolgicas y estructura primaria. Enlace peptdico. Pptidos y protenas. Diversidad de funciones biolgicas. Niveles de organizacin estructural de las protenas. Separacin y purificacin de protenas. Estructura primaria. Informacin a partir de la secuencia de aminocidos. Protenas homlogas. Mtodos de anlisis de protenas BIOQUMICA-1 de Medicina Dpto. Biologa MolecularJess Navas LOS AMINOCIDOS SE PUEDEN UNIR POR ENLACES PEPTDICOSDos aminocidos Eliminacin de unamolcula de agua Enlace peptdico ... Formacin del enlace CO-NHExtremo amino Extremo carboxiloTEMA 4 Garret & Grisham , 1999 2

2. PEPTIDOS Y PROTEINAS Pptido: hasta 50 aminocidos. Oligopptido: pptido pequeo. Polipptido: pptido grande. Protenas oligomricas: formadas por subunidades idnticas llamadas protmeros. Protenas sencillas y conjugadas (grupo prosttico)TEMA 4 3 SECUENCIA DE LA INSULINA DE VACA La insulina tiene dos cadenas unidas por dos puentes disulfuro. La cadena A tiene 21 aa y la B tiene 30 aa.TEMA 4Garret & Grisham , 1999 4 3. TEMA 4 5TEMA 4 6 4. Clasificacin de protenas segn su grupo prostticoTEMA 4(Lehninger, 2000)7Niveles de organizacin de las protenasEstruct. primariaEstruct. secundaria Estruct. terciariaEstruct. cuaternariaAminocidos Hlice alfaCadena polipeptdica Subunidades ensambladasTEMA 4(Lehninger, 2000)8 5. Factores que determinan la conformacin proteica Adems de la estructura primaria, las condiciones fsico-qumicas del entorno: cambios en el pH, concentracin salina, temperatura, otros factores ambientales. Desnaturalizacin es la prdida de la conformacin de una protena. Una protena desnaturalizada pierde su actividad biolgica.TEMA 49Clasificacin de protenas segn su grupo prostticoTEMA 4(Lehninger, 2000) 10 6. PURIFICACIN Y ANLISIS DE PROTENAS 1. Obtencin del extracto crudo 2. Fraccionamiento del extracto crudo por precipitacin con sulfato amnico y dilisis 3. Cromatografa en columna: Por su carga: cromatografa de intercambio inico Por su masa: cromatografa de filtracin molecular Por sus propiedades biolgicas: cromatografa de afinidad 4. Electroforesis en gel: Electroforesis en poliacrilamida-SDS Enfoque isoelctrico Electroforesis bidimensionalTEMA 4 11 DilisisTEMA 4 12 7. CromatografaintercambioinicoTEMA 4(Lehninger, 2000) 13Cromatografade exclusinmolecularTEMA 4(Lehninger, 2000) 14 8. WCromatografade afinidad TEMA 4 (Lehninger, 2000) 15Separacin de protenas por electroforesisen geles de poliacrilamida-SDS TEMA 416 9. Determinacin de la masa molecular de una protena por Patroneselectroforesis en poliacrilamida-SDSTEMA 4 17Sangre: clulas y protenas plasmticas La sangre es un sistema de transporte ydistribucin de nutrientes. Est formada por una solucin acuosa quecontiene molculas de tamao variable y diversostipos de elementos celulares.TEMA 4 18 10. Plasma y suero Los elementos formes de la sangre se encuentran en una suspensin acuosa denominada plasma. Es el sobrenadante obtenido al centrifugar una muestra de sangre tratada con anticoagulante. Suero: sobrenadante obtenido al centrifugar una muestra de sangre despus de haber dejado que coagule. La mayora de las determinaciones qumicas se hacen en suero.TEMA 4 19 Protenas plasmticas Sintetizadas en el hgado: albmina. Producidas por las clulas plasmticas de la mdula sea: inmunoglobulinas.TEMA 4 20 11. - 50% de la protena plasmtica humana - Concentracin en sangre: 35-55 g/l - Pm = 66 kDa, muy soluble en agua. - A pH 7 es un polianin con 20 cargas negativas (fija muchos ligandos) - Posee hendiduras hidrfobas capaces de fijarse a cidos grasosTEMA 421 PROTEINOGRAMA Protenas totales: 6-8 g/100ml Albmina: 35-55 g/100 ml Globulinas: 2-3 g/100 ml ELECTROFORESIS Albmina45-55 % total Globulinas 15-8 % 28-13 % 11-17 % 15-25 %TEMA 422 12. PATRONES DE ALTERACION DEL PROTEINOGRAMATEMA 423TEMA 424 13. CUANTIFICACION DE PROTEINAS Protena total (Biuret, Bradford). La cuantificacin de una protena requiere un ensayo biolgico especfico que permita medir su actividad (ej: ensayo de la actividad de un enzima). Parmetros ms utilizados: ACTIVIDAD: unidades totales de la protena (definir 1 U) ACTIVIDAD ESPECIFICA: n unidades de la protena/mg de protena total. A lo largo del proceso de purificacin va disminuyendo la actividad total y aumentando la actividad especfica.TEMA 425TEMA 426 14. Separacin de protenas por electroenfoqueTEMA 4 (Lehninger, 2000)27 Electroforesis bidimensional de protenasTEMA 4 28 (Lehninger, 2000) 15. La electroforesis bidimensional (isoelectroenfoque + electroforesisen SDS) permite separar las 4.000-5.000 protenas de una clula SegundaTEMA 4Primera 29PROTEOMA Y MEDICINA Proteoma: totalidad de las protenas que concurren a la realizacin de distintos procesos biolgicos. Posee una naturaleza dinmica modificable (ambiente, estrs, nutricin, enfermedad). El genoma humano consta de 30.000 genes, pero las protenas seran unas 300.000. Importancia en Medicina: muchos medicamentos ejercen su accin a travs de protenas o simplemente son protenas.TEMA 430 16. Para conocer la estructura primaria o secuencia de aminocidos de unaprotena:a) Sabiendo la secuencia de codones del gen:b) Secuenciando la protena: Enzimas proteolticas especficas Mtodo de degradacin secuencial de Edman Espectrometra de masas TEMA 4 31LA FUNCIN DE UNA PROTENA DEPENDE DE SUSECUENCIA DE AMINOCIDOS Protenas con funciones distintas tienen secuencias distintas. Cada protena tiene un n de residuos y secuencia caractersticos Una mutacin puntual produce un cambio en la secuencia de aacs que resulta en una protena defectuosa, que puede causar enfermedad. Protenas con funciones similares de diferentes especies tienen secuencias similares (ubiquitina, idntica en la mosca y en el hombre). El 20-30% de las protenas humanas son polimrficas (varan en diferentes individuos). La mayora de estas variaciones no afectan a su funcin. TEMA 4 32 17. Secuencias de lamioglobina humana y decachalote(Mathews & van Holde)TEMA 433Qu informacin proporciona lasecuencia de aminocidos? Prediccin de la funcin de la protena Clasificacin de las protenas en familias (25% de identidad mnima para pertenecer a la misma familia) Deteccin de motivos relacionados con funciones importantes (localizacin celular, anclaje de grupos prostticos)TEMA 434 18. PROTEINAS HOMOLOGAS Molculas homlogas: derivan de un antecesor comn. La homologa se manifiesta por una similitud significativa en lasecuencia de nucletidos y aminocidos, casi siempre proyectadaen la estructura 3D y en la funcin. Protenas homlogas: tienen secuencias de aacs y funcionessemejantes. Homlogos parlogos: homlogos presentes en la misma especie.Se diferencian en sus funciones bioqumicas detalladas. Homlogos ortlogos: homlogos presentes en especies distintas,con funciones idnticas o similares.TEMA 4 35 Gen ancestral Especiacin Genes ortlogosTEMA 4 36 19. Gen ancestralDuplicacin gnica Genes paralogosTEMA 4 37Protenas de funcin similar tienen fragmentos de secuencia similaresSabiendo la secuencia de una protena se puede predecir su funcin si se parece a la de protenas de funcin ya conocidaTEMA 4 38 (Garret & Grisham , 1999) 20. Homologa de los citocromos C de distintas especies 104 aacs, 27 invariables, 42 sustituciones conservadorasTEMA 4 39 Comparacin de secuencias de citocromo C Nmero de aminocidos variantesTEMA 4 (Garret & Grisham , 1999) 40 21. Evolucin segn la secuencia de los citocromos CTEMA 441