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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO INSTITUTO DE QUÍMICA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

(BIOQUÍMICA)

THAÍS DUARTE BIFANO TESE DE DOUTORADO

�FISIOLOGIA MOLECULAR INTESTINAL DE DYSDERCUS

PERUVIANUS (HEMIPTERA)�

São Paulo

28/08/2008

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THAÍS DUARTE BIFANO

�FISIOLOGIA MOLECULAR INTESTINAL DE DYSDERCUS

PERUVIANUS (HEMIPTERA)�

Tese apresentada ao Instituto de

Química da Universidade de São Paulo para

obtenção do Título de Doutor em

Ciências (Bioquímica)

Orientador: Prof. Dr. Walter Ribeiro Terra

São Paulo

2008

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THAÍS DUARTE BIFANO

�FISIOLOGIA MOLECULAR INTESTINAL DE DYSDERCUS PERUVIANUS

(HEMIPTERA)�

Dissertação apresentada ao Instituto de Química da Universidade de São Paulo para obtenção do

Título de Doutor em Ciências (Bioquímica)

Aprovado em: ____________ Banca Examinadora

Prof. Dr. ________________________________________________________

Instituição: _______________________________________________________

Assinatura: _______________________________________________________

Prof. Dr. ________________________________________________________

Instituição: _______________________________________________________

Assinatura: _______________________________________________________

Prof. Dr. ________________________________________________________

Instituição: _______________________________________________________

Assinatura: _______________________________________________________

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Aos meus pais Fátima e Adilson ao meu irmão Gustavo e a amiga Érica por todo amor e apoio.

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AGRADECIMENTOS

Antes mesmo de entrar no Laboratório de Bioquímica de Insetos do Instituto

de Química da USP, o professor Walter Ribeiro Terra me recebeu e me apoiou na

decisão de fazer parte do seu grupo de pesquisa. Isto nunca será esquecido, muito

menos em vão. Toda a sua dedicação ao ensino e a pesquisa me faz cada vez mais

querer ser um pouco do que ele é para os seus alunos e para o meio acadêmico.

Minha gratidão é eterna e verdadeira! Da mesma forma, fui acolhida pela professora

Clélia Ferreira Terra, que além das muitas dicas e idéias para o meu projeto,

melhorando e aperfeiçoando as minhas idéias e técnicas, sempre se fez muito

presente no meu enriquecimento cultural. Duas pessoas muito especiais que serão

para sempre lembradas com muito carinho.

Minha eterna gratidão àquele que foi o meu primeiro e eterno mentor,

professor Carlos Peres Silva, presente sempre na minha vida, como um grande

amigo e como parceiro de discussões e trocas de idéias.

Agradeço aos meus familiares e principalmente a minha mãe Maria de Fátima

Duarte Cataldi Bifano ao meu pai Adilson Cataldi Bifano e ao meu irmão Gustavo

Cataldi Bifano que mesmo sofrendo com a minha constante ausência física, sempre

me incentivaram e compreenderam a importância desta jornada solitária.

Companheira para todos os momentos e situações, amiga para vida toda,

Érica Moreira de Oliveira, define tudo que eu sou e que eu quero ainda ser um dia.

Pessoa correta, justa e acima de tudo lutadora e vencedora, te amo!

Minha cachorra Mel, mesmo não sendo uma pessoa de verdade para muitos,

pra mim você é e significa paz, tranqüilidade, amor e cumplicidade nos momentos

mais difíceis. Não sei o que seria do meu doutorado sem o seu apoio diário e

incondicional.

A Ana Gomez, John e Daniel, grandes amigos, vizinhos e companheiros meu

agradecimento por estar sempre aprendendo a lidar com diferenças que só

enriquecem a nossa vida.

A Patrícia Pessoa e ao Chico Schoenmaker, agradeço pela amizade e apoio.

Aos companheiros de instituto que se fizeram presente no decorrer do meu

doutorado: Fabiane Cançado, pelas conversas sérias e outras descontraídas; Luci

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Deise Navarro, sempre me recebendo e me ajudando com os sequenciamentos de

DNA; Milton Nishiyama Junior, me salvando da selva que foi por algum tempo pra

mim, a bioinformática; além de todos dos laboratórios de Regulação da Expressão

Gênica em Microorganismos, Bioquímica Molecular de Microorganismos, Bases

Moleculares das Propriedades Catalíticas das Enzimas e Laboratório de Transdução

de Sinal.

As Técnicas do Laboratório de Bioquímica de Insetos: Luiza Nakabayashi, Ma.

Ivanilde Marcelino e Christiane Cardoso, a ajuda e dedicação de vocês serão pra

sempre lembrada com muito carinho! A aluna Daniela Beton, e Dra. Maria Cícera

Pereira da Silva, agradeço pela constante ajuda na biologia molecular, tanto na

confecção de protocolos quanto na discussão de resultados. A amiga, Nathália

Ramalho, obrigada pela presença na minha vida. Aos colegas Marcelo Padilha,

Lucas, Alexandra Drumont, Ivan Bragatto, Fábio Tamaki, Bruno Lira, Fábio Mendes,

Pedro Galvão, André Pimentel, Flávia Bartolleti, Walciane da Silva, Dr. Fernando

Genta, eu agradeço pela ajuda e pela paciência comigo!

Augusto Crivellari e Thiago Alegria, alunos dedicados que tiveram grande

importância no meu crescimento profissional, agradeço por cada momento e cada

discussão de resultados e desenho de protocolo.

A Dra. Adriana Rios Lopes, primeira pessoa que me ajudou a dar os passos

iniciais no Laboratório de Bioquímica de Insetos. Sua ajuda foi essencial para o meu

projeto. Minha admiração e reconhecimento eternos.

As agências que financiaram o meu projeto, Fundação de Amparo a Pesquisa

do Estado de São Paulo - FAPESP, e Conselho Nacional de Pesquisa - CNPq, sou

grata pelo apoio financeiro e por acreditarem na minha competência.

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RESUMO

(Bifano, T.D.), Fisiologia Molecular Intestinal de Dysdercus peruvianus (Hemiptera).

2008. 173 páginas. Tese de Doutorado - Programa de Pós-Graduação em

Bioquímica. Instituto de Química, Universidade de São Paulo, São Paulo.

A partir da identificação de catepsinas L em ensaios in vitro e em zimogramas

partimos para purificação desta enzima no inseto. A região V2 foi selecionada como

fonte de obtenção da cisteína proteinase já que dentre os três ventrículos o segundo

apresentou maior atividade específica. Após diversas tentativas de isolar esta

proteinase, foi estabelecida uma marcha de purificação que envolvia em todas as

etapas a participação de metil metanosulfonato (MMTS), o que inativa a proteinase

evitando assim autólise ao longo do processo de purificação. A marcha consistiu de

três passos cromatográficos (troca-iônica, filtração em gel e afinidade, nesta ordem)

onde foi observada a presença de duas cisteína proteinases, cada uma

apresentando respectivamente as seguintes massas moleculares 32 e 45 kDa (SDS-

PAGE). As duas cisteína proteinases possuem o mesmo pH ótimo igual a 6,3. Além

disso, estas enzimas foram termicamente inativadas a 40 ºC segundo uma cinética

de primeira ordem aparente, sugerindo a existência de apenas uma espécie

molecular de cada enzima na preparação com meia vida de 5 minutos para cis 1 e

4,8 minutos para cis 2. Foi determinada a constante de dissociação entre enzima-

inibidor, onde foi observado os valores de 17,3 nM para cis 1 e 7,11 nM para cis 2

através da titulação por E-64. A eficiência de catálise cis 1 e cis 2 é maior para o

substrato sintético Z-FR-MCA do que para Z-RR-MCA, indicando que tratava-se de

catepsinas L.

Com o intuito de descrever os mecanismos moleculares por trás dos

fenômenos fisiológicos no intestino médio do Hemiptera Dysdercus peruvianus foi

construída uma biblioteca de cDNA a partir de mRNA deste tecido. Utilizamos ESTs

provenientes desta biblioteca com o objetivo de identificar genes transcritos

relacionados com proteínas de transporte de glicose além de enzimas digestivas.

Após o processamento das leituras, surgiram 1053 ESTs úteis. Montando estes

ESTs por alinhamento de bases, foram produzidos 62 contíguos e 841 singletos, o

que totaliza 903 seqüências únicas. Entre as seqüências homólogas encontradas as

mais relevantes para o nosso estudo foram: β-glicosidase (marcadora de

membranas microvilares), α-glicosidase (marcadora de membranas

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perimicrovilares), aminopeptidase (espaço perimicrovilar), catepsina L (conteúdo de

vesículas secretoras) e proteína transportadora de açúcar do tipo GLUT. Estas

seqüências encontradas tiveram a sua transcrição específica (ou preferencial)

averiguada por RT-PCR semiquantitativo nos diferentes tecidos do inseto estudado

(intestino médio, túbulo de Malpighi, corpo gorduroso, glândula salivar, ventrículo 1,

ventrículo 2 e ventrículo 3 do intestino médio).

O transporte de glicose e água in vivo foi estudado. Para isso, os insetos

foram alimentados com uma solução contendo glicose e corante não absorvível

seguido de dissecação e análise do conteúdo luminal. O transporte de água e

glicose foi inibido por floretina 0,2 mM (inibidor do uniportador GLUT) e por florizina

0,1 mM (inibidor do simportador SGLT) e ativado por K2SO4 50 mM. Isto sugere a

presença do transportador do tipo uniportador (GLUT), e do simportador K+-glicose

(SGLT), ambos co-transportando água. O transcriptoma revelou proteína homóloga

a transportador GLUT cuja seqüência está parcialmente completa e foi analisada

com ferramentas de bioinformática.

Palavras-chave: Dysercus peruvianus, Hemiptera, transcriptoma, catepsina L,

GLUT, SGLT.

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ABSTRACT

(Bifano, T.D.), Intestinal molecular physiology of Dysdercus peruvianus (Hemiptera).

2008. 173 pages. PhD Thesis � Graduate Programe in Biochemistry. Instituto de

Química, Universidade de São Paulo, São Paulo.

After identification of cathepsins L in vitro assays and in zimograms we began

to purify this enzyme in insect midgut. The region V2 was selected as a source of

material for purifying a cysteine proteinase because it contains most of the activity of

that proteinase. After several attempts to purify this proteinase, an effective process

was developed that avoid autolysis with methyl methanethiosulfonate (MMTS), a

sulfhydryl-reactive and reversible sulfonating reagent for thiol-containing molecules.

The purify process was made by three chromatographic steps (anion-exchange

column, gel filtration column and affinity column in this order), where two cysteine

proteinase were purified, cys 1 and cys 2 with 32 and 45 kDa (SDS-PAGE). The two

cysteine proteinases have the same pH optimum of 6.3. Besides that, these enzymes

were thermicaly inactivated following apparent first-order kinetics with a half-life of 5

min (cys1) and 4.8 min (cys2) at 40 ºC. Both Cys are inhibited by E-64 with a KD of

17.3 nM (Cys 1) and 7.11 nM (Cys2). Both Cys are more active on Z-FR-MCA than

on Z-RR-MCA, suggesting they are cathepsins-L.

With purpose of describe the molecular mechanisms underlying physiological

phenomena in midgut of the Hemiptera Dysdercus peruvianus a cDNA library was

prepared from midgut mRNA. We used ESTs from this library to identify transcripts

genes related with glucose transport proteins besides digestive enzymes. Analysis of

1053 high-quality expressed sequence tags (ESTs) yielded 903 unique sequences

comprised of 62 contigs and 841 singlets. Among the homologous sequences found

the following are more relevant to our aim: β-glucosidase (microvillar membrane

marker), α-glucosidase (perimicrovillar membrane marker), aminopeptidase

(perimicrovillar space marker), cathepsin L (vesicles content) and sugar transporter

protein, GLUT. These sequences had its specific transcription (or preferential)

verified by semi-quantitative RT-PCR on different insect tissues (malpighian tubules,

salivary gland, fat body, midgut, midgut first ventriculus, second ventriculus and third

ventriculus).

The glucose and water absorption across the first ventriculus of the midgut of

the Hemiptera Dysdercus peruvianus were determined. The insects were fed with a

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glucose-non-absorbable dye solution, followed by periodical dissection of insects and

analysis of ventriculus contents. The transport of water and glucose can be inhibited

by 0.2 mM phloretin (GLUT inhibitor) and by 0.1 mM phlorizin (SGLT inhibitor) and is

activated by 50 mM K2SO4 The results suggest that D. peruvianus has a transporter

uniporter like (GLUT) and K+-glucose symporter like SGLT, both co-transporting

water. The transcriptome showed a GLUT homologous protein which sequence is

almost complete and was analyzed by bioinformatics tools.

Keywords: Dysercus peruvianus, Hemiptera, transcriptome, cathepsin L, GLUT,

SGLT.

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LISTA DE ABREVIAÇÕES

µM Micromolar

ABS Absorbância

ATP Adenosina trifosfato

BLAST �Basic Local Aligment Search�

cDNA Ácido desoxirribonucléico complementar

Cis Cisteína proteinase

DEPC Dietilpirocarbonato

DMSO Dimetilsulfóxido

DNA Ácido desoxirribonucléico

DpCaL Catepsina L de Dysdercus peruvianus

DpGLUT Transportador facilitativo de glicose de Dysdercus peruvianus

E-64 Trans-epoxIsucinil-L-leucil-amino (4-guanidino) butano

EDTA Ácido etilenodiaminotetraacético de sódio

EST �Expressed sequence tags�

FPLC �Fast Protein Liquid Chromatography�

GLUT Transportador facilitativo de glicose

IPTG Isopropiltiol-β-D-galactopiranosídeo

kcat Constante catalítica

KD Constante de dissociação

kDa Quilodaltons

Ki Constante de inibição

Km Constante de Michaellis

LB Meio de cultura de Luria-Bertani

m/v Massa/volume

MES Ácido 2-(N-Morfolino) etanoesulfônico

MMTS Metilmetanosulfonato

MOPS Ácido morfolinopropano sulfônico

MPM Membrana perimicrovilar

mRNA Ácido ribonucléico mensageiro

mU miliunidades

NPβGlu Para nitrofenil beta D glicopiranosídeo

p/v Peso/volume

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pb Pares de base

PCR Reação em cadeia de polimerase

pfu Unidades formadoras de placa

PM Peso molecular

PMSF Fenilmetilsulfonil fluoreto

RNA Ácido ribonucléico

rpm Rotações por minuto

rRNA Ácido ribonucléico ribossomal

RT-PCR Reação em cadeia de polimerase precedida de transcrição reversa

SDS Dodecil sulfato de sódio

SDS-PAGE Eletroforese em gel de poliacrilamida com dodecil sulfato de sódio

SGLT Co-transportador glicose-sódio

TAE Tampão tris acetato EDTA

Tris Tris (hidroximetil)-amino metano

UV Ultravioleta

v/v Volume/volume

V1 Ventrículo 1

V2 Ventrículo 2

V3 Ventrículo 3

V4 Ventrículo 4

Vmax Velocidade máxima

X-gal 5-bromo-4-cloro-3indol beta D-galactopiranosideo

Z-FR-MCA Carboxibenzoil-fenilalanil-arginil-7-amino-4-metil-coumarina

Z-RR-MCA Carboxibenzoil-arginil-arginil-7-amino-4-metil-coumarina

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1 - INTRODUÇÃO

1.1 - CONSIDERAÇÕES INICIAIS

Dentre os numerosos filos que constituem o Reino Animal, o filo Arthropoda

se destaca dos demais, devido à diversidade de formas de vida, correspondendo a

83% do reino animal, agrupados em diversas classes que estão distribuídas em

cinco subfilos (Trilobitomorpha, Chelicerata, Myriapoda, Hexapoda e Crustacea)

(Gallo, 1978). Dentre elas, a classe Insecta que faz parte do subfilo Hexapoda é

considerada a maior e a mais bem sucedida de todo filo Arthropoda, representando

73% dos invertebrados e 83% dos artrópodes (Maranhão, 1977).

O subfilo Hexapoda compreende fundamentalmente artrópodes terrestres,

grupos que hoje habitam ambientes aquáticos invadiram secundariamente tais

habitats através de adaptações comportamentais e modificações em seus sistemas

para trocas gasosas com o ar. Os primeiros registros indiscutíveis de fósseis de

hexápodes são criaturas sem asas do Devoniano inferior (390 milhões de anos

atrás) que lembram os colêmbolos modernos (Collembola) e as traças-saltadoras

(Archaeognatha), os primeiros insetos fósseis com asas apareceram mais tarde no

Devoniano. No entanto, existem rastros fósseis que se parecem muito com os dos

hexápodes, e o relógio molecular sugere uma origem dos insetos do início do

Siluriano.

A mais espetacular irradiação evolutiva dos Hexapoda ocorreu, sem dúvida,

entre insetos, os quais habitam quase todos os hábitats concebíveis no meio

terrestre e na água doce e, de forma menos comum, até na superfície dos oceanos e

regiões litorâneas marinhas. Insetos também são encontrados em locais muito

improváveis, tais como poços e lagoas salgadas. Frequentemente vivem onde pouco

dos demais animais ou plantas conseguem existir. Não é exagero dizer que os

insetos governam a terra. Sua diversidade e abundância desafiam a imaginação.

Não sabemos quantas espécies de insetos existem, nem mesmo quantas

foram descritas. Estimativas publicadas do número de espécies descritas variam de

890.000 até mais de um milhão. Uma média de aproximadamente 3.500 novas

espécies tem sido descrita anualmente, de Lineu, em 1758, embora, nas últimas

décadas, essa média tenha subido para 7.000 novas espécies por ano. As

estimativas do número de espécies que ainda deverão ser descritas variam de 3

milhões a 100 milhões.

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A rica diversidade dos insetos parece ter surgido através da combinação de

características vantajosas, incluindo a exploração evolutiva dos genes de

desenvolvimento trabalhando sobre corpos segmentados e compartimentalizados, a

coevolução com as plantas (particularmente plantas com flores), a miniaturização, e

a invenção do vôo.

Em 1920, Brues apud Panizzi e Parra (1991) publicou um estudo sobre a

seleção de plantas hospedeiras por parte de insetos, especialmente lepidópteros e

concluiu que, salvo algumas exceções, estes insetos demonstravam acentuada

preferência em selecionar plantas de famílias ou gêneros e sugeriu a idéia de uma

evolução paralela sendo mais tarde definido como uma evolução adaptativa paralela

recíproca que determinava os padrões de uso da planta hospedeira pelos insetos.

Aproximadamente metade das espécies de insetos se alimenta de plantas,

entretanto, possivelmente nenhuma espécie de planta em seu meio ambiente é

atacada por todas as espécies de insetos e não é comum que um inseto, em seus

limites geográficos, se alimente indiscriminadamente de todas as plantas

(Thorsteinson, 1960 apud Panizzi e Parra, 1991). Simples observações demonstram

que os insetos vivem associados com certas espécies ou partes de plantas (Dethier,

1976 apud Panizzi e Parra, 1991).

A interação entre insetos e plantas levou ao longo da evolução ao

desenvolvimento de mecanismos de defesa contra o ataque de pragas (Gatehouse

et al., 1990). Estudos têm revelado que as plantas defendem-se de insetos e

patógenos produzindo substâncias químicas que os repelem ou intoxicam (Maug,

1982). Entre esses compostos existem proteínas capazes de inibir as enzimas

digestivas dos insetos e cujas concentrações nas plantas podem variar em resposta

ao ataque pelas pragas. O conhecimento da distribuição das enzimas no tubo

digestivo dos insetos permitirá inferir a facilidade de acesso do inibidor às diferentes

enzimas. Isso poderá orientar a seleção de variedades de plantas economicamente

interessantes capazes de produzir inibidores das enzimas mais acessíveis e

eficazes, tornando-as mais resistente às pragas.

Embora a utilização de genes que levam a expressão de proteínas

potencialmente tóxicas estarem sendo estudadas e muitas delas já terem sido

inseridas em plantas de interesse econômico tornando-as resistentes a insetos-

praga (Vaeck et al., 1987; Hilder et al., 1987), uma desvantagem dessa tecnologia

são os altos níveis da proteína normalmente requeridos para afetar o inseto (Brunke

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e Meeusen, 1991). Um maior conhecimento das enzimas digestivas dos insetos

poderia levar ao desenvolvimento de inibidores específicos dessas enzimas que

poderiam ser usados como uma nova geração de praguicidas.

Os insetos também são excelentes modelos de estudo do sistema digestivo

devido a grande adaptação em relação a dietas e habitat e também pelo seu

intestino ser uma das principais interfaces entre o inseto e o meio ambiente (Terra e

Ferreira, 2005).

Entretanto, o conhecimento sobre a organização do processo digestivo dos

insetos ainda não foi completamente elucidado (Terra e Ferreira, 2005). Entende-se

nesse contexto, a necessidade do desenvolvimento de estudos esclarecedores, uma

vez que a tecnologia de transferência de genes entre diferentes organismos já se

encontra bem avançada, porém, o conhecimento de alvos a serem explorados ainda

é reduzido.

1.2 - PERDAS AGRICOLAS CAUSADAS PELOS INSETOS E IMPORTÂNCIA ECONÔMICA DA

CULTURA DO ALGODÃO

A cultura do algodão (Gossypium hirsutum L.) é uma das mais tradicionais do

Brasil e tem dado sinais de forte avanço nos últimos anos. A sua cadeia produtiva

gera riquezas superiores a 25 bilhões de dólares anualmente, representando cerca

de 4% do PIB nacional e mais de 13,5% do PIB industrial (Têxtil, 2004).

O setor têxtil é um dos maiores empregadores do Brasil, com 1.650 milhões

de postos de trabalho, apesar da forte modernização tecnológica que se vem

observando desde a abertura da economia, no início da década de 1990 (Anuário

Brasileiro do Algodão, 2006).

No ano de 2005, o setor têxtil exportou 2,2 bilhões de dólares, um recorde

histórico, valor 5,89% superior ao do ano anterior (Anuário Brasileiro do Algodão,

2006). A expectativa da Associação Brasileira da Indústria Têxtil (ABIT) é que o setor

têxtil, como um todo, atinja o valor de vendas externas de 4,0 bilhões de dólares, em

2008.

No campo, os sinais de avanço são consideráveis. Apesar da redução da

área plantada na safra 2005/2006, o país tem colhido produções históricas: 1.309,4

milhões de toneladas de pluma na safra 2003/2004, 1.298,7 na safra 2004/2005 e

1.046,5 na safra 2005/2006, cultivando mais de 1 milhão de hectares com a cultura

do algodão (CONAB, 2006).

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Além dos fatores tecnológicos, o bom desempenho da cultura do algodão nos

últimos anos deveu-se à melhoria do preço e ao aumento das exportações. O Brasil

está no terceiro ano de exportações com quantidade significativa de algodão em

pluma para o mercado externo, principalmente China e Europa. Em 2002, foram

exportadas 110 mil toneladas; no ano de 2003, foram 175 mil; em 2004, os

agricultores fecharam contratos para venda de 331 mil toneladas; e, em 2005, as

exportações alcançaram 391 mil toneladas. Essa garantia de mercado foi o fator

determinante para o aumento da produção, via expansão da área colhida e

incrementos no rendimento médio da cultura, principalmente nos estados de Mato

Grosso, Goiás e Bahia, que respondem por, aproximadamente, 71% da área colhida

e 80% da produção nacional.

Ressalta-se ainda que a cultura do algodão modificou radicalmente a oferta

de emprego na agricultura dos cerrados brasileiros, onde, praticamente, emprega-se

o ano inteiro. O algodão exige uma estrutura complexa, por isso requer um

contingente maior de pessoas trabalhando. Estima-se que, somente nos estados do

Mato Grosso, Goiás e Bahia, na safra 2004/2005, foram gerados 89 mil empregos

diretos e 267 mil indiretos.

Trata-se de uma cultura de alta rentabilidade e de imensas possibilidades

para o Brasil, tanto para o cultivo de sequeiro como para o irrigado, que poderá

avançar paulatinamente e levar o País a ganhar posições entre os quatro maiores

produtores de fibras do mundo, hoje representados pela China, EUA, Índia e

Paquistão, caso as reduções nos subsídios à produção nos Estados Unidos sejam

executadas, em concomitância com o determinado pela Organização Mundial do

Comércio, e a demanda mundial cresça a taxas acima dos 2,49% a.a., observadas

nos últimos cinco anos. A competitividade do algodão e da cadeia têxtil brasileira

está entre as melhores do mundo.

Até o início da década de 90, a produção de algodão no Brasil concentrava-se

nas regiões Sul, Sudeste e Nordeste. Após esse período, aumentou

significativamente a participação do algodão produzido nas áreas de cerrado,

basicamente da região Centro-Oeste. Esta região, que em 1990 cultivava apenas

123.000 ha (8,8% da área de algodão do país) passou para 479.000 ha em 2002,

correspondendo a 63,0% do total da área. Os estados do Centro-Oeste,

reconhecidamente produtores de algodão herbáceo, são: Mato Grosso, Goiás e

Mato Grosso do Sul. Outros estados brasileiros que também estão produzindo

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algodão no Cerrado são: a Bahia e o Maranhão na região Nordeste, cujos sistemas

de produção apresentam características semelhantes às do Centro-Oeste.

Atualmente, a região Centro-Oeste responde por 74,47% do algodão produzido no

Brasil. Somando-se a produção do Centro-Oeste com a da Bahia e do Maranhão, o

algodão do cerrado representa mais de 80,0% da produção nacional.

É bem possível que a natureza tenha desenhado a planta de algodão

especialmente para os insetos, visto que suas flores são vistosas, coloridas e

grandes; além de suas folhas, às vezes também coloridas; os botões florais, as

maçãs e os nectários (florais, extraflorais e intraflorais) são largos e suculentos,

chegando a produzir grandes quantidades de açúcares solúveis por dia,

dependendo da espécie do cultivar, do ambiente que funcionam como estimulantes

para chamariz e posteriormente, colonização e recolonização de insetos fitófagos,

entre eles e Dysdercus peruvianus, inimigos naturais e outros artrópodes (Soares,

2000).

Todavia, os insetos-praga representam um dos fatores limitantes para sua

exploração. Estima-se que nos EUA, apesar de um aumento de dez vezes no uso de

inseticidas de 1945 a 1988, as perdas anuais das plantações causadas por insetos

aumentaram de 7 para 13%. Em todo o mundo essa perda é de cerca de 20%

(Apoema, 2000). A conseqüência direta desses dados é o alto consumo de

agroquímicos no combate aos insetos-praga, o que eleva o custo de produção,

diminuindo a margem de lucro do produtor, associado aos problemas relacionados à

saúde e poluição ambiental. A cultura do algodão é uma das que mais consomem

agrotóxicos na lavoura, pois apesar de ocupar menos de 2,0% de área plantada

mundialmente com todas as culturas, neste cultivo são gastos, anualmente, em torno

de 25% de todo o inseticida utilizado pelo homem (Soares, 2000).

Meios de controle baseados na biologia dos insetos, conhecidos como meios

biorracionais chamam cada vez mais atenção. Entretanto um maior desenvolvimento

desse meio de controle requer um maior conhecimento dos mecanismos de defesa

dos vegetais e da interação inseto-planta.

1.3 - INSETOS SUGADORES DE SEMENTES

As sementes são atacadas por uma ampla variedade de organismos que vão

desde microorganismos (fungos e bactérias) até invertebrados (insetos e

nematóides) e vertebrados (pássaros e mamíferos). Dentre os vários predadores das

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sementes, os insetos representam um amplo e variado grupo, em muitos casos

sendo um fator de grande importância na produtividade de sementes e grãos de

interesse econômico causando perdas consideráveis à produção de alimentos

(Panizzi e Parra, 1991).

Os insetos podem ser divididos em dois grandes grupos de acordo com seus

hábitos alimentares em relação às sementes: os mastigadores e os sugadores. Os

mastigadores são representados principalmente pelas ordens Coleoptera

(Anobiidae, Chrysomelidae, Cerambycidae, Curculionidae, Scolytidae) Lepidoptera

(Incurvariidae, Noctuidae, Olethreutidae, Pyralidae, Tortricidae), Hymenoptera

(Agaonidae, Eurytomidae, Formicidae), Orthoptera (Tettigoniidae) e Diptera

(Agromyzidae, Cecidomyydae, Tephritidae) (Janzen, 1971, 1977, 1978). Dentre os

mastigadores, a subfamília Bruchidae (Chrysomelidae) é o grupo mais comum e

amplamente estudado por serem importantes pragas de leguminosas (Panizzi e

Parra, 1991).

Os insetos sugadores de sementes são representados, principalmente, pela

ordem Hemiptera com diversas famílias, destacando a Pyrrhocoridae. A maioria dos

hemípteros (percevejos) prefere se alimentar de sementes imaturas, que são mais

macias e, portanto, mais fáceis de serem perfuradas. Entretanto, percevejos da

família Pyrrhocoridae e Lygaeidae alimentam-se de sementes maduras (Janzen,

1978). Os Pyrrhocoridae incluem os manchadores do algodão (Dysdercus spp.) que

são sugadores importantes de sementes de árvores das florestas decíduas na

América Central (Janzen, 1971), além de importante praga nas lavouras comerciais

de algodão (Freire e Santos, 1999).

D. peruvianus, assim como outros percevejos sugadores de sementes, se

alimentam introduzindo seus estiletes nas sementes. Após uma ejeção de saliva na

semente há sucção do que foi liquefeito (Silva e Terra, 1994). Embora alguns

autores sugerem um papel para as enzimas da glândula salivar na liquefação de

constituintes sólidos das sementes (revisão Miles, 1972), Saxena (1963) indeferiu

esta hipótese com o argumento de que a saliva se mantém em contato com o

substrato por um tempo muito curto. Segundo ele, os componentes insolúveis das

sementes são rompidos e desalojados, sob a forma de partículas finas pela ação

conjunta dos estiletes dos insetos e da saliva.

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Na lavoura de algodão as perdas são também se dão nas fibras desse

vegetal, já que o inseto mancha as flores causando prejuízos econômicos (Freire e

Santos, 1999).

A composição química das sementes é bem variável, dependendo de fatores

como espécie e idade da planta. Elas tendem a concentrar múltiplos nutrientes que

alteram a sua porcentagem em peso seco de proteína e óleo e costumam variar de

10 a 40% para sementes de várias famílias (Panizzi e Parra, 1991). As sementes

são ricas em proteínas como globulinas, albuminas, glutelinas, além de lipídeos

geralmente na forma de triglicerídeos e também de carboidratos presentes

principalmente em cereais, uma pequena porcentagem de açúcares além de

minerais, compostos nitrogenados, vitaminas e fitohormônios (Duffus e Slaugther,

1980; Carvalho e Nakagawa, 1983).

1.4 - PROCESSO DIGESTIVO EM INSETOS

O processo digestivo nos insetos é dividido em três fases: a digestão inicial,

intermediária e final. A digestão inicial consiste na diminuição do tamanho das

moléculas poliméricas do alimento em moléculas oligoméricas através da ação de

hidrolases, tais como: amilases, celulases, hemicelulases e proteinases. Estas

enzimas atuam respectivamente sobre o amido, celulose, hemicelulose e proteína.

Durante a digestão intermediária, os oligômeros resultantes da digestão inicial

continuam sendo hidrolisados por polímeros hidrolases como amilase ou oligômeros

hidrolases como aminopeptidase. Os produtos resultantes são dímeros tais como

maltose, celobiose e dipeptídeos derivados. Os dímeros na digestão final são

clivados em monômeros pelas dímero hidrolases, exemplificadas pela maltase,

celobiase e dipeptidase (Terra e Ferreira, 2005).

O maior sítio de digestão e absorção em insetos na maior parte das espécies

é o intestino médio, havendo pouca ou nenhuma participação de enzimas de

glândulas salivares. O intestino médio constitui um tubo simples (ventrículo) de onde

podem se expandir divertículos (cecos gástricos) usualmente na sua extremidade

proximal. Na maior parte dos insetos, os intestinos médios contem no seu lúmen

uma membrana (também chamada de matriz) quitino protéica (membrana peritrófica)

que envolve o alimento ingerido, e que separa o conteúdo luminal em dois

compartimentos, o espaço endoperitrófico (dentro da membrana) e o espaço

ectoperitrófico (fora da membrana).

20

1.5 - MEMBRANAS MICROVILARES E PERIMICROVILARES EM HEMIPTERA

Insetos da ordem Hemiptera se distinguem de todos outros insetos por

possuírem uma probóscide que inclui um canal salivar assim como um canal

alimentar (Goodchild, 1966). O aparelho bucal especializado dos Hemiptera é usado

para sugar líquido ou alimentos liquefeitos que podem variar de seiva de plantas ou

mesmo sementes a diferentes tipos de presas e hospedeiros. A adaptação de se

alimentar de líquidos provindos de plantas durante todos os estágios de vida é

característico da ordem Hemiptera, diferente de outros insetos que possuem

aparelhos bucais para a sucção e penetração. Esta observação sugere que outras

estruturas no trato intestinal devem e podem ser responsáveis pela capacidade que

os Hemiptera têm de explorar um número tão variado de fontes alimentícias

permitindo uma adaptação tão espetacular.

Além disso, os Hemiptera possuem células intestinais envolvidas por uma

membrana extracelular, chamada membrana perimicrovilar (MPM) (Terra, 1988) o

que também os faz distintos dos demais insetos. Esta estrutura foi detectada através

de estudos morfológicos realizados por vários pesquisadores e possuem diferentes

descrições e interpretações (Marshal e Cheung, 1974; Reger, 1971; Burgos e

Gutierrez, 1976; Lane e Harrison, 1979; Andries e Torpier, 1982; Baerwald e

Delcarpio, 1983; Billingsley e Downe, 1983, além de outros).

A MPM é uma estrutura lipoprotéica que se estende da base da

microvilosidade intestinal até o lúmen e delimita um compartimento fechado, o

espaço perimicrovilar (Terra, 1988). Este espaço está entre a membrana microvilar e

a perimicrovilar. Em Hemiptera não sugadores de seiva, a função da MPM está

relacionada à função da membrana peritrófica, tal como compartimentalização do

processo digestivo, otimização da absorção de aminoácidos da dieta, imobilização

de algumas enzimas e proteção do epitélio intestinal (Terra e Ferreira, 2005). A

membrana microvilar é mais rica em proteínas integrantes, dentre elas os

transportadores de aminoácidos e os portassomos (K +ATPases) (Terra e Ferreira,

1994). A membrana perimicrovilar é alimentada a partir de membranas internas das

vesículas multimembranosas, as quais se formam ao nível do Complexo de Golgi, e

se encaminham em direção às bases das microvilosidades, onde ocorre a fusão das

membranas externas dessas vesículas com a membrana microvilar, e a fusão das

membranas internas com a base das membranas perimicrovilares (Silva e Terra,

1994; Silva e Terra, 1995; Silva et al., 1995; Silva et al., 1996).

21

Um estudo recente baseado em microscopia eletrônica de transmissão e

imunolocalização de uma α-glicosidase embasam a sugestão de que a origem

evolutiva da MPM está nos Condylognatha, que compreende as ordens

Thysanoptera e Hemiptera (Silva et al., 2004). A origem celular da MPM não é ainda

completamente entendida, mesmo havendo diversos estudos publicados sobre este

assunto (Lane e Harrison, 1979; Andries e Torpier, 1982; Gutierrez e Burgos, 1986;

Silva et al., 1995).

Silva e colaboradores (1996) realizaram um trabalho pioneiro com uma α-

glicosidase ligada a MPM, onde propôs com base experimental sólida a origem

intracelular do sistema perimicrovilar. A α-glicosidase foi purificada, o que permitiu a

produção de um anticorpo policlonal que foi utilizado para investigar a localização

celular da enzima (Silva et al., 1995). A imunolocalização desta enzima no epitélio do

intestino médio do D. peruvianus reafirma a hipótese que as MPMs são originadas

de membranas internas de vesículas com dupla membrana que foram vistas vindo

do complexo de Golgi.

Apesar destes avanços, poucos trabalhos reportam a origem do sistema de

MPM em espécies de Hemiptera (Billingsley e Downe, 1983, 1990) e, além disso,

algumas questões continuam não resolvidas tais como as enzimas marcadoras

bioquímicas de outros compartimentos: espaço perimicrovilar (aminopeptidase),

membrana microvilar (β-glicosidase) e o lúmen do intestino médio (catepsinas). Seria

interessante gerar anticorpos destas enzimas e imunolocalizá-las nos seus distintos

compartimentos celulares para assim fortalecer a hipótese do modelo proposto por

Terra (1988).

O maior problema enfrentado pelos insetos sugadores de seivas vegetais é

assegurar a absorção de nutrientes essenciais, tais como aminoácidos que ocorrem

em baixa concentração em todos os tipos de seiva. Os sugadores de seiva

realizariam essa absorção de acordo com o seguinte modelo: as membranas

microvilares transportariam ativamente íons potássio do espaço perimicrovilar

gerando um gradiente de concentração de potássio entre o espaço intermembranas

e o lúmen intestinal com seiva rica em potássio. Este gradiente de concentração

poderia ser usado para forçar a absorção de compostos orgânicos através de co-

transportadores apropriados na membrana perimicrovilar. Os compostos orgânicos,

22

uma vez no espaço perimicrovilar, difundir-se-iam até transportadores na superfície

das membranas microvilares (Terra, 1988, Terra e Ferreira, 1994) (Figura 1).

FIGURA 1 - Modelo estrutural do papel fisiológico da membrana microvilar das células do intestino médio de Hemiptera.

A figura a esquerda é uma representação de uma típica célula de intestino médio de

Hemiptera e a figura a direita mostra em detalhe o seu ápice. A membrana microvilar (MM) é

recoberta pela membrana perimicrovilar (PMM), a qual de estende pelo compartimento

luminal com fundo cego. As membranas microvilar e perimicrovilar delimitam um

compartimento fechado, chamado espaço perimicrovilar (PMS). A membrana microvilar é

rica em proteínas integrais (IP) e a membrana perimicrovilar é pobre (Terra, 1988).

1.6 - O GÊNERO DYSDERCUS

O adulto possui um corpo elíptico, com 12 a 15 mm de comprimento. As asas

são de coloração castanho clara a escuro, e possuem três linhas brancas sob o

tórax e na base das pernas, apresentando cinco estágios ninfais. As ninfas são de

23

coloração avermelhada. A proporção sexual é de 1:1, sendo as fêmeas maiores que

os machos.

O desenvolvimento destes insetos inicia-se no solo, onde a fêmea, após a

fecundação, faz a postura nas escavações ou fendas no solo, nas proximidades do

algodoeiro, cobrindo-as com pequenas quantidades de terra. Os ovos são, a

princípio, esbranquiçados e, posteriormente, apresentam-se de cor amarelada. Após

10 dias ocorre a eclosão, surgindo as ninfas ou formas jovens, de cor alaranjada.

Estas sobem pela planta e se aglomeram sobre as maçãs e capulhos onde, após

introduzirem o rostro, sugam a seiva e atingem a semente. Preferencialmente,

penetram entre as fibras dos capulhos abertos, que são atacados tanto pelas ninfas

quanto pelos adultos que sugam as sementes. As ninfas bem desenvolvidas, medem

cerca de 8 mm de comprimento e são de coloração avermelhada. Após 30 dias

surge o adulto, que mede 15 mm de comprimento aproximadamente. O ciclo

evolutivo completo é de 45 dias, em média. A espécie se reproduz durante todo o

ano em plantas hospedeiras alternativas silvestres ou cultivadas (malváceas,

solanáceas, etc). As populações crescem e migram entre lavouras durante o verão,

e condições de alta umidade favorecem o desenvolvimento do inseto.

Os danos causados pelos manchadores podem assim ser resumidos: quedas

das maçãs novas provocadas pelas picadas; mau desenvolvimento das maçãs,

principalmente quando atacadas ainda novas; abertura defeituosa dos capulhos

quando as maçãs são atacadas durante o seu desenvolvimento, com prejuízo

parcial ou total; manchas nas fibras causadas pelas dejeções destes insetos.

Finalmente, os manchadores podem causar sérios danos através da podridão das

fibras dos capulhos, pela introdução de bactérias e de certos fungos (Gallo et al.,

1988).

Esse gênero é de grande interesse econômico, pois a ele pertencem algumas

das mais sérias pragas do algodoeiro nos países em que se cultiva essa Malvaceae.

De sua dieta principal também fazem parte plantas das famílias Amaranthaceae,

Bombaceae, Compositae, Rubiaceae e Esterculiaceae. Insetos do gênero Dysdercus

são fitófagos, mas exibem esporadicamente comportamento de predadores

saprófagos (Gonçalves, 2000).

O Dysdercus é um inseto pouco estudado e foram registrados atacando

algodoeiro (Gossypium spp.) em diversas regiões do mundo sendo registrada sua

ocorrência na África, Argentina, Guiana e Paraguai. No Brasil ela foi relatada nos

24

estados do Amazonas, Bahia, Goiás, Distrito Federal, Minas Gerais, Espírito Santo,

Rio de Janeiro, São Paulo, Paraná, Santa Catarina e Rio Grande do Sul. Vários

estudos foram realizados sobre ecologia e comportamento de diferentes espécies do

gênero Dysdercus em diversas regiões do mundo, principalmente na África.

Entretanto no Brasil, onde ocorrem 14 espécies e 7 subespécies desse gênero de

um total de 53 espécies americanas conhecidas, há poucos estudos (Gonçalves,

2000).

1.7 - MODELO EXPERIMENTAL: DYSDERCUS PERUVIANUS

Estudos do intestino médio de D. peruvianus mostraram que ele é dividido em

três ventrículos que são chamados V1, V2 e V3, conectando ao intestino posterior

através do V4 (Silva et al., 1995).

O V1 é uma região dilatada, com uma parede mais espessa, que serve de

reservatório para estocagem de alimento ingerido, absorção de água e açúcar.

Nesta câmara a água é rapidamente absorvida, permitindo a secreção de mais

saliva (Silva et al., 1995). A absorção de água em insetos depende do bombeamento

de sais para o interior de compartimentos no epitélio do órgão responsável pela

absorção. Isto cria um gradiente de pressão osmótica entre o compartimento e o

lúmen do órgão, o que leva á absorção da água (Berridge, 1970).

A absorção de água em D. peruvianus não depende de sais da sua dieta e ela

só se torna significativa quando cerca de 40% da glicose presente na dieta foram

absorvidos. Isto sugere que a água é absorvida em D. peruvianus somente quando

um gradiente osmótico favorável é estabelecido entre o lúmen ventricular e algum

compartimento no epitélio intestinal (Silva et al., 1995).

O V2 é uma região tubular, que se encontra dobrada na cavidade abdominal

do intestino, e é separada do primeiro segmento ventricular por uma constricção,

que serve de válvula para controle da passagem do alimento de uma região para

outra. Este segmento é o principal sítio de digestão de proteínas (Silva et al., 1995).

V3 tem uma forma esférica e parede delicada e bastante elástica. Na

passagem de V2 para V3 também se encontra uma constrição como observada

entre V1 e V3. O V4 é um ducto curto ligado ao V3 à ampola onde se inserem os

túbulos de Malpighi, marco onde finaliza o intestino médio e se inicia o posterior

(Silva et al., 1995).

25

1.8 - DISTRIBUIÇÃO DAS ENZIMAS DIGESTIVAS EM HEMIPTERA

A ocorrência de diferentes enzimas digestivas no canal alimentar de insetos é

freqüentemente dita depender principalmente da composição química da dieta

ingerida (Wigglesworth, 1972). Essa visão leva a acreditar que a adaptação ao

hábitat e o hábito alimentar são mais importantes que as características filogenéticas

na determinação do repertório de enzimas digestivas no trato intestinal de insetos.

Todavia, alguns trabalhos têm mostrado que características adaptativas observadas

em insetos pertencentes ao mesmo táxon, mas com diferentes hábitos alimentares

parecem ter evoluído de um mesmo padrão básico de digestão, enquanto que

insetos com hábitos alimentares similares, mas de grupos taxonômicos divergentes

mostram diferentes padrões na organização da digestão, apesar da existência de

numerosas características convergentes (Terra, 1988; 1990; Terra e Ferreira, 1994,

2005).

Os insetos utilizam uma grande variedade de proteinases com função

digestiva (Terra, 1988; 1990). Proteinases serínicas do tipo tripsina e quimotripsina

são descritas na maioria das espécies de insetos investigadas (Applebaum, 1985),

mas importantes grupos têm apresentado exceções interessantes, como os

hemípteros Heteroptera, os dípteros Cyclorrhapha e os coleópteros Cucujiformia

(Terra e Ferreira, 1994). Na ordem Hemiptera, apenas proteinases cisteínicas e

aspárticas têm sido descritas ocorrendo no lúmen intestinal desses insetos. Gooding

(1969) sugeriu pela primeira vez que enzimas semelhantes a catepsinas B de

mamíferos poderiam estar envolvidas na digestão extracelular em R. prolixus. De

fato, a ocorrência de catepsinas B tem sido verificada em várias espécies de outras

famílias de Hemiptera, como Cimicidae (Houseman e Downe, 1982), Pentatomidae

(Houseman, et al., 1984), Phymatidae (Houseman, et al., 1985) e Pyrrhocoridae

(Silva e Terra, 1994). Catepsinas D também foram descritas em R. prolixus

(Houseman e Downe, 1983; Garcia, 1987; Terra et al., 1988).

Através de estudos sobre o fracionamento celular das células do epitélio do

ventrículo posterior de R. prolixus e a separação de frações de membranas

microvilares e perimicrovilares por centrifugação isopícnica em gradientes de

sacarose, Ferreira et al. (1988) propuseram que a α-manosidase e a α-glicosidase

seriam proteínas integrantes das membranas microvilares e perimicrovilares,

26

respectivamente, e que uma aminopeptidase estaria aprisionada no espaço

perimicrovilar. Baseados nesses resultados, os autores sugeriram que os

oligopeptídeos resultantes da digestão de proteínas por proteinases tipo catepsinas

seriam transportados para o espaço perimicrovilar, onde sofreriam a ação da

aminopeptidase ali presente e os produtos seriam então absorvidos.

D. peruvianus apresenta uma α-glicosidase majoritária associada à

membrana perimicrovilar que se encontra principalmente no primeiro segmento

ventricular (V1), região onde ocorre a absorção de glicose (Silva e Terra, 1994). A

atividade de aminopeptidase é principalmente solúvel, sendo facilmente liberada

com a homogeneização do tecido intestinal. Assim como foi descrito para R.

prolixus, Silva et al. (1996) demonstraram em D. peruvianus que a α-glicosidase

seria integrante da membrana perimicrovilar, enquanto que a β-glicosidase seria

integrante da membrana microvilar e a aminopeptidase solúvel estaria no espaço

perimicrovilar.

1.9 - CLASSIFICAÇÃO DE ENZIMAS DIGESTIVAS

A classificação das enzimas e o sistema de numeração usado são

recomendados pelo Comitê de Nomenclatura da União Internacional de Bioquímica

e Biologia molecular (1992). Dentre elas destacamos as peptidases (EC 3.4),

enzimas que atuam clivando as ligações peptídicas e incluem as endopeptidases,

(EC 3.4.21-24) e exopeptidases (EC 3.2.4.11-19). As proteinases são divididas em

subclasses com base no seu mecanismo catalítico, como o mostrado pelos

substratos específicos ou pH (Terra e Ferreira, 2005).

Glicosidases (EC 3.2) são classificadas de acordo com a especificidade com o

substrato. Estão incluídas nesta classe enzimas que clivam ligações internas em

polissacarídeos e são usualmente nomeadas de acordo com o seu substrato, como

amilase, celulase, pectinase e quitinase. Além disso, há enzimas que hidrolisam

oligossacarídeos e dissacarídeos. Oligossacaridases e dissacaridases são

usualmente nomeadas com base no monossacarídeo que doa o seu grupo redutor

para a ligação glicosídica e a sua configuração (α ou β) para a ligação (Terra e

Ferreira, 2005).

O grupo dos lipídeos é grande e heterogêneo e tem como características a

insolubilidade em água e a grande solubilidade em solventes apolares. Alguns

27

contêm ácidos graxos (gorduras, fosfolipídeos, glicolipídeos e ceras) e outros não

(terpenóides, esteróides e carotenóides). Ligações de éster são hidrolisadas em

lipídeos que contêm ácidos graxos antes de serem absorvidos. As enzimas que

hidrolisam ligações de éster são: hidrolases éster carboxil (EC 3.1.1), lipases,

esterases e fosfolipases A e B; hidrolases monoester fosfórico, que são as fofatases

e as hidrolases diéster fosfóricas (EC 3.1.4), incluindo fosfolipases C e D (Terra e

Ferreira, 2005).

1.10 - PROTEINASES

O termo proteinase é sinônimo de peptídeo hidrolase, e este termo incluem

todas as enzimas que clivam ligações peptídicas (classificadas pela Enzyme

Comission of the International Union of Biochemistry como EC 3.4). Embora as

proteínas possam sofrer modificações pós-transcricionais reversíveis (fosforilação e

transições alostéricas), a proteólise é irreversível. Uma vez a proteína tendo sido

hidrolisada, a única maneira viável para reconstrução de uma molécula intacta é

transcrever mais mRNA. Baseado na natureza da proteólise, não é de se

surpreender que enzimas proteolíticas estejam envolvidas na mediação de

processos que são frequentemente irreversíveis: coagulação, digestão, maturação

de citocinas e pró-hormônios, apoptose e quebra de proteínas intracelulares.

Proteólise é um mecanismo onipresente que a célula emprega para regular a função

e destino das proteínas (Neurath e Walsh, 1976; Polgar, 1989a).

Proteinases podem ser subdivididas em exopeptidases, na qual a ação pode

ocorrer nas porções amino ou carboxi-terminal do peptídeo (EC 3.4.11-19), ou em

endopeptidases, enzimas que clivam ligações peptídicas internas em peptídeos e

usualmente não podem acomodar aminoácidos das porções amino ou carboxi-

terminal carregados em seu sítio ativo (EC 3.4.21-24,99). Todas têm em comum o

mecanismo geral de ataque nucleofílico ao carbono carbonil de uma ligação

peptídica (Polgar, 1989b). Isto resulta num processo hidrolítico ácido-base que

rompe a ligação covalente. Diferentes proteinases utilizam estratégias distintas para

gerar o nucleófilo e para justapor o nucleófilo com a ligação alvo. Estas diferenças

são úteis na classificação e, baseado nisto, as endoproteinases podem ser

agrupadas em quatro classes majoritárias: serino (EC 3.4.21), cisteína (EC 3.4.22),

aspartato (EC 3.4.23) e metalo (EC 3.4.24). Os dois últimos grupos de enzimas

utilizam resíduos aspartato e metais pesados (usualmente zinco), respectivamente

28

para imobilizar e polarizar a molécula de água para que o átomo de oxigênio da

água se torne o nucleófilo (Menard e Storer, 1992). Serino e cisteíno proteinases

utilizam suas cadeias laterais HO- e HS-, respectivamente, diretamente como

nucleófilo. Embora não seja idêntico, os mecanismos catalíticos da serino e da

cisteína proteinase são consideravelmente semelhantes. Em geral, estas enzimas

são dobradas em dois domínios globulares relativamente grandes que circundam

uma fissura contendo os resíduos do sítio ativo. A entrada do substrato na fissura é

um pré-requisito para a clivagem, dessa forma, é essencial que ocorra um ajuste

estrutural adequado entre o substrato e a enzima. Análises cristalográficas de vários

membros das classes das serino e cisteíno proteinases revelam estrutura detalhada

da região do sítio ativo e da importância de aminoácidos adicionais para o

mecanismo catalítico (Matthews et al., 1967; Varughese et al., 1989). Em ambas

serino e cisteíno proteinases, a formação de um oxiânion ou ânion tiolato (o

nucleófilo), respectivamente, é crucial para catálise, e a formação destes ânions

parece ser dependente da formação do par de íons entre o aminoácido do sítio ativo

e do aminoácido básico vizinho (histidina) (Polgar, 1989a; Manson e Wilcox, 1993).

1.11 - CLANS E FAMÍLIAS DAS CISTEÍNO PROTEINASES

Proteinases nas quais o nucleófilo que ataca a ligação peptídica é um grupo

sulfidril de um resíduo de cisteína são conhecidas como cisteíno proteinases. O

mecanismo catalítico é parecido com as das proteinases serínicas, onde um

nucleófilo e um doador de prótons são necessários, sendo um resíduo de histidina o

doador de prótons em todas cisteína proteinases, assim como na maioria das serino

proteinases. Em algumas famílias apenas a dupla Cys e His parecem essenciais

para a catálise, enquanto em outras famílias há evidência da necessidade de um

terceiro resíduo para orientar o grupamento imidazol da His.

Rawlings e Barrett, com base na seqüência de aminoácidos, classificaram as

cisteíno proteinases em clãs e famílias. O termo família é utilizado para descrever

um grupo de enzimas na qual cada proteína apresenta similaridade da sua

seqüência primária inteira ou da seqüência responsável pela atividade catalítica,

com pelo menos uma outra enzima do grupo. O clã compreende um grupo de

famílias que apresenta sinais de relação evolutiva (Rawlings e Barrett, 1993;

Rawlings e Barrett, 1994). As cisteínas proteinases estão agrupadas em seis clãs

(CA, CD. CE. CF, CH, CX).

29

1.12 - CISTEÍNA PROTEINASE EM INSETOS

A cisteína proteinase intestinal de insetos foi primeiramente denominada

catepsina B (EC 3.4.22.1), pois este grupo de enzimas foi o primeiro a ser descrito.

Mais tarde ficou esclarecido que catepsinas B são mais importantes como

dipeptidases do que como endopeptidases (Barrett et al., 1998). Catepsina L (EC

3.4.22.15) é a verdadeira endopeptidase que cliva ligações peptídicas contendo

resíduos de aminoácidos hidrofóbicos em P2 (catepsina B prefere Arg nesta posição)

(Barrett et al., 1998). Desta forma, a distinção entre estas duas catepsinas se faz

através da utilização de dois substratos fluorogênicos: Z-FR-MCA (específico para

catepsina L) e Z-RR-MCA (específico para catepsina B). A especificidade do

substrato para as catepsinas B, K, L e S é determinada pelo resíduo de aminoácido

da posição P2. Para que o substrato se ligue efetivamente à enzima, deve ocorrer

uma interação favorável entre o resíduo de aminoácido da posição S2 e o resíduo da

posição P2 (Bown et al., 2004). Para a maioria das catepsinas, incluindo a L, tal

interação é favorecida pela presença de cadeias hidrofóbicas volumosas em S2 e

desfavorecida quando há cadeias carregadas (Barrett et al., 1998).

Há cinco famílias estruturais de cisteína proteinases (EC 3.4.22.15) das quais

C1 inclui a maioria daquelas importantes para animais (Rawlings e Barrett, 1993). A

maioria dos membros da família C1 tem propriedades similares à papaína. Eles têm

três resíduos diretamente envolvidos na catálise, Cys 25, His 169 e Asn 175 com Glu

19 (numeração como papaína) ajudando a estabilizar o intermediário reativo. As

propriedades semelhantes à papaína são reconhecidas pelo motivo ERFNIN com os

resíduos conservados: Glu 34, Arg 68, Phe 72, Asn 75, Asn 83 (numeração como

papaína). A maioria das proteinases C1 prefere substratos que possuem uma cadeia

lateral hidrofóbica ocupando o subsítio S2, que é formado por Ser 205 (numeração

como papaína) entre outros resíduos (Barrett et al., 2004).

Como visto anteriormente, o mecanismo catalítico das cisteíno proteinases, é

bastante similar ao das serino proteinases, pois em ambos os casos há a formação

de um intermediário tetraédrico covalentemente ligado (Lowe, 1976), que se forma

pela reação entre um nucleófilo e a carbonila da ligação peptídica que será

hidrolisada. No caso das cisteíno proteinases, o nucleófilo que ataca é o átomo de

enxofre da cadeia lateral de uma cisteína (cisteína 25, numeração da papaína) e o

grupo imidazol da cadeia lateral de uma histidina (histidina 159, numeração da

papaína) também está envolvido no papel de aceptor de hidrogênio. O grupo SH da

30

Cys reativa deverá estar no estado livre, assim como o resíduo de His próximo

(Drenth et al., 1971 e Glazer e Smith, 1971). A asparagina 175 também é importante

para a catálise das cisteíno proteinases, já que este resíduo participa orientando o

anel imidazólico His159. Dois grupos NH- e dois resíduos da enzima, Gln 19 e Cys

25, atuam no papel da �cavidade oxiânica�, em perfeita analogia à classe das serino

proteinases.

As etapas de acilação e desacilação da enzima, no modelo proposto por

Storer e Ménard, envolvem a formação de dois intermediários tetraédricos iônicos e

quatro estados de transição (Storer e Ménard, 1994). Alguns autores sugerem que o

estado de transição pode ser considerado um fator limitante, na determinação da

especificidade das enzimas proteolíticas (Storer e Ménard, 1996).

As cisteína proteinases, neste tipo de catálise, necessitam do grupo tiol da

Cys 25. A His 159, localizada próxima a cisteína, intervém igualmente na catálise

enzimática (Kamphius et al., 1984) conferindo a alta nucleofilicidade ao grupo tiol

através da formação do par iônico tiol-imidazol (Storer e Ménard, 1994).

As cisteína proteinases de insetos podem ser digestivas (Terra e Ferreira,

1994; 2005), envolvidas na degradação de vitelina (Cho et al., 1999) ou

metamorfose (Takahashi et al., 1993). A ocorrência de cisteína proteinase como

enzima digestiva, no lugar das ubíquas serino proteinases, em Hemiptera

(percevejos, pulgões e cigarras) (Gooding, 1969; Houseman et al., 1984; Terra e

Ferreira, 1994; Cristofoletti et al., 2003) pode resultar de dois eventos evolutivos

(Houseman et al., 1985; Cristofoletti et al., 2003). O primeiro foi a perda das serino

proteinases após adaptação para hábito sugador de seivas por hemípteros

Auchenorrhyncha-símiles (semelhantes às cigarrinhas) que são considerados

ancestrais de toda ordem Hemiptera (Goodchild, 1966). O segundo evento foi o uso

de proteinase lisossômica para digerir proteína por alguns hemípetros sugadores de

seiva (alimento de regra carente de proteína) ao retornar para o hábito de ingerir

proteína. Concordando com esta hipótese há o fato de que serino proteinases são

somente encontradas em secreções salivares dos Hemiptera, nunca no intestino

médio (Thie e Houseman, 1990). Além disso, dados citoquímicos sugerem como

sendo a origem da cisteína luminal a cisteína lisossomal (Billingsley e Downe, 1988).

No caso dos Coleoptera (besouros) da série Cucujiformia, os únicos outros insetos

além dos Hemiptera que têm cisteína proteinase como enzima digestiva (Murdock et

al., 1987; Terra e Cristofoletti, 1996), a presença da enzima é admitida como

31

resultado da adaptação que permitiu esses insetos se nutrir de sementes ricas em

inibidores de serino proteinases (Terra e Cristofoletti, 1996).

A despeito da óbvia importância das catepsina L-símiles (CALs) digestivas de

insetos, que podem ter rotas secretoras peculiares (Terra e Ferreira, 2005) e

parecem estar envolvidas em mecanismos de resistência contra inibidores naturais e

podem ser usadas em estratégia de produção de plantas transgênicas, a

caracterização molecular dessas enzimas não progrediu muito. Isto é conseqüência

de: (1) dificuldade no estabelecimento que uma CAL ensaiada nos intestinos de

insetos foi realmente secretada para o lúmen intestinal e, portanto, pode ser

considerada como enzima digestiva verdadeira; (2) dificuldade de isolamento,

purificação e caracterização cinética das CALs devido autólise frequentemente

observada nos estágios finais da purificação; (3) dificuldade no relacionamento de

CALs codificadas por cDNAs clonados de células intestinais, com enzimas digestivas

porque muitas daquelas enzimas devem ser lisossômicas, jamais deixando as

células.

Existem 86 seqüências de CALs de insetos registradas no GenBank (abril de

2007), da quais 45 correspondem a ordem Coleoptera, 20 Diptera, 10 Hemiptera, 5

Lepidoptera, 4 Thysanoptera e 2 de Hymenoptera. As seqüências apresentam as

características comuns às famílias 1 de cisteína proteinases: pró-peptídeo N-terminal

que deve ser removido para ativar a enzima, a tríade catalítica e o motivo ERFNIN

(Barrett et al., 1994).

A despeito do conhecimento das seqüências acima, as CALs digestivas foram

purificadas até homogeneidade apenas de Diabrotica virgifera (Coleoptera:

Cucujiformia: Chrysomelidae) (Koiwa et al., 2000), Leptinotarsa decemlieata

(Coleoptera: Chrysomelidae) (Gruden et al., 2003), Acyrtosiphon pisum (Hemiptera:

Auchenorrhyncha) (Cristofoletti et al., 2003) e Tenebrio molitor (Cristofoletti et al.,

2005). Dessas, as únicas estudadas em detalhes são as de T. molitor (Cristofoletti et

al., 2005).

As CALs digestivas são proteinases chaves no processo de digestão de

proteínas em Hemiptera e Coleoptera Cucujiformia. Como essas ordens são muito

destrutivas em plantações e a mesma planta pode ser atacada por insetos das duas

ordens, o desenvolvimento de inibidores que afetassem ambas as enzimas seria

muito interessante. Para isto deve-se fazer um estudo detalhado das CALs das duas

ordens.

32

1.13 - AMINOPEPTIDASES EM INSETOS

As aminopeptidases (EC 3.4.11) catalisam a hidrólise seqüencial de resíduos

de aminoácidos da região N-terminal de peptídeos, sendo classificadas com base na

sua dependência de íons metálicos (geralmente Zn2+ ou Mn2+) e especificidade ao

substrato. A aminopeptidase N (EC 3.4.11.2) possui uma ampla especificidade,

apesar de remover preferencialmente resíduos de alanina e leucina, enquanto que a

aminopeptidase A (EC 3.4.11.7) prefere resíduos de ácido aspártico e glutâmico

como substratos (Norén et al., 1986). Em insetos, essas enzimas são encontradas

no intestino médio e desempenham um papel importante na digestão intermediária

de proteínas, já que são em geral mais ativas que as carboxipeptidases nesses

animais (Terra e Ferreira, 1994). As aminopeptidases clivam aminoácidos de

oligopeptídeos produzidos pela ação de proteinases (principalmente tripsina),

permitindo que esses aminoácidos sejam transportados através do epitélio intestinal

e, conseqüentemente, usados como substratos para a construção de proteínas

endógenas do inseto (Taylor, 1993). Comparação de seqüências e de estruturas de

aminopeptidases baseada nas suas homologias estruturais e nos principais resíduos

envolvidos na catálise permitiu agrupá-las na classe M1 de proteases (Rawlings e

Barrett, 1993).

As aminopeptidases de insetos são metaloenzimas e possuem um pH ótimo

entre 7,2-9,0, massas moleculares entre 90 e 130 kDa e valores de Km de 0,13 a

0,78 mM (valores para LpNA como substrato) (Terra e Ferreira, 1994). As

aminopeptidases conhecidas em insetos possuem uma ampla especificidade, sendo

capazes de hidrolisar uma variedade de substratos β-naftilamidas, exceto acil-amino-

β-naftilamidas ácidos, o que indica que são em geral aminopeptidases N (Terra e

Ferreira, 1994). Uma exceção é uma aminopeptidase solúvel associada ao glicocálix

de Rhynchosciara americana (Diptera) que se assemelha a aminopeptidase A de

vertebrados. Essa enzima cliva resíduos N-terminais de ácido aspártico ou glutâmico

de peptídeos que não são eficientemente clivados por outras aminopeptidases

(Klinkowstrom et al., 1994).

Nos insetos menos evoluídos (Orthoptera, Hemiptera, Coleoptera Adephaga),

as aminopeptidases estão principalmente na forma solúvel, enquanto que em

insetos mais evoluídos (Coleoptera Polyphaga, Diptera e Lepidoptera), as

aminopeptidases estão geralmente ligadas às membranas microvilares das células

do intestino médio (Terra e Ferreira, 1994). Na maioria desses insetos, as

33

aminopeptidases são as principais proteínas presentes nas membranas microvilares

(compõem 55% das proteínas microvilares em Tenebrio molitor segundo Cristofoletti

e Terra, 1999).

As mais bem caracterizadas aminopeptidases de insetos são as de

Rhynchosciara americana (Ferreira e Terra, 1984, 1985, 1986a e 1986b) de

Tenebrio molitor (Cristofoletti e Terra, 1999 e 2000) e de Acyrthosiphon pisum

(Cristofoletti et al., 2006).

O estudo das aminopeptidases digestivas de insetos tem adquirido grande

impulso com a descoberta de que, em vários insetos, esta enzima é o sítio receptor

para ligação de toxinas de Bacillus thuringiensis (Knight et al., 1995; Gill et al., 1995;

Valaitis et al.; 1997; Garczynski e Adang, 1995; Lee et al., 1996; Nagamatsu et al.,

1998; Garner et al., 1999). Estas proteínas de B. thuringiensis após sofrerem

ativação pelas proteases digestivas do trato digestivo, tornam-se capazes de se

ligarem à membrana do enterócito através de uma aminopeptidase e causam a

formação de poros que ocasionam despolarização da membrana plasmática e o

vazamento do conteúdo celular, levando os insetos à morte (Schnepf et al., 1998).

Nos insetos da ordem Hemiptera, as aminopeptidases se encontram tanto na

forma solúvel quanto ligada a membrana. Cristofoletti e colaboradores (2006)

purificaram, caracterizaram cineticamente e clonaram uma aminopeptidase N ligada

à membrana perimicrovilar modificada do afídeo Acyrthosiphon pisum. As

aminopeptidases solúveis já estudadas estão aprisionadas no espaço perimicrovilar,

como foi demonstrado em R. prolixus (Ferreira et al., 1988) e em D. peruvianus

(Silva et al., 1996) de acordo com estudos de fracionamento celular e separação de

membranas microvilares e perimicrovilares por centrifugação em gradientes de

sacarose.

1.14 - α-GLICOSIDASES EM INSETOS

As α-glicosidases (EC 3.2.1.20) são enzimas que catalisam a hidrólise dos

resíduos de glicose na porção terminal não redutora da ligação α-1,4 de

dissacarídeos, aril-glicosídeos ou oligossacarídeos com eficiência variada como para

D. peruvianus, onde ela é capaz de hidrolisar oligossacarídeos até maltopentose

(Terra e Ferreira, 2005). As α-glicosidases são classificadas, em função de sua

34

similaridade de seqüência em quatro famílias: as famílias 4, 13, 31 e 97 (Henrissat,

1991; Henrissat e Bairoch, 1993).

α-Glicosidases de intestino médio de insetos podem ser solúveis ou podem

estar ligadas à membrana microvilar. As formas solúveis podem estar presentes no

lúmen do intestino médio, como observado em Coleoptera (Ferreira e Terra, 1989;

Baker, 1991), e Hymenoptera (Schumaker et al., 1993) ou pode permanecer

absorvida no glicocálix da célula, como em Lepidoptera (Santos e Terra, 1986). Em

Musca domestica (Diptera), uma α-glicosidase minoritária foi encontrada no lúmen

do intestino médio e uma α-glicosidase majoritária adsorvida no glicocálix (Terra e

Jordão, 1989). α-Glicosidases ligadas a membrana são proteínas integrantes de

membranas microvilares em células de intestino médio (Espinoza-Fuentes e Terra,

1986; Terra e Jordão, 1989; Jordão e Terra, 1991). A compartimentalização das α-

glicosidases no intestino médio depende da posição filogenética dos insetos, de

acordo com o fato estabelecido de que toda digestão padrão se correlaciona bem

com a filogenia (Terra, 1988, 1990).

Diversas α-glicosidases foram caracterizadas em insetos (Terra e Ferreira,

2005), e várias já foram purificadas: adulto de Apis mellifera (Heber e Mathinson,

1976); adulto de Drosophila melanogaster (Tanimura et al., 1979); larva de

Thaumetopeae pityocampa (Pratviel-Sosa et al., 1986). Entretanto todas essas

enzimas foram purificadas a partir de insetos inteiros, e, portanto, não devem ser

claramente de origem intestinal, podendo também ser encontradas em glândulas

salivares ou hipofaringeanas (Huber e Mathinson, 1976). α-Glicosidases purificadas

e caracterizadas até este momento foram a α-glicosidase de D. peruvianus

purificada a partir de membranas perimicrovilares (Silva e Terra 1995), duas α-

glicosidases do intestino médio de Spodoptera frugiperda (Lepidoptera: Noctuidae)

(Marana et al., 2000), três α-glicosidases do vetor neo-tropical da malária o

Anopheles aquasalis (Diptera: Culicidae) (Souza-Neto et al., 2007) e uma α-

glicosidase da abelha japonesa Apis cerana japonica (Wongchawalit et al., 2006).

1.15 - β-GLICOSIDASES EM INSETOS

β-glicosidases (EC 3.2.1) são exoenzimas, que removem os monossacarídeos

da região terminal não redutora de di e/ou oligossacarídeos. Dependendo do

monossacarídeo que é removido, a β-glicosidase é chamada β-glicosidase (glicose),

35

β-xilosidase (xilose), β-galactosidase (galactose). Frequentemente a mesma β-

glicosidase tem habilidade em hidrolisar diferentes resíduos de monossacarídeos de

glicosídeos. Neste caso, β-glicosidase é usado para nomear todas as enzimas, que

removem glicose com eficiência (Terra e Ferreira, 1994). Em insetos, β-glicosidases

têm um papel na digestão final de celulose e hemicelulose, na quebra de

carboidratos de glicoproteínas (Terra e Ferreira, 1994) e pode ainda hidrolisar

glicolipídeos, como proposto por Marana e colaboradores (1995). No entanto, a

função precisa de muitas β-glicosidases não está clara, já que algumas hidrolisam

apenas substratos sintéticos (Morgan, 1975; Marana et al., 1995).

Características gerais já podem ser delineadas para as β-glicosidases

digestivas encontradas em insetos (ver Terra e Ferreira, 2005). No geral elas

apresentam um peso molecular que varia de 30 a 150 kDa; pIs já determinados

mostraram que essas enzimas apresentam características de ácidas a neutras com

esse parâmetro variando de 3,7 a 7,8 e o pH ótimo está na faixa de 4,5 a 6,5.

Entretanto, em Lepidoptera essas enzimas apresentam um pH ótimo mais alto do

que o encontrado em outros insetos variando de 6 a 7.

O número de β-glicosidases no tubo digestivo pode variar. Alguns insetos

possuem apenas uma β-glicosidase capaz de clivar vários substratos, enquanto

outros possuem várias dessas enzimas com especificidades diferentes para os

diversos substratos. Quando várias enzimas estão presentes, suas especificidades

são diferentes e, quando somente uma enzima está presente, ela possui

especificidade ampla cobrindo as especificidades de todas aquelas enzimas

presentes nos insetos que possuem duas ou quatro dessas proteínas (Ferreira et al.,

1998, Azevedo et al., 2003).

Baseado na eficiência catalítica relativa a diferentes substratos, β-glicosidases

de insetos podem ser divididas em duas classes. Classe A inclui as enzimas que

possuem eficiência em hidrolisar substratos contendo aglicones hidrofílicos, como

dissacarídeos e oligossacarídeos. A classe B compreende enzimas que possuem

uma alta atividade somente sobre substratos contendo aglicones hidrofóbicos, como

as alquil-, p-nitrofenil- e metilumbeliferil β-glicosidases.

Enzimas da classe A são mais abundantes do que as β-glicosidases da classe

B. A classe A hidrolisa di- e oligossacarídeos e possui quatro subsítios para ligação

36

com glicose no sítio ativo (Ferreira et al., 2001, 2003; Marana et al., 2000; Azevedo

et al., 2003).

Além do importante papel na digestão, β-glicosidases são importantes na

relação inseto-planta. Para impedir a herbivoria, plantas sintetizam um grande

número de glicosídeos tóxicos que podem estar presentes em concentrações que

vão de 0,5% a 1% (Spencer, 1988). A presença destes glicosídeos em dietas de

alguns insetos pode explicar o variado número de β-glicosidases com diferentes

especificidades nos seus intestinos. A maior parte dos glicosídeos de plantas possui

um aglicone hidrofóbico e são compostos β-ligados O-glicosil. Já que os aglicones

são normalmente mais tóxicos do que os próprios glicosídeos, a intoxicação pode

ser evitada pela diminuição da atividade sobre glicosídeos tóxicos (β-glicosidase tipo

B) provavelmente responsáveis pela hidrólise de glicolipídeos, sem afetar a digestão

final da hemicelulose e celulase que é feita pelas β-glicosidases do tipo A (Terra e

Ferreira, 2005).

Experimentos realizados través de fracionamento celular sugeriram que essas

enzimas poderiam servir como marcadores em insetos da espécie D. peruvianus

(Hemiptera: Pyrrhocoridae), onde a α-glicosidase estaria associada à membrana

perimicrovilar, a β-glicosidase à membrana microvilar e a aminopeptidase no espaço

entre estas duas membranas, denominado espaço perimicrovilar. Estudos

minuciosos deverão ser realizados de modo a comprovar definitivamente a origem

deste sistema membranar, auxiliando desse modo no aprofundamento dos

conhecimentos de como se organiza o processo digestivo na ordem Hemiptera.

1.16 - ETIQUETAS DE SEQÜÊNCIAS EXPRESSAS (EXPRESSED SEQUENCE TAGS � ESTS)

As etiquetas de seqüências expressas são seqüências curtas (200-500 pb) de

DNA geradas das extremidades 3´ e 5´ de clones de cDNA selecionados ao acaso,

os quais representam os genes expressos de um organismo. Os genes mais

expressos serão representados na biblioteca muitas vezes por clones idênticos ou

por clones quase idênticos. Para reduzir esta redundância e para aumentar as

possibilidades de identificar transcritos raros, as bibliotecas do cDNA usadas em

projetos de EST são frequentemente normalizadas para aumentar a freqüência

relativa de clones raros (Bonaldo et al., 1996). O método foi descrito pelo grupo de

Craig Venter, em 1991, para análise de genes expressos em cérebro humano e

37

atualmente vem sendo aplicado para a análise da expressão de genes nos mais

diferentes tipos de organismos. O objetivo do seqüênciamento e análise de ESTs é

gerar, rapidamente, dados sobre os genes que codificam proteínas de um

determinado tipo de célula, organismo ou parte do mesmo. A análise de EST é um

método eficaz para amostragem de genes expressos em um organismo ou em um

tecido. Assim, para organismos molecularmente e geneticamente até agora mal

descritos, a facilidade e economia relativa de obter uma seqüência parcial a partir de

bibliotecas de cDNA pode ser uma maneira altamente produtiva de gerar muita

informação sobre genes funcionais (Boguski et al., 1993; Rudd, 2003). No campo da

biologia molecular de parasitas, este tipo de abordagem permitiu o descobrimento de

diversos candidatos a drogas e vacinas (Lizotte-Waniewski, et al., 2000). Entretanto,

dados gerados por ESTs também contém tipos de informações adicionais

importantes.

A abundância da seqüência de um EST particular no banco de dados de um

organismo refletirá o seu nível de expressão (no caso da biblioteca não ser

normalizada). Como as bibliotecas de cDNA das quais os ESTs são gerados são

construídas dos tecidos isolados ou dos estágios específicos do ciclo de vida, o

índice do EST por biblioteca pode ser informativo a respeito do tecido ou estágio-

específico, ou da expressão do tecido ou estágio-regulado. Além disso, pode-se ao

comparar perfis de EST de organismos relacionados montando um perfil filogenético

de conservação da seqüência e expressão para cada gene e seus homólogos.

Em 2002 o grupo do pesquisador Alfried Vogler mostrou o potencial que há

nas pequenas bibliotecas de cDNA para descoberta e análise comparativa de genes

úteis para estudos funcionais e filogenéticos ao comparar bibliotecas de EST de sete

espécies de Coleoptera (Theodorides et al., 2002). Outros grupos de pesquisa

utilizaram esta mesma metodologia para análise transcripcional em diversos

organismos de interesse econômico. Apesar dos Hemiptera terem grande

importância econômica são claramente pouco representados em banco de dados

genômicos quando comparados com outras ordens. Um total de 134.954 seqüências

de nucleotídeos de Hemiptera são citadas no banco de dados do NCBI (National

Center for Biotechnology Information) contra 1.453.547 de Diptera e 466.126 de

Lepidoptera (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) (GenBank, Junho 2008).

Um incremento do nosso conhecimento sobre seqüênciamento genômico tem

grande importância no estudo de porções expressas do genoma através de

38

estratégia baseada em seqüênciamento de cDNAs. Além de rápida, esta

metodologia tem um custo menor, sendo muito eficaz na identificação de um grande

número genes no organismo do interesse (Adams et al., 1991). Nós adotamos esta

estratégia com intuito de obter seqüências relacionadas com enzimas digestivas

(cisteína-proteinase, aminopeptidase, β-glucosidase), transportadores e proteínas

estruturais do intestino médio do D. peruvianus.

1.17 - PRINCIPAIS CARACTERÍSTICAS MOLECULARES, BIOQUÍMICAS E FUNCIONAIS DOS

TRANSPORTADORES DE MONOSSACARÍDEOS

Em insetos, glicose é importante em vários aspectos do metabolismo e

absolutamente necessária para a sobrevivência (Wegener et al., 2003). Durante a

metamorfose em insetos, a glicose funciona como fonte energética e substrato para

a síntese dos tecidos da pulpa e do adulto (Chippendale, 1978). A falta de glicose

causa falência de órgãos e falência do sistema nervoso o que resulta numa

desordem de comportamento e morte (Wegner et al., 2003). Além disso, já foi

observada a importância deste açúcar na reprodução de Bombyx mori (Kawamura et

al., 2003).

Membranas plasmáticas de células eucarióticas são formadas por duas

camadas de lipídios que impedem a passagem de moléculas hidrofílicas e, portanto

a glicose é transportada pela membrana plasmática através de proteínas

carreadoras associadas à membrana, chamadas transportadores de glicose. Há dois

grupos de proteínas transportadoras que se distinguem estruturalmente e

funcionalmente, que mediam a transferência da glicose e outros açúcares através da

bicamada lipídica: um sistema carreador acoplado a Na+ (SGLT) (Wright, 2001) e o

transportador facilitativo de glicose (GLUT) (Bell et al., 1990; Carrunthers, 1990;

Mueckler, 1994; Joost e Thorens, 2001). Os dois tipos de transportadores pertencem

às famílias carreadoras de solutos (SLC), que compreendem 43 famílias (SLC1-

SLC43).

1.17.1 - CO-TRANSPORTADOR DE GLICOSE E SÓDIO (SGLT)

Os SGLTs efetuam um transporte acoplado, ingressando conjuntamente na

célula, sódio, glicose (ou galactose, em alguns casos) e água. Localizam-se na

membrana luminal das células epiteliais encarregadas de absorção (intestino

delgado) e reabsorção de nutrientes. Aproveita-se a entrada do sódio a favor de um

39

gradiente eletroquímico formado entre o exterior e o interior da célula, para

transportar a glicose contra um gradiente químico. A família SGLT (transportador de

glicose dependente de sódio, gene SLC5A) compreende co-transportadores de

glicose dependentes de sódio (SGLT1 e SGLT2), o sensor de glicose SGLT3,

inositol (Berry et al., 1995) e transportadores de multivitaminas SGLT4 e SGLT6

(Balamurugan et al., 2003), e o transportador de iodo de tireóide SGLT5 (Smanik et

al., 1996). SGLT1 e SGLT2 podem ser inibidos por florizina (floretina-2´-β-

glicosídeo), um produto da casca da macieira (Gerardi-Laffin et al., 1993). Todos os

SGLTs possuem uma estrutura secundária similar, com quatorze domínios

transmembranares com estrutura de α-hélice.

O SGLT1, é uma proteína de 664 aminoácidos, que tem uma alta afinidade

por glicose, com um Km de 0,3 mM. Apresenta quatorze domínios transmembranares

em α-hélice, com os domínios amino (N) e carboxi (C) terminais localizados na

região extracelular da membrana, além de apresentarem um sítio de glicosilação

entre os domínios seis e sete. O transporte de sódio e de glicose se realiza através

de duas vias diferentes, o sódio entra por uma região da proteína na porção N-

terminal e o monossacarídeo através da região C-terminal. A união do sódio ao

SGLT gera uma mudança de conformação que permite o transporte de glicose para

o interior da célula, na estequiometria: duas moléculas de sódio, uma molécula de

glicose e 260 moléculas de água (Wright, 2001; Loo et al., 1996).

O SGLT2 é uma proteína de 672 aminoácidos com 59% de similaridade com

o SGLT1 e apresenta um Km de 1,6 mM para glicose. Transporta uma molécula de

sódio por uma de glicose, seu Km para o sódio é de 200 a 300 mM. Localizam-se nos

rins e são responsáveis pela reabsorção de 90% da glicose filtrada nos rins.

O SGLT3 é uma proteína de 674 aminoácidos com 70% de similaridade com

SGLT1 e apresenta um Km de 6 mM para glicose. Transporta duas moléculas de

sódio para uma de glicose (Wright, 2001).

1.17.2 - TRANSPORTADOR FACILITATIVO DE GLICOSE (GLUT)

Os transportadores facilitativos de glicose (GLUT) utilizam o gradiente de

difusão de glicose (e outros açúcares) pela membrana plasmática e exibem

especificidades por diferentes substratos, propriedades cinéticas e padrão

diferenciado de expressão em tecidos. O genoma humano contém 14 membros da

família GLUT, a qual é dividida em três subfamílias de acordo com as similaridades

40

entre seqüências de nucleotídeos e elementos característicos (Joost e Thorens,

2001; Rogers et al., 2002; Uldry et al., 2001). As diferenças são principalmente

relacionadas com características funcionais (especificidade por substrato, valores de

Km, afinidade de ligação com os inibidores citocalasina B e forscolina) (Joost et al.,

2001). Além disso, a função de alguns transportadores é modificada pela

redistribuição regulada de proteínas entre a membrana celular e o compartimento

intracelular. Estas diferentes características permitem uma regulação específica e

complexa da tomada de glicose de acordo com as necessidades celulares e das

condições fisiológicas de suprimento de substrato (Joost et al., 2001).

Os GLUTs apresentam uma conformação protéica similar; são glicoproteínas

de 45 a 55 kDa (Doege et al., 2000), com doze domínios transmembranares com

estrutura α-hélice. Os extremos N- e C-terminais localizam-se no citoplasma, além

disso, apresentam um sítio de glicosilação na região externa da membrana. Cada

uma das diferentes isoformas de GLUT possui características cinéticas próprias,

adaptadas as necessidades metabólicas do organismo. Os segmentos

transmembranares 3, 5, 7 e 11 são hidrofílicos em uma face do cilindro α-hélice e

hidrofóbicos na outra, portanto formam um poro e desta forma permite a entrada do

monossacarídeo a favor de um gradiente de concentração (Guerre-Millo et al.,

1995). Para que ocorra a entrada de glicose deve formar previamente uniões como

pontes de hidrogênio entre os grupos hidroxila e carbamino do GLUT e os grupos

hidroxila da glicose (Lienhard et al., 1992). A glicose é internalizada na célula

através de quatro etapas: primeiramente a glicose se une ao transportador na face

externa da membrana, em seguida o transportador modifica a sua conformação no

sítio de união fazendo com que a glicose no próximo passo seja liberada no

citoplasma, finalmente o transportador livre muda novamente sua conformação,

expõe o sítio de união à glicose na face externa e retorna o seu estado inicial

(Carruthers, 1990).

Há uma grande defasagem de conhecimento a respeito dos transportadores

de glicose em insetos, tendo apenas sido identificado e caracterizado até o momento

um cDNA codificante de GLUT8 em formiga (Chen et al., 2006).

1.18 - BOMBAS DE ÁGUA

A água pode atravessar membranas celulares através de três rotas: bicamada

lipídica, canais de passagem de água ou por mecanismos dependentes de

41

mudanças conformacionais de proteínas transportadoras (Zeuthen, 1991, 1994;

Zeuthen, et al., 1996; Loo, et al., 1996; Zeuthen et al. 1997).

Desde o momento em que Reid (1892) demonstrou que a água é

transportada pelo intestino na ausência de diferença de pressão hidrostática e

osmolaridade transepitelial, essa questão, de como a água é transportada através

das células epiteliais na ausência de forças externas, vêm intrigando fisiologistas. A

maioria dos estudos nos últimos 40 anos originou da hipótese de que o transporte

ativo de sódio era o responsável pela geração de gradientes osmóticos locais em

tecidos epiteliais e esta água estaria acoplada ao movimento do sódio por osmose.

Peter Curran propôs um modelo com três compartimentos para a absorção de

fluidos pelo intestino (Curran e McIntosh, 1962), e Jared Diamond propôs um modelo

de osmose local para vesícula biliar (Diamond e Bossert, 1967). O compartimento de

osmose local não foi definido no modelo de Curran, mas Diamond propôs que o

gradiente de osmose local era gerado em espaços intracelulares laterais. A última

hipótese está de acordo com a localização das bombas de sódio e potássio na

membrana basolateral do epitélio absortivo.

Com a descoberta de Peter Agre dos canais de passagem de água (Preston

et al., 1992), as aquaporinas, houve o retorno do interesse do transporte de água em

epitélio, especialmente em rim. No intestino há pouca ou quase nenhuma expressão

de aquaporinas em enterócitos e isto aumenta a possibilidade de que a alta

permeabilidade a água pelas membranas basolateral ou microvilosidades está

relacionada a uma grande permeabilidade da bicamada lipídica ou da presença de

canais para passagem de água. Glicose estimula o transporte de sódio através das

microvilosidades do enterócito pelo co-transporte glicose-sódio, e o sódio que entra

na célula é bombeado para fora para o espaço intercelular lateral pela bomba

basolateral sódio-potássio. É comumente aceito que a água segue o transporte de

açúcar e do sal através de osmose local. Esta ligação entre o transporte de glicose,

sal e água é a base da terapia utilizada para o tratamento de diarréia causada por

cólera, chamada terapia de re-hidratação oral (Hirschorn e Greenough, 1991).

A comprovação de que transportadores de monossacarídeos do tipo co-

transportador glicose-sódio estariam envolvidos também na entrada de moléculas de

água nas células foi feita através de estudos envolvendo a expressão de SGLT1 em

oócitos de Xenopus laevis (Zampighi et al. 1995; Loo et al. 1996, 1999; Loike et al.

1996; Meinild et al. 1998). Foi observado que a permeabilidade osmótica da água de

42

SGLT1 expressos em oócitos é diretamente proporcional ao número de co-

transportadores expressos na membrana. A permeabilidade à água pelo SGLT1

ocorre independente do tamanho e da direção do gradiente osmótico, assim como

da presença ou ausência de ligantes (sódio e glicose), mas a florizina inibe a

passagem da água através do SGLT1 com um Ki de aproximadamente 5 µM na

presença de sódio (Zeuthen et al., 2001). De acordo com o modelo proposto por

Parent e colaboradores (1992b), Loo e colaboradores (1993) e Meinild e

colaboradores (2002), primeiramente dois íons sódio se ligariam ao SGLT1,

promovendo uma mudança conformacional no co-transportador, permitindo a

�ligação� de uma molécula de glicose e 200-260 moléculas de água. Este complexo

preenchido passaria por um processo de mudança conformacional para expor o

substrato na superfície interna da membrana, onde a água e o açúcar se

dissociariam. O deslocamento do sódio da membrana ocorre, pois há uma baixa

concentração de sódio dentro da célula. A saída do sódio faz com que a

conformação antes relaxada da proteína resulte numa conformação mais fechada

fazendo com que haja a expulsão da água. O ciclo catalítico é completado com a

isomerização da proteína voltando esta para a conformação inicial.

Recentemente foi demonstrado que além de transportar glicose o

transportador do tipo facilitativo GLUT2 transporta também moléculas de água

(Zeuthen et al., 2007). Quando expressos em oócitos de Xenopus laevis, estes

transportadores exibem propriedades de canais para passagem de água que são

sensíveis ao inibidor específico floretina (Fischbarg et al., 1990). O GLUT2

transporta água através de dois mecanismos que funcionam em paralelo: a partir de

um acoplamento com glicose e por um transporte osmótico dirigido por uma

acumulação de açúcar no oócito (Zeuthen et al., 2007).

43

2 - OBJETIVOS GERAIS

O inseto utilizado neste trabalho, Dysdercus peruvianus (Hemiptera), constitui

um interessante modelo de estudo, visto que, possui uma membrana que recobre o

intestino médio distinta de qualquer outra membrana já observada em insetos; seu

intestino médio é seccionado em ventrículos, o que possibilita estudos precisos de

transporte de açúcares e água; e a presença de cisteína proteinase como proteinase

digestiva majoritária ao contrário de uma serino proteinase encontrada na maioria

das ordens da classe Insecta. Desta forma, as principais metas desta dissertação

abrangem a identificação das proteínas encontradas no intestino médio do inseto

modelo, caracterização do transporte de glicose no ventrículo anterior e o estudo das

cisteína proteinases digestivas.

2.1 - OBJETIVOS ESPECÍFICOS

• Construção de uma biblioteca de cDNAs do intestino médio de D. peruvianus

em fago Lambda Uni ZAP para seqüênciamento ao acaso. Processamento e

análise das ESTs. Seleção de algumas seqüências para estudo de

distribuição tecidual através de RT-PCR semiquantitativo.

• Estudo de cisteína proteinases digestivas, envolvendo distribuição tecidual,

purificação e caracterização cinética, além de tentativa de relacionar as

seqüências de catepsinas L encontradas no transcriptoma com as proteinases

purificadas do inseto.

• Descrição por experimentos in vivo dos tipos de transportadores de açúcar

no intestino médio de D. peruvianus. Seqüênciamento completo e análise com

ferramentas de bioinformática de seqüência homóloga ao transportador de

glicose encontrado no transcriptoma obtido.

44

3 - MATERIAIS E MÉTODOS

3.1 - COLÔNIA DE INSETOS

Neste estudo foram usados insetos adultos do sugador de sementes de

algodão, Dysdercus peruvianus (Pentatomomorpha: Pyrrhocoridae), obtidos da

colônia mantida em nosso laboratório desde 1990. Estes insetos são mantidos em

viveiros de plástico contendo areia e cobertos por um pedaço de pano de algodão

presos por elásticos, tendo livre acesso à água e a sementes de algodão

(Gossypium hirsutum) que são previamente congeladas com o intuito de eliminar

organismos que possam contaminá-las. Estas sementes são obtidas no Instituto

Agronômico de Campinas (IAC).

As colônias são mantidas em condições de fotoperíodo natural com umidade

relativa de 50-70% e temperatura de 24 ± 2 ºC.

3.2 - DISSECÇÃO DOS INSETOS E PREPARO DE AMOSTRA

Fêmeas adultas de D. peruvianus foram previamente imobilizadas no gelo e

então dissecadas em solução de cloreto de sódio 215 mM para remoção do trato

digestivo e posterior retirada de membranas microvilar e perimicrovilar.

Para obtenção de enzimas digestivas, os insetos utilizados estavam no

período adulto, com acesso a água e sementes de algodão. Durante a dissecção

dos insetos, em solução de cloreto de sódio 215 mM, primeiramente são

descartados a carapaça e o corpo gorduroso e posteriormente o intestino anterior e

posterior. Somente o intestino médio é utilizado, sendo que este é subdividido em

ventrículo 1, 2 e 3. Os ventrículos (V1, V2 e V3) que formam o intestino médio foram

separados para serem futuramente homogeneizados.

Animais que passaram pelo processo de jejum com posterior privação de

água e foram alimentados com solução de corante, tiveram o V1 retirado e o seu

conteúdo luminal coletado com auxílio de um capilar acoplado a um aparato de

sucção.

Cada lote de ventrículos foi homogeneizado em água bidestilada em gelo com

auxílio de um homogeneizador tipo Potter-Elvehjem, seguida de centrifugação a

20.000 g por 30 minutos à 4 ºC. O sedimento foi descartado e o sobrenadante

utilizado para ensaio de atividade e determinação de proteínas.

45

3.3 - ELETROFORESE EM GEL DE POLIACRILAMIDA EM CONDIÇÕES DESNATURANTES (SDS-

PAGE)

Amostras contendo intestinos de D. peruvianus foram aquecidas durante 5

minutos a 95 ºC em tampão de amostra (Tris-HCl 60 mM, pH 6,8, contendo SDS 2%

(p/v), glicerol 10%, β-mercaptoetanol 0,36 mM e azul de bromofenol 0,0025%) e em

seguida submetidas a uma separação eletroforética utilizando um equipamento Mini-

Protean II (Bio-Rad, EUA) em placa fina (1 mm) em poliacrilamida 12% (Laemmli,

1970). As eletroforeses foram realizadas a 200 V e temperatura ambiente, até que o

azul de bromofenol (utilizado como indicador da mobilidade eletroforética) estivesse

a 0,5 cm da borda inferior da placa sendo que o gel foi corado para visualização de

proteínas pelo método de prata (Blum et al., 1987). O marcador de massa molecular

utilizado foi o Low Range Prestained SDS-PAGE Standards (Bio-Rad) contendo as

seguintes proteínas: fosforilase B (112 KDa), albumina sérica bovina (81 KDa),

ovalbumina (49,9 KDa), anidrase carbônica (36,2 KDa), inibidor de tripsina de soja

(29,9 KDa) e lisozima (21,3 KDa).

3.4 - ATIVIDADE EM GEL DE POLIACRILAMIDA EM CONDIÇÕES NATIVAS (PAGE)

Amostra contendo intestinos de D. peruvianus com o equivalente a 7 µg/µL de

proteína foi submetida a uma separação eletroforética em gel 12% utilizando um

equipamento Mini-Protean II (Bio-Rad, EUA) em placa fina (1 mm) em condições

nativas (Laemmli, 1970). Os géis nativos não continham SDS e β-mercaptoetanol,

assim como o tampão de amostra e o tampão de corrida. As eletroforeses foram

realizadas a 100 V a 4 ºC até que o azul de bromofenol (utilizado como indicador da

mobilidade eletroforética), estivesse a 0,5 cm da borda inferior da placa.

A atividade da cisteína-proteinase foi monitorada em gel através do ensaio

com o substrato específico. Após o fracionamento das proteínas, o gel foi incubado

em banho-maria por 5 minutos a 30 ºC utilizando como substrato o reagente

fluorogênico Z-FR-MCA 1 mM em tampão MES 0,1 mM pH 6,0, EDTA 3 mM e

cisteína 3 mM. O produto da atividade enzimática pode ser evidenciado em

transiluminador de UV 312 nm (Manchenko, 1994) e posteriormente fotografado.

46

3.5 - DETERMINAÇÃO DE ATIVIDADES ENZIMÁTICAS

Nos ensaios de atividade enzimática a mistura dos reagentes foi incubada a

30 ºC por pelo menos quatro períodos de tempo. Controles sem enzima (brancos de

enzimas) ou sem substrato (branco de enzima) foram feitos e tratados do mesmo

modo que os experimentais. A atividade está expressa em mili unidades (mU), onde

a unidade de atividade enzimática foi definida como a quantidade de enzima capaz

de clivar 1µmol de ligações por minuto.

O ensaio de cisteína proteinase foi realizado utilizando como substrato Z-FR-

MCA 1 mM (inicialmente solubilizado em DMSO) em tampão MES 0,1 M pH 6,0 com

3 mM de EDTA e 3 mM de cisteína. O volume de reação foi de 1,2 mL e a reação foi

interrompida com a adição de 0,2 mL de ácido acético 30%. Metil coumarina é

liberada quando o substrato é hidrolisado e desta forma pode-se detectá-la através

de sua florescência medida com a excitação a 380 nm e emissão a 460 nm (Alves et

al., 1996).

3.6 - DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE PROTEÍNAS

A determinação da concentração de proteína na amostra foi feita utilizando o

método descrito por Smith et al. (1985) e modificado por Morton e Evans (1992),

usando curva padrão de albumina sérica bovina, nos casos de amostras que

continham Triton X-100; ou o descrito por Bradford (1976), usando uma curva

padrão de albumina de ovo.

3.7 - EFEITO DE DIFERENTES INIBIDORES NA ATIVIDADE PROTEOLÍTICA

Os homogeneizados de intestino médio total e dos ventrículos separados (V1,

V2 e V3) de D. peruvianus foram pré-incubados e ensaiados com vários inibidores a

fim de verificar o efeito perante a atividade da cisteína-proteinase digestiva deste

inseto. Os inibidores utilizados foram: E-64, um inibidor irreversível de cisteína-

proteinases, 10 µM solubilizado em DMSO; pepstatina A, um inibidor reversível de

aspártico-proteinases, 1 µM solubilizado em DMSO e PMSF, inibidor irreversível de

serino-proteinases, 1 mM solubilizado em metanol. Além disso, foi feito um ensaio

controle nas mesmas condições citadas anteriormente para testar uma possível

interferência do metanol utilizado na solubilização do PMSF.

47

3.8 - PREPARAÇÃO DAS AMOSTRAS PARA PURIFICAÇÃO DE CISTEÍNA PROTEINASE

Para preparação do homogeneizado de cada ventrículo do intestino médio

foram utilizadas fêmeas com 4-7 dias após emergência. Os insetos foram

dissecados como citado anteriormente (item 3.3).

Cada lote de aproximadamente 20 ventrículos foi homogeneizado em tampão

Tris-HCl 20 mM contendo 1 mM de MMTS pH 8,0 com auxílio de um

homogeneizador tipo Potter-Elvehjem, seguida de centrifugação a 20.000 g por 30

minutos à 4 ºC. O sedimento foi descartado e o sobrenadante utilizado para

homogeneização de mais um lote de 20 ventrículos, seguida de centrifugação a

20.000 g por 30 minutos à 4ºC.

3.9 - CROMATOGRAFIAS 3.9.1 - CROMATOGRAFIA DE TROCA IÔNICA

Foi usada a coluna HiTrap Q XL (Pharmacia) de 1 mL. A coluna foi operada

manualmente, sendo a cromatografia realizada a 4 ºC dentro de uma câmara fria. As

frações obtidas foram analisadas quanto a sua atividade sobre o substrato Z-FR-

MCA.

O fluxo utilizado foi de aproximadamente 1 mL/min e as frações coletadas de

1,0 mL. A coluna foi previamente equilibrada com 5 volumes de tampão Tris-HCl 20

mM contendo 1 mM de MMTS pH 8,0 antes das cromatografias. A amostra foi eluída

com tampão Tris-HCl 20 mM contendo 1 mM de MMTS e 1 M de NaCl pH 8,0.

Esta coluna foi utilizada com a finalidade de retirar pigmentos e

contaminantes da amostra, já que o próximo passo envolve uma coluna de filtração

em gel, onde a presença de pigmento pode inviabilizar a utilização da coluna em

pouco tempo de uso.

3.9.2 - CROMATOGRAFIA DE GEL FILTRAÇÃO

Foi usada a coluna Superdex 75 HR 10/30 (Pharmacia). A coluna foi acoplada

ao sistema de FPLC (Pharmacia Biotech), sendo a cromatografia realizada em

temperatura ambiente. A eluição de proteína foi monitorada pela leitura a 280 nm. As

frações obtidas foram analisadas quanto a sua atividade sobre o substrato Z-FR-

MCA.

A cromatografia foi realizada em tampão MES 100 mM contendo NaCl 0,2 M e

MMTS 1 mM, pH 6,0, sendo o fluxo utilizado de 0,5 mL/min e as frações coletadas

48

de 0,3 mL. A coluna foi previamente equilibrada com 2 volumes de tampão antes das

cromatografias.

3.9.3 - CROMATOGRAFIA DE AFINIDADE

Foi usada a coluna Arginina-Sepharose 4B acoplada ao sistema Akta Prime

Plus (Pharmacia), sendo a cromatografia realizada em temperatura ambiente. As

frações obtidas foram analisadas quanto a sua atividade sobre o substrato Z-FR-

MCA.

A cromatografia foi realizada em tampão MES 0,1 M contendo cisteína 3 mM,

EDTA 3 mM, pH 6,0 sendo o fluxo utilizado de 1,0 mL/min e as frações coletadas de

1,0 mL. A amostra foi eluída com tampão MES 0,1 M contendo cisteína 3 mM, EDTA

3 mM e arginina 1 M, pH 6,0. A coluna foi previamente equilibrada com 10 volumes

de tampão antes das cromatografias. A amostra aplicada na coluna foi diluída na

ordem de 1:1 com tampão MES 0,2 M contendo cisteína 6 mM, EDTA 6 mM, pH 6,0

para retirada do MMTS presente na amostra, permitindo assim que os resíduos de

cisteína ligassem na coluna. Toda fração foi coletada em tubos contendo tampão

MES 0,5 M e MMTS 5 mM, pH 6,0.

3.10 - PURIFICAÇÃO DAS CISTEÍNA PROTEINASES DO VENTRÍCULO 2

O sobrenadante do homogeneizado seguido de centrifugação (vide item 3.2)

do ventrículo 2 do intestino médio de D. peruvianus foi aplicado na coluna HiTrap Q

XL (Pharmacia). As frações eluídas com maior atividade sobre o substrato Z-FR-

MCA foram reunidas. Esse material foi concentrado de um volume de 2 mL para

aproximadamente 200 µL com o auxílio do concentrador de amostra Amicon Ultra

(Millipore). Esta amostra concentrada foi então aplicada na coluna de filtração em gel

Superdex 75 (Pharmacia). Dois picos contendo atividade sobre Z-FR-MCA foram

observados. Dessa forma, o primeiro pico foi chamado pico 1 e o segundo de pico 2.

As frações do pico 1 foram reunidas, bem como as do pico 2 separadamente. Cada

um destes dois picos foram separadamente diluídos da ordem de 1:1 no tampão

MES 0,2 M contendo cisteína 6 mM, EDTA 6 mM, pH 6,0 e aplicados na coluna de

afinidade Arginina-Sepharose (Pharmacia). Em cada uma das cromatografias foram

obtidas frações que foram eluídas com tampão MES 0,1 M contendo cisteína 3 mM,

EDTA 3 mM e arginina 1 M, pH 6,0 e apresentavam atividade sobre Z-FR-MCA.

49

3.11 - DETERMINAÇÃO DO EFEITO DO PH SOBRE A ATIVIDADE DAS ENZIMAS PURIFICADAS

Essa determinação foi realizada usando preparações purificadas das cisteína

proteinases de D. peruvianus. A atividade enzimática foi determinada como descrito

no item 3.8. O experimento foi realizado través de um ensaio de quatro tempos,

sendo a inclinação da reta para cada ponto determinada. A atividade foi expressa

em porcentagem da maior atividade obtida. Tanto os ensaios quanto a determinação

de pH das misturas de substrato e tampão foram realizadas a 30 ºC. Esse cuidado é

necessário uma vez que a temperatura pode afetar a ionização de grupos presentes

no tampão. Foi utilizado o tampão citrato-fosfato 100 mM, para o pH entre 3,6 e 4,6 e

o tampão MES 0,1 M para o pH entre 5 e 8, todos contendo cisteína 3 mM e EDTA 3

mM.

3.12 - INATIVAÇÃO TÉRMICA

Inativação térmica das cisteína proteinases foi estudada incubando-se

preparações purificadas das mesmas em banho-maria a 40 ºC, seguindo-se a

determinação da atividade remanescente após diferentes intervalos de tempo (5, 7,

10, 12, 15, 20, 25, 30 minutos).

3.13 - ESTUDOS CINÉTICOS

Os ensaios cinéticos foram realizados usando preparações purificadas das

cisteína proteinases 1 e 2 de Dysdercus peruvianus. Para determinação de Km, a

velocidade de hidrólise foi determinada usando pelo menos dez concentrações

diferentes de substrato. As velocidades de hidrólise dos diferentes substratos foram

determinadas e usadas para traçar o gráfico de Lineweaver-Burk. O programa

Enzfitter (Elsevier Biosoft, Cambridge, UK) foi usado para determinar Km e Vmax.

3.14 - TITULAÇÃO COM TRANS-EXPOXYSUCCINIL-L-LEUCIL-AMIDO (4-GUANIDINO BUTANO) (E-64) DA CIS 1 E CIS 2 DO INTESTINO MÉDIO DO D. PERUVIANUS

A porção linear do plote da atividade contra a concentração de E-64 extrapola

a concentração de E-64, o qual é equivalente à concentração total da enzima

estudada. A atividade proteolítica no ponto de equivalência corresponde à

concentração da enzima livre que é idêntica a concentração de E-64 livre. Sabendo

a concentração total da enzima e a concentração da enzima livre, é possível

determinar a concentração do complexo enzima-inibidor. A constante de dissociação

50

(Kd) do complexo cisteína proteinase�E-64 pode ser calculada pela equação:

Kd=[E][I]/[EI] (detalhes em Green e Work, 1953; Knight e Barrett, 1976). A atividade

específica é calculada pela fórmula: atividade específica = A/nM, onde A é a

atividade na alíquota titulada; n é o número de mols de enzima na alíquota titulada e

M o peso molecular da enzima em mg.

3.15 - EXTRAÇÃO DE RNA TOTAL DE INTESTINO DE D. PERUVAINUS

Apenas fêmeas de D. peruvianus bem alimentadas foram utilizadas para

extração de RNA total do intestino médio.

A dissecção dos insetos foi feita utilizando tampão NaCl 215 mM preparado

com água DEPC (dietilpirocarbonato), sendo que logo após serem retirados os

intestinos foram congelados em gelo seco para evitar a ação de RNAses.

O RNA total de 10 intestinos de fêmeas de D. peruvianus foi extraído com o

reagente Trizol (GIBCO-BRL). Durante 5 minutos 10 intestinos foram

homogeneizados em 1 mL de Trizol em temperatura ambiente. O homogenato foi

centrifugado a 11000 rpm por 10 minutos a 4 ºC. Á fase aquosa foi acrescentado

200 µL de clorofórmio. Após 15 segundos de agitação seguida de 3 minutos de

incubação à temperatura ambiente, o tubo foi centrifugado a 11000 rpm por 15

minutos a 4 ºC. A fase aquosa foi transferida para um novo tubo, onde 250 µL de

isopropanol e 250 µL de solução de precipitação (1,2 M de NaCl; 0,8 M de citrato

trisódico e água DEPC) foram adicionados e por 10 minutos ficaram incubando a

temperatura ambiente. Após 10 minutos de centrifugação a 11000 rpm por 5 minutos

a 4 ºC, o sobrenadante foi descartado e o sedimento foi ressuspendido em etanol

75%, centrifugado a 11000 rpm por 5 minutos a 4 ºC, sendo que esta etapa foi

repetida mais uma vez. Ao final da segunda lavagem com etanol 75%, o sedimento

passou por um período de secagem no fluxo laminar por 3 minutos. O sedimento

seco foi dissolvido em 100 µL de água tratada com DEPC com agitação manual

freqüente à 65 ºC.

Depois de feita a preparação, a qualidade do RNA foi checada através da

razão de absorbância A260/A280 nm, obtendo o resultado de 1,9 e através de gel de

agarose 1,5%.

51

3.16 - CONSTRUÇÃO DA BIBLIOTECA DE CDNA DO INTESTINO MÉDIO DE DYSDERCUS

PERUVIANUS O RNA total extraído do intestino de D. peruvianus foi enviado para a

empresa Vertis Biotechnologie AG, localizada na Alemanha com o propósito da

construção da biblioteca de cDNA de expressão normalizada.

Partindo do RNA total enviado, a poli A+RNA foi purificada. Com a poli

A+RNA foi sintetizada a primeira fita de cDNA utilizando um primer random-Xho1-

linker e uma transcriptase reversa M-MLV-Rnase. A síntese da segunda fita foi feita

utilizando um segundo primer e DNA polimerase Klenow. O N0-cDNA resultante foi

então amplificado com 13 ciclos de LA-PCR (Barnes, 1994).

Depois de obtida a normalização do cDNA amplificado, este foi clonado e

inserido no vetor Lambda Uni ZAP .

Este vetor permite uma excisão, in vivo, simples e eficiente e a

recircularização de qualquer inserto contido dentro do vetor lambda para formar um

fagomídeo contendo o inserto (Ausubel et al., 1990). Esse processo de excisão

depende da localização da seqüência de DNA dentro do fago e da presença de uma

variedade de proteínas como, por exemplo, as M13. As proteínas M13 do fago

reconhecem a região do DNA que normalmente serve como origem de replicação.

Esta origem pode ser dividida em duas partes: o sítio de iniciação e o sítio de

término para a síntese de DNA (Sambrook et al., 2001). O fago lambda se faz

acessível às proteínas M13 pela infecção simultânea das células XL1-Blue MRF´

com o vetor lambda e o fago �helper EX Assist�. Dentro dessas bactérias as

proteínas M13 reconhecem a região iniciadora do DNA dentro do vetor lambda e

uma nova fita de DNA é sintetizada e duplicada. A síntese dessa nova fita continua

passando pelo inserto clonado e pelo gene de resistência à ampicilina, até o sinal de

término que se encontra no vetor lambda. Essa fita simples de DNA é circularizada e

empacotada pelo produto do gene II do fago Helper na forma de fagomídeo, que é

em seguida secretado pelas células XL1-Blue MRF´. Posteriormente à secreção das

partículas do fago, as bactérias usadas no processo de excisão do clone de cDNA

são mortas por aquecimento à 70 ºC e o fago lambda é lisado, mas o fagomídeo não

é afetado pelo aquecimento. As células SOLR são infectadas com o fagomídeo e

podem ser plaqueadas para a formação de colônias. As colônias formadas a partir

do fagomídeo pBluescript foram amplificadas por PCR e submetidas à

seqüênciamento.

52

3.17 - LIGAÇÃO DOS FRAGMENTOS DE DNA A PLASMÍDEOS VETORES

A clonagem de fragmentos de DNA obtidos de amplificações por PCR, foram

clonados no plasmídeo pGEM-T, utilizando o Kit de ligação pGeneT-Easy vector

Sistem I (Promega). A reação de ligação consistia de T4 DNA ligase, 1µg de

plasmídeo juntamente com o fragmento de PCR (purificado de géis de agarose) a

ser clonado no tampão apropriado. Esta mistura foi incubada por 16 h a 4 ºC. O

produto de ligação foi utilizado para transformar bactérias competentes.

3.18 - PREPARAÇÃO DAS BACTÉRIAS COMPETENTES

Um pré-inóculo de Escherichia coli da linhagem XL1-blue foi preparado a

partir de uma colônia isolada, crescida em meio LB líquido durante 16 h, a 37 ºC e

sob agitação de 250 rpm. Este pré-inóculo foi adicionado a 400 mL de meio LB

líquido e mantido nas condições anteriormente descrita de crescimento até obter

uma A600 = 0,3. A cultura foi mantida no gelo por 10 min. Este material foi submetido

a várias centrifugações e o precipitado que continha as células em cada

centrifugação foi ressuspendido em tampão PIPES 10 mM, pH 7, contendo CaCl2 60

mM e glicerol 15% (v/v). As condições de centrifugação foram as seguintes: (a)

centrifugação a 1.600x g, por 7 min a temperatura ambiente, precipitado

ressuspendido em 10 mL de tampão. (b) centrifugação a 1.000x g, por 5 min a

temperatura ambiente, precipitado ressuspendido em 10 mL de tampão, esta

ressuspenção foi mantida no gelo por 30 min. (c) centrifugação a 1.000x g, por 5 min

a temperatura ambiente, precipitado ressuspendido em 2 mL de tampão. Finalmente,

o sobrenadante final foi alíquotado e estocado a -80 ºC.

3.19 - TRANSFORMAÇÃO DE BACTÉRIAS COMPETENTES

Foram utilizados 30 µl das células competentes XL1-blue (ver 3.18) para

serem transformadas com 10 µl da reação de ligação dos fragmentos ao plasmídeo

vetor. Esta mistura foi mantida no banho de gelo por 30 min e imediatamente

submetida a um choque térmico a 42 ºC por 90 seg, retornando ao gelo por 3 min.

Adicionou-se 200 µL de meio LB líquido e as células foram incubadas a 37 ºC por 1

hora para a recuperação e expressão do gene de resistência a ampicilina (presente

no plasmídeo pGeneT-Easy vector). Finalmente, as células foram plaqueadas em LB

ágar contendo 50 µg/mL de ampicilina; 100 µL de IPTG 100 mM e 50 mg/mL X-gal,

53

incubadas a 37 ºC por 16 horas. As bactérias transformadas com o plasmídeo

contendo o inserto originaram colônias de cor brancas.

3.20 - SEQÜÊNCIAMENTO AO ACASO DA BIBLIOTECA DE CDNA 3.20.1 - EXCISÃO IN VIVO DO PLASMÍDEO BLUESCRIPT

Células XL1-Blue MRF´ e SOLR foram crescidas em LB líquido suplementado

com maltose 0,2% (p/v) e MgSO4 10 mM durante 16 h a 30 ºC sob agitação de 250

rpm. Em seguida as células foram precipitadas por centrifugação (2.000 g por 5

minutos a 8 ºC) e ressuspensas em uma solução de MgSO4 10 mM até obter uma

A600 de 1.0 (8 x 108 células/mL).

Em seguida, foram combinados 107 pfu da biblioteca em fago λ Zap II (1µL)

com 108 de XL1-Blue MRF´ e 109 pfu de fago �helper EX Assist�. Nesse passo

proteínas codificadas pelo fago �helper� reconhecem especificamente regiões do

DNA do fago λ Zap II e promovem a excisão e circularização de uma fita simples de

DNA que contêm as seqüências do plasmídeo Bluescript e o inserto de cDNA

contido no clone de interesse. Essa mistura foi então incubada a 37 ºC por 15

minutos e logo em seguida foi acrescentado LB líquido para incubação por 3 horas a

37 ºC com agitação para que o plasmídeo fosse então encapsulado pelas proteínas

do fago �helper� e eliminado pelas células XL1-Blue MRF´. Para purificar os fagos, a

cultura foi incubada a 70ºC por 20 minutos, período suficiente para matar células

XL1-Blue MRF´ presentes no meio. Finalmente, esse material foi centrifugado (2.000

g por 10 minutos a 8 ºC) e o sobrenadante, contendo os fagos carregando o

plasmídeo pBluescript e fagos λ Zap II, recuperados.

Para finalizar, as células SOLR foram transformadas com o plasmídeo

pBluescript. Para isso 200 µL de células SOLR foram incubadas com 1 µL da

preparação de fagos obtida no passo anterior. Após 15 minutos de incubação a 37

ºC essas células foram plaqueadas em meio LB agar contendo carbenicilina (50

µg/mL), X-gal (50 mg/mL) e IPTG 100 mM. As placas foram incubadas por 16 h a

37ºC.

Durante esse procedimento, os fagos �helper EX Assist� infectam as célula

SOLR, mas não são capazes de crescer. Essas células são selecionadas

negativamente em meios contendo carbenicilina e X-gal. Os fagos λ Zap II não são

capazes de infectar as células SOLR. Células infectadas pelos fagos �helper

54

ExAssist� contendo como material genético o plasmídeo pBluescript são

selecionadas positivamente em meios contendo carbenicilina e X-gal.

3.20.2 - CRESCIMENTO DE CÉLULAS TRANSFORMADAS EM LB LÍQUIDO E PCR DE

COLÔNIA

As colônias isoladas obtidas no meio LB agar contendo carbenicilina, X-gal e

IPTG foram crescidas em placas de 96 poços durante 16 h a 37 ºC sem agitação em

meio LB líquido também contendo carbenicilina (50 µg/mL).

Posteriormente com auxilio de um carimbo de replicação parte das bactérias

que cresceram no meio líquido foram transferidas para uma placa de PCR para

realização do PCR de colônia e ao restante foi acrescido glicerol 30% e então

armazenadas a -80 ºC. A reação de PCR de colônia foi realizada em tampão 10 mM

Tris-HCl pH 8,4, contendo KCl 50 mM; gelatina 0,01% (p/v); Triton X-1000,1% (p/v);

MgCl2 1,5 mM; dNTP 0,2 mM; 0,5 mM de cada iniciador utilizado; 5 U de taq DNA

Polimerase. Esta reação foi incubada a 94 ºC por 5 minutos, seguida de 30 ciclos

como descrito a seguir: 30 segundos a 94 ºC, para a desnaturação da dupla fita do

DNA; 30 segundos a 55 ºC para o pareamento dos iniciadores e finalmente 3

minutos a 68 ºC, para o alongamento da fita complementar de DNA.

Para analisar os fragmentos de DNA derivados da amplificação com PCR

foram feitas eletroforeses em gel de agarose escolhendo aleatoriamente algumas

amostras. Os géis foram preparados na concentração final de 1% (p/v) de agarose

em tampão TAE (Tris-acetato 8 mM; EDTA 0,4 mM, pH 8,0) e as amostras de DNA

foram resolvidas com uma diferença de potencial de 80-100V. O tampão de amostra

(2:5 volumes de amostra) contendo azul de bromofenol, utilizado na eletroforese, foi

usado para monitorar a migração da amostra e determinar o encerramento da

eletroforese. Após a eletroforese, o DNA foi evidenciado utilizando-se brometo de etídeo

(0,5 µg/mL) e visualizado em transiluminador de luz UV (312 nm).

3.20.3 - SEQÜÊNCIAMENTO DOS CDNAS

Os produtos do PCR de colônia após terem sido verificados aleatoriamente

através de gel de agarose foram utilizados na reação de seqüênciamento. Com

auxílio do carimbo de replicação, o produto do PCR de colônia foi carimbado em

uma placa de PCR contendo a mistura para reação de seqüênciamento, usando o

55

iniciador T7. A reação de seqüênciamento foi realizada usando o produto do PCR de

colônia; 3 µL de iniciador na concentração de 3,3 pmol/µL; 2 µL de �Terminator

Ready Reaction Mix� (Perkin Elmer); 3 µL de tampão Tris-HCl 200mM, pH 9

contendo MgCl2 5 mM, para um volume final de 15 µL. A reação foi realizada na

maquina da Perkin-Elmer com 35 ciclos que consistiam de: 96 ºC por 45 segundos;

50 ºC por 30 segundos; 60 ºC por 4 minutos. As amostras foram seqüenciadas pelo

serviço de seqüênciamento de cDNA, do Departamento de Bioquímica, Instituto de

Química, utilizando um seqüenciador automático ABI373A (Perkin-Elmer, Norwalk,

CT, USA).

3.20.4 - ANÁLISE E MONTAGEM DOS ESTS

As seqüências foram processadas em um computador Pentium D 3.00 GHz

rodando sobre o sistema operacional Linux (Debian Testing com kernel 2.6) com os

programas Phred, Phrap e Consed Linux 2.6 (Ewing e Green 1998a e 1998b;

Gordon et al., 1998) compilados, cujas licenças de uso para fins acadêmicos são

gratuitas e obtidas diretamente com os autores. Eletroferogramas gerados no

seqüenciador foram convertidos em seqüências, as quais foram aparadas,

extirpando-se extremidades de baixa qualidade, e as regiões seqüenciadas de vetor

foram mascaradas. Em seguida ao processamento, as seqüências foram alinhadas,

separando as que se sobrepõe em contíguos e as isoladas (singletos).

As seqüências obtidas foram compradas com a base de dados não

redundante (nr) do GenBank e Swissprot através da ferramenta de biologia

molecular Blast Client 3, software distribuídos pelo NCBI (National Center for

Biotechnology Information, http://www/ncbi.nlm.nih.gov), usando o algorítimo Blastx,

com matriz BLOSUM 62 e parâmetros padrão (Altschul et al., 1990; Wheeler et al.,

2000). Este algorítimo compara a seqüência de nucleotídeos traduzida em todos os

quadros de leitura com as proteínas presentes em um banco de dados. Após

comparação com a base de dados é gerado um arquivo de saída com a análise de

cada seqüência comparada. A similaridade com a seqüência do banco de dados é

avaliada por dois parâmetros: a nota, SCORE, que pontua o número de

coincidências entre as bases da seqüência estudada com as bases da seqüência

presente no banco de dados; e o E-VALUE, que avalia a probabilidade do

alinhamento ter ocorrido ao acaso.

56

Além disso, uma segunda anotação dos genes foi feita de acordo com a

classificação do GO (Gene Ontology, http://www.geneontology.org), que descreve,

quando possível três categorias para o mesmo produto gênico: função molecular,

processo biológico e componente celular.

3.21 - OBTENÇÃO DE PLASMÍDEOS CONTENDO INSERTOS DE PROTEÍNAS INTERESSANTES

Após análise de 1053 seqüências, incluindo montagem de contíguos, algumas

foram selecionadas, para dar início ao estudo da transcrição específica (ou

preferencial) nos diferentes tecidos averiguada por RT-PCR semiquantitativo.

As colônias transformadas de interesse foram selecionadas para serem

crescidas em 3 ml de meio LB-líquido a 37 ºC sob agitação de 250 rpm, durante 16

horas. A partir destas culturas de bactérias foram extraídos os plasmídeos usando o

protocolo �Wizard Miniprep� (Promega). As bactérias foram sedimentadas por

centrifugação a 3000 rpm por 10 min a temperatura ambiente e ressuspendidas em

200 µl de tampão de ressuspenção (Tris-HCl 50 mM, pH 7,5 contendo EDTA 10 mM

e RNAse 100 µg/ml). Após incubação por 5 min a temperatura ambiente foi realizada

a lise alcalina das bactérias, adicionando 200 µl de solução de lise (NaOH 0,2 M;

SDS 1% (p/v)), agitando suavemente e incubando novamente por 5 min a

temperatura ambiente, seguido de adição de 200 µl de tampão de neutralização

(acetato de potássio 1,32 M, pH 4,8). Este material foi centrifugado a 10.000 rpm por

10 min a temperatura ambiente e o sobrenadante foi aplicado em mini-coluna

contendo uma resina de troca iônica. A coluna foi lavada com tampão acetato 80

mM, EDTA 40 µM e etanol 55% (p/v) para a retirada do material contaminante. A

eluição dos plasmídeos pela coluna foi realizada com água Milli Q pH 7,0.

Os plasmídeos que continham os fragmentos de interesse foram

seqüenciados baseados no método de interrupção da reação de polimerização do

DNA com a utilização de didesoxirribonucleotídeos (Sanger et al.,1977), usando os

iniciadores T7 e T3, que pareiam na região do vetor.

3.22 - EXTRAÇÃO DE RNA TOTAL DE DIFERENTES TECIDOS DE D. PERUVIANUS

Apenas fêmeas de D. peruvianus bem alimentadas foram utilizadas para

extração de RNA total.

57

A dissecção dos insetos foi feita utilizando tampão NaCl 215 mM preparado

com água DEPC 0,01% (dietilpirocarbonato), sendo que logo após serem retirados

os intestinos foram congelados em gelo seco para evitar a ação de RNases.

O RNA total de aproximadamente 15 de fêmeas de D. peruvianus das

regiões: intestino médio, corpo gorduroso, glândula salivar, túbulo de Malpighi, V1,

V2 e V3 do intestino médio foram extraídos com o reagente Trizol (GIBCO-BRL)

(metodologia usada 3.18).

3.23 - ELETROFORESE DE RNA EM GEL DE AGAROSE CONTENDO FORMALDEÍDO

Cerca de 400 ng de RNA total em água DEPC foram misturados com 3

volumes de tampão de amostra [formamida 65% (v/v), MOPS 10X 12% (v/v),

formaldeído 8%(v/v), azul de bromofenol 3% (p/v) e brometo de etídeo 0,5 mg/mL

preparados em água DEPC] imediatamente antes da aplicação em gel de agarose

contendo formaldeído [agarose 1,25% (p/v), MOPS 1x contendo 16% (v/v) de

formaldeído adicionado após fusão da agarose]. A solução de MOPS 10 X

corresponde a: MOPS Free Acid 4,1% (p/v), acetato de sódio 0,4% (p/v) e EDTA

0,028% (p/v) e a água DEPC corresponde a água previamente tratada com

dietilpirocarbonato como descrito em Ausbel et al., 1990. A eletroforese foi realizada

a 40-60 V em aparato livre de contaminação com RNases.

3.24 - RT-PCR SEMIQUANTITATIVO

RNA total foi extraído de intestino médio, corpo gorduroso, glândula salivar,

túbulo de Malpighi, V1, V2 e V3 do intestino médio através do mesmo procedimento

descrito em 3.26. As reações de RT-PCR (PCR precedida de transcrição reversa)

foram realizadas com reagentes do kit SuperScriptTM First-Strand Synthesis System

for RT-PCR (Invitrogen Life Technologies) de acordo com os protocolos sugeridos

pelo fabricante. A etapa de transcrição reversa foi realizada a partir de amostras de

RNA total previamente tratadas com DNase I (Invitrogen Life Technologies) (para

eliminar eventual contaminação de DNA genômico da preparação) utilizando-se o

iniciador oligo (dT)12-18 na síntese da primeira fita. Em seguida, a etapa de

amplificação do cDNA foi realizada utilizando oligonucleotídeos (Tabela 1) que foram

desenhados de acordo com cada seqüência de interesse selecionadas no

seqüênciamento ao acaso da biblioteca de cDNAs do intestino médio do Dysdercus

peruvianus.

58

A reação de PCR foi realizada utilizando a enzima Taq DNA polimerase

(Invitrogen Life Technologies) em reações de 50 µL contendo oligonucleotídeos 10

mM, dNTP mix 10 mM, tampão da Taq DNA Polimerase, MgCl2 1,5 mM e DNA

molde. As reações foram realizadas em termociclador (Perkin Elmer) com

desnaturação inicial por 2 minutos a 94 ºC, seguida de 35, 30, 25 ou 20 ciclos como

descrito a seguir: 45 segundos a 94 ºC, para a desnaturação da dupla fita do DNA;

30 segundos a 53 ºC para o pareamento dos iniciadores e finalmente 2 minutos a 72

ºC, para o alongamento da fita complementar de DNA. Para o cálculo da

temperatura de pareamento dos iniciadores foi utilizada a seguinte equação: Tm(ºC)

= 2.(A+T)+4.(G+C).

Os produtos do RT-PCR semiquantitativo foram analisados através de

eletroforese em gel de agarose. TABELA 1 - Seqüência dos oligonucleotídeos utilizados para realização do RT-PCR

semiquantitativo

Oligonucleotídeo Seqüência de DNA

Aminopeptidase

Forward primer

Reverse primer

5´-CTGAGGGGCAGTTTCAAGAG-3´

5´-GCTTCCTTTAGGCAGCCTTT- 3´

Beta-glicosidase

Forward primer

Reverse primer

5´-GGAGGGACAATTTGGCTTTT-3´

5´-TTGCAAGAGCAAAAGAAGCA-3´

Alfa-glicosidase 1

Forward primer

Reverse primer

5´-GCCAGATATGGTCGGAGGTA-3´

5´-GGTGCGTCGTGTCCTTAAAT-3´

Alfa-glicosidase 2

Forward primer

Reverse primer

5´-ACCGTTGATAACGGCAGAAC-3´

5´-TCGGTGACTGCTTGTGCTAC-3´

DpCaL 1

Forward primer

Reverse primer

5´-GGCAGAGGACGAGACAGAAC-3´

5´-ACACTGAGCCGAGCTGTTTT-3´

DpCaL 2

Forward primer

Reverse primer

5´-GGCAGAGGACGAGACAGAAC-3´

5´-CTGATTCCAGTGGCAAACCT-3´

59

Oligonucleotídeo Seqüência de DNA

DpCaL 3

Forward primer

Reverse primer

5´-GGCAGAGGACGAGACAGAAC-3´

5´-CGGGTGCTTTGTATTCAGGT-3´

DpCaL 4

Forward primer

Reverse primer

5´-TCGTACGAGCAGTCCATCAG-3´

5´-ACAAAGGGACGCATTGAAAC-3´

Transportador de açúcar

Forward primer

Reverse primer

5´-CGACCATTGTTTCAGTGTGG-3´

5´-TAGGAGCCATGGAATCGAAC-3´

rRNA1

Forward primer

Reverse primer

5´-TGGTGCATGGAATAATGGAA-3´

5´-GCTTTCGCTCTAGTGCGTCT- 3´

rRNA2

Forward primer

Reverse primer

5´-CGGTGAAATTCTTGGATCGT-3´

5´-ACCCAAAAGCTTTGGTTTCC-3´

3.25 - MEDIDA IN VIVO DA ABSORÇÃO DE ÁGUA E GLICOSE NO VENTRÍCULO 1 DO INTESTINO

MÉDIO DE D. PERUVIANUS

Grupos de 7 a 10 fêmeas após passarem 10 dias em jejum foram submetidas

à privação de água por aproximadamente 12 horas. Em seguida estas fêmeas foram

imobilizadas, com ajuda de fita Fisher®, em um aparato montado numa caixa de

isopor. Seus estiletes foram inseridos em capilares, que estavam dentro de

Eppendorfs, preenchidos com solução do corante azul de Evans 0,02% (p/v),

contendo glicose 200 mM e glicerol 20 mM (Figura 2). Os animais permaneceram

ingerindo essa solução durante 20 minutos, e após diferentes intervalos de tempo

(10, 20, 30 e 40 minutos) e a temperatura ambiente (26 oC), grupos foram

dissecados e volumes conhecidos dos conteúdos luminais de V1 foram coletados e

levados para 1,0 mL com água bidestilada. A concentração de azul de Evans foi

calculada a partir de leituras de absorbância a 610 e 800 nm. Como o corante não

absorve a 800 nm, enquanto a 610 nm sua absorbância é máxima, as leituras a 800

nm devem ser proporcionais à turbidez das amostras, sendo usadas para corrigir as

leituras de absorbâncias a 610 nm das amostras coletadas, levando em conta a

razão entre as leituras a 610 e 800 nm (A610 /A800) dos controles. Esses foram feitos

com animais, para os quais as soluções oferecidas não continham o corante.

60

Finalmente, a massa de azul de Evans nos conteúdos de V1 foi calculada a partir

das leituras corrigidas de absorbância a 610 nm.

A absorção de glicose a partir do conteúdo luminal de V1 foi estudada usando

o mesmo tratamento dos animais como descrito acima para a absorção de água. A

quantidade de glicose nos conteúdos foi determinada pelo método de Dahlqvist

(1968). Glicose remanescente no conteúdo de V1 foi expressa através da razão

entre as massas de glicose e azul de Evans a diferentes intervalos de tempo após o

início da alimentação. Posteriormente, o mesmo procedimento foi realizado com a

adição de inibidores de transportadores de glicose: floretina (inibidor de GLUT2) 0,2

mM e Florizina (inibidor de SGLT1) 0,1 mM. Além disso, foi também adicionado 50

mM de sulfato de potássio (K2SO4) e 50 mM de sulfato de sódio (Na2SO4) 50 mM

para analisar um possível cotransporte com estes íons.

FIGURA 2 - Dysdercus peruvianus sugando solução oferecida após passar por jejum e

abstinência de água.

Eppendorfs contendo solução de corante azul de Evans 0,02% (p/v), glicose 200 mM

e glicerol 20 mM.

61

0

5000

10000

15000

20000

25000

30000

V1E V2E V3E V1L V2L V3L

U/mg

U

4 - RESULTADOS E DISCUSSÃO

ESTUDO DAS CISTEÍNA PROTEINASES DIGESTIVAS DO INSETO DYSDERCUS PERUVIANUS

4.1 - DISTRIBUIÇÃO E QUANTIFICAÇÃO DA ATIVIDADE ESPECÍFICA E ATIVIDADE TOTAL DA

CISTEÍNA-PROTEINASE EM DIFERENTES COMPARTIMENTOS INTESTINAIS

A atividade de cisteína-proteinase pôde ser medida e observada através de

ensaios enzimáticos em tubos (Figura 3) além de ensaios em gel de poliacrilamida

(Figura 4) nos três ventrículos. A fim de ter uma exata medida de atividade

específica desta proteinase, foram feitas medidas de atividade com o substrato Z-

FR-MCA e quantificação de proteínas separadamente nos três ventrículos tendo o

cuidado de separar o epitélio intestinal do conteúdo luminal do intestino médio de D.

peruvianus (Figura 3).

No epitélio há pouca atividade de cisteína-proteinase quando comparamos

com a atividade no conteúdo luminal nos três ventrículos (Figura 3). Se

compararmos os três ventrículos entre si, verificamos que V2 luminal é a região do

intestino médio com maior atividade específica (14.500 U/mg de proteína) de

cisteína-proteinase, seguido por V3 (9.000 U/mg de proteína) e V1 (515 U/mg de

proteína) (Figura 3).

FIGURA 3 - Atividade específica e total de cisteína-proteinase nas diferentes regiões do intestino médio de D. peruvianus.

Fêmeas adultas do inseto praga D. peruvianus foram dissecadas separando-se o

epitélio intestinal do conteúdo luminal dos três ventrículos do intestino médio. O ensaio de

62

atividade de cisteína proteinase foi realizado com o substrato fluorogênico Z-FR-MCA e a

quantificação de proteína foi feita com BCA . V1E, V2E e V3E correspondem ao epitélio

intestinal dos ventrículos 1, 2 e 3; V1L, V2L e V3L correspondem ao conteúdo luminal

intestinal dos ventrículos 1, 2 e 3. Barras brancas correspondem a atividade específica,

barras cinzas correspondem a atividade total. Os dados são médias e desvio padrão da

média de 3 preparações obtidas a partir de 20 animais cada.

4.2 - VERIFICAÇÃO DE ATIVIDADE DE CISTEÍNA-PROTEINASE EM GEL DE ELETROFORESE

Análise da atividade enzimática através de eletroforese em gel para

observação de atividade de proteinases é útil, pois permite uma rápida separação e

detecção de atividades enzimáticas em extrato biológico bruto, sendo uma

ferramenta valiosa no estudo de vários sistemas enzimáticos (Gabriel e Gersten,

1992). Uma das vantagens deste método inclui a possibilidade de se detectar

atividade proteolítica em homogeneizado do intestino do inseto sem que haja

necessidade de purificação preliminar.

Os intestinos médios das fêmeas adultas e alimentadas de D. peruvianus

foram separados em ventrículo 1 (porção dilatada), ventrículo 2 (porção alongada) e

ventrículo 3 (porção oval). Após estas regiões serem homogeneizadas e

centrifugadas, e passarem por processos descritos em materiais e métodos (item

3.2), os homogeneizados resultantes foram submetidos a uma eletroforese nativa e

posterior ensaio em gel para verificação de bandas fluorescentes. Foi observado um

padrão diferente de bandas nas três regiões (Figura 4). No ventrículo 1, há uma

banda de menor mobilidade eletroforética que está presente também no ventrículo 2,

mas não está presente no ventrículo 3 (banda 1, Figura 4). Em V2, além da banda

de menor mobilidade eletroforética observa-se também uma banda mais intensa de

maior mobilidade, sendo que esta última está presente em V3 também (banda 2,

Figura 4). Finalmente em V3, há a mesma banda majoritária que aparece em V2 e

uma segunda banda de menor migração menos intensa, mas que está somente

presente neste ventrículo (banda 3, Figura 4).

63

FIGURA 4 - Ensaio em gel de poliacrilamida revelando os padrões de cisteína-proteinase nos diferentes ventrículos em fêmeas adultas de Dysdercus peruvianus alimentadas com sementes de algodão.

Amostras contendo o equivalente a 9 intestinos/mL foram homogeneizadas,

centrifugadas e submetidas a eletroforese em gel de poliacrilamida 12% nativo-. Em cada

raia foi aplicado 30µL de amostra com a quantidade adequada de tampão de amostra. Após

a migração, a atividade de cisteína-proteinase foi ensaiada com Z-FR-MCA e visualizada

sob luz UV, como está detalhada em materiais e métodos. Embora Z-FR-MCA seja também

substrato para tripsina, esta enzima não ocorre nos ventrículos de D. peruvianus (Figura 5 e

texto).

V1 V2 V3

1 3

2

64

4.3 - CONFIRMAÇÃO DA PRESENÇA DE CISTEÍNA-PROTEINASE COMO A PROTEINASE

MAJORITÁRIA INTESTINAL DE D. PERUVIANUS

A classe mecanística da qual a proteinase pertence é determinada a partir de

características in vitro que incluem a sensibilidade por vários inibidores específicos.

Um dos inibidores mais comuns que vem sendo utilizado para diagnóstico e

caracterização de cisteína-proteinase é o E-64 (Beynon e Salvesen, 1989; Barrett,

1994). Originalmente isolado de culturas de Aspergillus japonicus (Hanada et al.,

1978), E-64 é um inibidor não competitivo, irreversível de proteinases que possuem

um grupo tiol das famílias papaína e calpaína (Hanada et al., 1978; Barrett et al.,

1982; Parkes et al., 1985). Como havia sido assumida a especificidade de E-64 por

cisteína-proteinase, este inibidor foi largamente utilizado na caracterização de

proteinases digestivas de diversas fontes biológicas, incluindo insetos. Em

Coleoptera e Hymenoptera, onde a cisteína-proteinase tem participação digestiva

majoritária, E-64 inibiu a atividade proteolítica tanto in vitro (Murdock et al., 1987;

Wolfson e Murdock, 1990) quanto in vivo (Hines et al., 1990). Além disso, foi visto

que E-64 é ineficaz em inibir atividade proteolítica em insetos que possuem serina

proteinases, tais como Lepidoptera, Hymenoptera, Orthoptera e Diptera (Wolfson e

Murdock, 1990; Purcell et al. 1992; Christeller et al., 1992).

Depois de observado que E-64 não inibe algumas proteinases tais como

serina, metalo e aspártico-proteinases (Hanada et al., 1978; Barrett et al., 1982)

fazendo deste inibidor específico para cisteína-proteinases, Sreedharan e

colabordores (1996) observou que tripsina bovina quando ensaiada com BapNa é

inibida por E-64 através de um mecanismo reversível.

Além disso, em estudos realizados com diversas espécies de Lepidoptera

(Ortego et al.,1996), foi observado a inibição de tripsina, uma serino proteinase,

quando esta é ensaiada com os substratos BapNa e BAEE e dependendo da

espécie estudada, pode-se também observar inibição por E-64 quando a tripsina é

ensaiada com substrato protéico, assim como Lee e Anstee (1995) observaram ao

ensaiar tripsina de Spodoptera littoralis com BapNa. Vale ressaltar que a

concentração de E-64 utilizada para inibir cisteínas proteinases é dez vezes menor

do que a utilizada para inibir serino proteases.

Desta forma, a opção de ensaiar outros inibidores específicos para serino-

proteinase (PMSF) e aspártico-proteinase (pepstatina A) se fez necessário, a fim de

confirmar o resultado obtido da inibição com E-64 verificada nos ensaios com

65

0

10

2030

40

50

60

7080

90

100

V1 V2 V3 V1 V2 V3 V1 V2 V3 V1 V2 V3

% d

as a

tivid

ades

em

rela

ção

ao c

ontr

ole

E-64 PMSF Metanol Pepstatina A

homogeneizados dos ventrículos (V1, V2 e V3) no intestino médio de D. peruvianus.

Podemos observar que na figura 5 os três ventrículos foram inibidos por E-64 e

permaneceram com atividade nos inibidores para proteinases serínicas e aspárticas.

Como há uma pequena inibição observada quando os ventrículos são ensaiados

com PMSF, que foi solubilizado em metanol, foi necessário fazer um controle

contendo somente o metanol, podendo-se observar que a inibição visualizada era na

verdade decorrente da presença de metanol.

A ausência de inibição da atividade proteolítica, ao se usar inibidores de

aspártico (pepstatina A) e serina-proteinases (PMSF) (Figura 5), é um forte indício

de que a cisteína-proteinase seja a principal protease digestiva de D. peruvianus,

estando também de acordo com dados da literatura (Silva e Terra, 1994).

FIGURA 5 - Porcentagem das atividades de V1, V2 e V3 na presença de diferentes inibidores em relação ao controle.

Inibidores de proteinases usados: E-64 10 µM, PMSF 1 mM, metanol 1% (p/v) e

pepstatina 1 µM. Os dados são médias e desvio padrão da média de 3 preparações obtidas

a partir de 20 animais cada.

66

4.4 - A ESTABILIZAÇÃO DA ATIVIDADE DA CISTEÍNA-PROTEINASE IN VITRO

Como o ventrículo 2 apresentou maior atividade específica de cisteína

proteinase (Figura 3), esta região foi escolhida para a tentativa de purificação da

proteinase.

Cisteína proteinases são difíceis de isolar, purificar e caracterizar

cineticamente devido a freqüente autólise observada nos passos iniciais e finais de

purificação. Com o intuito de impedir a autólise nós utilizamos primeiramente cloreto

de mercúrio, um composto largamente utilizado para impedir autólise de cisteína

proteinase. Observamos, no entanto, que parte da cisteína do intestino médio do

inseto estava sendo precipitada e, portanto perdida durante a homogeneização.

Dessa forma o cloreto de mercúrio foi substituído por metil metanossulfonato

(MMTS), que passou a ser utilizado tanto na homogeneização dos ventrículos

quanto nos tampões de cromatografia. O MMTS reage com grupos SH modificando-

os para -S-S-CH3, o que inativa a proteinase. Subsequentemente, tratando a

proteinase com cisteína são restabelecidas sulfidrila original e a atividade. Foi

observado que os ventrículos que foram homogeneizados com MMTS, após terem

sido congelados por 24h e descongelados para posterior medida de atividade,

tiveram sua atividade de cisteína proteinase mantida, ao contrário dos ventrículos

que foram homogeneizados apenas com água bidestilada (Figura 6). A atividade de

cisteína proteinase do ventrículo 1 não foi alterada na ausência ou na presença de

MMTS, ao contrário de V2 e V3 que, respectivamente, conservam 100% e 68% da

atividade relativa quando homogeneizados com MMTS. Na ausência de MMTS V2

apresentou apenas 20% de sua atividade remanescente e V3 19% (Figura 6)

67

0

20

40

60

80

100

V1 V2 V3

Ativ

idad

e re

lativ

a (%

)

sem MMTScom MMTS

FIGURA 6 - Porcentagem da atividade total remanescente nas três regiões do intestino

médio do D. peruvianus após congelamento e descongelamento da amostra tratada ou não com MMTS.

Barras escuras correspondem à porcentagem da atividade total remanescente dos

homogeneizados sem MMTS; barras hachuradas correspondem a porcentagem da atividade

total remanescente dos homogeneizados com MMTS.

4.5 - PURIFICAÇÃO DE DUAS CISTEÍNAS-PROTEINASES DO VENTRÍCULO 2 DO INTESTINO

MÉDIO DE D. PERUVIANUS

Para impedir grandes perdas de atividade da cisteína proteinase ao longo da

marcha de purificação, a homogeneização do ventrículo 2 do D. peruvianus foi feita

em solução contendo MMTS. Após centrifugação, o sobrenadante foi aplicado

manualmente dentro de uma câmara fria em uma coluna HiTrap Q de 1 mL, para

retirada de pigmentos. Como o próximo passo envolve uma coluna de filtração em

gel (Superdex 75) e esta possui um limite de volume permitido a ser aplicado (250

µL), optou-se em concentrar a amostra eluída da troca aniônica. A recuperação da

atividade enzimática após a concentração é quase total. Após a concentração, a

amostra foi cromatografada em uma coluna Superdex 75, onde foram separados

dois picos de atividade de cisteína proteinase (Figura 7A). A enzima eluída nas

68

frações 38 e 39 correspondentes ao pico 1, foi denominada cisteína proteinase 1, e

a enzima eluída na fração 44 referente ao pico 2, foi então denominada cisteína

proteinase 2. O enriquecimento observado para a cisteína proteinase 1 durante esse

passo foi de 4,8 vezes e a recuperação da atividade enzimática foi de 1,14% com

relação ao material inicial, já o enriquecimento observado para a cisteína proteinase

2 foi de 11,4 vezes e a recuperação da atividade enzimática foi de 0,8% com relação

ao material inicial (Tabela 2). Os dois picos separadamente foram cromatografados

em uma coluna de afinidade montada a partir da resina Arginina-Sepharose. A

amostra correspondente ao pico 1 da filtração em gel depois de ser aplicada na

coluna de afinidade foi eluída desta em um único pico com 1,0 M de arginina (Figura

7B). A recuperação da atividade enzimática aplicada foi de 52% e obtido um

enriquecimento de mais de 400 vezes em relação ao material anterior. A amostra

correspondente ao pico 2 da filtração em gel depois de ser também aplicada na

coluna de afinidade foi eluída desta em um único pico com aproximadamente 0,6 M

de arginina (Figura 7C). A recuperação da atividade enzimática aplicada foi de 175%

e obtido um enriquecimento de mais de 200 vezes em relação ao material anterior. A

recuperação é surpreendente, mas foi obtida mais de uma vez. Talvez algum inibidor

contaminante seja excluído da preparação neste passo cromatográfico ou o

resultado reflita um artefato não identificado.

As frações obtidas nos passos cromatográficos de purificação foram

submetidas à eletroforese em SDS-PAGE (Figura 8). Ao longo dos passos

cromatográficos pode-se observar diminuição de bandas de proteínas quando

comparados ao homogeneizado (raia 1 da figura 8). Após a filtração em gel pode-se

observar um enriquecimento de bandas na faixa de 31 kDa e na de 21 kDa na raia 4,

correspondente ao pico 1. Finalmente, a preparação apresentou apenas um proteína

após a cromatografia de afinidade com aproximadamente 32 kDa. Na raia 5,

correspondente ao pico 2 da filtração em gel, observamos um enriquecimento de

bandas na faixa de 66 kDa e na de 45 kDa. Sendo que ao final da cromatografia de

afinidade apenas uma banda de proteína de aproximadamente 45 kDa foi detectada.

69

FIGURA 7 - Purificação das cisteína proteinases de Dysdercus peruvianus.

Filtração em gel em uma coluna Superdex 75 de homogeneizado de V2 tratado com

MMTS após passar por uma coluna HiTrap Q seguida de concentração (A). As frações 38 e

39 correspondentes ao Pico 1 foram reunidas e cromatografadas em uma coluna Arginina-

Sepharose (B). A fração 44 correspondente ao Pico 2 foi cromatografada em uma coluna

Arginina-Sepharose (C). A atividade enzimática foi determinada para o substrato Z-FR-MCA

1 mM. Os losangos escuros (♦) correspondem às frações que foram reunidas durante a

marcha de purificação.

A

B

C

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000

4500

0 20 40 60 80 100Frações

Fluo

resc

ênci

a (e

xcita

ção

380

nm e

em

issã

o46

0 nm

)

0

100

200

300

400

500

600

700

800

900

0 10 20 30 40

Frações

Fluo

resc

ênci

a (e

xcita

ção

380

nm e

em

issã

o 46

0 nm

)

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

Arg

inin

a

0

50

100

150

200

250

300

350

400

450

500

0 10 20 30 40

Frações

Fluo

resc

ênci

a (e

xcita

ção

380

nm e

em

issã

o 46

0 nm

)

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

Arg

inin

a

Pico 2

Pico 1

70

TAB

ELA

2 -

Purif

icaç

ão d

e du

as c

iste

ína

prot

eina

ses

de D

. per

uvia

nus

Fraç

ão

A

tivid

adeT

otal

(mU

)

Pr

oteí

na T

otal

(mg)

A

tivid

ade

Espe

cífic

a

(mU

/mg)

Rec

uper

ação

(%)

Fa

tor d

e

Purif

icaç

ão

Fraç

ão s

olúv

el d

o co

nteú

do

lum

inal

1.

508.

040

8.52

0 17

7 10

0 1

HiT

rap

Q

808.

080

1.82

0 44

4 53

2,

5

Supe

rdex

75

Pi

co 1

Pi

co 2

17

.220

12

.138

20

6

861

2.02

3 1,

14

0,8

4,8

11,4

Arg

inin

a Se

phar

ose,

pic

o 1

9.04

8 0,

0223

405.

000

0,

6

2.28

8

Arg

inin

a Se

phar

ose,

pic

o 2

2.11

12

0,05

421.

534

1,

4

2.38

2

71

PM 1 2 3 4 5 6

97,4

66,2

4531

21,5

14,4

kDa

FIGURA 8 - SDS-PAGE (12%) das frações reunidas durante a marcha de purificação das cisteína proteinases do D. peruvianus.

Todas as amostras foram dialisadas e submetidas à fervura antes de serem

aplicadas no gel. O gel foi corado por prata segundo Blum et al. (1987), para evidenciar

proteínas. PM, padrões de peso molecular; raia 1, homogeneizado de V2; raia 2, fração

concentrada após ter sido eluída da HiTrap Q; raia 3, frações correspondentes ao pico 1

eluídas da Superdex; raia 4, fração correspondente ao pico 2 eluída da Superdex 2; raia 5,

fração eluída da cromatografia de afinidade da cisteína 1; raia 6, fração eluída da

cromatografia de afinidade da cisteína 2.

4.6 - PROPRIEDADES DAS CISTEÍNA PROTEINASES DE V2 DE D. PERUVIANUS

As cisteína proteinases digestivas encontradas no lúmen de V2, no intestino

médio do D. peruvianus purificadas, foram denominadas cis 1 (32 kDa) e cis 2 (45

kDa).

Estas enzimas purificadas foram caracterizadas quanto às suas propriedades

físicas e cinéticas. A Figura 9 apresenta a determinação do pH ótimo, e a Figura 10

sua inativação térmica. Como podemos observar, as duas cisteína proteinases

possuem o mesmo pH ótimo igual a 6,3, conciliando com os valores de pH ótimos

reportados para as cisteína proteinases de insetos, os quais variam entre 5,0 e 6,0

(Terra e Ferreira, 2005). Além disso, estas enzimas são inativadas a 40 ºC segundo

uma cinética de primeira ordem aparente por pelo menos 3 meias-vidas, sugerindo a

existência de apenas uma espécie molecular de cada enzima na preparação com

meia vida de 5 minutos para cis 1 e 4,8 minutos para cis 2 (Figura 10). Estas

medidas são compatíveis com cisteína proteinases descritas em outros insetos

(Terra e Ferreira, 1994; Cristofoletti et al., 2005).

72

FIGURA 9 - Efeito do pH sobre as cisteína proteinases purificadas de Dysdercus

peruvianus. A, cisteína proteinase 1 ensaiada com Z-FR-MCA. B, cisteína proteinase 2 ensaiada

com Z-FR-MCA. Utilizou-se o tampão citrato-fosfato 100 mM, para o pH entre 3,6 e 4,6 ( ס) e

o tampão MES 0,1 M para o pH entre 5 e 8 (●), todos contendo cisteína 3 mM e EDTA 3

mM. Os resultados estão expressos em função da maior atividade.

0

20

40

60

80

100

120

0 2 4 6 8 10

pH

Ativ

idad

e R

elat

iva

(%)

0

20

40

60

80

100

120

0 2 4 6 8 10

pH

Ativ

idad

e R

elat

iva

(%)

B

A

73

FIGURA 10 - Inativação térmica. Inativação térmica a 40 ºC da cisteína proteinase 1 (A) e da cisteína proteinase 2 (B),

com T1/2 estimado em 5 min para cis 1 e 4,8 min para cis 2. O logaritmo da atividade

remanescente relativa foi plotado contra o tempo de inativação térmica.

4.7 - PARÂMETROS CINÉTICOS PARA AS CISTEÍNA PROTEINASES DE D. PERUVIANUS

Alguns parâmetros cinéticos para estas enzimas purificadas foram também

determinados. A titulação por E-64 (Figura 11) foi o método utilizado para determinar

a quantidade de proteína nas amostras contendo as enzimas purificadas, já que ao

final da purificação o material se encontra com uma quantidade de proteína

50

40 30 20

B

10

100

0 5 10 15 20

Tempo (min)

Ativ

idad

e re

lativ

a (%

)

A

10

100

0 5 10 15 20

Tempo (min)

Ativ

idad

e re

lativ

a (%

)

50

40

30

20

74

indetectável por métodos colorimétricos usuais (BCA, Bradford), além de determinar

a constante de dissociação entre enzima-inibidor, onde foram observado os valores

de 17,3 nM para cis 1 e 7,1 nM para cis 2. A constante de dissociação (KD) foi

determinada através dos cálculos citados no materiais e métodos (3.14). Os plotes

foram obtidos através do programa GraFit© (versão 3.0) para gráficos de cinética

enzimática em computador. Foram calculadas as atividades específicas das enzimas

na titulação, obtendo um valor de 73.000.000 mU/mg para cis 1 e 17.500.000

mU/mg para cis 2 (ver 3.14). Ao comparar estes valores de atividade específica com

os encontrados na tabela de purificação concluímos que grande parte da enzima no

material purificado se encontra degradada, mostrando a real dificuldade de purificar

cisteínas proteinases. Como a atividade específica calculada na titulação está

relacionada com apenas as proteínas realmente ativas o valor de atividade

específica se torna muito maior quando comparado com a amostra purificada, que

além de conter as enzimas com atividade contem aquelas inativas.

As primeiras cisteína proteinases intestinais de insetos encontradas foram

indicadas como enzimas catepsinas B-�like� (EC 3.4.22.1), já que esta foi a primeira

cisteína proteinase descrita em animais. Mais tarde descobriu-se que a catepsina B

apesar de possuir atividade endopeptídica é mais importante como uma peptil-

dipeptidase (Aronson & Barrett, 1978). Isto se deve ao fato da existência de uma

alça estendida que carrega um par de resíduos de histidina formando uma capa

protegendo a região do sítio ativo, mas permite a ligação do carboxilato C-terminal

do substrato (Barrett et al., 2004). Outra maneira de se distinguir catepsinas B de

outros membros da família das cisteína proteinases, se refere à habilidade que as

catepsinas B têm de clivar substratos contendo resíduo de arginina em P2 (Hasnain

et al., 1993; Jia et al., 1995). A catepsina L (EC 3.4.22.15) é uma verdadeira

endopeptidase que prefere clivar ligações peptídicas contendo resíduos de

aminoácidos hidrofóbicos em P2 (catepsinas B preferem resíduos de arginina nesta

mesma posição) (Barrett et al., 2004). Portanto, é possível distinguir entre as duas

enzimas usando os substratos como Z-FR-MCA e Z-RR-MCA.

A eficiência de catálise das duas cisteína proteinases de D. peruvianus

purificadas foi então determinada para dois substratos sintéticos. A tabela 3 mostra

os valores de Km para os dois substratos, bem como uma comparação entre as

razões de kcat/Km (um parâmetro que indica a adequação de substratos para uma

determinada enzima; Fersht, 1999) para os mesmos substratos. Os valores de Km

75

encontrados estão listados na tabela 3. Podemos observar que o Z-FR-MCA

constitui o melhor substrato para ambas as proteinases quando comparado com a

porcentagem de eficiência do Z-RR-MCA, demonstrando que possivelmente as

cisteína proteinases aqui estudadas são do tipo catepsinas L. Pesquisas recentes

demonstram que todas as cisteínas proteinases digestivas de insetos bem

estudadas são catepsinas L (Terra e Ferreira, 2005; Koiwa et al., 2000; Gruden et

al.,2003; Cristofoletti et al., 2003 e 2005).

FIGURA 11 - Titulação por E-64 das cisteína proteinases.

Cis 1(A) e Cis 2 (B) foram tituladas através do inibidor E-64. O KD e atividade

específica foram determinadas através do programa GraFit© (versão 3.0).

[E-64], µM

100806040200

1

0,8

0,6

0,4

0,2

0

Ativ

idad

eR

esid

ual (A)

[E-64], µM 100806040200

1

0,8

0,6

0,4

0,2

0

(B)

Ativ

idad

eR

esid

ual

76

TABELA 3 - Determinação da eficiência catalítica das cisteína proteinases purificadas de D.

peruvianus, sobre dois substratos diferentes.

Enzima Substrato Km (µM) kcat (s-1) kcat/Km (µM, s-1) Relativo

Cis 1 Z-FR-MCA 9,1 7,3.10-2 8,0.10-3 100

Z-RR-MCA 6,9 6,6.10-3 9,5.10 -4 11,9

Cis 2 Z-FR-MCA 8,6 2,3.10-1 2,6.10-2 100

Z-RR-MCA 5,3 2,0.10-3 3,7.10-4 1,42

Os parâmetros cinéticos foram ajustados utilizando-se o programa Enzfitter (Elsevier,

Biosoft).

4.8 - SEQÜÊNCIAMENTO DE UMA CATEPSINA L DE D. PERUVIANUS

Através do seqüênciamento ao acaso da biblioteca de cDNAs de intestino

médio do D. peruvianus (ítens 4.11-4.15) foram obtidas quatro seqüências de

catepsinas L entre singletos e contígos denominadas DpCaL 1-4 (Tabelas 7 e 8).

Dentre estas seqüências, a denominada DpCaL 1 teve sua transcrição observada

apenas no ventrículo 2 do intestino médio através de RT-PCR semiquantitativo

(Figura 24 E). Este resultado aponta esta seqüência como uma provável catepsina L

digestiva majoritária presente no ventrículo onde a maior parte da proteólise ocorre

(Silva e Terra, 1994) sendo provavelmente esta uma das catepsinas L purificadas.

A partir da seqüência parcial apontada como catepsina L pelo Blastx,

iniciadores foram confeccionados com objetivo de completar a seqüência. Foram

usados diversos iniciadores específicos combinados com iniciadores universais para

amplificação por PCR utilizando como molde a biblioteca de cDNAs de intestino

médio do inseto. Cada produto obtido na reação de amplificação foi separado em gel

de agarose 1%, e então purificado. Os fragmentos de cDNA foram ligados ao vetor

pGEM-T, que foi usado para transformar células XL1-blue competentes. Colônias

transformantes isoladas foram selecionadas, crescidas em meio LB líquido e

submetidas à Mini-prep. Para verificar se esses plasmídeos continham realmente o

fragmento de PCR clonado foi feita uma digestão por enzima de restrição EcoRI

(dados não mostrados). Os plasmídeos que continham o fragmento foram então

seqüenciados. As seqüências obtidas a cada clonagem foram analisadas através

dos programas Phred, Phrap e Consed para a montagem correta da seqüência e

posterior comparação nos bancos de dados depositados internacionalmente.

77

A catepsina L seqüenciada de D. peruvianus (DpCaL1) consiste de 927

nucleotídeos que codifica uma proteína de 309 aminoácidos (Figura 12).

4.9 - CARACTERIZAÇÃO DA PROVÁVEL SEQUÊNCIA DE PROTEÍNA DA DPCAL1

A DpCaL1 apresentada na figura 12 está parcialmente completa, já que não

chega até a metionina inicial, porém a região que codifica a proteína madura está

completa. Esta seqüência contém um pró-peptídeo com 92 resíduos de aminoácidos

sendo a enzima madura formada por 128 resíduos de aminoácidos. Com o intuito de

proteger células contra atividade degradativa indesejada, essencialmente todas as

enzimas proteolíticas celulares e de bactérias são sintetizadas como precursores

inativos (zimógenos) (Carmona et al., 1996; Khan e James, 1998). Proteólise ácida é

necessária para ativação destes zimógenos (Mason et al., 1987; Rawlings e Barret,

1994). Dessa forma, foi encontrado na DpCaL1 um provável sítio de clivagem do

pró-peptídeo entre E92-V93 (Rawlings e Barret, 1994). Como em outras enzimas da

família da papaína, uma prolina (P94), que deve servir para prevenir proteólise

inadequada da porção N-terminal da enzima (Rawlings e Barret, 1994), foi

encontrada na posição 2 na forma madura. Dois motivos característicos de

catepsinas L (ERFNIN e GNFD) estão presentes na pró-região da DpCaL1: E23 R26

F30 N33 I37 N41 e K54 N56 F58 D60 (Kirschke e Wiederanders, 1994) (Figura 12). A

seqüência que codifica a enzima madura apresenta os resíduos conservados entre

catepsinas: cisteína 25, histidina 169 e asparagina 175 (numeração da papaína)

(Rawlings e Barret, 1994; Berti e Storer, 1995) que são identificados como parte do

sítio ativo das cisteína proteinases estando posicionados da seguinte forma na

DpCaL1: C117 H256 N276. G156 C157 N158 G159 G160 é conhecido como um importante

motivo estrutural (Karrer et al., 1993). Sete prováveis sítios de glicosilação foram

encontrados utilizando o programa NetGlycate 1.0

(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetGlycate/) (Johansen et al., 2006).

Análise da DpCaL1 utilizando os programas SignalP (Nielsen et al., 1997) e

TargetP (Emanuelsson et al., 2000) não detectou presença de peptídeo sinal na

região N-terminal da proteína, embora essa região não esteja completa. No entanto,

já foi estudado que catepsina L de humano pode ser direcionada para secreção por

uma seqüência de nove aminoácidos localizados na porção C-terminal da proteína

(Chauhan et al., 1998). Esta característica também foi observada na seqüência da

catepsina L de Rhodnius prolixus (Lopez-Ordoñez et al, 2001) que não apresenta o

78

peptídeo sinal, mas possui esta região característica na porção C-terminal que pode

ser a responsável por exportar a proteína para o meio extracelular. Esta seqüência

de nove aminoácidos foi identificada no C-terminal da DpCaL1 com três

modificações quando comparada com a catepsina secretada de humano: uma

treonina por uma valina na penúltima posição, um alanina por um glutamato sete

aminoácidos antes do final da proteína e uma serina por uma treonina oito

aminoácidos antes do final da proteína. Chauhan e colaboradores (1998)

demonstraram que a substituição de treonina por uma valina na penúltima posição,

assim como ocorre em DpCaL1, não afeta a exportabilidade da proteína. Nenhuma

informação é dada para as outras duas substituições observadas. Este resultado

sugere que a DpCaL1 pode ser direcionada para rota de secreção. Apesar disso,

mais estudos devem ser realizados a fim de determinar a localização celular desta

proteína.

Comparações da DpCaL1 com outras catepsinas L depositadas no banco de

dados usando Blastp 2.1.18+, indicaram alta identidade com a catepsina L de

Triatoma infestans (64%), Aedes aegypti (62%) e Rhodnius prolixus (64%). O

alinhamento das seqüências (Figura 13) mostra que alguns resíduos de aminoácidos

são altamente conservados entre essas enzimas.

79

tattccatcaggcagaggacgagacagaacgcaaacgcatggaacgcatatacagaaatcca 62

F H Q A E D E T E R K R M E R I Y R N P 20

actgaagaacattatcgtatgggagttttcttaaagaacaaacagatgatcgaagaacac 122

T E E H Y R M G V F L K N K Q M I E E H 40

aacaagaactacgagagcggcgatgtttcgtttcaaatgaagatgaaccatttcggtgac 182

N K N Y E S G D V S F Q M K M N H F G D 60

ttgtctccagaagaattcaaagaaagaatgaacaagtacaagagttccggtaaaccaaaa 242

L S P E E F K E R M N K Y K S S G K P K 80

cagctcggctcagtgttcgtcgaaccaaacgttgaagttcccgcctccgtcgactggagg 302

Q L G S V F V E P N V E V P A S V D W R 100

gaaaagggtgcagttactccggtgaaagatcaggggcagtgcggctcctgctgggcattc 362

E K G A V T P V K D Q G Q C G S C W A F 120

agtacaaccggatctttggaaggccaacattttctcaaaactggaaaacttgtatcattg 422

S T T G S L E G Q H F L K T G K L V S L 140

agcgaacagaacttagtcgattgtgctggaaggtacggcaatgatggttgcaacggtggg 482

S E Q N L V D C A G R Y G N D G C N G G 160

ctgatggacagtgctttcaaatttatcaaagcaaacggaggactagacaccgaagcatct 542

L M D S A F K F I K A N G G L D T E A S 180

tacccctacgaagcaatggacggaagatgcagatttaagaaagcaaacgttggagctact 602

Y P Y E A M D G R C R F K K A N V G A T 200

ctaaacagttttgttgacattcctcaaggcgatgaagaagctctcaagaaagctatagcg 662

L N S F V D I P Q G D E E A L K K A I A 220

acggtaggacctatttccgtggccattgacgctggagaaagttcgttccaattttactcc 722

T V G P I S V A I D A G E S S F Q F Y S 240

ggaggcgtatactacgagaagagatgcagtccttacaacctcgaccacggagtcctcgca 782

G G V Y Y E K R C S P Y N L D H G V L A 260

gtcggctacggttcagaaaacggccaagattactggctggtcaagaactcctggaacgca 842

V G Y G S E N G Q D Y W L V K N S W N A 280

aaatggggagaaaacggttacatcaagatggcaaggaacaagaacaaccactgcggaatc 902

K W G E N G Y I K M A R N K N N H C G I 300

gctactgaagcaagctaccccgtggtt 929

A T E A S Y P V V 309

FIGURA 12 - Nucleotídeo e seqüência de aminoácidos deduzida do cDNA que codifica catepsina L de Dysdercus peruvianus (DpCaL1)

Os resíduos de aminoácidos que formam os motivos característicos de catepsinas L

E-R-F-N-I-N, G-N-F-D e GCNGG estão destacados em cinza. Os resíduos conservados

80

envolvidos com catálise (C117, H256, N276) estão realçados em preto. O provável sítio de

clivagem do propeptídeo para liberação da enzima madura está indicado por uma seta.

Possíveis resíduos de lisina glicosiladas por NetGlycate estão em negrito e itálico. Nove

aminoácidos da provável seqüência de secreção na região C-terminal está em negrito. 10 20 30 40 50 60 70 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| L. vannamei --MKFLTVL---ACVVAAAVASPSL---RQQWRD----------FKAEHGRRYASVQEERYRLSVFEQNQ R. haemaphysaloides A --MLRLSLL---CAIVAVTVAANSHEILRTQWEA----------FKTTHKKSYESHMEELLRFKIFTENS P. stali --MQGLLVL---SCLIALGQAVSFFDLSADEFTL----------FKKFHRKEYDNELEESYRKKIFLENK N. norvegicus -------------CGLALATASPS-------WEH----------FKTQYGRKYGDAKEELYRQRVFQQNE T. molitor 2 --MKVFIIL---AIAIYGASAALPSTFVAEKWEN----------FKTTYARSYVNAKEETFRKQIFQKKL R. haemaphysaloides B --MRGYIVL---CCLFVTAAAITHQELVGAEWSA----------FKALHGKDYASDTEEYYRLKIYMENR T. molitor 3 --MSELGIL--VLCLAFAATLALPKSLFQEQWSQ----------FKLTHKKSYSSPIEEIRRQLIFKDNV H. armigera --MKSIAVL---LCVVGAACAVSLLDLVREEWSA----------FKLEHSKRYDSEVEDKFRMKIYLENK M. persicae --MKVVIVLGLVAFAISSVSSINLNEVIEEEWSL----------FKMQFKKLYEDIKEETFRKKVYLDNK A. gossypii --MKVVIVLGLVAFAISTVSSINLNEVIEEEWSL----------FKIQFKKLYEDIKEETFRKKVYLDNK S. exigua --MKGVAVL---LCLVAGACAVSLLDLVRGEWNA----------FKMEHSKQYDSEVEDKFRMKIYVENK I. ricinus] --MLRCLVL---CLLVAAAAAVSYQEVLGAEWSA----------FKAKHGKSYVSETEEVFRLKIYMENR R. prolixus -----ML------IPSFDID--------PQEWLA----------FKAMHGKNYRNQFEEIFRMKVFIDNK T. infestans --MKVAICF----LAFFAISHTALHDYFPEEWLA----------FKAQFGKSYKNSFEELFRMNVYKENQ A. aegypti --MKILILL---VAFVAAANAVSLYELVKEEWNA----------FKLQHRKNYDSETEERIRLKIYVQNK D. peruvianus ----------------FHQA---------EDETE-----------RKRMERIYRNPTEEHYRMGVFLKNK Clustal Consensus : : * . *: * :: .: 80 90 100 110 120 130 140 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| L. vannamei QFIDDHNARFENGEVTFTLQMNQFGDMTSEEFTATMNGFLNVPSRR------------PTAILRADPDET R. haemaphysaloides A LIIAKHNAKYAKGLVSYKLGMNQFGDLLAHEFAKIFNGYRG---QR-----------TSRGSTFMPPANV P. stali KRIEKHNSRYKQGKVSFKLKLNHLADMLIHEYSDVYLGFNKSSKAN---------NNKLQSYTFIPPAHV N. norvegicus QLVEAFNKKFENGEVTFKVAMNQFGDMTNEEFNAVMKGYKKGSRGE------------PTTVFTAE-GRP T. molitor 2 ETFEEHNEKYRQGLVSYTLGVNLFTDMTPEEMKAYTHGLIMPADLHKN---------GIPIKTREDLGLN R. haemaphysaloides B LKIARHNEKYAKSQVSYKLAMNEFGDLLHHEFVSTRNGFKRNYRDS-----------PREGSFFVEPEGF T. molitor 3 AKIAEHNAKFEKGEVTYSKAMNQFGDMSKEEFLAYVNRGKAQKPKHP----------ENLRMPYVSSKKP H. armigera HRIAKHNQRFEQGAVSYKLRPNKYADMLSHEFVHVMNGFNKTLKHP---KAVHGKGRESRPATFIAPAHV M. persicae LKIARHNKLYESGEETYALEMNHFGDLMQHEYSKMMNGFKPSLAGG------DSNFTNDEGVTFLKSENV A. gossypii LKIAGHNKLYESGEETYALEMNHFGDLMQHEYTKMMNGFKPSLAGG------DRNFTNDEAVTFLKSENV S. exigua HRITKHNQRFEQRLVSYKLKPNKYADMLHHEFVHTMNGFNKTAKHGGRNKNVHGKGHDGRAATFIAPAHV I. ricinus] HKIAKHNEKYARGEVPYSMAMNEFGDMLHHEFVSTRNGFKRNYKDQ-----------PREGSTYLEPENI R. prolixus KKIDEHNAKYELGEASYKMKMNHLGDLMVHEFKALMNGFKKTPNAE------------RNGKIYVPSNEN T. infestans RKIDEHNKRYENGEVSYKLKMNHFGDLMQHEFKALN-KLKRSAKQQ------------NSGEVFRATGGK A. aegypti HKIAKHNQRFDLGQEKYRLRVNKYADLLHEEFVQTVNGFNRTDSKK----SLKG-VRIEEPVTFIEPANV D. peruvianus QMIEEHNKNYESGDVSFQMKMNHFGDLSPEEFKERMNKYKSSGKPK------------QLGSVFVEPNVE Clustal Consensus . .* : : * *: .* 150 160 170 180 190 200 210 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| L. vannamei LP----KEVDWRTKGAVTPVKDQKQCGSCWAFSTTGSLEGQHFLKDGK--LVSLSEQNLVDCSDKFGNMG R. haemaphysaloides A NDSSLPSTVDWRKKGAVTPVKDQGQCGSCWAFSATGSLEGQHFLKDGE--LVSLSEQNLVDCSQSFGNNG P. stali T---LNKEVDWRTKGAVTPVKNQGHCGSCWAFSTTGALEGQNFRKTGK--LVSLSEQNLVDCSGSYGNNG N. norvegicus MA----ADVDWRTKGAVTPVKDQGQCGSCWAFSATGSLEGQHFLKNNE--LVSLSEQELVDCSTEYGNDG T. molitor 2 ASVRYPASFDWRDQGMVSPVKNQGSCGSCWAFSSTGAIESQMKIANGAGYDSSVSEQQLVDCVPN--ALG R. haemaphysaloides B EDLQLPKTVDWRKKGAVTPVKNQGQCGSCWAFSTTGSLEGPHFRKTRK--LVSLSEQNLVDCSRSFGNNG T. molitor 3 LA----ASVDWRSN-AVSEVKDQGQCGSCWSFSTTGAVEGQLALQRGR--LTSLSEQNLIDCSSSYGNAG H. armigera T---YPDHVDWRKKGAVTEVKDQGKCGSCWAFSTTGALEGQHFRKTGY--LVSLSEQNLIDCSAAYGNNG M. persicae V---IPKSIDWRKKGYVTPVKNQGQCGSCWSFSATGSLEGQHFRKTGV--LVSLSEQNLIDCSRKYGNNG A. gossypii V---IPKSVDWRKKGYVTPVKNQGQCGSCWSFSATGSLEGQHFRKTGV--LVSLSEQNLIDCSRKYGNNG S. exigua S---YPDHVDWRKKGAVTDVKDQGKCGSCWAFSTTGALEGQHFRKTGY--LVSLSEQNLIDCSAAYGNNG I. ricinus] EDFSLPKTVDWRTKGAVTPVKNQGQCGSCWAFSATGSLEGQHFRKSGS--MVSLSEQNLVGCSTDFGNNG R. prolixus LP----KSVDWRQRGAVTPVKDQGHCGSCWSFSATGSLEGQLFLKTGR--LVSLSEQNLVDCSKTYGNSG T. infestans LP----AKVDWRQKGAVTPVKDPGQCGSCWAFSSTGSLGGQLFLKNKK--LVSLSEQQLVDCSGNYGNDG A. aegypti E---VPTTVDWRKKGAVTPVKDQGHCGSCWSFSATGALEGQHFRKTGK--LVSLSEQNLVDCSGKYGNNG D. peruvianus VP----ASVDWREKGAVTPVKDQGQCGSCWAFSTTGSLEGQHFLKTGK--LVSLSEQNLVDCAGRYGNDG Clustal Consensus .*** . *: **: *****:**:**:: . *:***:*:.* *

81

220 230 240 250 260 270 280 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| L. vannamei CMGGLMDQAFRYIKANKGIDTEDSYPYEAQDGKCRFDASNVGATDTGYVDVEHGSESALKKAVATIGPIS R. haemaphysaloides A CEGGLMDNAFKYIKANDGIDAEESYPYEAMDDKCRFKKEDVGATDTGFVDIEGGSEDDLKKAVATVGPIS P. stali CEGGLMDNAFQYIKENHGIDTEKSYPYEGEDETCRFRKTSIGATDSGFVDITQGDEEALMQAVATIGPIS N. norvegicus CGGGWMTSAFDYIKDNGGIDTESSYPYEAQDRSCRFDANSIGATCTGFVEVQH-TEEALHEAVSDIGPIS T. molitor 2 CSGGWMNDAFTYVAQNGGIDSEGAYPYEMADGNCHYDPNQVAARLSGYVYLSGPDENMLADMVATKGPVA R. haemaphysaloides B CEGGLMDNAFKYIKSNKGIDTEWSYPYNATDGVCHFNRSDVGATDTGFVDIPEGDENKLKKAVAAVGPVS T. molitor 3 CDGGWMDSAFSYIHDY-GIMSESAYPYEAQGDYCRFDSSQSVTTLSGYYDLPSGDENSLADAVGQAGPVA H. armigera CNGGLMDNAFKYIKDNGGIDTEKAYPYEGVDDKCRYNAKNSGADDVGFVDIPQGDEEKLMQAVATVGPVS M. persicae CEGGLMDLAFKYIKSNKGLDTEKSYPYEAEDDKCRYNPDNSGATDNGFVDIPEGDEEALMHALATVGPVS A. gossypii CEGGLMDLAFKYIKSNKGLDTEKSYPYEAEDDKCRYNPENSGATDKGFVDIPEGDEDALMHALATVGPVS S. exigua CNGGLMDNAFKYIKDNGGIDTEKSYPYEAVDDKCRYNPKESGADDVGFVDIPQGDEEKLMQAVATVGPIS I. ricinus] CEGGLMDDAFKYIRANKGIDTEKSYPYNGTDGTCHFKKSTVGATDSGFVDIKEGSETQLKKAVATVGPIS R. prolixus CEGGLMNQAFQYVRDNKGIDTEASYPYEARENNCRFKEDKVGGTDKGYVDILEASEKDLQSAVATVGPIS T. infestans CDGGIMVQAFQYIKGNGGIDTEGSYPYEAEDDKCRYKTKSVAGTDKGYVDIAQGDENALKEAVAEIGPIS A. aegypti CNGGMMDYAFQYIKDNGGIDTEKSYPYEAIDDTCHFNPKAVGATDKGYVDIPQGDEEALKKALATVGPVS D. peruvianus CNGGLMDSAFKFIKANGGLDTEASYPYEAMDGRCRFKKANVGATLNSFVDIPQGDEEALKKAIATVGPIS Clustal Consensus * ** * ** :: *: :* :***: *:: .: : * * :. **:: 290 300 310 320 330 340 350 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| L. vannamei VAIDASQPSFQFYHDGVYYEEGCSSTMLDHGVLAVGYGETEKGEAYWLVKNSWNTSWGNKGYIQMSRDKK R. haemaphysaloides A VAIDAGHSSFQLYSEGVYDEPECSSEELDHGVLAVGYGVKDG-KKYWLVKNSWGGSWGDNGYILMSRDKN P. stali VAIDASHQSFQFYSEGVYYEPECSSENLDHGVLVVGYGVEDN-QKYWLVKNSWGTQWGDGGYIKMARDQD N. norvegicus VAIDASHFSFQFYSSGVYYEKKCSPTNLDHGVLAVGYG-TESTEDYWLVKNSWGSGWGDAGYIKMSRNRD T. molitor 2 VAFDAD-DPFGSYSGGVYYNPTCETNKFTHAVLIVGYG-NENGQDYWLVKNSWGDGWGLDGYFKIARNAN R. haemaphysaloides B VAIDASHESFQFYSEGVYDEPECSSEQLDHGVLVVGYGTKDG-QDYWLVKNSWGTTWGDEGYIYMTRNKD T. molitor 3 VAIDAT-DELQFYSGGLFYDQTCNQSDLNHGVLVVGYG-SDNGQDYWILKNSWGSGWGESGYWRQVRNYG H. armigera VAIDASQESFQFYSDGVYYDENCSSTDLDHGVMVVGYGTDEQGGDYWLVKNSWGRTWGDLGYIKMARNKN M. persicae IAIDASSEKFQFYKKGVFYNPRCSSTELDHGVLAVGFRTDKKGGDYWIVKNSWGKTWGDEGYIMMARNKK A. gossypii IAIDASSEKFQFYKKGVFYNPRCSSTELDHGVLAVGFGSDKKGGDYWIVKNSWGKTWGDEGYIMMARNKK S. exigua VAIDASQETFQFYSKGVYYDENCSSTDLDHGVMVVGYGTEEDGSDDWLVKNSWGRSWGELGYIKMARNKN I. ricinus] VAIDASHESFQFYSDGVYDEPECDSESLDHGVLVVGYGTLNG-TDYWFVKNSWGTTWGDEGYIRMSRNKK R. prolixus VRIDASHESFQFYSEGVYKEQYCSPSQLDHGVLTVGYG-TENGQDYWLVKNSWGPSWGESGYIKIARNHK T. infestans VAIDAGNLSFQFYSEGIYDEPFCSNTELDHGVLVVGYG-TENGQDYWLVKNSWGPSWGENGYIKIARNHN A. aegypti IAIDASHESFQFYSEGVYYEPQCDSENLDHGVLAVGYGTSEEGEDYWLVKNSWGTTWGDQGYVKMARNHD D. peruvianus VAIDAGESSFQFYSGGVYYEKRCSPYNLDHGVLAVGYG-SENGQDYWLVKNSWNAKWGENGYIKMARNKN Clustal Consensus : :** : * *:: : *. : *.*: **: . *::****. ** ** *: 360 ....|....|.... L. vannamei NNCGIASQASYPLV R. haemaphysaloides A NQCGIASAASYPLV P. stali NNCGIATQASYPLV N. norvegicus NNCGIASEPSYPTV T. molitor 2 NHCGIAGVASVPTL R. haemaphysaloides B NQCGIASSASYPLV T. molitor 3 NNCGIATAASYPAL H. armigera NHCGIASSASYPLV M. persicae NNCGVASSASYPLV A. gossypii NNCGVASSASYPLV S. exigua NHCGIASSASYPLV I. ricinus] NQCGIASSASIPLV R. prolixus NHCGIASMASYPVV T. infestans NHCGIASMASYPIV A. aegypti NHCGVATCASYPLV D. peruvianus NHCGIATEASYPVV Clustal Consensus *:**:* .* * :

FIGURA 13 - Catepsina L do Dysdercus peruvianus (DpCaL1) alinhada com outras catepsinas L de insetos.

As seqüências aqui listadas foram retiradas do GenBankTM. L. vannamei: catepsina L

de Litopenaeus vannamei (CAA68066); R. haemaphysaloides A: catepsina L de

Rhipicephalus haemaphysaloides haemaphysaloides (AAQ16117); P. stali: catepsina L de

Plautia stali (BAF94152); N. norvegicus: catepsina L de Nephrops norvegicus (CAA56915);

T. molitor 2: catepsina L de Tenebrio molitor (AY337517); R. haemaphysaloides B: catepsina

L de Rhipicephalus haemaphysaloides haemaphysaloides (AAQ16118); T. molitor 3:

82

catepsina L de Tenebrio molitor (AY332272); H. armigera: catepsina L de Helicoverpa

armigera (AAQ75437); M. persicae: catepsina L de Myzus persicae (CAD42716); A.

gossypii: catepsina L de Aphis gossypii (CAD33266); S. exigua: catepsina L de Spodoptera

exigua (ABK90824); I. ricinus: catepsina L de Ixodes ricinus (ABO26562); T. molitor 2:

catepsina L de Tenebrio molitor (AAP94046); R. haemaphysaloides B: catepsina L de

Rhipicephalus haemaphysaloides haemaphysaloides (AAQ16118); R. prolixus: catepsina L

de Rhodnius prolixus (AF320565); T. infestans: catepsina L de Triatoma infestans

(AAP94047); H. armigera: catepsina L de Helicoverpa armigera (AAR12010); A. aegypti:

catepsina L de Aedes aegypti (ABE72970); D. peruvianus: catepsina L de Dysdercus

peruvianus. *, : e . indicam, respectivamente resíduos idênticos, altamente conservados e

pouco conservados entre as seqüências. O alinhamento foi feito nas condições padrões do

programa ClustalX versão 1.8.

4.10 - A ORIGEM E FUNÇÃO DAS CATEPSINAS L DE INTESTINO MÉDIO DE INSETOS

Foi feita análise evolutiva molecular e, filogenética através de um cladograma

utilizando o programa Molecular Evolutionary Genetic Analysis Versão 3.1 (MEGA

3.1) (Kumar et al., 2004) com 46 seqüências de CALs de insetos registradas no

GenBank, das quais 30 correspondem a ordem Coleoptera, 7 Diptera, 4 Hemiptera,

1 Lepidoptera, 4 Thysanoptera, além das 4 DpCaLs de D. peruvianus (Figura 14). As

CALs de insetos formam um grande ramo, ficando apenas uma seqüência de D.

melanogaster de fora. Este grande ramo se divide num grupo monofilético (bootstrap

84) contendo as DpCaL 1, 3, e 4, além de todas as seqüências de Hemiptera,

Thysanoptera, Lepidoptera, 2 de Diptera, 4 de Coleoptera, e num arranjo polifilético

contendo além da DpCaL 2 as outras seqüências de Coleoptera e duas seqüências

de D. melanogaster.

Já que no ramo monofilético estão as seqüências demonstradas como de

lisossomos de T. molitor (ppCAL1 a-c) (Cristofoletti et al., 2005), além de algumas

seqüências de Diptera e Lepidoptera, que não possuem cisteína proteinases

digestivas (Terra e Ferreira, 1994), este grupo deve incluir apenas enzimas

lisossômicas. No entanto, Hemiptera Heteroptera (Terra e Ferreira, 1994), Hemiptera

Auchenorrhyncha (afídeos) (Cristofoletti et al., 2003) e Hemiptera Sternorrhyncha

possuem apenas catepsinas L como proteinase digestiva. Neste caso é provável

que estes insetos utilizem enzimas lisossomais como proteinases digestivas. Este

resultado sugere que as catepsinas L digestivas de Hemiptera são similares as

83

lisossomais de T. molitor, enquanto as de Coleoptera são similares as digestivas de

T. molitor.

No ramo polifilético estão as seqüências de catepsinas L de T. molitor

conhecidas como digestivas (ppCAL 2 e 3) de acordo com estudos de localização

tecidual através de RT-PCR semiquantitativo e imunocitolocalização (Cristofoletti et

al., 2005). Além destas seqüências outras de Coleoptera: C. maculatus, L.

decemlineata, D. virgifera virgifera, P. cochleariae, H. postica, Diptera: D.

melanogaster e a DpCaL 2 de D. peruvianus também fazem parte deste grupo.

Desta forma, provavelmente todas as seqüências deste ramo são digestivas.

Levando em consideração que T. molitor possui catepsinas L digestivas e

lisossomais podemos imaginar que catepsinas L digestivas originaram de catepsinas

L lisossomais através de duplicação gênica e evolução independente.O fato da

DpCaL 2 fazer parte deste ramo não significa se tratar de uma catepsina L digestiva

diferente das demais de hemípteras, já que foi verificada transcrição do seu mRNA

em outros tecidos do D peruvianus além do intestino médio (Figura 24).

Provavelmente por se tratar de um EST muito curto (666 pb), esta seqüência não

contém regiões importantes para sua caracterização filogenética correta, que seria

estar no ramo monofilético com as demais catepsinas L de hemípteras.

84

Tenebrio molitor ppCAL1a (C) Tenebrio molitor ppCAL1c (C) Tenebrio molitor ppCAL1b (C) Bombyx mori (L) Drosophila melanogaster 1 (D) Delia radicum (D) Sitophilus oryzae (C) Myzus persicae (H) Aphis gossypii (H) Acyrthosiphon pisum (H) Dysdercus peruvianus DpCaL1 (H) Rhodnius prolixus (H) Dysdercus peruvianus DpCaL3 (H) Dysdercus peruvianus DpCaL4 (H) Frankliniella occidentalis 1 (T) Frankliniella occidentalis 2 (T) Frankliniella occidentalis 3 (T) Frankliniella occidentalis 4 (T) Leptinotarsa decemlineata 1 (C) Diabrotica virgifera virgifera 1 (C) Diabrotica virgifera virgifera 2 (C) Dysdercus peruvianus DpCaL2 (H) Tenebrio molitor ppCAL3 (C) Tenebrio molitor ppCAL2 (C) Drosophila melanogaster 3 (D) Drosophila melanogaster 4 (D) Diabrotica virgifera virgifera 4 (C) Drosophila melanogaster 5 (D) Drosophila melanogaster 6 (D) Leptinotarsa decemlineata 4 (C) Leptinotarsa decemlineata 5 (C) Leptinotarsa decemlineata 6 (C) Leptinotarsa decemlineata 2 (C) Leptinotarsa decemlineata 3 (C) Diabrotica virgifera virgifera 5 (C) Phaedon cochleariae (C) Callosobruchus maculatus 1 (C) Callosobruchus maculatus 7 (C) Callosobruchus maculatus 9 (C) Callosobruchus maculatus 8 (C) Callosobruchus maculatus 10 (C) Callosobruchus maculatus 6 (C) Callosobruchus maculatus 11 (C) Callosobruchus maculatus 4 (C) Callosobruchus maculatus 5 (C) Callosobruchus maculatus 2 (C) Callosobruchus maculatus 3 (C) Diabrotica virgifera virgifera 3 (C) Hypera postica (C) Drosophila melanogaster 2 (D)

92100

99

98

62

50

100

100

100

85

91100

99

86100

99

76100

9398

94

71

58

55

84

85

FIGURA 14 - Cladograma de seqüências de catepsinas L de insetos depositadas no GenBank. As ramificações foram estatisticamente calculadas através do programa Mega 3.1

(Kumar et al., 2004) com análise de Bootstrap (corte de 50). C, Coleoptera; D, Diptera; H,

Hemiptera; L, Lepidoptera; T, Thysanoptera. Tenebrio molitor ppCAL 1a, ppCAL 1b, ppCAL

1c, ppCAL2, ppCAL3, (Coleoptera): AY207373, AY332270, AY332271, AY337517,

AY332272; Bombyx mori (Lepidoptera): AAB33990; Drosophila melanogaster 1, 2, 3, 4, 5, 6

(Diptera): AAM68565, AAF58330, AAF51923, AAF51924, AAF58331, AAF52922; Delia

radicum (Diptera): AAL16954; Sitophilus oryzae (Coleoptera): Q26636; Myzus persicae

(Hemiptera: Auchenorrhyncha): CAD42716; Aphis gossypii (Hemiptera: Auchenorrhyncha):

CAD33266; Acyrthosiphon pisum (Hemiptera: Sternorrhyncha): XP_001944978; Dydercus

peruvianus DpCaL 1, 2, 3, 4 (Hemiptera: Heteroptera); Rhodnius prolixus (Hemiptera:

Heteroptera): AAL34984; Frankliniella occidentalis 1, 2, 3 ,4 (Thysanoptera): AAL02222,

AAL02220, AAL02223, AAL02221; Leptinotarsa decemlineata 1, 2, 3, 4, 5, 6 (Coleoptera):

AAS20593, AAS20592, AAS20591, AAS20589, AAS20590, AAS20588; Diabrotica virgifera

virgifera 1, 2, 3, 4, 5 (Coleoptera): CAE47500, CAE47501, CAE47497, CAE47499,

AAG17127; Phaedon cochleariae (Coleoptera): CAA76927; Callosobruchus maculatus 1, 2,

3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 (Coleoptera): AAQ11975, AAQ11974, AAQ11973, AAQ11971,

AAQ11968, AAQ11970, AAQ11972, AAQ11966, AAQ11967, AAQ11965, AAQ11969;

Hypera postica (Coleoptera): AAD41105.

86

UM LEVANTAMENTO DO TRANSCRIPTOMA DO INTESTINO MÉDIO DO HEMIPTERA, DYSDERCUS

PERUVIANUS, UTILIZANDO SEQUENCIAMENTO DE ESTS 4.11 - CONSTRUÇÃO DA BIBLIOTECA DE CDNA E SEQUENCIAMENTO DAS ESTS

O descobrimento de genes através do seqüênciamento de ESTs ao acaso

tem se tornado um método de baixa relação custo-benefício para caracterização

biológica de uma ampla e crescente série de organismos (Theodorides et al., 2002;

Valenzuela et al., 2002; Ribeiro, 2003; Pedra et al., 2003a, 2003b; Ribeiro et al.,

2004a, 2004b, 2006; Calvo et al., 2004, 2006; Siegfried et al., 2005; Siviero et al.,

2006; Sabater-Muñoz et al., 2006; Felitti et al., 2006; Coblentz et al., 2006). O valor

da informação da seqüência derivada está também aumentando através da

aplicação de diversos meios de anotação e sofisticadas ferramentas de análise.

Com o intuito de obter informações sobre as proteínas do intestino médio do

Hemiptera D. peruvianus adultos, este tecido foi utilizado como fonte de mRNA para

posterior geração de cDNA. A empresa Vertis Biotechnologie AG, localizada na

Alemanha, foi quem após obter a normalização dos cDNAs amplificados, clonaram e

inseriram estes cDNAs no vetor Lambda Uni ZAP . A biblioteca foi normalizada para

minimizar a redundância de transcritos e permitir a detecção de transcritos pouco

abundantes.

Aqui no Brasil, no Laboratório de Bioquímica de Insetos do Instituto de

Química, esta biblioteca de cDNAs em fagos foi seqüenciada ao acaso e seu

resultado analisado. O objetivo principal deste procedimento foi fornecer dados

relacionados com a fisiologia molecular deste inseto praga.

Cerca de 1060 clones da biblioteca foram selecionados aleatoriamente,

distribuídos em placas de cultura de 96 poços contendo meio LB líquido e

carbenicilina (50 µg/mL). Estas placas foram incubadas a 37 ºC por 16h sem

agitação. Os plasmídeos foram amplificados através de PCR de colônia e a partir do

material amplificado de cada colônia foi feito o seqüênciamento automático no

equipamento ABI100 (Applied Biosystems). Foram seqüenciados clones a partir da

extremidade 5´ utilizando o iniciador universal T7.

87

4.12 - PROCESSAMENTO, ANÁLISE, CATEGORIZAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DO

TRANSCRIPTOMA DE INTESTINO MÉDIO DE D. PERUVIANUS

Foi realizado o processamento das leituras, onde as seqüências de vetor

foram aparadas e as de baixa qualidade foram descartadas. Uma seqüência foi

considerada útil quando apresentava um mínimo de 150 bases contíguas com

qualidade inferida pelo Phred ≥20 (Ewing et al., 1998 a, b).

A montagem de contíguos consiste na junção ordenada dos nucleotídeos,

com base na similaridade entre as seqüências das diferentes ESTs seqüenciadas,

levando em conta os critérios de qualidade de seqüênciamento e sua interpretação.

Assim é possível estabelecer uma seqüência comum (consenso) a partir da

montagem de várias seqüências. As seqüências que não formaram contíguos foram

denominadas singletos.

Um total de 1053 seqüências curtas de alta qualidade foram analisadas e

utilizadas para montagem de contíguos para evitar redundância. Montando estes

ESTs por alinhamento de bases (Phrap) (Gordon et al., 1998), foram produzidos 62

contíguos e 841 singletos, o que totaliza 903 seqüências únicas. Porém não se pode

esperar que cada seqüência única seja um transcrito diferente, pois muitos dos

ESTs pertencentes à mesma mensagem não se sobrepõem ou podem estar

presentes no banco de ESTs representando �splicings� alternativos e pré-mRNAs,

além de polimorfismos e regiões de baixa qualidade que dentro das condições de

estringência adotadas podem levar a formação de contíguos diferentes de um

mesmo transcrito. A tabela 4 mostra um resumo dos dados obtidos do

seqüênciamento da biblioteca. Do total de contíguos, 54 foram formados por apenas

2 ou 3 ESTs. Apenas dois contíguos foram formados por mais de 20 ESTs.

O número de clones seqüenciados foi limitado através da observação da taxa

de novidade obtida após cada placa seqüenciada, o que corresponde a 96

seqüências. Esta taxa de novidade diminuiu acentuadamente, demonstrando assim

que os clones por nós seqüenciados já haviam atingido a maioria das cópias

diferentes de cDNA gerado a partir do intestino médio do D. peruvianus (Figura 15).

O seqüênciamento ao acaso foi finalizado quando a taxa de novidade se tornou

aproximadamente constante. Isto aconteceu quando a taxa de novidade esteve

próxima de 0,1.

O número de ESTs por contíguos variou de 2 a 27, com cerca de 70%

contendo 2 EST (Figura 16). O tamanho dos contíguos variou de menos de 200 a

88

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

0 200 400 600 800 1000 1200

Clones sequenciados

Taxa

de

novi

dade

1400 pb, com uma média de aproximadamente 860 pb (ilustrado graficamente na

Figura 17).

TABELA 4 - Resumo da análise do seqüênciamento de EST da biblioteca de cDNA do

intestino médio e Dysdercus peruvianus

Seqüências Totais 1056

Total de seqüências aceitas 1053

Seqüências Não-redundantes 903

Número de Singletos 841

Número de contíguos 62

Número de contíguos contendo:

2-4 ESTs 57

5-15 ESTs 3

>20 2

FIGURA 15 - Mudanças na taxa de novidade acompanham o seqüênciamento ao acaso da biblioteca de intestino médio de D. peruvianus.

A taxa de novidade corresponde à razão do número de bases novas com o numero

total de bases seqüenciadas.

89

0

5

10

15

20

100

200

300

400

600

700

800

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1000

1100

1200

1300

1400

Tamanho do contíguo (pb)

Núm

ero

de c

ontíg

uos

45

9

31 1 1 1 1

0

5

10

15

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35

40

45

50

2 3 4 5 14 15 22 27

Número de EST por contíguo

Núm

ero

de c

ontíg

uos

FIGURA 16 - Distribuição e número de ESTs em cada contíguo.

As ESTs foram agrupadas pelo programa Phrap. A maioria dos contíguos é formada

por 2 ou 3 ESTs e o maior contíguo por 27 ESTs.

FIGURA 17 - Característica dos contíguos.

Distribuição do tamanho total das seqüências dos contíguos.

90

Após a clusterização e montagem, os contíguos e os singletos resultantes

foram analisados através de Blastx (Altschul et al., 1990) contra o banco de dados nr

(NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov), que inclui seqüências de todos os organismos.

Os parâmetros utilizados foram: -p blastx �d nr �b 10 � T T. As traduções das

seqüências dos contíguos e singletos quando comparadas às seqüências

depositadas no GenBank, revelaram que 86% das seqüências únicas possuem

similaridade com alguma proteína depositada no banco público. Destas 48,2%

mostraram proteínas de insetos como maior semelhante (�best hit�) (Figura 18A),

sendo que dentro do grupo dos insetos a ordem Coleoptera apresentou uma maior

semelhança (32,2%) seguido por Diptera (31,7%) e Hymenoptera (28,9%), os �best

hits� dos outros 7,3% destes ESTs se distribuem em proporções bem menores entre

as outras ordens de insetos conforme mostra a Figura 18B.

Não é incomum encontrar nas respostas de Blastx proteínas de humanos,

camundongos, entre outros organismos distantes de D. peruvianus como �best hit�.

Em nossos resultados estes organismos representam aproximadamente 52% das

respostas, podendo-se apontar diferentes motivos para encontrarmos organismos

muito divergentes de Dysdercus ocupando a posição de maior semelhante nas

comparações entre as traduções de EST e o banco de proteínas do GenBank.

Proteínas muito conservadas entre diferentes filos quando comparadas entre si

podem apresentar os mesmos valores de e-values e de score.

91

FIGURA 18 - Distribuição das similaridades de proteínas entre Dysdercus peruvianus e outros organismos.

Os números representam a porcentagem dos ESTs que apresentaram similaridade

com algum organismo presente no GenBank.

A fim de gerar uma visão mais ampla do estado metabólico do tecido, os

ESTs gerados foram categorizados segundo critérios do Gene Ontology Consortium

(GO). Uma provável Função Molecular foi designada para 445 seqüências (50% do

total de seqüências) (Figura 19), bem como para Processo Biológico onde foram

categorizadas 390 seqüências (43% do total de seqüências) (Figura 20), as

seqüências restantes não puderam ser categorizadas pelo banco de dados de

proteínas anotadas pelo GO. É natural que uma quantidade menor de transcritos

seja classificada no aspecto Processo Biológico, reflexo da complexidade da tarefa

de associar evidências reais a cada termo do GO e de fato de não ser conhecido o

perfil completo da participação em processos biológicos em que cada função de uma

dada proteína é desempenhada.

Com o intuito de preservar a integridade do vocabulário do GO e seu sentido

original, os seus termos não foram traduzidos para o português.

Os termos do GO relacionados à Função Molecular e Processo Biológico são

mais curados e detalhados. A distribuição na categoria Componente Celular é

considerada menos instrutiva e, portanto não foi aqui demonstrada.

A figura 19 ilustra a distribuição das seqüências na categoria Função

Molecular, indicando maior similaridade com proteínas relacionadas com ligação

(binding) e atividade catalítica (catalytic activity). A tabela 5 mostra a distribuição dos

transcritos nas categorias mais comumente achadas no primeiro e segundo níveis

Plantas; 4,7%

Fungos; 7,0%

Outros; 14,2%

Bactéria; 11,4%

Vertebrados; 14,1%

Outros Artropodes;

0,5%

Insetos; 48,2%

Orthoptera; 1,4%

Diptera; 31,7%

Odonata; 0,3%

Coleoptera; 32,2%

Hemiptera; 2,5%

Lepidoptera; 3,1%

Hymenoptera; 28,9%

A B

92

hierárquicos da função molecular. Foi encontrado maior número de seqüências

relacionadas com ligação de proteínas (22,02%), ligação de ácidos nucléicos

(10,78%) e ligação de íons metálicos (2,92%). Na categoria atividade catalítica, as

hidrolases foram maioria com 13,26%, seguido das transferases (11,7%) e das

oxirredutases (4,94%). Dentre as proteínas relacionadas com transporte, foram

achadas similaridades com transportadoras de íons (2,92%), transportadoras de

aminoácidos (0,9%), além de uma seqüência com função de transporte de

carboidratos que pode ser uma provável molécula envolvida na internalização de

açúcares no intestino médio do inseto estudado.

Na categorização de Processo Biológico podemos observar (Tabela 6) que a

maioria das proteínas foi distribuída dentro da categoria processo fisiológico

(physiological process) (68,97%), sendo que a subcategoria com maior número de

seqüências está relacionada com metabolismo (metabolism), com 169 seqüências

(43,33%). Outra categoria com representatividade de seqüências foi regulação de

processos biológicos (Regulation of biological process) com 15,90%, sendo a sua

maioria classificada dentro a subcategoria regulação de processos fisiológicos

(Regulation of physiological process) com 14,36%.

O perfil da categorização está condizente com o tecido estudado, envolvido

com digestão, já tendo sido observado em outros transcriptomas de intestino médio

de insetos (Siegfried et al., 2005) esta mesma proporção de proteínas com função

de ligação e de catálise.

93

171 155

34 2924

1511

32

1

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10

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1000

A B C D E F G H I J L

FIGURA 19 - Perfil de expressão de genes da biblioteca de cDNAs de intestino médio de D. peruvianus nas categorias de Função Molecular Ontology.

Os valores indicam os números de clones seqüenciados da biblioteca agrupados nas

categorias de Função Molecular Ontology. A � Binding, B - Catalytic activity, C - Transporter

activity, D - Structural molecule activity, E - Transcription regulator activity, F - Signal

transducer activity, G - Enzyme regulator activity, H - Motor activity, I - Translation regulator

activity, J - Nutrient reservoir activity, L - Molecular function unknown.

94

TABELA 5 - Distribuição dos transcritos do inseto D. peruvianus na categoria Função Molecular do Gene Ontology. Função Molecular (GO) Número de

seqüênciasPorcentagem em relação ao nº. total

de seqüências categorizadas (%) Binding 171 38,42

Carbohydrate binding 1 0,22 Lipid binding 2 0,45 Metal ion binding 13 2,92 Nucleic acid binding 48 10,78 Nucleotide binding 5 1,12 Peptide binding 1 0,22 Protein binding 98 22,02 Ribonucleoprotein binding 1 0,22 Vitamin binding 2 0,45

Catalytic activity 155 34,83 Helicase activity 4 0,9 Hydrolase activity 59 13,26 Isomerase activity 3 0,67 Ligase activity 3 0,67 Lyase activity 2 0,45 Oxidoreductase activity 22 4,94 Small protein conjugating enzyme activity 1 0,22 Thiolase activity 1 0,22 Transferase activity 52 11,70 Transposase activity 3 0,67 Other Catalytic activity 5 1,12

Enzyme regulator activity 11 2,47 Motor activity 3 0,67 Nutrient reservoir activity 1 0,22 Signal transducer activity 15 3,37

Receptor activity 6 1,35 Rceptor binding 6 1,35 Other transducer activity 3 0,67

Structural molecule activity 29 6,52 Extracellular matrix structural constituent 13 2,92 Structural constituent of cell wall 1 0,22 Structural constituent of cuticle (sensu

Insecta) 2 0,45

Structural constituent of cytoskeleton 5 1,12 Structural constituent of peritrophic membrane (sensu Insecta)

1 0,22

Structural constituent of ribosome 3 0,67 Other structural molecule activity 4 0,9

Transcription regulator activity 24 5,4 Translation regulator activity 2 0,45 Transporter activity 34 7,64

Amine transporter activity 1 0,22 Amino acid transporter activity 4 0,9 Carbohydrate transporter activity 1 0,22 Carrier activity 1 0,22 Channel or pore class transporter activity 1 0,22 Intracellular transporter activity 1 0,22 Intracellular transporter activity 1 0,22 Ion transporter activity 13 2,92 Nucleobase\, nucleoside\, nucleotide and nucleic acid transporter activity

1 0,22

Organic acid transporter activity 2 0,45 Peptide transporter activity 1 0,22 Vitamin transporter activity 1 0,22 Other transporter activity 6 1,35

95

269

62

21 16 15

6

1

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1

10

100

1000

A B C D E F G H

FIGURA 20 - Perfil de expressão de genes da biblioteca de cDNAs de intestino médio de D. peruvianus nas categorias de Processo Biológico Ontology

Os valores indicam os números de clones seqüenciados da biblioteca agrupados nas

categorias de Processo Biológico Ontology. A � Physiological process, B - Regulation of

biological process, C - Cellular process, D - Development, E - Response to stimulus, F -

Reproduction, G - Pigmentation, H - Biological process unknown.

TABELA 6 - Distribuição dos transcritos do inseto D. peruvianus na categoria Processo

Biológico do Gene Ontology

Processo Biológico (GO) Número de seqüências

Porcentagem em relação ao nº. total de seqüências categorizadas (%)

Cellular process 21 5,38 Cell adhesion 3 0,77 Cell communication 18 4,62

Development 16 4,10 Pigmentation 1 0,26

Pigmentation during development 1 0,26 Physiological process 269 68,97

Cellular physiological process 39 10,00 Homeostasis 1 0,26 Localization 41 10,51 Locomotion 12 3,08 Metabolism 169 43,33 Organism physiological process 7 1,79

Regulation of biological process 62 15,90 Regulation of catalytic activity 3 0,77 Regulation of cellular process 3 0,77 Regulation of physiological process 56 14,36

Response to stimulus 15 3,85 Behavior 4 1,03 Response to abiotic stimulus 3 0,77 Response to biotic stimulus 3 0,77 Response to stress 4 1,03 Sensory perception 1 0,26

Reproduction 6 1,54 Sexual reproduction 6 1,54

96

4.13 - IDENTIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS DO INTESTINO MÉDIO DE D. PERUVIANUS

Uma porção considerável dos ESTs obtiveram similaridade com a proteinase

utilizada pelo inseto praga, a cisteína proteinase, além de transportadores de

aminoácidos e enzimas envolvidas com a digestão. A Tabela 7 sumariza todos os

contíguos mostrando com qual organismo e proteína teve melhor alinhamento no

Blastx (nr) e seus e-values. Devido ao grande número de seqüências de proteínas

do banco de dados serem preditas ou hipotéticas, foi olhado todos os alinhamentos

abaixo da primeira e quando havia uma informação mais curada foi citada

juntamente com a mais parecida.

Dentre os contíguos mais interessantes para o presente estudo, estão:

catepsina L, lipase, transportador dependente de sódio, proteína transmembrânica

transportadora de aminoácidos, ATPase transportadora de cátions e canais

ânionicos. Todos estes contíguos apresentam bons e-values e compartilham

semelhança com proteínas de outros insetos.

Dos 841 singletos seqüenciados e analisados, 29 apresentam relevância para

o estudo da fisiologia molecular do inseto em questão (Tabela 8). Dentre estes

singletos estão as enzimas principais envolvidas com digestão: β e α-glicosidase, α-

amilase, catepsina L e F, serino proteinase, aspartil proteinase, oligopeptidase,

lipase e aminopeptidase; além de transportadores envolvidos com a internalização

de glicose e aminoácidos provenientes do alimento digerido: transportador de

monocarboxilato, transportadores de cátions, transportador de metal divalente,

simportador sódio/soluto, permease de aminoácido, proteína transportadora de íon,

canais iônicos de sódio, potássio e cálcio, V-ATPases, transportador de açúcar.

97

TAB

ELA

7 -

Sum

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105

4.14 - SELEÇÃO DE SEQUÊNCIAS DE PROTEÍNAS OBTIDAS ATRAVÉS DE SEQÜÊNCIAMENTO AO

ACASO DE BIBLIOTECA DE CDNA DE INTESTINO MÉDIO DE D. PERUVIANUS

Através da análise do transcriptoma intestinal, foram encontradas seqüências

relacionadas com enzimas marcadoras que hipoteticamente participam do processo

secretório de enzimas digestivas em Hemiptera (Figura 21). O modelo proposto,

vesículas (contendo enzimas digestivas) com duas membranas são formadas a

partir de cisternas com dupla membrana provenientes da região do trans-Golgi.

Essas vesículas com dupla membrana originariam as membranas perimicrovilares

após dois eventos sucessivos de fusão: primeiro da membrana externa da vesícula

com a membrana microvilar e, segundo, da membrana interna vesicular com a

membrana perimicrovilar (Silva et al., 1995). Esta hipótese foi reforçada após a

imunolocalização de α-glicosidase em algumas áreas do complexo de Golgi e na

membrana interna dessas vesículas de dupla membrana (Silva et al., 1995), a qual

se especulava ser a membrana que daria origem às membranas perimicrovilares.

Uma β-glicosidase, duas α-glicosidases, uma aminopeptidase e quatro

catepsinas L, foram as seqüências encontradas dentre os ESTs analisados que

podem ajudar a afirmar a hipótese postulada (Figura 22 A-I) (Tabela 9). A escolha

baseia-se no fato de que enzimas com essas atividades foram identificadas como

marcadoras (Silva e Terra, 1994; Silva et al., 1996): β-glicosidase, marcadora de

membranas microvilares; α-glicosidase, marcadora de membranas perimicrovilares;

aminopeptidase, encontrada no espaço perimicrovilar e catepsinas L, proteinase que

podem ser encontradas em vesículas secretoras ou em lisossomos.

Cada singleto referente à seqüência similar a β-glicosidase, as duas α-

glicosidases, a aminopeptidase, ao transportador de açúcar e aos contíguos das

catepsinas L foram detalhadamente analisados a fim de recuperar os plasmídeos

congelados a -80 ºC em glicerol referente a cada EST para tentar obter seqüências

maiores e com melhor qualidade de bases. Após o crescimento em meio líquido e

purificação do DNA, este foi seqüenciado utilizando dois oligonucleotídeos

universais, T7 e T3 obtendo ao final seqüências que foram analisadas e montadas.

A partir destas seqüências (Figura 22 A-I) foram desenhados oligonucleotídeos

(Tabela 1) para análise de transcrição tecidual.

106

FIGURA 21 - Modelo proposto para a origem das membranas perimicrovilares.

A figura à esquerda mostra vesículas de dupla membrana brotando do Golgi e

transportando proteínas secretórias que são liberadas no lúmen após a fusão da membrana

externa da vesícula com a membrana microvilar e da membrana interna com a membrana

perimicrovilar. A figura à direita mostra em detalhes a origem das vesículas de dupla

membrana a partir de uma cisterna do complexo de Golgi (A) que é envolvida por outra

cisterna (B) e (C). A membrana mais interna desaparece dando origem a uma cisterna de

dupla membrana da qual brotam as vesículas (Silva et al., 1995).

10

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FIGURA 22 - Seqüência de nucleotídeos e seqüência de aminoácidos. Seqüências deduzidas a partir dos cDNAs que codificam: A, a aminopeptidase; B, o

transportador de açúcar; C, a β-glicosidase; D, a α-glicosidase 1, E, α-glicosidase 2; F, a

DpCaL 1; G, DpCaL 2; H, DpCaL 3; I, DpCaL 4 de D. peruvianus.

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I 4.15 - LOCALIZAÇÃO DAS ENZIMAS MARCADORAS QUE HIPOTETICAMENTE PARTICIPAM DO

PROCESSO SECRETÓRIO DE ENZIMAS DIGESTIVAS EM HEMIPTERA E DE UM TRANSPORTADOR

DE GLICOSE ATRAVÉS DE RT-PCR SEMIQUANTITATIVO

A fim de investigar a distribuição dos transcritos das enzimas supostamente

marcadoras e do transportador de açúcar, fêmeas do inseto D. peruvianus foram

dissecadas separando-se as regiões: intestino médio, corpo gorduroso, glândula

salivar, túbulo de Malpighi, ventrículo 1, ventrículo 2 e ventrículo 3 do intestino

médio. Após extração do RNA total destes tecidos (Figura 23), foi realizada a etapa

de transcrição reversa partir de amostras de RNA total previamente tratadas com

DNase I, utilizando-se o iniciador oligo (dT)12-18 na síntese da primeira fita. Em

seguida, foi realizada a reação em cadeia da polimerase utilizando oligonucleotídeos

117

específicos para cada seqüência de interesse selecionada. O resultado foi analisado

através da observação de bandas de DNA amplificadas pelo PCR em eletroforese

em gel de agarose. Só nos interessa respostas sim e não, isto é, se determinada

seqüência é expressa ou não em determinado tecido.

α-Glicosidase 1 é transcrita em corpo gorduroso e intestino, enquanto que a

α-glicosidase 2 foi encontrada apenas no intestino médio, mais especificamente no

ventrículo 1 (Figura 24 C e D). Como corpo gorduroso não tem membrana

perimicrovilar, a α-glicosidase 2 é que deve ser a marcadora dessa membrana. A

ausência de transcrição de α-glicosidase em V2 e V3 contrasta com o fato de que as

membranas perimicrovilares nessas regiões são mais desenvolvidas que em V1

(Silva e Terra, 1994; 1995; Silva et al., 1995; 1996). Assim, a baixa atividade de α-

glicosidase associada com as MPM em V2 e V3 (Silva e Terra, 1994; 1995; Silva et

al., 1995; 1996) deve corresponder a outra enzima ou à mesma enzima que é muito

pouco transcrita.

A seqüência de β-glicosidase foi encontrada nos três ventrículos do intestino

médio e nos túbulos de Malpighi (Figura 24 B). Como esta enzima está ligada nas

microvilosidades do intestino médio (Silva et al., 1994), este resultado mostra o que

já era esperado e sugere que as microvilosidades do túbulo de Malpighi sejam pelo

menos em parte similares às intestinais. Através de estudos morfológicos em túbulos

de Malpighi de Drosophila melanogaster foi observado membrana microvilar na

região apical nos dois tipos celulares encontrados neste tecido (Wessing e

Eichelberg, 1978; Dow e Davis, 2001). Além disso, a comparação desta seqüência

similar a β-glicosidase com as depositadas no banco de dados do Swissprot

demonstra que se trata de uma provável glicosilceramidase (Tabela 9). Já foi

descrito que glicosilceramidases hidrolisam bem o substrato sintético NPβGlu e não

têm atividade sobre celobiose (Ferreira et al., 1998). Para confirmar esta hipótese,

foi dosada atividade frente estes dois substratos no homogeneizado do intestino

médio de D. peruvianus, onde foi verificado hidrólise de NPβGlu e ausência de

hidrólise de celobiose (dado não mostrado). Isto confirma a hipótese da presença de

uma glicosilceramidase no intestino médio de D. peruvianus.

A aminopeptidase foi encontrada em todos os tecidos estudados, menos na

glândula salivar (Figura 24 A), o que não confirma, mas também não descarta a

possibilidade de ser o marcador procurado.

118

Quatro seqüências de catepsinas L foram estudadas e denominadas,

DpCaL 1, 2, 3 e 4. A DpCaL 1 foi encontrada apenas no intestino médio, mais especificamente no ventrículo 2; DpCaL 2 foi encontrada em todos os tecidos menos na glândula salivar e no ventrículo 2 e 3, DpCaL 3 nos três ventrículos do intestino médio e DpCaL 4 nos ventrículos 2 e 3 do intestino médio e

túbulos de Malpighi. De acordo com o padrão de expressão das catepsinas L transcritas nos diferentes tecidos, uma forte candidata a proteinase digestiva majoritária seria a DpCaL 1, já que esta encontra-se somente no ventrículo 2 do intestino médio, local com maior atividade específica de cisteína proteinase

dentre os três ventrículos, determinada através ensaios enzimáticos com o substrato Z-FR-MCA e quantificação de proteínas (14.500 U/mg de proteína). A DpCaL 2 apesar de não ser expressa em V2 e V3 parece ser lisossômica, já que está visível nos demais tecidos. A DpCaL 3 pode ser uma segunda cisteína

proteinase digestiva, sendo minoritária. A DpCaL 4 deve ser lisossômica pois está presente em túbulo de Malpighi apesar de não estar sendo expressa em corpo gorduroso.

O transportador de glicose, provavelmente do tipo GLUT (Tabela 8) foi

observado apenas no intestino médio, estando predominantemente no ventrículo 1 e

ventrículo 2 (Figura 24 I). Como já evidenciado por Silva e Terra (1994), V1 seria o

principal sítio de absorção de água e glicose. Provavelmente V2 pode ter uma

pequena participação em absorver a glicose remanescente que não foi

completamente absorvida em V1. O tipo de experimento realizado por Silva e Terra

(1994), assim como o descrito abaixo, não permitem confirmar ou descartar essa

possibilidade de envolvimento de V2. O sítio de transcrição desse transportador é

compatível com o seu envolvimento na absorção de glicose em V1.

119

FIGURA 23 - Eletroforese em gel de agarose 1,5% do RNA total extraído dos diferentes

órgãos de D. Peruvianus.

TM, túbulos de Malpighi; GS, glândula salivar; CG, corpo gorduroso; IM, intestino médio; V1, ventrículo 1; V2, ventrículo 2; V3, ventrículo 3. Foi aplicado o

volume de 10 µl de amostra, TM, GS, CG e IM cada um contendo 400 ng de RNA; V1,

V2 e V3 cada um contendo 500 ng de RNA. O gel foi submetido ao tratamento por brometo de etídio e a banda de RNA total visualizada em transiluminador de UV 312 nm.

TM GS CG IM V1 V2 V3

120

FIGURA 24 - Transcrição dos mRNAs correspondentes a proteínas escolhidas (Tabela 9) em vários tecidos de D. peruvianus mostrada através de RT-PCR semiquantitativo.

Quantidades iguais (5 µg) de RNA total dos diferentes tecidos foram extraídos,

tratados com DNAse e utilizados como molde para a reação RT. O produto desta reação foi

usado para amplificação em termociclador, utilizando oligonucleotídeos específicos para

cada seqüência de cDNA e para o RNA ribossomal. O produto da amplificação foi analisado

em gel de agarose 2% em TAE. As bandas amplificadas aparecem no tecido quando o

Aminopeptidase

TM GS CG IM V1 V2 V3

β-glicosidase

α-glicosidase 1

DpCaL 1

α-glicosidase 2

DpCaL 2

DpCaL 3

DpCaL 4

rRNA1

Transportador de açúcar

rRNA2

A

B

C

D

E

F

G

H

J

I

L

121

mRNA correspondente é transcrito. TM, túbulos de Malpighi; GS, glândula salivar; CG, corpo

gorduroso; IM, intestino médio; V1, ventrículo 1do intestino médio; V2, ventrículo 2; V3,

ventrículo 3; rRNA, RNA ribossomal. O número de ciclos de amplificação foi escolhido, após

diversas tentativas, para assegurar que a amplificação estivesse na fase log e resultando

numa banda amplificada clara e visível em gel.

IDENTIFICAÇÃO DE TRANSPORTADORES ENVOLVIDOS NA ABSORÇÃO DE GLICOSE E ÁGUA NA

PORÇÃO ANTERIOR DO INTESTINO MÉDIO DO DYSDERCUS PERUVIANUS

4.16 - CARACTERIZAÇÃO DO TRANSPORTE DE GLICOSE EM V1 DE D. PERUVIANUS

Processos que envolvem transporte através de membranas biológicas

representam alvos em potencial, já que envolvem a entrada de nutrientes

essenciais, sem os quais o parasita ou praga agrícola pode morrer. Transportadores

de glicose estão entre um dos mais bem estudados sistemas de transporte em

mamíferos.

O movimento de hexoses através do intestino de mamíferos é quase

exclusivamente transcelular e já se sabe que ocorre por co-transporte sódio-glicose

(SGLT) e por dois membros da família dos transportadores facilitativos, GLUT2 e

GLUT5. Os genes que codificam estes transportadores foram identificados, e as

propriedades funcionais de cada uma destas proteínas foram completamente

caracterizadas (Uldry e Thorens, 2004; Wright e Turk, 2004). O modelo clássico da

absorção de açúcar no intestino de mamíferos foi exaustivamente estudado,

predizendo a presença de dois transportadores SGLT1 e GLUT5 (expresso

transientemente) na membrana apical das células intestinais, favorecendo a entrada

de glicose e frutose e uma saída para a corrente sangüínea para os dois açúcares

por GLUT2, constitutivamente expresso na membrana basolateral das células

intestinais (Caccia et al., 2007). Pouco ou quase nada se sabe do modelo de

absorção de glicose pelas células intestinais em outros vertebrados não mamíferos e

em invertebrados.

Pouco se sabe sobre absorção de açúcar em insetos. Alguns estudos iniciais

(Treherne, 1957; Treherne, 1958; Shyamala e Bhat, 1965; Crailsheim, 1988),

sugerindo a ausência de transportadores de açúcar em intestino de insetos,

descrevem a absorção como passiva, possivelmente difusional, processo sustentado

pela extrema rapidez com que a glicose é transformada no dissacarídeo trealose. No

122

entanto, estudos moleculares e funcionais demonstraram recentemente que

transportadores facilitativos (GLUT) estão presentes em insetos de diferentes

ordens, embora a localização membranar em células que absorvem glicose tenha

sido demonstrado apenas em dois dos artigos citados (Caccia et al., 2005; Price et

al., 2007).

O grupo da pesquisadora Bárbara Giordana imunocitolocalizou com

anticorpos anti GLUT2 de camundongo transportadores do tipo GLUT2 em células

do intestino médio das larvas de 2º e 3º instar de Aphidius ervi, além de observar

inibição de absorção de glicose no intestino médio de larvas de 2º instar por

citocalasina B e por excesso de glicose e frutose (Caccia et al., 2005). Pela primeira

vez um GLUT8 de inseto, da formiga Solenopis invicta, foi clonado e caracterizado

molecularmente, estando presente transcritos deste uniportador em cérebro,

intestino médio e posterior, túbulos de Malpighi, corpo gorduroso e ovário (Chen et

al., 2006). Um cDNA com 68% de similaridade com GLUT1 de mamífero foi

seqüenciado e clonado de D. melanogaster, além disso, foi realizado estudo de

estrutura secundária e análise filogenética (Escher e Rasmuson-Lestander, 1999).

No gafanhoto Locusta migratoria foi estudado o transporte de D-galactose in vitro

utilizando regiões isoladas do trato digestivo (intestino anterior, cecos gástricos,

ventrículos, íleum e ampola retal) encubadas com uma solução fisiológica contendo

galactose e açúcar radioativo. Além disso, foi verificada a absorção de açúcar por

oócitos de X. laevis injetados com poli A+ RNA de ceco gástrico do gafanhoto

indepensente da presença de sódio, indicando a presença do transportador do tipo

GLUT, confirmando experimentos in vitro onde foi observada inibição do transporte

de glicose com adição de floretina e citocalasina B na solução fisiológica que

banhava as regiões isoladas do trato digestivo (Pascual et al., 2006). Em células Kc

de D. melanogaster foi caracterizado o transportador de glicose definido como do

tipo GLUT já que teve a absorção da glicose radioativa inibida por citocalasina B e

floretina (Wang e Wang, 1993). Foi encontrada uma seqüência similar a GLUT

através da análise de uma biblioteca de cDNAs de intestino do Hemiptera

Nilaparvata lugens. Este transportador foi expresso em vesículas da levedura Pichia

pastoris para estudo de absorção de glicose e a proteína foi detectada através de

RT-PCR e hibridização in situ apenas no intestino (Price et al., 2007)

O transporte de água em intestino de insetos nunca foi estudado em detalhe,

além de ainda não ter sido verificado transportador do tipo SGLT em insetos. Desta

123

forma, o intuito deste estudo está em contribuir para o cenário de transportadores de

glicose e água em intestino de insetos, ao mesmo tempo em que ilustra um

mecanismo absortivo através de duas membranas apicais (perimicrovilar e

microvilar).

O açúcar majoritário presente nas sementes de algodão é rafinose. Essa é

hidrolisada a uma mistura equimolecular de galactose, frutose e glicose pela ação

sucessiva de duas enzimas presentes em D. peruvianus, α-galactosidase e α-

glicosidase (Silva e Terra, 1997).

A metodologia utilizada para o estudo da absorção de glicose no primeiro

ventrículo do intestino médio envolveu a preparação de uma dieta contendo azul de

Evans (um corante não absorvível pelo intestino do inseto), glicose (substrato

transportado) e glicerol (acrescentado para resultar numa osmolaridade final de 430

Osmolar) que foi oferecida a fêmeas em jejum de D. peruvianus. Durante 20

minutos, os insetos foram forçados a sugar esta dieta, permanecendo imóveis, com

seus estiletes imersos na solução oferecida. Após diferentes intervalos de tempo,

grupos de animais foram dissecados para observação da tomada de glicose. O

sucesso do experimento dependia da observação do corante ficando cada vez mais

concentrado na medida em que ocorria a absorção de água. Além disso, a glicose

remanescente no V1 foi medida e, portanto, sabendo a concentração inicial da dieta

oferecida, a tendência seria observar uma diminuição da quantidade de glicose no

intestino. A razão glicose/azul de Evans decresce rapidamente no lúmen de V1,

assim como a água remanescente. Este comportamento confirma o resultado obtido

por Silva e Terra (1994), onde sugeriram que V1 é o principal sítio de absorção de

água e glicose. Até 40 minutos após o início do experimento a maior parte da glicose

ingerida é absorvida do conteúdo luminal de V1 juntamente com a água (Figura 25).

Nos experimentos efetuados na presença do sal K2SO4 é possível observar

um aumento da absorção de glicose e água, sugerindo co-transporte efetuado por

transportadores do tipo SGLT (Figura 25 e 26). Quando é acrescido florizina com o

K2SO4, podemos observar uma diminuição da absorção de glicose e água,

reafirmando o resultado anterior de que há um transportador do tipo SGLT em V1

(Figura 25 e 26). O Na2SO4 não interfere na absorção de glicose, mas aumenta a

demanda de água (Figura 25 e 26). O aumento da absorção de água na presença

de Na+, sem afetar o transporte de glicose, sugere a possibilidade de ser co-

transporte associado a íons. A propósito o co-transportador K+-Cl- observado na

124

membrana basal de enterócitos é capaz de transportar 500 moléculas de água por

par de íons na direção do transporte de K+ e Cl- (Zeuthen, 1991; 1994).

Na presença de floretina com K2SO4, verificamos uma alta inibição de

absorção de glicose (Figura 25 e 26), o que nos leva a concluir que provavelmente

além de transportadores do tipo SGLT, há transportadores do tipo GLUT.

A absorção de glicose e água observada na presença de florizina deve

corresponder a transportador do tipo GLUT, enquanto que na presença de floretina a

absorção de glicose e água deve ser mediada por SGLT (Figura 27). A figura 27

mostra que a contribuição do GLUT hipotético na absorção de glicose é superior a

de SGLT. A figura 27 mostra também que SGLT transporta mais água em relação a

glicose que GLUT. Esse resultado concorda com os dados obtidos para mamíferos

onde se verifica que o número de moléculas de água transportadas por glicose é de

200-260 no caso de SGLT (Loo et al., 1996) e 35, em se tratando de GLUT (Zeuthen

et al., 2007).

12

5

050100

150

200

250

300

010

2030

4050

Tem

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Glicose/corante

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25

Tem

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1520

25

Tem

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3540

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Tem

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os)

020406080100

Conteúdo relativo de água remanescente

A

B

C

D

FIG

UR

A 2

5 -

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por

V1

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126

0

50

100

150

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Controle K+, 50 mM K+, 50 mM eFlorizina 0,1

mM

K+, 50 mM eFloretina 0,2

mM

Na+, 50 mM

Abs

orçã

o re

lativ

a

Glicose Água

FIGURA 26 - Efeito da absorção de água e glicose na presença dos sais sulfato de potássio e sulfato de sódio, a partir do lúmen de V1.

Após 20 minutos absorvendo glicose e água os insetos foram dissecados para

determinação dos valores de absorção, cujos resultados foram apresentados na figura 25.

Foi estipulado 100% de absorção relativa para a absorção de glicose e água na ausência de

sais (controle). Os valores, da absorção relativa dos experimentos contendo sais e inibidor

foram obtidos através de cálculo comparativo com o experimento controle. Os dados são

médias e desvio padrão da média de 4 preparações obtidas a partir de 10 animais cada.

127

0

20

40

60

80

100

120

Controle com K+ GLUT SGLT

Abs

orçã

o re

lativ

a

Glicose Água

FIGURA 27 - Contribuição de GLUT e SGLT na absorção de água e glicose a partir do lúmen de V1 em 20 minutos.

Foi estipulado 100% para o valor da absorção de água e glicose dos insetos que

absorveram por 20 minutos solução contendo glicose e o íon potássio (ver figura 26). Os

valores de absorção relativa de açúcar e água de GLUT e SGLT foram calculados pelos

decréscimos na absorção relativa ao controle na presença de florizina e floretina,

respectivamente (Figura 26). Os dados são médias e desvio padrão da média de 4

preparações obtidas a partir de 10 animais cada.

A existência de transportadores do tipo GLUT e SGLT foi reafirmada

experimentalmente ao se observar a inibição da absorção de glicose e água por

floretina e florizina agora após 40 minutos de absorção e pelo fato de que a atividade

transportadora remanescente na presença de florizina corresponde

aproximadamente ao decréscimo observado no transporte por adição de floretina

(Figura 28).

128

0

20

40

60

80

100

120

Controle GLUT SGLT

Abs

orçã

o re

lativ

a

Glicose Água

FIGURA 28 - Contribuição de GLUT e SGLT na absorção de água e glicose a partir do lúmen de V1 em 40 minutos.

Foi estipulado 100% para o valor da absorção de água e glicose dos insetos que

absorveram por 40 minutos solução contendo glicose e o íon potássio (ver figura 26). Os

valores de absorção relativa de açúcar e água de GLUT e SGLT foram calculados pelos

decréscimos na absorção relativa ao controle na presença de florizina e floretina,

respectivamente (Figura 26). Os dados são médias e desvio padrão da média de 4

preparações obtidas a partir de 10 animais cada.

Os resultados sugerem, pois, a existência de dois tipos de transportadores:

GLUT (o mais importante) e o SGLT que devem ocorrer nas membranas

perimicrovilares. O transportador SGLT deve operar com K+ no lugar de Na+, que é

observado em mamíferos. Potássio é o íon abundante em fontes vegetais e, por isso

é o íon co-transportado com a glicose para as células intestinais nesse inseto. Esse

resultado é paralelo a absorção de aminoácidos descrita em larvas de Lepidoptera.

Nesses insetos os aminoácidos são co-transportados com K+ (mamíferos com Na+),

utilizando um transportador característico de insetos (Giordana et al., 1998). O

açúcar, uma vez no espaço perimicrovilar da célula intestinal de D. peruvianus deve

adentrar a célula através de transportador do tipo GLUT, que talvez ocorra também

129

na membrana baso-lateral de forma a permitir a saída de glicose para a hemolinfa.

Alternativamente, o último GLUT pode não existir se a glicose for usada para

sintetizar trealose na célula intestinal antes de ser transportada para a hemolinfa.

Como se recorda, trealose é o açúcar circulante dos insetos (Becker et al., 1996).

Esta é a primeira demonstração a partir de estudos fisiológicos em organismo

vivo da existência dos transportadores do tipo GLUT e SGLT intestinal em insetos.

Outros trabalhos já haviam chamado a atenção para o transportador uniportador

através de isolamento de mRNA e clonagem em oócitos seqüênciamento com

iniciadores específicos, imunoensaios, experimentos fisiológicos de regiões do trato

digestivo, mas até então nenhum grupo demonstrou a presença do co-transporte.

Provavelmente porque ao invés de utilizar o íon potássio como possível molécula co-

transportada com açúcar e água, estavam utilizando o sódio. Como verificado por

nós, o íon sódio não tem efeito algum sobre a internalização de glicose. Além disso,

as seqüências de proteínas de SGLT não são muito parecidas entre os diferentes

organismos e dessa forma fica muito difícil a confecção de iniciadores específicos

para utilização na busca de seqüências em bibliotecas de cDNA. Outro resultado

inédito foi o do transporte de água junto com a glicose tanto pelo GLUT quanto pelo

SGLT, já observado amplamente em mamíferos, mas ignorado em insetos.

4.17 - ANÁLISE DA SEQÜÊNCIA PARCIAL DO SUPOSTO TRANSPORTADOR DE AÇÚCAR DO

TIPO FACILITADOR, GLUT DO INTESTINO MÉDIO DE D. PERUVIANUS

Um singleto similar a um transportador de açúcar facilitativo foi identificado na

biblioteca de intestino médio de D. peruvianus através de um seqüênciamento ao

acaso (DpGLUT) (Tabela 6). A seqüência foi verificada e primers específicos foram

desenhados com o propósito de aumentar a seqüência e de confirmar o resultado de

identidade. Além disso, foi realizado estudo de localização tecidual através de RT-

PCR semiquantitativo (Figura 24), onde foi extraído RNA de diversos tecidos do

inseto com o propósito de analisar se este transportador do tipo GLUT estaria

envolvido com transporte de açúcar no intestino médio. Como mostrado

anteriormente, foram detectados transcritos nos ventrículos 1 e 2 do intestino médio

e não detectados em túbulos de Malpighi, confirmando a provável função de

transportador de glicose e água no intestino médio do D. peruvianus.

Após diversas tentativas de aumentar a seqüência de cDNA encontrada no

transcriptoma, através de PCR utilizando primers específicos e a biblioteca de

130

cDNAs de intestino médio de D. peruvianus como molde, foi conseguido uma

seqüência com 1182 nucleotídeos que codificam uma provável proteína de 394

aminoácidos (Figura 29). De acordo com outros GLUTs detectados em outros

insetos estariam faltando de 100-200 aminoácidos para completar a seqüência

(Chen et al., 2006, Price et al., 2007).

DpGLUT apresenta algumas características de membros da superfamília de

transportadores facilitativos de açúcar (InterPro IPR003663, IPR005828, IPR005829)

incluindo 10 regiões transmembrânicas preditas pelo programa TMHMM 2.0

(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/), assinaturas específicas deste tipo de

proteína (IIGINCGLNAGLAPLYINEVSPTKIR, SVWLVEKFGRKPLLLVA) de acordo

com o programa NPS@PROSCAN (http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-

bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_server.html) (Combet et al., 2000) além de

7 sítios de glicosilação de acordo com o programa NetGlycate 1.0

(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetGlycate/) (Johansen et al., 2006) (Figura 29).

131

catcaggcagaggacgagacagaacgcaggatcacagattacggcaaccttcatccttgct 61

I R Q R T R Q N A G S Q I T A T F I L A 20

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T P E E V I K G W M S A E L D T P S T S 60

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N V F A F I A A I I M G I T R T T E V P 120

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A P L Y I N E V S P T K I R G A M G S L 160

taccaacttaatattacaatagccattcttatagcccagctacttggaactagtacagct 541

Y Q L N I T I A I L I A Q L L G T S T A 180

cttggtaccgaaacactgtggccacttctcatgggactcattggaatcgttggtttcctc 601

L G T E T L W P L L M G L I G I V G F L 200

caactagtcgggtttttcttctgcccagaaagtccaaaatatatattggagaaaaaaaat 661

Q L V G F F F C P E S P K Y I L E K K N 220

gacgaacaaggaacaaaaatggttttagacaggctagtaggaagtaattcacaccaacag 721

D E Q G T K M V L D R L V G S N S H Q Q 240

tttatagaattgaaaaaagatatagaagatgcacaaagtctcccgaaagttactttaagc 781

F I E L K K D I E D A Q S L P K V T L S 260

caaatggtacgacaaaaaaaactgagaactcctcttattataatcggtgtattgatggcg 841

Q M V R Q K K L R T P L I I I G V L M A 280

TM2

TM3

TM4

TM5

TM6

TM7

TM1

132

gcacaacagctttctggtgtaaacgctgtaattttctattcaacagaaatttttaaaatg 901

A Q Q L S G V N A V I F Y S T E I F K M 300

ggaaagctcagtgatgaagcagctcaatacgcaactgtaggtgtaggagtaatcaatgta 961

G K L S D E A A Q Y A T V G V G V I N V 320

ctgacgaccattgtttcagtgtggcttgttgaaaaatttgggaggaaaccacttctactg 1021

L T T I V S V W L V E K F G R K P L L L 340

gttgcttttggtggattgactatctgcatgacaatactttttatctgtctttattttgtc 1081

V A F G G L T I C M T I L F I C L Y F V 360

gaaacaagcccttttgcaaagtatttatcaattgtcatcgtatttgtttacttggtcttt 1141

E T S P F A K Y L S I V I V F V Y L V F 380

tttgccattggagcgggttcgattccatggctcctaaatcactag 1186

F A I G A G S I P W L L N H 394

FIGURA 29 - Seqüência de aminoácidos e nucleotídeos de cDNA de um provável transportador de açúcar do tipo GLUT de intestino médio de D. peruvianus (DpGLUT).

Aminoácidos correspondentes a prováveis regiões transmembrânicas, preditas por

TMHMM estão sublinhadas (TM 1-10); resíduos de lisina glicosiladas preditas por

NetGlycate estão realçadas em cinza; assinatura característica de transportadores de

açúcar preditas por NPS@PROSCAN estão realçadas em amarelo; peptídeo sinal predito

por SignalP (Nielsen et al., 1997) está realçado em verde e códon de parada em negrito.

TM8

TM9

TM10

133

4.18 - CLASSES E SUBCLASSES DA FAMÍLIA DOS TRANSPORTADORES FACILITATIVOS DE

GLICOSE GLUT

Em mamíferos, quatorze membros da família de transportadores facilitativos

de glicose (GLUT) foram identificados (GLUT1-14) (Scheepers et al., 2004) e todos

apresentam as seguintes assinaturas características: (1) a presença de doze hélices

que atravessam a membrana plasmática com a região N-terminal direcionada para o

interior celular assim com as alças 2, 4, 6, 8 e 10 sendo as alças 1, 3, 5, 7, 9 e 11

direcionadas para o meio extracelular; (2) sete resíduos de glicina conservados nas

hélices 1, 2, 4, 5, 7, 8 e 10; (3) vários aminoácidos ácidos e básicos na superfície

intracelular das proteínas; (4) dois resíduos de triptofano conservados nas hélices 6

e 11; (5) dois resíduos de tirosina nas hélices 4 e 7 (Joost e Thorens, 2001; Wood e

Trayhurn, 2003; Scheepers et al., 2004).

Baseado em homologia de seqüências e elementos característicos, a família

GLUT pode ser dividida em três classes, denominadas classe 1, 2 e 3 (Joost e

Thorens, 2001; Wood e Trayhurn, 2003; Scheepers et al., 2004).

A classe 1 dos transportadores facilitativos de glicose compreende as

isoformas GLUT1-4 e GLUT14, as quais se distinguem majoritariamente por sua

distribuição tecidual, afinidade por glicose e regulação hormonal. GLUT1 exibe altos

níveis de expressão em eritrócitos, em células endoteliais do cérebro e é

responsável pelo suprimento básico de glicose em células (Mueckler et al., 1985).

GLUT2 é um transportador com baixa afinidade por glicose com predominante

expressão em células pancreáticas, fígado e rim (Fukumoto, et al., 1988). Em todos

estes tecidos, a absorção de glicose não é dependente do número e da atividade

dos transportadores de glicose, mas da concentração de glicose no sangue (Gould e

Holman, 1993). Desta forma, atividade de transporte de GLUT2 não pode ser

saturada por concentração fisiológica de glicose no sangue. Além de glicose, GLUT2

pode transportar frutose e com grande afinidade glicosamina (Wood e Trayhurn,

2003). GLUT3 é um transportador com alta afinidade por glicose com expressão

predominante em tecidos com grande necessidade de glicose como o cérebro

(Uldry, et al., 2002). GLUT4 é um transportador com alta afinidade por glicose

expresso em tecidos insulino-sensíveis (coração, músculo esquelético e tecido

adiposo) (Fukumoto, et al., 1989). Insulina estimula a translocação do GLUT4 de

membranas intracelulares para a membrana plasmática, resultando em um aumento

imediato de 10-20 vezes o transporte de glicose (Simpson e Cushman, 1986;

134

Sheperd e Kahn, 1999; Bryant et al., 2002). GLUT14 parece representar uma

duplicação do gene SLC2A3 (que codifica GLUT3) sendo a sua seqüência de

aminoácidos 95% idêntica a de GLUT3 (Wu e Freeze, 2002).

A classe 2 inclui o transportador específico de frutose, o GLUT5, além dos

GLUTs 7, 9 e 11. O mRNA de GLUT5 é predominantemente expresso em intestino,

testículos e rim (Kayano et al., 1990). GLUT5 não transporta glicose e é responsável

pela absorção de frutose nos tecidos mencionados acima. GLUT7 é um

transportador com alta afinidade em transportar glicose e frutose e pode ser

detectado em intestino, cólon, testículos sendo predominantemente expresso em

membranas microvilares de enterócitos (Li et al., 2004). GLUT9 exibe altos níveis de

expressão em rim e fígado e baixos níveis de mRNA em intestino, placenta, pulmão

e leucócitos (Phay et al., 2000). Em GLUT11 o transporte de glicose pode ser inibido

por frutose, desta forma, sugere-se que GLUT11 transporta frutose com baixa

afinidade por glicose (Doege et al., 2001) Ele é expresso predominantemente em

pâncreas, rim e placenta e possui moderada expressão em coração e músculo

esquelético.

A classe 3 compreende as isoformas GLUT6, GLUT8, GLUT10, GLUT12 e

HMIT (GLUT13). Em contraste com as classes 1 e 2, todos os membros desta

classe são caracterizados por possuírem a alça número 1 mais curta com ausência

do motivo de glicosilação na porção extracelular e presença da alça número 9 maior

contendo um sítio de glicosilação (Joost e Thorens, 2001). Como os transportadores

de açúcar da classe 3 apresentam alta homologia com diferentes transportadores de

bactérias, levedura e D. melanogaster, especula-se que evoluíram antes das classes

1 e 2, esta última deve refletir um ajuste evolutivo para necessidades adicionais de

homeostase de glicose em mamíferos (Joost e Thorens, 2001). Os transportador

com baixa afinidade por glicose, o GLUT6 é predominantemente expresso em

cérebro, baço e leucócitos (Doege et al., 2001). GLUT8 possui alta afinidade por

glicose podendo este transporte ser inibido D-frutose e D-galactose, o que faz deste

transportador multifuncional (Ibberson et al., 2000). É expresso predominantemente

em testículos e pouca quantidade foi observada em tecidos sensíveis a insulina

como coração e músculo esquelético. GLUT10 é encontrado em fígado e pâncreas

(McVie-Wylie et al., 2001). GLUT12 é observado em coração e próstata (Macheda et

al., 2002). O transportador mio-inositol HMIT é expresso em cérebro, transporta mio-

inosital e esterioisômeros, mas não transporta açúcar (Uldry et al., 2001).

135

Com intuito de classificar a DpGLUT de D. peruvianus dentro destas três

classes de transportadores de glicose, foi feita uma árvore filogenética contendo

além das seqüências de GLUTs de humanos, uma seqüência de GLUT de D.

melanogaster (DmHT1), uma da formiga S. invicta, cuja seqüência já foi

caracterizada como uma GLUT8 (Chen et al., 2006) e uma seqüência do hemíptera

N. lugens (NIHT1) (Price et al., 2007) (Figura 30). A árvore, construída através do

programa Mega 3.1, se divide em dois ramos polifiléticos, um contendo as classes 1

e 2 separadamente e um outro ramo contendo a classe 3 (Boodstrap 100) (Figura

30). Através da análise da seqüência de DpGLUT contra o banco de dados do

Swissprot utilizando o BlastX, foi observado uma identidade de 40% com GLUT1 de

porco (Tabela 9). Ao construir está árvore filogenética esta característica ficou mais

evidente, já que o DpGLUT foi posicionado próximo aos GLUTs humanos

pertencentes à classe 1 da família dos transportadores facilitativos de glicose

juntamente com o DmHT1 de D. melanogaster.

De acordo com as características comuns entre os GLUTs e baseado no

modelo proposto por Joost e Thorens (2001), foi desenhado um modelo

esquemático do DpGLUT com suas 10 regiões transmembrânicas (Figura 31). Como

a seqüência não está completa a análise foi feita até a décima hélice. Além dos

resíduos conservados entre os membros da família GLUT, podemos observar

resíduos típicos e específicos de GLUTs da classe 1.

136

FIGURA 30 - Cladograma de seqüências de transportadores de glicose do tipo facilitativo de humano e de insetos depositadas no GenBank As ramificações foram estatisticamente calculadas através do programa Mega 3.1

(Kumar et al., 2004) com análise de Bootstrap (corte de 50). HUMANGLUT1, (P11166);

HUMANGLUT2, (NP000331); HUMANGLUT3, (NP008862); HUMANGLUT4, (NP001033);

HUMANGLUT5, (NP003030); HUMANGLUT6, (NP060055); HUMANGLUT7, (NP997303);

HUMANGLUT8, (NP055395); HUMANGLUT9, (NP001001290); HUMANGLUT10,

(NP110404); HUMANGLUT11, (AAI00809); HUMANGLUT12, (NP660159); S. invicta

GLUT8, (AAX92638) (Solenopsis invicta); N. luguens NlHT1, (ABM01870) (Nilaparvata

lugens); D. peruvianus DpGLUT (Dysdercus peruvianus); D. melanogaster DmHT1, (Q8IRI6)

(Drosophila melanogaster).

Classe 1

Classe 2

Classe 3

HUMANGLUT3 HUMANGLUT14 HUMANGLUT1 HUMANGLUT4 HUMANGLUT2 D. peruvianus DpGLUT D. melanogaster DmHT1 HUMANGLUT5 HUMANGLUT7 HUMANGLUT9 HUMANGLUT11 HUMANGLUT12 HUMANGLUT10 HUMANHMIT HUMANGLUT8 HUMANGLUT6 S.invicta GLUT8 N.lugens NlHT1

99

100

99

100

99

99

100

99

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90

81

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7

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GG

138

5 - CONCLUSÕES

! A maior atividade especifica de cisteína proteinase encontra-se no conteúdo

luminal de V2 e, portanto esta foi a região escolhida para purificação desta

enzima.

! Duas cisteínas proteinases foram purificadas de V2, denominadas cis 1 (32

kDa) e cis 2 (45 kDa). Elas possuem o mesmo pH ótimo igual a 6,3, são

inativadas a 40 ºC com meia vida de 5 minutos para cis 1 e 4,8 minutos para

cis 2. A constante de dissociação (KD) enzima-E-64 foi de 17,3 nM para cis 1

e 7,1 nM para cis 2. O Z-FR-MCA constitui o melhor substrato para ambas cis

1 e cis 2 quando comparado com a porcentagem de eficiência do Z-RR-MCA,

demonstrando que possivelmente as cisteína proteinases aqui estudadas são

do tipo catepsinas L.

! A catepsina L seqüenciada de D. peruvianus (DpCaL1) consiste de 927

nucleotídeos que codifica uma proteína de 309 aminoácidos.

! Através de estudo de filogenia foi observado que catepsinas L digestivas de

Hemiptera são similares as lisossomais de T. molitor, enquanto as de

Coleoptera são similares as digestivas de T. molitor.

! Através de um levantamento do transcriptoma do intestino médio do

Hemiptera, Dysdercus peruvianus, utilizando seqüênciamento de ESTs foram

encontrados catepsina L e F, lipase, β e α-glicosidase, α-amilase, serino

proteinase, aspartil proteinase, oligopeptidase, e aminopeptidase além de

transportadores envolvidos com a internalização de glicose e aminoácidos

provenientes do alimento digerido: transportador de monocarboxilato,

transportadores de cátions, transportador de metal divalente, simportador

sódio/soluto, permease de aminoácido, proteína transportadora de íon, canais

iônicos de sódio, potássio e cálcio, V-ATPases, transportador de açúcar.

! RT-PCR semiquantitativo mostrou que a seqüência relacionada com α-

glicosidase 2 provavelmente é da enzima marcadora de membrana

perimicrovilar; a seqüência de β-glicosidase pode ser da enzima marcadora

de membrana microvilar; a aminopeptidase tem possibilidade de ser o

marcador de espaço perimicrovilar; DpCaL 1 é uma forte candidata a

proteinase digestiva majoritária; DpCaL 2 parece ser lisossômica, DpCaL 3

pode ser uma segunda cisteína proteinase digestiva; DpCaL 4 deve ser

139

lisossômica; O transportador de glicose do tipo GLUT deve participar da

absorção de água e glicose na porção anterior do intestino médio de D.

peruvianus.

! Foi realizada identificação de transportadores envolvidos na absorção de

glicose e água na porção anterior do intestino médio do D. peruvianus através

de experimentos de fisiologia in vivo onde foi confirmada a existência de

transportadores do tipo GLUT e SGLT.

! Alongado EST correspondendo a suposto transportador de açúcar do tipo

facilitador, GLUT do intestino médio de D. peruvianus, foi obtida uma

seqüência denominada DpGLUT com 39% de identidade com GLUT 1 de

humano, contendo 1182 nucleotídeos que codificam uma provável proteína

de 394 aminoácidos. O DpGLUT apresenta 10 regiões transmembrânicas e 7

sítios de glicosilação.

140

6 - BIBLIOGRAFIA

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7- SÚMULA CURRICULAR

7.1- DADOS PESSOAIS

Nome: Thaís Duarte Bifano

Local e data de nascimento: Campos dos Goytacazes/RJ, 21 de julho de 1978.

7.2- EDUCAÇÃO

Colégio, local, ano: Liceu de Humanidades de Campos, Campos dos

Goytacazes/RJ, 1995.

Universidade, local, ano: Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro

(UENF), Campos dos Goytacazes/RJ, 2001.

Graduação (Modalidade): Ciências Biológicas (Bacharelado)

Universidade, local, ano: Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro

(UENF), Campos dos Goytacazes/RJ, 2004.

Mestrado em Biociências e Biotecnologia

7.3- FORMAÇÃO COMPLEMENTAR

2001 - 2001 Curso de curta duração em Curso de curta duração em

Biossegurança. Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy

Ribeiro, UENF, Campos dos Goytacazes/RJ, Brasil.

7.4- OCUPAÇÃO

2004 - 2008 Bolsista de Doutorado pela FAPESP

2002 - 2004 Bolsista de Mestrado pela FENORTE

1998 - 2002 Bolsista de Iniciação Científica pela FAPERJ

7.5- PUBLICAÇÕES

7.5.1- ARTIGOS COMPLETOS

1. BIFANO, T. D., SILVA, C. P., ISEJIMA E.M., XAVIER FILHO, J., SÁ, M. F.

G., DAMATTA R.A, TERRA, W. R., MIGUENS, F. C. Digestion of legume starch

granules by larvae of Zabrotes subfasciatus (Coleoptera: Bruchidae) and the

induction of alpha-amylases in response to different diets. Insect Biochem. Molec.

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2. BIFANO, T. D., SILVA, C. P., TERRA, W. R., SÁ, M. F. G., ISEJIMA E.M.,

165

SAMUELS, R.I., ALMEIDA, J. S. Induction of digestive alpha-amylases in larvae of

Zabrotes subfasciatus (Coleoptera: Bruchidae) in response to ingestion of common

bean alphaamylase inhibitor 1. Journal of Insect Physiology. , v.47, p.1283 - 1290,

2001.

7.5.2- RESUMOS EM CONGRESSOS

1. BIFANO, T. D., TERRA, W. R.

Identification of transporters involved in glucose and water absoption in the

Dysdercus peruvianus anterior midgut. XXXVII Reunião Anual da Sociedade

Brasileira de Bioquímica e Biologia Molecular, 2008, Águas de Lindóia/SP.

2. BIFANO, T. D., TERRA W.R

Two digestive cysteine proteinases from Dysdercus peruvianus 32º FEBS Congress,

2007, Vienna, Austria.

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Bean lectin (PHA) as inductor of alpha-amylases in larval Zabrotes subfasciatus

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Lectina de feijão (PHA) como indutor de alpha-amilases digestivas em larvas de

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Estudo da indução de alfa-amilases digestivas em larvas do caruncho praga de

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Induction of alfa-amylases in larvae of the bruchid beetle Zabrotes subfasciatus in

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