Propagar la Mammillaria, un verdadero reto. Título del trabajo

Memminger

Pseudónimo de integrantes

Biología

Área

Local

Categoría

Investigación Experimental Modalidad

8149156

Folio de Inscripción

Propagar la Mammillaria, un verdadero reto

3. Resumen

El cultivo de tejidos vegetales in vitro es un conjunto de técnicas que se

utilizan para la producción en masa de plantas genéticamente iguales y libres

de patógenos. Esta es una de las múltiples opciones que se tiene para las

especies que se encuentran en peligro de extinción. El CTV se basa en

recrear las condiciones del ambiente, pero en un medio estéril, nos permite

propagar plantas en cualquier momento del año. Es una técnica

recomendada ya que, con una porción de una planta, explante, se producen

masivamente copias genéticas de la misma.

Nuestra intención al realizar el CTV es encontrar un medio de cultivo

adecuado para salvar la Mammillaria, una especie en peligro de extinción, y

al encontrar el medio de cultivo que satisfaga las necesidades de esta planta

comenzar a propagarla de manera masiva para pasarla a un sustrato, donde

comenzará el proceso de aclimatación en el que los órganos que no estaban

siendo utilizados cuando la Mammillaria se encontraba en un medio de

cultivo, comiencen a cumplir con su función. Como una visión a futuro, al

concluir el proceso de aclimatación donaremos los ejemplares de

Mammillaria al sendero ecológico donde se encargan de cuidar a las plantas

que se encuentran en peligro de extinción.

Consideramos que este proyecto tiene especial importancia porque podemos

rescatar una especie en peligro de extinción y producirla de manera masiva,

pues, cuando se pierde una especie sucede un efecto domino en el que

después se pierde otra y otra hasta acabar con un ecosistema, eso sin

mencionar las consecuencias que económicas y sociales que esto conlleva.

Es por eso que surgió nuestro interés por propagar una planta que se

encuentra en peligro de extinción.

4. Introducción

4.1. Marco teórico

El investigador del Instituto de Biología de la Universidad Nacional Autónoma de

México (UNAM), Lázaro Guevara, en el marco del Día Mundial de la Vida Silvestre,

que se conmemora el 3 de marzo, afirmó que la estimación de especies de plantas

y animales silvestres que se encuentran amenazadas o en peligro de

extinción es de 30 por ciento. Expuso que lo anterior es preocupante porque la

vida silvestre es un recurso vital desde el punto de vista ecológico, cultural,

económico, político, recreativo y científico.

Las amenazas del cambio climático y de las actividades humanas en ambientes

naturales son de gran amenaza para la existencia de la vida salvaje. La mayoría de

las plantas que viven en los bosques tropicales están mayormente amenazadas.

Esto se debe, principalmente, a los cambios en nuestro hábitat y transformación de

los ecosistemas, la explotación excesiva, la destrucción, la deforestación y los

efectos del calentamiento global. Ya se estiman más de 1000 especies de plantas

mexicanas en peligro de extinción. Una de ellas es la Mammillaria mathildae.

Mammillaria mathildae es una especie perteneciente a la familia Cactaceae. Se

distribuye al este de la ciudad de Querétaro en México de donde es endémica. Su

hábitat natural es el bosque tropical caducifolio y el matorral crasicaule. Es

considerada como una especie en peligro de extinción debido a la pérdida de su

hábitat. Es una planta perenne carnosa y globosa, de color verde obscuro. Los

ejemplares silvestres llegan a medir hasta 6 cm de altura. Presenta entre 11 y 12

espinas radiales y una espina central, de color café rojizo, que termina en gancho.

Sus flores son blancas con el centro de color rosa.

Esta planta fue propagada en el ITESM-Campus Querétaro, dentro de su Programa

de Cactáceas (1986-2001), empleando técnicas tradicionales (semilla) y

desarrollando un método in vitro exitoso (proliferación 5 veces cada 4 semanas;

enraizamiento y adaptación ex vitro 100%). A lo largo de los últimos 15 años, la

Mammillaria mathildae ha sido una especie símbolo de la pérdida de la diversidad

biológica causada por la expansión urbana de la ciudad de Querétaro. A mediados

de los noventas un grupo de individuos de esta cactácea, provenientes de la

reproducción artificial, fueron plantados en los terrenos, entonces propiedad del

Centro de Rescate Ecológico Aztlán (pertenencia de las ecologistas Heidi Bauer e

Isabel Söhn López-Formet), situados apenas a un kilómetro de la localidad original

de La Cañada (ver la fotografía con el Sr. Charles Glass disponiéndose a plantar

una de estas biznagas). A pesar de los esfuerzos incesantes de algunos pocos, el

destino de esta suculenta continúa siendo desfavorable. En marzo del 2005, se

declaró una parte de la superficie del cerro del Tángano zona de preservación

ecológica; aunque M. mathildae no ha sido explícitamente referida de esa localidad,

el lugar sí constituye un hábitat potencial para el repoblamiento natural o artificial

(E. Sánchez, 2005, personal).

Es una especie de carácter ornamental que si bien no es una de las más

demandadas sí representa un símbolo para la conservación local y defensa del

medio en el municipio de Querétaro, en donde ha sido empleada como especie

bandera junto con el nopal Opuntia elizondoana. La importancia taxonómica, por ser

vínculo entre las Stylothelae del Este de México y las de occidente, es de

considerarse (E. Sánchez, 2005, personal).

De todo lo anterior, se deriva la necesidad de preservar esta especie, y una opción

es a través del Cultivo de Tejidos Vegetales (CTV) in vitro.

El cultivo de células y tejidos vegetales se refiere al conjunto de técnicas usadas

para crecer células, tejidos u órganos vegetales in vitro, bajo condiciones asépticas,

controladas y libres de microorganismos (Street 1977, Calva y Ríos 1999). Se basa

en el principio de totipotencia, que indica que cualquier célula vegetal contiene una

copia íntegra del material genético de la planta a la que pertenece sin importar su

función o posición en ella, y por lo tanto tiene el potencial para regenerar una nueva

planta completa (Ferl y Paul 2000).

El proceso involucrado en la transformación de una célula a una planta u órgano,

inicialmente lo llamaron diferenciación celular, pero actualmente se denomina

organogénesis.

El procedimiento general consiste en inocular un medio de cultivo gelificado

(generalmente con agar) con un fragmento de tejido u órgano vegetal, llamado

explante, previamente tratado para eliminar todo organismo que se encuentre en su

superficie (desinfestación).

El cultivo se incuba bajo condiciones ambientales de luz, temperatura y humedad

controladas, que junto con las fisicoquímicas y nutricionales conducen el desarrollo

del explante hacia la formación de una masa celular amorfa denominada callo, o

hacia la diferenciación en un tejido organizado que producirá órganos o embriones.

Los callos obtenidos mediante este procedimiento pueden subcultivarse para su

mantenimiento y propagación o inducir su diferenciación para formar órganos

(organogénesis), embriones (embriogénesis) o pasarse a un medio de cultivo

líquido para obtener células y pequeños agregados en suspensión.

Los cultivos se mantienen bajo las mismas condiciones físicas y fisicoquímicas

usadas para la inducción de callos. Los cultivos de órganos se pueden rediferenciar

hasta plantas completas (micropropagación) que luego se transfieren a invernadero.

La temperatura de los cultivos generalmente se controla entre 25 y 28 °C, el pH

entre 5.2 y 6.5 y la luz de 0 a 12,000 lux (Calva y Ríos 1999, Seabrook 1980, Martin

1980, Yasuda et al 1972).

Las principales aplicaciones de la técnica de cultivo de células, tejidos y órganos

vegetales son en los campos de micropropagación, obtención de plantas libres de

patógenos, preservación de germoplasma, mejoramiento genético, biosíntesis de

metabolitos e investigación básica en áreas como la genética, fisiología y bioquímica

(Fowler 1987, Carpita y McCann 2000).

Un medio de cultivo es una formulación de sales inorgánicas y compuestos

orgánicos (vitaminas, aminoácidos, etc.), fitorreguladores de crecimiento y fuente

de carbono; requeridos para la nutrición y manipulación de los cultivos in vitro.

Existen numerosas formulaciones, cada una de las cuales comprende entre seis y

40 compuestos, cada formulación tiene un fin específico.

De entre la gran diversidad de éstos, habitualmente se utiliza el medio Murashige

y Skoog (MS) es el medio más conocido. Se elaboró en 1962, tomando el cultivo

in vitro de tabaco como modelo y siguiendo un procedimiento cuantitativo se

determinaron las concentraciones más adecuadas de todos los nutrientes. El

medio MS es apto para la mayoría de las especies, por lo que es de amplia

utilización, excepto para las más sensibles a la salinidad ya que se caracteriza

por tener una elevada concentración salina. En el Anexo 1, se encuentra la

formulación del medio MS.

4.2. Objetivo

• Indagar sobre el medio de cultivo que cumpla con los requerimientos de la

Mammillaria para que pueda desarrollarse adecuadamente desde el callo

hasta la plántula.

4.3. Problema

Como parte de nuestro proyecto de investigación decidimos indagar sobre

diferentes plantas que se encuentran en peligro de extinción, para así encontrar el

medio de cultivo necesario para propagarlas de manera masiva y evitar la extinción

de alguna especie. Luego, nuestras asesoras nos llevaron al laboratorio de CTV de

la Facultad de Química (Conjunto E); ahí, las investigadoras hicieron preguntas y

nosotras participamos asertivamente, demostrando nuestro interés en las especies

en peligro de extinción. Entonces, nos proporcionaron callo de la especie

Mammillaria, una planta perteneciente a la familia Cactaceae.

La investigadora, responsable del laboratorio de CTV, Mtra. María Teresa Olivares,

nos explicó que hasta el momento sólo habían logrado generar el callo de la

especie, pero no habían logrado avanzar más. Por lo tanto, esperaba que nosotras

lográramos desarrollar la plántula.

Así, nuestro problema se limitaba a encontrar un medio de cultivo óptimo para el

desarrollo del callo hasta la plántula. Es decir, buscar los nutrientes y sus

concentraciones, necesarias para la generación de la plántula.

4.4. Hipótesis

Sí el desarrollo del callo de la Mammillaria está controlado por el

metabolismo hormonal y/o de suplementos del medio de cultivo, entonces

se observará el desarrollo del callo hacia la plántula, al manipular estos

componentes del medio.

5. Desarrollo

Se utilizó la técnica de cultivo de tejidos vegetales in vitro, en donde se pueden

destacar algunas etapas; pero, es necesario aclarar que cada etapa requiere de una

metodología en específico. No obstante, que mencionaremos e ilustraremos las

etapas, únicamente se detallará la elaboración de los medios, por ser el punto

central de la investigación. Las etapas son:

a) Lavado y esterilización de los materiales a usar.

b) Preparación de los medios de cultivo, incluyendo su esterilización.

En general se deben considerar los siguientes puntos:

I. Colocar agua destilada y esterilizada, en un vaso de precipitado de plástico

(aproximadamente dos tercios del volumen a preparar).

II. Se agregan las sustancias que van a formar parte del medio de cultivo

vegetal (indicadas en la Tabla 1).

III. Los componentes como el agar y sacarosa se solubilizan por separado (en

ese orden) con ayuda de la placa de agitación y calentamiento en horno de

microondas, teniendo cuidado con el hervor. Se agregan al vaso.

IV. Cuando el medio de cultivo requiera carbón activado, éste se agregará

después de haber ajustado el pH al medio.

V. El pH se ajustará con ayuda del potenciómetro a 5.7 ± 0.1, este ajuste es

importante, puesto que afecta el tejido. Con la consistencia del medio en pH

< 4.8, el gel pierde firmeza, se hace blando y pH > 6.0 adquiere una

consistencia más dura, el pH se ajusta con NaOH o HCl 0.1 N. Se afora al

volumen deseado.

VI. Con ayuda de una probeta graduada, se depositan 30 ml de agua en un

frasco Gerber para que éste sirva de referencia en cuanto a la cantidad de

medio de cultivo que debe depositarse en cada frasco.

VII. Se abren los frascos Gerber (previamente esterilizados y rotulados) y se

agregan aproximadamente 30 mL del medio de cultivo preparado en cada

frasco. Posteriormente se cierran de inmediato.

VIII. Los frascos se esterilizan en la autoclave a una temperatura de 120ºC (20

lb.in2) durante 20 minutos, verificando el nivel de agua de la autoclave en

condiciones de seguridad.

IX. Los frascos esterilizados, se sacan de la autoclave antes de enfriarse por

completo y se colocan en una superficie recta para favorecer la regularidad

de la superficie del medio.

X. Finalmente, los medios completamente fríos están listos para inocularse.

c) Inoculación de los medios de cultivo con el material biológico a usar, en este

caso, el callo de la Mammillaria.

d) Incubación de los medios de cultivo inoculados en condiciones de luz y

temperatura controladas.

e) Aclimatación de las plántulas.

En el esquema 1, se puede observar los principales componentes de un medio de

cultivo, así como la función de cada uno. Ahí mismo, se encuentran las sustancias

con las que nosotras trabajamos; pues, aunque existe una gran variedad de ellas,

sólo utilizamos a las que tenemos en el laboratorio. Por citar un ejemplo, existen

varios carbohidratos que se pueden utilizar como fuente de energía y

osmoreguladores, tales como el manitol, sorbitol, fructuosa y otros; sin embargo,

únicamente usamos sacarosa, porque es a la que tenemos acceso.

En la Tabla 1, se encuentra detallada la composición de cada medio de cultivo que

experimentamos y en la Tabla 2, se justifica su composición.

Tabla 1. Composición de los medios de cultivo probados

COMPONENTE MEDIO DE CULTIVO

CONTROL Mm1 Mm2 Mm3 Mm4 Mm5 Mm6 Mm7 Mm8

MS (comercial)

50% 50% 50% 50% 50% 50% 50% 50% 50%

Agar (g/L)

9.0 9.0 9.0 9.0 9.0 9.0 9.0 9.0 9.0

Tiamina (mg/L)

0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1

Ácido nicotínico (mg/L)

0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5

Piridoxina (mg/L)

0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5

Myo-Inositol (mg/L)

100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0

Glicina (mg/L)

2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0

Sacarosa g/L)

45.0 45.0 45.0 45.0 45.0 45.0 45.0 30.0 15.0

Cefotaxime (mg/L)

--- 10.0 0 10.0 --- --- --- --- ---

BAP (mg/L)

--- 0 15.0 15.0 --- --- --- --- ---

Agua de coco (%)

--- --- --- --- 20 0 20 20 20

Carbón activado (g/L)

--- --- --- --- --- 1.0 1.0 1.0 1.0

Nota: Hay que enfatizar que las concentraciones para todas las sustancias que utilizamos,

son las recomendadas y usualmente usadas en la bibliografía revisada.

Tabla 2. Justificación de la composición de los medios (introducción de variables)

Medio de

cultivo

Justificación

Control Es en el que se encontraba el callo inicialmente y que se nos

proporcionó junto con el callo.

Mm1 Se decidió introducir al medio de cultivo un antibiótico (cefotaxime)

porque aún teníamos problemas de contaminación bacteriana en los

medios de cultivo y queríamos prevenirla.

Mm2 El BAP (Bencil Amino Purina) es una fitohormona que promueve la

diferenciación del callo, es por ello que se introdujo al medio de

cultivo.

Mm3 También se probó utilizar en conjunción cefotaxime y BAP.

Mm4 Luego que no se vio ninguna mejora en M1, M2 y M3, con respecto al

control. Se introdujo agua de coco, quien promueve la inducción de la

embriogénesis somática y la maduración de los embriones.

Mm5 Se adicionó carbón activado, porque favorece la germinación y la

maduración de los embriones. También ayuda a controlar la

oxidación, un problema al que veníamos enfrentándonos, desde el

control.

Mm6 Se probó la conjunción de agua de coco y carbón activado.

Mm7 Una vez que se empezó a desarrollar la plántula, se disminuyó la

cantidad de sacarosa, para obligar a la planta a realizar la

fotosíntesis.

Mm8 Se probó una concentración menor de sacarosa.

6. Resultados

En la foto de la izquierda se muestra

el medio de cultivo control, observe

que el medio es claro, casi

translucido y que el callo de la

Mammillaria es verde opaco.

Las siguientes figuras muestran los medios de cultivo con los que se inició la

investigación.

Mm1 Mm2 Mm3

Cefottaxime BAP Cefottaxime + BAP

La fotografía de la izquierda, muestra el medio de cultivo con cefotaxime, un

antibiótico que se adiciono para prevenir el desarrollo de bacterias. En la

imagen de en medio, se muestra el medio adicionado con BAP (Benzo Amino

Purina) una hormona que promueve la diferenciación de callo. Finalmente,

en la izquierda se muestra el medio con cefotaxime y BAP. Advierta que en

los tres medios se oxido el callo, por lo que se consideró probar con otras

variables.

La imagen de arriba muestra, a la izquierda el control, y a la derecha los

medios de incubación Mm6 con agua de coco y carbón activado, Mm5 con

carbón activado y Mm4 con agua de coco, en orden de izquierda a derecha.

Note que en el medio 4 no hubo desarrollo del callo, y que en los medios 5 y

6, no hay diferencias significativas. Ahora el medio de cultivo es negro, por la

presencia del carbón activado.

Control En orden de izquierda a derecha, los medios de cultivo Mm6, Mm5 y Mm4

Aunque en los frascos de los medios de

cultivo Mm5 y Mm6, no se observó

diferencias; sí se observaron diferencias a

la hora de resembrar los callos, pues quizá

por lo ennegrecido del medio no se lograba

ver que el cultivo Mm5, tenia más callo

oxidado que el Mn6. Las imágenes de la

izquierda, así lo evidencian.

La primera imagen muestra la cantidad de

callo oxidado con respecto al no oxidado en

el cultivo Mm6.

En la segunda imagen, del lado izquierdo

se muestra la cantidad de callo oxidado que

se quito a un frasco de cultivo Mm5 y la de

la derecha, lo muestra para el cultivo Mm6.

Lo anterior nos lleva a inclinarnos por el

cultivo Mm6.

Al dar seguimiento al medio Mm5, el

que contiene, además del medio

basal o control, carbón activado y

agua de coco, se observó que el callo

empezó a diferenciarse, pero no

lograba hacerlo por completo, así se

muestra en la fotografía de la derecha

Entonces, se decidió bajar la concentración de sacarosa, para obligar a la

especie a realizar la fotosíntesis y elaborar su propia fuente de energía, de

tal manera que se terminará de diferenciar el callo. De ahí, se experimentó

con los medios Mm7 y Mm8, en comparación con el control, contenían dos

tercios de sacarosa en Mm7 y uno en Mm8. Se observó que en el Mm7 la

diferenciación del callo era mejor. Las imágenes de abajo lo avalan.

Finalmente, la plántula generada a partir del callo se pasó a sustrato, tal

como se muestra abajo.

7. Análisis e interpretación de resultados

Es importante comentar que el cultivo de tejidos vegetales es una técnica

multidisciplinaria, que demanda muchos y variados conocimientos, además

de habilidades. Dominarla es imprescindible para dar validez a los resultados.

Es por ello que decidimos empezar con la incorporación a los medios de

cultivo de un antibiótico, para prevenir la proliferación de bacterias, pues la

verdad nos tomo bastante esfuerzo y concentración dominar la técnica, es

decir, no tener contaminación bacteriana, ni de hongos en los cultivos.

También, consideramos al inicio, la incorporación de una hormona que

estimulará la diferenciación del callo, pues como se expreso en el marco

teórico, la técnica de CTV (cultivo de tejidos vegetales), se basa en el

principio de totipotencialidad, el callo es solo un cumulo de células

indiferenciadas, que deben evolucionar a células diferenciadas o

especializadas para empezar a funcionar como una planta completa. Una de

las funciones de la hormona BAP, es precisamente promover la

diferenciación del callo. Sin embargo, los resultados de la experimentación

nos demuestran que estas sustancias no ayudan a lograr tal diferenciación.

Luego de realizar estos experimentos, nuestra primera pretensión fue probar

otras hormonas, sin embargo, eso no fue posible porque no contamos con

otras en el laboratorio. Así, en la bibliografía consultada se menciona mucho

el uso de agua de coco y carbón activado como suplementos nutrimentales

para los cultivos de tejidos. Se reporta que la función del carbón activado es

como adsorbente y antioxidante, dado que los cultivos se oxidaron decidimos

incorporar esta variable.

Por otra parte, se atribuye al agua de coco la propiedad de promover el

desarrollo y maduración de embriones, por ello se pensó que este ingrediente

puede ayudar a la diferenciación del callo.

A su vez, la sacarosa en un medio favorece el crecimiento de la planta,

puesto que la sacarosa es parte del proceso de fotosíntesis y el metabolismo.

Se probaron cada uno por separado, en los medios de cultivo Mm4 y Mm5,

y en el Mm6 se conjuntaron los dos. Cabe hacer mención que se noto una

gran mejoría y desarrollo del callo cuando están presentes ambos; pero hay

que aclarar que el callo se empezó a diferenciar pero no se completaba ésta,

porque como se observa en las fotos, solo aumenta la masa del callo y se

vislumbra alguna plántula muy pequeña.

Con este avance nos motivamos, pues la verdad ya habíamos dedicado

mucho tiempo y esfuerzo y aún se había visto ningún avance. Luego se

decidió disminuir la cantidad de sacarosa, pues probablemente el callo

estaba muy mimado con todos los nutrientes en exceso, que no tenía la

necesidad de desarrollarse. También, vimos avances, pues al disminuir su

concentración de sacarosa se mejoró el desarrollo hacia la plántula.

Los resultados indican que el mejor medio para promover el desarrollo del

callo es el Mm7, pues con éste logramos llegar a obtener la plántula.

Nuestra motivación es mayúscula, porque logramos nuestro objetivo. Sin

embargo, estamos conscientes que solo es el principio para la

micropropagación masiva de esta especie, pues necesitamos seguir

investigando para lograr primero que se reproduzcan los resultados, y

segundo, que la planta pueda aclimatarse favorablemente para completar el

esquema de etapas de la técnica CTV.

También, hay que remarcar, que tuvimos la suerte de partir del callo, así nos

ahorramos la etapa de desinfectar la especie, sembrar los tejidos y generar

el callo.

8. Conclusiones

El medio de cultivo encontrado para propiciar el desarrollo de callo hacia la

plántula es el Mm7:

MS (comercial)

50%

Agar (g/L)

9.0

Tiamina (mg/L)

0.1

Ácido nicotínico (mg/L)

0.5

Piridoxina (mg/L)

0.5

Myo-Inositol (mg/L)

100.0

Glicina (mg/L)

2.0

Sacarosa g/L)

30.0

Agua de coco (%)

20.0

Carbón activado (g/L)

1.0

La técnica de CTV es apropiada para la micropropagación de especies en

peligro de extinción.

La Mammillaria es una especie perteneciente a la familia Cactaceae. Es

considerada como una especie en peligro de extinción debido a la pérdida de su

hábitat. Sin embargo, es posible preservarla, por la técnica de CTV.

En la actualidad, algunos investigadores y organismos trabajan en preservar las

especies y paliar esta abrupta desaparición. Hay que notar los esfuerzos de la

UNAM por fomentar el cultivo y conservación de algunas de nuestras plantas

mexicanas en peligro de extinción. El Jardín Botánico del Instituto de Biología

de la universidad resguarda en sus colecciones 300 de las 945 especies

consideradas en riesgo de acuerdo a la Norma Oficial Mexicana 059. Si bien

conservar algunos ejemplares de plantas en riesgo en los Jardines Botánicos es

útil, no es suficiente para asegurar la conservación de las especies vegetales de

nuestro país y el planeta. Por ello, proponemos estudios de este género para

ayudar a la preservación de las especies.

9. Fuentes de información

Sánchez, E., Arias, S., Hernández Martínez M. M. y Chávez, R. 2006. Ficha

técnica de Mammillaria mathildae. En: Sánchez, E. (compilador). Apuntes técnicos

para el conocimiento de la situación de conservación de especies de la familia

Cactaceae en el estado de Querétaro. Jardín Botánico Regional de Cadereyta "

Ing. Manuel González de Cosío" Consejo de Ciencia y Tecnología del Estado de

Querétaro-(CONCyTEQ). Bases de datos SNIB-CONABIO. Proyecto No. CK016.

México, D.F.

Altamirano, R. & Sharry, S. (2018). Aplicación del cultivo de tejidos in vitro (CTV)

para la propagación de especies leñosas. Facultad de Ciencias Agrarias y

Forestales. Universidad Nacional de Plata. Consultado el 3 de marzo de 2019. (pp.

11-15).

Castillo, A. (2004). Unidad de Biotecnología, INIA Las Brujas. Propagación de

plantas por cultivo in vitro: una biotecnología que nos acompaña hace mucho

tiempo. Recuperado el 3 de marzo de 2019. (pp. 3-8).

Mateo-Sagasta, L. (1990). Cultivo in vitro de las plantas superiores. México:

Editorial Trillas. (pp. 73).

Morgan, W.M. (2000). International Plant Laboratories, Baltonsborugh. Cultivo de

tejido vegetal. Recuperado el 3 de marzo de 2019.(pp. 1-4).

Reinoso, R. F. (2017). Departamento de Química Inorgánica e Instituto

Universitario de Materiales. Universidad de Alicante. Alicante, España. Versatilidad

de los materiales basados en carbono. Recuperado el 7 de marzo de 2019. (pp. 2-

3).

ANEXO 1

Preparación de las soluciones madre para el medio de cultivo Murashige y

Skoog (1962) (MS).

Componente Concentración en el medio MS

(mgl-1)

Concentración en la solución madre (mgl-

1)

Pesar (g) para 1 litro

Macroelementos (10X)

NH4NO3 1650 16500 16.5

KNO3 1900 19000 19.0

CaCl2 .2H2O 440 4400 4.4

MgSO4.7 H2O 370 3700 3.7

KH2PO4 170 1700 1.7

Microelementos (200X)

H3BO3 6.2 1240 1.240

MnSO4. 4H2O 22.3 4460 4.460

ZnSO4. 7H2O 8.6 1720 1.720

KI 0.83 166 0.166

Na2MoO4. 2 H2O 0.25 50 0.050

CoCl2. 6H2O 0.025 5 0.005

CuSO4.5H2O 0.025 5 0.005

Hierro (100X)

EDTA-NaFeO4 43 4300 4.3

Vitaminas (200X)

Ácido nicotínico 0.5 100 0.100

Piridoxina 0.5 100 0.100

Tiamina 0.5 100 0.100

Myo-inositol 100 20000 20.000

Otros

Glicina 2 400 *

Sacarosa 30000 Añadir fresco 30.00

Agar 8000 Añadir fresco 8.000

* Pesar 50 mg y disolver en 100 ml de agua destilada