Producción en laboratorio de microorganismos efectivos de montaña (MM), para su uso en la...

Producción en laboratorio de microorganismos efectivos de montaña (MM), para su uso en la degradación acelerada de residuos orgánicos de cosecha en finca

Marco A. Córdoba1; Oscar Quirós2; Harold Víquez3

Palabras clave: microorganismos efectivos, microorganismos de montaña, materia orgánica, Lactobacillus sp., descomposición, hongos, bacterias ácido-lácticasKey words: effective microorganisms, mountain microorganisms, organic matter, Lactobacillus sp. Decomposition, fungus, acid-lactic bacteria. Abreviaciones: microorganismos efectivos (EM), microorganismos de montaña (MM), Instituto Tecnológico de Costa Rica (ITCR)

RESUMENSe realizó un aislamiento de microorganismos a partir de residuos de hojarasca de montaña, con material vegetal colectado en sotobosque en la finca de Flores y Follajes del Caribe S.A, en el cantón de Guácimo, provincia de Limón, Costa Rica. Los microorganismos de montaña (MM), fueron capturados a partir de un sustrato compuesto por melaza, agua destilada, semolina de arroz. En este medio se colocó unos 100 gramos de hojarasca, la cual fue macerada y mezclada en forma homogénea. Al cabo de una semana, se observó la proliferación de micelio de hongos y se procedió a tomar un gramo de sustrato sólido, él cual se suspendió en agua estéril para luego por medio de dilución seriada realizar un cultivo. De igual forma se obtuvó a partir de suero lácteo, cultivos de Lactobacillus sp., del cuál se tomó un volumen de: 200 cc. para adicionar al sustrato con 1500 gramos de semolina de arroz, 200 cc de melaza y 1000 gramos de arroz cocinado, además de 1 litro de agua destilada; todo se mezcló y se colocó dentro de un recipiente cerrado tipo bioreactor casero, en el cual se dejó para que se produjera la fermentación sólida durante un período de 3 semanas. Mediante cultivos selectivos, se comprobó la presencia de hongos, levaduras y bacterias ácido-lácticas. Se concluye la necesidad de continuar la investigación en lo referente a formulación de un sustrato o vehículo mediante el cual los microorganismos se puedan utilizar e incorporar al suelo para su uso en el manejo de desechos orgánicos vegetales, o en desechos de estiércol en producción pecuaria, incrementando la tasa de descomposición y mineralización de la materia orgánica y su incorporación al suelo.

Se considera imprescindible la identificación y caracterización de los microorganismos aislados, con el propósito de poder escalar la producción y desarrollar productos biotecnológicos de interés comercial.

ABSTRACTAn isolation of microorganisms was done

from mountain trash leaves collected in the understory from Flores y Follajes del Caribe S.A., located in Guácimo, Limón province, Costa Rica. The mountain microorganisms (MM), were captured in organic substrate composed by molasses (sugar syrup), distilled water, and rice bran. In this substrate, 100 g. of macerated litter was placed which was mixed homogenously. A week later, the mycelia of fungus was observed, and 1 gram of substrate was taken and mixed in sterile distilled water, the microbiological method of serial dilution was applied to isolate the microorganisms. Lactobacillus sp. was isolated from whey; 200cc of whey were mixed together with 200 cc. molasses, 1000 g. of cooked rice, and 1 liter of distilled water. All these ingredients were mixed and placed in a plastic tank used as a homemade bioreactor. In this bioreactor, there was solid fermentation produced during 3 weeks. Using selective culture media, the presence of fungus, acid-lactic bacteria and yeasts was shown. It is concluded the importance to do more research in aspects related to formulation, appropriate substrate and vehicle to apply the MM for the management of organic waste from vegetables or from cattle manure to the increase rate of decomposition and mineralization to incorporate it to the soils.


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INTRODUCCION

El empleo y la aplicación de compostaje orgánico y fertilizantes biológicos en la agricultura es una de las alternativas de mayor seguridad para obtener rendimientos con bajo uso de agroquímicos ( Reganold and Parr y Litterick, 1999 citados por: (Ryang et al. 2003).

El significado de EM corresponde a una abreviación del término: Microorganismos Eficaces o Microorganismos Eficientes, los cuales no son más que un cultivo mixto de microorganismos habitantes del suelo rico en materia orgánica encontrados en forma natural y sin manipulación genética en ecosistemas naturales. Son productos de la naturaleza capaces de degradar malos olores causados por hongos y bacterias, controlar agentes patógenos y focos de enfermedades como las moscas y en general paa mantener ambientes regulados y sanos (Ecotecnología, 2012). Tienen la facultad de regenerar el equilibrio microbiano del suelo, mejora sus condiciones físico-químicas, incrementa la producción de cultivos y su protección pues consume exudados de raíces, hojas, flores y frutos que favorece a los patógenos en el desarrollo de enfermedades, incrementa la posibilidad de supervivencia de plántulas, tiene acción en la actividad meristemática de las plantas (Aprolab 2007).

La tecnología del EM, fue desarrollada por el Dr. Teruo Higa, de la Universidad de Ryukyus en Okinawa, Japón en la década de los años ochentas, como una opción viable y sostenible para la producción agrícola y animal dentro de los parámetros orgánicos y biológicos, para no afectar el medio ambiente, así como para lograr productos de alta calidad con bajo costo.

Su composición a base de bacterias ácido lácticas, levaduras y la combinación de estos ayudan a restaurar el equilibrio natural en los agro-ecosistemas y además actúan como complemento biológico (Emprotec 2012). Los EM, constituyen a una mezcla de tres grupos básicos los cuales son:

A. Bacterias fototrópicas (Rhodopseudomonas spp.), son autótrofos y metabolizan materia orgánica..

B. Bacterias acido lácticas (Lactobacillus spp.).Suprime microrganismos dañinos y ayuda a la descomposición de materiales como la lignina y la celulosa fermentándolos; además reducen las poblaciones de nemátodos y controla la propagación y dispersión de Fusarium y gracias a ello induce un mejor ambiente para el crecimiento de los cultivos.

C. Levaduras (Saccharomycetes spp.)Sintetizan sustancias antimicrobiales

1 Autor para correspondencia. Universidad Estatal a Distancia (UNED) Correo

electrónico: [email protected]

2COOPELESCA R.L. Ciudad Quesada, San Carlos, Alajuela, Costa Rica, Correo electronic: email: [email protected]

FUNDECOR . Sarapiquí, Heredia. Costa Rica. Correo Electrónico: email: [email protected]

mailto:[email protected]



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Al aumentar los niveles en el suelo de Microorganismos Eficientes (EM), se estimula que la microflora del suelo se incremente su actividad metabólica y poblacional y por ello el suelo desarrolle un sistema microbial bien balanceado. En este proceso los microorganismos específicos (especialmente los causantes de enfermedades en cultivos como: Fusarium sp. y Phytium sp. son suprimidos, a su vez reduciendo especies microbiales del suelo que causan enfermedades (Aprolab 2007).

Los EM son ampliamente utilizados a nivel industrial y a nivel doméstico; su aplicación es variada desde la agricultura hasta el uso doméstico en el manejo de desechos orgánicos e incluso en sanitización de tanques sépticos.

El empleo de melaza es útil para el crecimiento de microorganismos, según Ariza y González (1997) citadas por Fajardo y Sarmiento ( 2007); el empleo de la melaza permitió el crecimiento de levaduras, hongos y bacterias y resultó útil para microorganismos mesófilos.

La función de la semolina de arroz es para servir como fuente proveedora de calorías disponibles para los microorganismos y aporta P, K, Ca y Mg; la semolina favorece la fermentación y puede ser reemplazada por afrecho o harinas ( CNAOH, sf).

Según la literatura, el Lactobacillus sp. acelera la descomposición de la materia orgánica pues degrada la celulosa y la lignina, además de que confiere una acción supresora en hongos fitopatógenos como: Fusarium sp. (PyMERURAL et. al. 2011).

MATERIALES Y MÉTODOS

Se recolectó hojarasca de residuos de bosque secundario y terciario en áreas en las cuáles no se ha practicado ningún tipo de actividad agrícola en la finca de la empresa Flores y Follajes del Caribe S.A. , ubicada en La Perla de Guácimo de Limón, aproximadamente a 110 msnm, en la zona de vida BMhT. La hojarasca se mantuvo durante 4 días en una bolsa de plástico con alta humedad.

. Fig. 1 Hojarasca colectada del mantillo ubicado en el

sotobosque, de la finca de Flores y Follajes del Caribe S.A., Guácimo, Limón, Costa Rica.








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Posteriormente en laboratorio se pesó 1500 gramos de semolina de arroz, la cual se utilizó como sustrato y se mezcló partícula que contenía el inóculo de hongos y bacterias colectadas en la hojarasca (figura 1), dicha hojarasca fue macerada con el objetivo de reducir su tamaño, aumentando así el área superficial de la partícula inoculada con hongos y bacterias.

Se adicionó: 174 ml. de melaza y 1655 ml. de agua destilada; todo se mezcló en conjunto para promover el crecimiento bacteriano y fúngico colectado en la muestra de campo. La mezcla se colocó en forma extendida en un recipiente de plástico con su respectiva tapa para mantener separado la mezcla del ambiente externo. (Figura 3).

Fig.2.Materiales usados para el crecimiento de microorganismos (Semolina de arroz, Melaza y agua destilada.

Se empleó como base la metodología descrita por: PymeRURAL y PRONAGRO (2011). Dicha metodología se desarrolló para la captura de microorganismos de montaña (MM), para la producción de un quintal de sustrato. Los componentes empleados como fuentes de carbono, nitrógeno, fósforo y agua, se ilustran en la figura 2. En el cuadro 1 se detalla la composición de las fuentes empleadas en esta etapa del experimento.

Fig. 3. Trampa de semolina empleada en la captura de MM.

Cuadro 1 Componentes utilizados para la captura de microorganismos descomponedores de materia orgánica, mezclados en 100 g. de hojarasca.

Componente Cantidad por 100g. de hojarasca

Composición química

Semolina de arroz

1500 g. ND

Melaza 174 ml Sacarosa 60 % 63% p/pAzúcares reductores 3-5 %p/pOtros azúcares (4-8 %p/p) *

Agua destilada 1655 ml H2O(*) Fajardo C.,E.;Sarmiento F.,S. 2007.








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El material al cabo de 8 días fue removido de la bandeja plástica y se le adicionó un kilo de arroz humedecido, se adicionaron 200 cc de melaza al que se le adicionó 200 cc de suero de leche conteniendo Lactobacillus sp., además se adicionó 1 litro de agua destilada . Para la obtención de Lactobacillus sp. se utilizó suero de leche de vaca cruda (sin pasterurización) y también se mezclo con un extracto de agua de arroz, obtenida a partir del remojamiento de granos de arroz durante 8 horas y luego de permanecer en reposo durante 24 horas. Siguiendo la metodología descrita por: PymeRural y Pronagro (2011). Todo este material fue homogenizado en forma manual y colocado en un recipiente plástico para promover la fermentación del conjunto de levaduras, Lactobacillus y hongos. La fermentación sólida se realizo en un recipiente plástico o tanque de fermentación fue conectado mediante una tubería plástica de 3/8 de pulgada, a un envase plástico de 1 galón de capacidad, el cual contenía agua y que sirve como trampa para capturar el CO2 (figura 4), que se produce por acción metabólica de los microorganismos efectivos, se ilustra en la figura 3, el sistema descrito.

Fig. 3 Biorreactor artesanal usado en las pruebas

Este sistema o bioreactor artesanal permaneció a la sombra durante 3 semanas para que se de un crecimiento de los microorganismos efectivos se reproduzcan.

Se realizó un aislamiento o cultivo en placa a partir de una suspensión de semolina de arroz conteniendo microorganismos capturados a partir de las hojas maceradas y colectadas de campo. Mediante la técnica de dilución seriada, se procedió a inocular en el medio de cultivo 0,1 ml de la suspensión acuosa de microorganismos capturados en semolina de arroz, las concentraciones utilizadas fueron de: 1 x 10 -4 y 1 x 10-5 UFC/ml., ambas alícuotas se colocaron en el medio de PDA (Difco®) y pH de 5,5. en este medio se adicionó un mililitro de solución de la suspensión que contenía microorganismos, obtenidos a partir de la trampa de arroz (figura 3), luego de 2 semanas de estar en








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reposo y una vez que se evidenció la formación de colonias de hongos en la superficie de la trampa.

Al cabo de 3 días de mantener las placas Petri en condiciones de temperatura ambiente se formaron colonias de hongos y bacterias. Con base en estas colonias se procedió a hacer un cultivo puro de cada una, para lo cual se preparó dos medios uno un PDA acidificado con pH 4,5, se empleó para acidificar ácido cítrico y ascórbico obtenidos a partir de jugo de limón ( Citrus sp.). En este medio se colocaron secciones de hifas de las colonias de hongos que se identificaron creciendo en el aislamiento. En el caso de las bacterias fueron aisladas en un medio: PDA + peptona 8 g/l y el pH se ajustó a 8,5

con el objetivo de realizar cultivos puros. Las placas fueron mantenidas a temperatura ambiente y con humedad relativa fluctuante pues se carecía de una incubadora microbiológica.

El objetivo de éste aislamiento fue obtener las cepas de los microorganismos para realizar los cultivos puros, caracterizarlos y proceder a su identificación en laboratorio.

RESULTADOS Y DISCUSION

Se logró aislar microorganismos de montaña, y a partir de éstos se logró producir un sustrato enriquecido con cepas de microorganismos conformados por: bacterias ácido lácticas, levaduras y otros hongos filamentosos. Se estima que la producción de microorganismos eficaces como lo indica la literatura es una fuente apropiada de materia orgánica para los sistemas agrícolas y dar a estos un aprovechamiento de los recursos propios de la finca.

Se evidencia que la fuente básica para la obtención de microorganismos efectivos es el uso de materia vegetal en proceso de descomposición o residuos de arbustos parcialmente descompuestos que presentaban evidencia de micelios de color blanco. El cultivo o captura de los microorganismos mediante la trampa de semolina de arroz enriquecida con melaza, permitió que los hongos presentes en la hojarasca recolectada colonizara el sustrato, el cual era rico en carbohidratos (semolina y melaza de caña de azúcar). La identificación y aislamiento de








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los hongos capturados permite generar alternativas para poder desarrollar otras formulaciones más específicas para lograr la hidrólisis de la celulosa y la lignina, con el objetivo de poder incorporar más rápidamente la materia orgánica al sistema. Para efectos de esta investigación los factores como: infraestructura y conocimiento de los agentes descomponedores específicos fueron aspectos limitantes para poder tener claridad en los organismos aislados.

Sin embargo, si se logró el objetivo de producción de EM a nivel artesanal, escalando la producción de la captura en un bioreactor sencillo tanque de fermentación (ver figura 3), en el cual se enriqueció, con arroz cocinado, agua destilada, melaza y la adición de bacterias ácido lácticas obtenidas a partir del suero obtenido a partir de leche cruda y que se mantuvo en un sistema anaeróbico durante 3 semanas.

Se comprobó la presencia de Lactobacillus sp., mediante un cultivo selectivo de PDA (Difco®) enriquecido con Peptona hidrolizada (Meron®) y ajustando el pH a 8,0. La figura 4, ilustra el crecimiento de estos microorganismos en el medio utilizado.

Fig. 4 Cultivo de Lactobacillus sp., aislado a partir de suero de leche de vaca cruda sin pasteurizar.

Fig. 5 Cepas de hongos creciendo en un medio PDA concentración de alícuota 1 x 10-5 .

La Figura 5, ilustra la captura de hongos que se obtuvo a partir de la trampa de captura de MM, en una concentración de 1 x 10-5 UFC/ml, el cual fue cultivado en un medio general, papa-dextrosa-agar, (PDA) (Difco®)








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Fig. 6 Cepas de hongos creciendo en un medio PDA acidificado obtenido a partir de las colonias de la

figura 1.

En los medios selectivos como PDA acidificado, se cultivaron hongos para su aislamiento como los ilustrados en las figuras: 5,6,7 y 8.

Fig. 7 Cepas de hongos creciendo en un medio PDAacidificado aislados a partir de las colonias del aislamiento logrado en la dilución serial 1 x

10-5.

Fig. 8 Cepas de hongos creciendo en un medio PDA acidificado obtenido a partir de las colonias de la

figura 1.

El caso de la única bacteria identificada fue aislada en un medio de agar enriquecido con peptona, con la cual se produjeron rayados de placa como la ilustrada en la figura 9-a y 9-b. A la fecha de esta publicación los aislamientos fueron enviados al Centro de Investigaciones Agronómicas de la Universidad de Costa Rica para su cultivo, aislamiento e identificación.

Fig 9-.a Medio de PDA con crecimiento de bacteria








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Fig. 9-b Medio de PDA con crecimiento de bacteria aislada en cultivo puro a partir del crecimiento observado en la placa de la figura 5

Con éste producto obtenido a partir de la fermentación sólida (FFS), se pretende hacer suspensiones en agua y poder atomizar éstas a la materia orgánica producida como residuos de cosecha. Dado que se evidenció la presencia de hongos descomponedores de celulosa capturados a partir de la hojarasca y posteriormente aislados en la trampa enriquecida con semolina y melaza. Además, de que esta mezcla fue enriquecida con la adición de bacilos de bacterias ácido-lácticas (Lactobacillus sp. ), obtenidas a partir del suero de leche de vaca sin pasteurizar. Y cuya presencia fue demostrada en el cultivo selectivo empleado para el crecimiento de éstas. Se requieren al menos 3 semanas según la literatura consultad para la producción de

EM, para lograr que el sustrato se fermente en su totalidad y se pueda hacer uso del mismo en aplicaciones en fincas. Cómo el objetivo de esta investigación era validar la presencia de MM, en los sustratos empleados y replicar el procedimiento de producción artesanal a un nivel piloto, se puede considerar que la eficacia del proceso dependerá en gran medida de las condiciones que se le den a los microorganismos para que puedan colonizar el sustrato, de allí la importancia de un adecuado cultivo de cepas para asegurar que la producción de microorganismos es la requerida o deseada y no la producción de microorganismos oportunistas que no tendrían importancia en el proceso de descomposición de materia orgánica.

CONCLUSIONES

El uso de microorganismos efectivos de montaña y su posterior aislamiento para la implementación de una tecnología de manejo de desechos sólidos en un sistema de producción agrícola, resulta ser una buena

estrategia de aprovechamiento de los recursos de la misma finca. Mediante el uso de procedimientos microbiológicos se logró capturar los microorganismos que participan en los procesos de descomposición de materia orgánica vegetal.








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El empleo de esta tecnología permite mitigar el impacto que causan en los agroecosistemas el uso continuo de fertilizantes químicos, los cuales se sabe que en la medida que aumenta su concentración en el suelo disminuye la actividad microbiana, con la consecuente pérdida de fertilidad debido a la ausencia de procesos de mineralización de la fracción orgánica del suelo. Esto también incide en la relación de hospedante – patógenos, pues se sabe que los microorganismos compiten en espacio y actúan como antagonistas de algunas

enfermedades de plantas causadas por hongos del suelo como Fusarium oxysporum.

Se requiere continuar una línea de investigación en el uso de microorganismo

efectivos, su caracterización y aislamiento en laboratorio. De igual forma se requiere trabajar en formulación de un sustrato o vehículo mediante el cual los microorganismos se puedan utilizar e incorporar al suelo mediante diversas formas de aplicación para su uso en el manejo de desechos orgánicos vegetales, o en otras actividades cómo el manejo de desechos de estiércol en producción pecuaria.

La identificación y caracterización de los microorganismos aislados, es imprescindible para poder desarrollar los medios de cultivo más apropiados para el aislamiento, multiplicación y escalamiento en la producción de microorganismos efectivos, para su uso en las fincas.








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LITERATURA CITADA

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