Producción de Bioetanol de Tercera Generación. Kenny Díaz b.
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PRODUCCIÓN DE BIOETANOL DE TERCERA GENERACIÓN MEDIANTE LA BIOCONVERSIÓN DE EXOPOLISACÁRIDOS (EPS) EXTRAÍDOS DEL CULTIVO IN VITRO DE UNA MICROALGA VERDE (CHLOROPHYTA) Kenny Cristian Díaz Bayona Est. Doctorado en Biotecnología GRUPO DE BIOTECNOLOGÍA UNIVERSIDAD DE ANTIOQUIA MEDELLÍN JULIO-2012
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PRODUCCIÓN DE BIOETANOL DE TERCERA
GENERACIÓN MEDIANTE LA BIOCONVERSIÓN DE
EXOPOLISACÁRIDOS (EPS) EXTRAÍDOS DEL
CULTIVO IN VITRO DE UNA MICROALGA VERDE
(CHLOROPHYTA)
Kenny Cristian Díaz Bayona
Est. Doctorado en Biotecnología
GRUPO DE BIOTECNOLOGÍA
UNIVERSIDAD DE ANTIOQUIA
MEDELLÍN
JULIO-2012
Las reservas mundiales de
combustibles fósiles se
agotarán en sólo 40 años.
(FAO,1997).
Para el año 2022, el
sistema de transporte en
USA requerirá cerca de
36 millones de galones de
biocombustibles.
Los Biocombustibles
El Bioetanol
GLUCOSA
El Bioetanol
0
2.000
4.000
6.000
8.000
10.000
12.000
Pro
du
ctio
n (M
illio
n G
allo
ns)
World Fuel Ethanol Production by Country
2007
2008
2009
Gráfica 1. Producción mundial de bioetanol en el año 2010. Fuente:Renewable Fuels Association, 2010. Departamento de Energía (DOE) de los Estados
Unidos.
• Cultivos de caña de azúcar (ingenios) y de yuca, entre otros
(Monsalve et al, 2006).
• Promoción del Decreto No. 2629-2007, para el uso de BCS
(flex).
• Para el uso de Etanol: Ley 693-2001; Ley 788-2002; Decreto
1135-2009; Resol. 182368-2009
MARCO TEÓRICO
DIVERSOS PROBLEMAS DESATADOS AL PRODUCIR BIOETANOL DE 1ª Y 2ª GENERACIÓN (CEPAL, 2007).
El mundo ha centrado su atención
en las microalgas como fuente de
compuestos de alto valor energético
y de diversos co-productos que se
han podido obtener a gran escala
gracias a la biotecnología (Barsanti
& Gualtieri, 2006).
3ª GENERACIÓN
Ventajas:
* Alta productividad por área de
cultivo.
* No competencia con los
alimentos.
* Se pueden utilizar tierras no
aptas para la agricultura.
* Se pueden utilizar una amplia
variedad de fuentes de agua para
su cultivo.
* Se puede explotar tanto la
biomasa como los productos de
alto valor energético.
* Tienen el potencial para reciclar
CO2, nutrientes y desechos, etc. (Sawayama et al, 1992; Pulz,
2001; Gudin et al, 1984).
Chlorophyta
* Fuente: Algae Resource
Database. www.shigen.nig.ac.jp
* Tomado de: www.wind-sea-
algae.org
Microalga fotosintética unicelular
formadora de colonias.
Cosmopolita.
Potencial fuente renovable de BC.
Produce hasta un 75% de su peso
en hidrocarburos.
Convierte un 3% de la energía solar
en hidrocarburos.
Puede fijar CO2 atmosférico.
Usar BC de Chlorophytas puede
reducir las emisiones de CO2 hasta
1,5 x 105 Ton/año.
PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
* Fuente: www.wind-sea-
algae.org
EPS
OBJETIVOS
General: Estudiar la viabilidad de producir etanol a partir de los EPS de
una microalga Chlorophyta.
Específicos:
• Establecer a nivel de matraces el efecto de diferentes cepas,
medios de cultivo y longitudes de onda emitidas por LEDs
sobre la producción de biomasa y EPS.
• Efectuar la hidrólisis y fermentación de los EPS.
• Establecer la pureza del etanol producido.
• Analizar la producción de EPS a mayor escala mediante el
uso de un fotobiorreactor de columna de burbujeo.
METODOLOGÍA
Cultivo de las cepas.
Utilizar 50 ml como inóculo de cada cepa para erlenmeyers de 500 mL.
Parámetros:
* Agitación: 100 rpm.
* Luz: Condiciones de Laboratorio (blanca). (2 ± 0,1 KLuxes).
Foto-período continuo.
* Temperatura del Laboratorio: 25-30°C.
* Suministro periódico de CO2 1%.
* Fuente de nitrógeno: Nitratos (8 mM)
Monitoreo de producción de biomasa.
Cada 3 días durante 45 días
* Densidad celular: Absorbancia a 680 nm.
* Peso seco: Muestra de 2 mL. Centrifugación a 12000 rpm y 4°C
durante 10 minutos. Secar a 70°C durante 12 h.
METODOLOGÍA
EPS secos
Centrifugación
Liofilizado Dializado
Filtrado Cultivo
METODOLOGÍA
Cultivo en fotobiorreactor.
Fotobiorreactor de Columna de burbujeo de 10L con
las mejores condiciones de cultivo.
• Se usará a un 80% de volumen de trabajo. Contará
con un sistema de iluminación con LEDs.
• Se implementarán todos los parámetros críticos
debidamente controlados (pH, temperatura, agitación,
condiciones de iluminación, etc.)
Conversión y fermentación de los EPS.
• Catalizadores inorgánicos (ácidos ó bases fuertes).
• Cuantificados e identificación de carbohidratos
totales (método de Dubois) y azúcares reductores (DNS
y HPLC).
• Fermentación mediante levaduras.
• Centrifugación, destilación y deshidratación.
• Pureza y calidad en términos de pH, porcentaje de
humedad y % de cloruros, sulfuros, metanol, etc.
(HPLC, ensayos espectrofotométricos).
Figura 1. (Izquierda) Muestra enviada por el proveedor
desde la Universidad de Coimbra-Portugal; (Derecha)
Cultivos axénicos en agar.
Figura 2. Cultivos líquidos de microalga
Chlorophyta logrados durante esta investigación.
Las células del inóculo se tomaron de los mejores
cultivos realizados sobre agar. Los cultivos líquidos
mostrados en esta imagen se utilizan como fuente
de células para los experimentos siguientes.
Figura 3. Cultivos líquidos de la
microalga Chlorophyta obtenidos
durante esta investigación
empleando diferentes medios de
cultivo. Las células tienen un
comportamiento diferente en cada
uno de los medios de cultivo
evaluados.
Figura 4. Cultivos líquidos de la
microalga Chlorophyta obtenidos
durante esta investigación
empleando los mejores medios de
cultivo.
Tabla 1. Resultados (g/L) de la evaluación de los medios A (Sheridan), B (Spirulina), C (Euglena) y D
(BG11), en el crecimiento de B. braunii.
Figura 4. Comparación de medias de crecimiento B. braunii Figura 5. Comparación de medias de producción de biomasa en los
medios evaluados
Tabla 1. Resultados (g/L) de la evaluación de los medios A, B, C y D, en el crecimiento de la
microalga de estudio.
Figura 6. Prueba positiva de
floculación de EPS empleando
etanol absoluto.
Figura 7. Prueba positiva de
presencia de EPS mediante el
método de Dubois (Dubois et
al, 1956). El tubo de ensayo
de la izquierda corresponde a
la muestra de sobrenadante
evaluada y el otro es un
blanco con agua en lugar de
muestra. La coloración ocre-
naranja es característica de la
presencia de carbohidratos en
la muestra.
Tabla 2. Composición del medio extracelular de reportada por otros
autores (Allard et al, 1990).
LINKAGE RESIDUE
RETENTION TIME PEAK AREA AREA %
Terminally linked Fucopyranosyl residue 9,099 75940541 22,8
2 linked Arabinofuranosyl residue 10,297 2537135 0,8
2 linked Rhamnopyranosyl residue 10,315 1993752 0,6
3 linked Rhamnopyranosyle residue 10,517 5243706 1,6
Terminally linked Mannopyranosyl residue 10,528 6258065 1,9
Terminally linked Glucopyranosyl residue 10,618 1073850 0,3
3 linked Fucopyranosyl residue 10,917 1500140 0,4
Terminally linked Galactofuranosyl residue 11,125 1959067 0,6
4 linked Fucopyranosyl residue 11,226 900932 0,3
Terminally linked Galactopyranosyl residue 11,312 4472317 1,3
2,3 linked Fucopyranosyl residue 12,515 1638362 0,5
2 linked Mannopyranosyl residue + 3 linked Mannopyranosyl residue 13,077 1177797 0,4
2 linked Hexofuranoyl residue 13,311 2409099 0,7
3 linked Galactopyranosyl residue 13,473 32203686 9,7
2 linked Galactopyranosyl residue 13,981 127690972 38,3
4 linked Galactopyranosyl residue 14,09 7498514 2,2
4 linked Glucopyranosyl residue 14,351 1090298 0,3
6 linked Galactopyranosyl residue 15,2 3231974 1,0
2,3 linked Galactopyranosyl residue + 3,4 linked Glucopyranosyl residue 15,623 45131020 13,5
3,6 linked Galactopyranosyl residue 17,821 9647724 2,9
Figura 8.
Montaje correspondiente al
proceso de diálisis de los
EPS.
Figura 9. De izquierda a derecha: EPS secados con horno de convección;
EPS secados con liofilizador; serie de EPS liofilizados correspondientes a
diferentes tiempos de cultivo, lo cual repercute en los procesos
subsiguientes.
Cinética de Producción EPS en medio 1
Cinética de Producción EPS en medio 2
Se obtuvo un valor de 1,11 g/L de EPS. En
comparación con la literatura, la cual reporta
concentraciones de 250 mg/L de EPS (Allard et al,
1990), la producción lograda es cuatro veces mayor
y significa un avance valioso en términos de
productividad y cultivo de la especie como biofábrica
de EPS.
Figura 10. Imágenes del medio extracelular empleado en este
ensayo. Pueden apreciarse las colonias bacterianas formadas
luego del período de exposición al ambiente.
Figura 12. Imágenes del montaje realizado para el ensayo de
fermentación dispuesto en una incubadora con agitación y
temperatura controladas.
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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2003. 105p.
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Biotechnol. 2001; 70: 231–247.
Molina E, Fernandez J, Acién FG, Chisti Y. Tubular photobioreactor design for algal culture. J
Biotechnol. 2001; 92: 113.
Moser T, Basu SS, Prata R, Moon H, Zhong X, Kim M. Syngenta Participations AG, asignee. Methods
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20100240082. 2010 Sep 23.
Powell EE, Hill GA. Economic assessment of an integrated bioethanol–biodiesel–microbial fuel cell
facility utilizing yeast and photosynthetic algae. Chemical Engineering Research and Design. 2009;
87(9): 1340–1348.
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Razo C, Astete-Miller S, Saucedo A, Ludeña C. Comisión Económica para América Latina y el Caribe,
CEPAL (ONU). Biocombustibles y su impacto potencial en la estructura agraria, precios y empleo en
América Latina. 2007.
Starr RC, Zeikus JA. UTEX- the culture collection of algae at the University of Texas at Austin. J
Phycol Suppl. 1993; 29: 1–106.
United Nations Environment Program (UNEP).Towards Sustainable Production and Use of Resources:
Assessing Biofuels. Corporate Report. Section 3. Important trends and drivers. 2009.Pp. 29–46.
MUCHAS GRACIAS
