PRODUCCIÓN DE PLANTINES DE LIMA (Citrus x limetta ...

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UNIVERSIDAD AGRARIA DEL ECUADOR FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS CARRERA DE INGENIERÍA AGRONÓMICA (3 líneas en blanco) PRODUCCIÓN DE PLANTINES DE LIMA (Citrus x limetta) MEDIANTE LA TÉCNICA DE CULTIVO IN VITRO TRABAJO EXPERIMENTAL (3 líneas en blanco) Trabajo de titulación presentado como requisito para la obtención del título de INGENIERO AGRÓNOMO (3 líneas en blanco) AUTOR LARRETA ALONSO VICTOR HUGO (3 líneas en blanco) TUTOR MORÁN BAJAÑA JOAQUÍN TEODORO MILAGRO – ECUADOR 2021
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    28-Jun-2022
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UNIVERSIDAD AGRARIA DEL ECUADOR FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS CARRERA DE INGENIERÍA AGRONÓMICA
(3 líneas en blanco)
limetta) MEDIANTE LA TÉCNICA DE CULTIVO IN VITRO TRABAJO EXPERIMENTAL
(3 líneas en blanco)
obtención del título de INGENIERO AGRÓNOMO
(3 líneas en blanco)
MILAGRO – ECUADOR
UNIVERSIDAD AGRARIA DEL ECUADOR FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS CARRERA DE INGENIERÍA AGRONÓMICA
(3 líneas en blanco)
Yo, MORÁN BAJAÑA JOAQUÍN TEODORO, docente de la Universidad Agraria
del Ecuador, en mi calidad de Tutor, certifico que el presente trabajo de titulación: :
PRODUCCIÓN DE PLANTINES DE LIMA (Citrus x limetta) MEDIANTE LA TÉCNICA DE CULTIVO IN VITRO, realizado por el estudiante LARRETA ALONSO VICTOR HUGO; con cédula de identidad N° 0941146722 de la carrera INGENIERÍA
AGRONÓMICA, Unidad Académica Milagro, ha sido orientado y revisado durante
su ejecución; y cumple con los requisitos técnicos exigidos por la Universidad
Agraria del Ecuador; por lo tanto se aprueba la presentación del mismo.
(1 línea en blanco) Atentamente, (3 líneas en blanco) Firma del Tutor (5 líneas en blanco) Milagro, 24 de Junio del 2021
3
UNIVERSIDAD AGRARIA DEL ECUADOR FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS CARRERA DE INGENIERÍA AGRONÓMICA
(3 líneas en blanco)
(2 líneas en blanco)
Los abajo firmantes, docentes designados por el H. Consejo Directivo como
miembros del Tribunal de Sustentación, aprobamos la defensa del trabajo de
titulación: “PRODUCCIÓN DE PLANTINES DE LIMA (Citrus x limetta) MEDIANTE LA TÉCNICA DE CULTIVO IN VITRO”, realizado por el estudiante
LARRETA ALONSO VICTOR HUGO, el mismo que cumple con los requisitos
exigidos por la Universidad Agraria del Ecuador.
(2 líneas en blanco) Atentamente,
Ing. Paulo Centanaro Quiroz PRESIDENTE
Ing.Fernando Martinez Alcivar Ing. César Peña Haro EXAMINADOR PRINCIPAL EXAMINADOR PRINCIPAL
Ing. Joaquin Morán Bajaña EXAMINADOR SUPLENTE
Milagro, 24 de Jinio del 2021
4
DEDICATORIA
Dedico esta tesis a Dios, ya que gracias al he logrado
concluir mi carrera.
A mi madre noralma quien con sus palabras de aliento
y apoyo económico no me dejaban claudicar ante los
problemas.
5
Agradecimiento
haber llegar hasta donde eh llagado.
Gracias a la universidad agraria del Ecuador por
haberme abierto sus puertas y brindarme las
oportunidades para culminar mi carrera como
ingeniero Agrónomo.
A mi madre y padre gracias por sus esfuerzos y su
amor.
brindado, que sin duda alguna en el trayecto de mi
vida me has demostrado tu amor corrigiendo mis
faltas y celebrando mis triunfos.
A mi novia gracias por esa mano amiga que siempre
estuvo a disposición de ayudarme en todos los
problemas y necesidades que me surgían.
6
Autorización de Autoría Intelectual
Yo LARRETA ALONSO VICTOR HUGO, en calidad de autor(a) del proyecto
realizado, sobre “PRODUCCIÓN DE PLANTINES DE LIMA (Citrus x limetta)
MEDIANTE LA TÉCNICA DE CULTIVO IN VITRO” para optar el título de
INGENERIERÍA AGRONÓMICA, por la presente autorizo a la UNIVERSIDAD
AGRARIA DEL ECUADOR, hacer uso de todos los contenidos que me pertenecen
o parte de los que contienen esta obra, con fines estrictamente académicos o de
investigación.
Los derechos que como autor(a) me correspondan, con excepción de la presente
autorización, seguirán vigentes a mi favor, de conformidad con lo establecido en los
artículos 5, 6, 8; 19 y demás pertinentes de la Ley de Propiedad Intelectual y su
Reglamento.
______________________
7
AGRADECIMIENTO ............................................................................................. 5
Índice general ...................................................................................................... 7
1.3 Justificación de la investigación................................................................ 14
1.5 Objetivo general .......................................................................................... 16
1.6 Objetivos específicos ................................................................................. 16
2. Marco teórico ................................................................................................ 17
2.2 Bases teóricas ............................................................................................. 18
2.2.7 Obtención de embriones somáticos ....................................................... 23
2.3 Marco legal .................................................................................................. 24
3.1 Enfoque de la investigación ....................................................................... 26
3.1.2.1. Recursos Materiales ............................................................................ 27
4. Resultados ..................................................................................................... 31
4.1 Proponer un protocolo de desinfección de los explantes de lima .......... 31
4.2 Identificar la concentración hormonal más eficiente en micropropagación
............................................................................................................................ 31
4.3 Obtener plantines viables a partir de explantes por la vía de la
embriogénesis directa ...................................................................................... 33
5. Discusión ....................................................................................................... 35
6. Conclusiones ................................................................................................. 37
7. Recomendaciones ......................................................................................... 38
8. Bibliografia .................................................................................................... 39
Tabla 2. Modelo de análisis de varianza ............................................................. 31
Tabla 3. Resultados de números de plantines..................................................... 33
Tabla 4. Resultados de cantidades de hojas obtenidas. ...................................... 34
Tabla 5. Resultados de la longitud (cm) de plantines .......................................... 35
Tabla 6. Análisis de varianza de la longitud de los plantines ............................... 50
Tabla 7. Análisis de vaarianza del número de plantines ...................................... 51
Tabla 8. Análisis de varianza del número de hojas ............................................. 52
10
Figura 1. Longitud de plantines bajo las concentraciones hormonales ............... 52
Figura 2. Número de plantines obtenidos bajo las concentraciones hormonales 53
Figura 3. Número de hojas de los plantines obtenidos bajo las concentraciones
hormonales ......................................................................................................... 54
Figura 4. Fitohormonas utilizadas en el experimento. ......................................... 55
Figura 5. Realizando cálculos de los materiales para la preparación de los medios
con hormonas. .................................................................................................... 56
Figura 6. Mediciòn de pH para la preparaciòn del medio cultivo. ........................ 57
Figura 7. Medio de cultivo preparado para la ditribuciòn en los envases y posterior
siembra. .............................................................................................................. 58
Figura 8. Realizando la desinfecciòn de la cabina de flujo para proceder a siembrar.
............................................................................................................................ 59
Figura 9. Realizando siembra en la cabina de flujo. ........................................... 60
Figura 10. Medio de cultivo solidificado con la siembra realizada. ...................... 61
Figura 11. Monitorizaciòn en cámara de incubación............................................ 62
Figura 12. PLantin de lima. ................................................................................. 63
Figura 13. Plantin de lima.................................................................................... 64
Figura 14. Plantin de lima.................................................................................... 65
Figura 15. Plantines de lima. ............................................................................... 66
Figura 16. Plantines de lima en su último estadio luego del trabajo de investigación
en laboratorio. ..................................................................................................... 67
11
RESUMEN
En el Ecuador la fruta conocida como lima (Citrus x limetta) pertenece al grupo de
los cítricos cuya presencia en el mercado de vegetales frutales en el Ecuador se
percibe como muy escasa. Se planteó una investigación cuyo objetivo fue evaluar
la producción de plantines de lima (Citrus x limetta) mediante la técnica de cultivo
in vitro. En un diseño DCA con arreglo factorial 32 con 9 tratamientos se probaron
3 combinaciones de 3 concentraciones de ANA (0.05, 0.10 y 0.15 mg/L-1) y Kinetina
(0.1, 0.2 y 0.3 mg/L-1) en 9 tratamientos con 3 repeticiones. La comparación de
medias de los tratamientos se aplicó el test de Duncan (p=0.05). Se propuso el
protocolo de desinfección con seis soluciones y tiempos de NaClO (1%,1 minuto.
Etanol (70%, 30 segundos); 2 gotas de Tween80, (1 minuto); 1 gota de Tween 80,
(1 minuto); agua destilada estéril con Benomil (2 g/L) y Gentamicina (2 ppm, 1
minuto); Ácido ascórbico (2 ppm, 30 segundos). Los explantes deben lavarse y
escurrirse tres veces con agua destilada estéril. La concentración hormonal más
eficiente correspondió a 0.1 mg/L-1 de ANA en mezcla con 0,3 mg/L-1 de kinetina.
Se logró: mayor longitud (8.37 cm) de los tallos de los plantines, mayor número de
plantines (3.33 unidades) y mayor número de hojas promedio. Se acepta la
hipótesis “Mediante cultivo in vitro empleando la vía de la embriogénesis directa se
pueden producir plantines de lima”.
Palabras claves: Plantines, Acido Naftalacético, Kinetina, explantes
12
ABSTRACT
Tropical Ecuador the fruit known as lime (Citrus x limetta) belongs to the group of
citrus fruits whose presence in the fruit vegetable market in Ecuador is perceived as
very scarce. An investigation was proposed whose objective was to evaluate the
production of lime seedlings (Citrus x limetta) by means of the in vitro culture
technique. In a DCA design with a 32 factorial arrangement with 9 treatments, 3
combinations of 3 concentrations of ANA (0.05, 0.10 and 0.15 mg / L-1) and Kinetin
(0.1, 0.2 and 0.3 mg / L-1) were tested in 9 treatments with 3 repetitions. The
comparison of means of the treatments was applied Duncan's test (p = 0.05). The
disinfection protocol was proposed with six solutions and times of NaClO (1%, 1
minute. Ethanol (70%, 30 seconds); 2 drops of Tween80, (1 minute); 1 drop of
Tween 80, (1 minute); sterile distilled water with Benomyl (2 g / L) and Gentamicin
(2 ppm, 1 minute); Ascorbic acid (2 ppm, 30 seconds). The explants should be
washed and drained three times with sterile distilled water. The most efficient
hormone concentration corresponded at 0.1 mg / L-1 of ANA in a mixture with 0.3
mg / L-1 of kinetin. It was achieved: greater length (8.37 cm) of the stems of the
seedlings, greater number of seedlings (3.33 units) and greater number of average
leaves The hypothesis "By in vitro culture using the direct embryogenesis pathway,
lime seedlings can be produced" is accepted.
Keywords: Seedlings, Naphthalacetic Acid, Kinetin, explants
13
1. Introducción 1.1 Antecedentes del problema
El Ecuador tropical posee potencial para producir cítricos, principalmente en la
región litoral, cultivándose 10.219 ha en monocultivos (naranja, limón, mandarina)
y 58.219 ha en asociación. Las provincias que sobresalen en esta actividad son
Manabí, Los Ríos, Bolívar, Guayas, Pichincha y Tungurahua (Sotomayor, et al,
2019)
La fruta conocida como lima (Citrus x limetta) pertenece al grupo de los cítricos
cuya presencia en el mercado de vegetales frutales en el Ecuador se percibe como
muy escasa aunque ancestralmente se ha consumido de manera directa sobre todo
en la región costa.
Los pisos agroclimáticos de hasta 80 msnm poseen todas las condiciones para
su cultivo y la demanda indica la tendencia de consumo en estado fresco por parte
de la población por su contenido rico en vitamina C y fibra (Valarezo et al, 2014).
Los pocos reportes sobre superficie sembrada y datos de producción provienen
del INIAP Portoviejo quienes informan que estos árboles se han dispersado y
reducido el número de plantas que ahora el fruto de la lima es escaso (Valarezo et
al, 2014).
En el ámbito nacional como regional la información sobre esta planta es limitada
asumiendo que es por falta de interés investigativo aunque el manejo de este cultivo
es muy similar a una plantación de naranjas, toronjas o limón (Santistevan et al,
2017).
La técnica de propagación de plantas a través de herramientas biotecnológicas
como son los cultivos in vitro permite contar por la vía de la embriogénesis directa
la formación de plantines que bajos las condiciones adecuadas bien pudiera
emplearse para incrementar la población de plantas de interés comercial
14
El propósito de este proyecto de investigación es la producción de plantines de
lima (Citrus x limetta) mediante la técnica de cultivo in vitro.
1.2 Planteamiento y formulación del problema
1.2.1 Planteamiento del problema
En Ecuador, principalmente en las provincias de la costa y en aquellas donde
empieza la cordillera de los Andes, se cultivan grandes plantaciones de cítricos
cuya producción abastece el mercado nacional.
Según los informes de prensa se comunica que hasta el año 2013 se producían
más de cien mil toneladas de cítricos en el Ecuador. Las frutas que se producen en
este grupo son las naranjas, mandarinas y toronjas. Estos mismos reportes no
informan sobre la lima ni el pomelo.
La biotecnología permite hoy propagar plantas y la lima podría ser objeto de esta
actividad para multiplicarla mediante la vía de la embriogénesis directa empleando
explantes que permitan disponer de plantines listos para ser procesados,
adaptados y sembrados para la recuperación de la lima y disponerla como
tradicionalmente ha sido, una fruta apetecida por los consumidores.
El problema sería dilucidar si esta especie puede propagarse mediante estas
herramientas y obtener plantines con características deseadas para su repoblación.
1.2.2 Formulación del problema
¿La vía de la embriogénesis directa en un cultivo in vitro de explantes de lima
podría convertirse en un método de propagación adecuado?
1.3 Justificación de la investigación
Mediante la aplicación de técnicas biotecnológicas se pretendIó contribuir a la
recuperación del cultivo de lima y facilitar la producción comercial de alta calidad
15
de este fruto muy apetecido por su contenido de vitamina C por sus propiedades
sensoriales agradables para el consumidor y su utilización en la gastronomía y
preparación de cocteles, este cultivo presenta un gran potencial con fines de
exportación.
El cultivo in vitro de plántulas por un lado propaga una planta en poblaciones
considerables por otro lado participa en los programas de mejoramiento y la
obtención de plantas resistentes a virus, impide la dispersión genética asociada a
la cigosis ya que ésta multiplica material vegetal que al ser clonadas responden a
las propias características de la planta progenitora debido a su alto grado de
poliembrionía.
Asimismo su multiplicación permite la preservación de las peculiaridades que se
desean dentro del material clonal de plántulas. Por lo tanto la aplicación de técnicas
de cultivo in vitro ofrece numerosas ventajas en la mejora de la producción del
material vegetal y de esta manera se pueden implementar un paquete tecnológico
indispensable para asegurar una producción uniforme y de alta calidad que pueda
garantizar y avalar las expectativas que cubre el potencial del cultivo de los cítricos
y sobretodo de la lima en Ecuador.
1.4 Delimitación de la investigación
• Espacio: El lugar donde se desarrolló el trabajo de titulación fue en el
laboratorio de biotecnología vegetal de la Universidad Agraria del Ecuador en
la Ciudad Universitaria “Dr. Jacobo Bucaram Ortiz” en Milagro.
• Tiempo: El período de tiempo que tomó el desarrollo del trabajo de titulación
fue de seis meses.
• Población: El trabajo de titulación fue dirigido a los productores de cítricos.
1.5 Objetivo general
16
Evaluar la producción de plantines de lima (Citrus x limetta) mediante la técnica
de cultivo in vitro.
- Proponer un protocolo de desinfección de los explantes de lima
- Identificar la concentración hormonal más eficiente en micropropagación
- Obtener plantines viables a partir de explantes por la vía de la embriogénesis
directa
1.7 Hipótesis
Mediante cultivo in vitro empleando la vía de la embriogénesis directa se pueden
producir plantines de lima.
Un estudio realizado en Honduras revelo que, la citoquinina Bencilaminopurina
BAP en bajas concentraciones estimula la división celular, induciendo la formación
de vástagos adventicios, que inhibe la formación de raíces y disminuye la
dominancia apical en plantaciones de Citrus latifolia (Vidal, 2015).
En una investigación sobre técnicas de propagación se informa que el
enraizamiento de Croton lechleri en condiciones in vitro ayuda a fortalecer el
comportamiento y desarrollo radicular del cultivo, en este ensayo se realizaron dos
etapas: la primera, un medio liquido (Murashige y Skoog MS más vitaminas y ácido
naftalacético ANA 0,01 mg/l y 0,1 ácido giberélico AG3) y la segunda etapa, el
traspaso a un medio MS con la mitad de concentración de macro elementos
(Argüelles C., Hernández A., Cortéz L., & Díaz P., 2020)
Hallazgos realizados en la Universidad Técnica de Ambato mediante dos
protocolos de desinfección en los meristemos axilares en cultivos de mora de
castilla revelaron que la propagación mediante in vitro favorece el crecimiento y
vigorosidad de las hojas (Ayala, 2012)
Por otro lado investigaciones realizadas en México a una gran variedad de
especies silvestres del territorio nacional mencionaron que la propagación in vitro
del genero Polianthes estimula la respuesta del tejido vegetal y su regeneración
(Arrieta P. & Rico H., 2005)
En un estudio sobre la obtención de embriones somáticos de Perezia
coerulescens, una especie nativa peruana, empleada en la medicina tradicional
como un calmante de los nervios y considerada como vulnerable debido a su
sobreexplotación comercial. Este ensayo evaluó la eficiencia de las hojas, raíces,
18
rizomas, brotes pequeños en un cultivo in vitro empleando medio Murashige y
Skoog con sacarosa (2 %) y agar-agar (0,75 %), aplicando un programa de 16 horas
luz a 16–20 ºC, suplementado con ANA (2 mg/L) y 2,4-D (0,2; 1 y 2 mg/L) y un
control sin fitohormona, se encontró que los reguladores empleados a los dos
meses indujeron la formación de callos al 100 % en los brotes pequeños y grandes.
Sin embargo, los callos embriogénicos provenientes del tratamiento 2,4-D (2 mg/L)
se fenolizaron a los cuatro meses, (Olivera et al, 2018).
2.2 Bases teóricas
2.2.1 Generalidades
El Limero, o Lima, que responde a la denominación científica de Citrus X limetta,
es un árbol perennifolio espinoso de bajo porte (mide alrededor de cuatro metros)
perteneciente al género de cítricos y a la familia Rutaceae cultivado por la
producción frutal que genera y que es muy apreciada mundialmente.
La lima es el fruto del árbol conocido como limero. Es un cítrico de aroma
placentero. Se consume principalmente en fresco; por ejemplo, en la elaboración
casera de jugos y postres, además de ser un condimento en multitud de platillos
regionales. En los últimos años se ha incrementado su uso industrial para la
obtención de jugos y concentrados, aceite esencial, pulpas y dulces (Navarro L. ,
2011)
2.2.2 Taxonomía
La familia Rutaceae de la cual la lima forma parte, es un árbol armado con
espinas gruesas, hojas de 5 a 7,5 cm, elíptico-ovales, redondeadas, el pecíolo
estrechamente alado. Las flores son de color blanco; el fruto puede ser amarillo
pálido, liso, de 5 a 7 cm de diámetro y produce un zumo algo insípido (R.L Gomez,
L,s Sendin, V.A. Ledesma , L,A. Romero, & M.P. Filippone, 2020)
19
Reino Plantae
División Magnoliophyta
Clase Dicotiledoneas
Subclase Sapindales
Orden Rosidae
Familia Rutaceas
Sub-Familia Aurantoideae
Género Citrus
Especie Limetta
2.2.3 Clasificación botánica
El género de los cítricos, está compuesto por plantas de mediano a gran
desarrollo, con hojas perennes y generalmente glabras, aunque en algunas
especies son pubescentes, con bordes serrados, pecíolos más o menos alados o
sin alas y glándulas provistas de aceites aromáticos. Flores solitarias o en cimas
terminales o axilares, cuatro o cinco sépalos cortos de color verde y unidos entre
sí, cinco pétalos de coloración blanca o matizados de púrpura, estambres libres o
más o menos soldados entre sí y en número múltiple al de pétalos, con anteras
alargadas; el ovario es súpero y gamocarpelar. El fruto es una hespéride con
número variable de semillas (Hernández et al, 2010).
2.2.4 Mejora genética de los cítricos y el cultivo in vitro
Los cítricos constituyen el primer cultivo frutal del mundo, con una producción de
unos 110 millones de toneladas y una superficie de más de 7 millones de hectáreas
(Navarro, 2011).
20
La fuente antes citada enfatiza que la disponibilidad de variadas biotecnologías
pero todas basadas en el cultivo in vitro de tejidos y en la transformación genética
empleando vectores plasmídicos o virales permiten superar algunos de los
problemas de la mejora tradicional y ofrecen nuevas posibilidades que no podían
abordarse hasta ahora.
Hay que destacar especialmente la puesta a punto de técnicas para la obtención
de híbridos triploides sin semillas, para la fusión de protoplastos, para la
transformación genética y el desarrollo de numerosos marcadores moleculares
aportará nuevas herramientas y conocimientos que facilitarán la mejora de los
cítricos (Navarro, 2011).
La propagación in vitro de tejidos vegetales es una herramienta de la
biotecnología útil para la micropropagación masiva de plantas y productos
naturales. Consiste en aislar porciones de una planta denominados explantes, los
cuales son colocados en un medio de cultivo de 10 composición química definida
en condiciones de estricta asepsia para evitar contaminación microbiana (Linares
Rivero, 2014).
En lo referido a los cítricos, la regeneración de plantas in vitro vía embriogénesis
somática es un prerrequisito indispensable. Existen exigencias muy específicas en
la capacidad de división y regeneración de este cultivo, en cuanto a la composición
del medio, especialmente en lo referente a los reguladores del crecimiento
(Hernández et al, 2010).
En el Ecuador se ha identificado que la provincia de Santa Elena posee los
mejores rendimientos en productividad en algunos cítricos entre los que sobresale
el limón y otras especies (Santistevan et al, 2015).
21
Algunos autores resaltan las ventajas del cultivo in vitro el cual permite plantas
libres de enfermedades (hongos, bacterias, micro plasmas, virus y tiroides), (Ibarra,
2012).
La fuente anteriormente citada destaca que la micropropagación vegetal permite
propagar fácilmente el material vegetal en cualquier época del año y en corto tiempo
conservando su potencial genético y calidad sanitaria. Permite optimizar el uso de
factores ambientales y nutricionales. Facilita el cultivo de un gran número de plantas
en una superficie pequeña. Puede conservar material biológico por periodos de
tiempos prolongados.
Además, mediante este método de propagación se puede incluir aspectos de
fitomejoramiento.
2.2.6 Etapas del cultivo in vitro
La elección de los tejidos vegetales constituye una acción valiosa debido a su
dependencia asociada a la respuesta que se dé en las condiciones in vitro; mientras
más joven sea la planta de la que se extrae el material vegetal mejor será la
respuesta, principalmente debido a que tiene zonas de crecimiento más activas que
una planta adulta (Orozco, 2012).
Castro (2006), señala que los tejidos pueden ser de variados en su origen como
por ejemplo: segmentos de tejido foliar, protoplastos, granos de polen, semillas,
entre otros; sin embargo, si lo que se desea es mantener una alta estabilidad
genética se prefiere como explante los meristemos apicales y segmentos nodales.
El establecimiento del cultivo in vitro tiene como objetivo primordial obtener un
cultivo libre contaminación, en el que los explantes se encuentren sembrados en
un medio de composición química definida para su desarrollo y crecimiento; y así,
tener plantas vigorosas para el proceso de propagación (Arrieta P. & Rico H., 2005)
22
Se ha reportado que los primeros ensayos para obtener embriones somáticos
ocurrieron en Portugal, donde se logró conseguir con éxito, en tomate de árbol, con
el uso de auxinas, principalmente 2,4-D (ácido 2-dicloro fenoxiacético) en
suspensiones líquidas, a partir de hojas e hipocótilos. Otros trabajos de
embriogénesis somática se ha informado en otras solanáceas como la papa
mostrando resultados eficientes con la auxina ANA (ácido naftalenacético) y con
combinaciones de ANA y 2,4-D (Arahana et al, 2010).
2.2.6.1 Multiplicación
En la fase de multiplicación se espera que los explantes que sobrevivieron a las
fases de desinfección y establecimiento generen periódicamente nuevos brotes por
medio de división y resiembra al ser sub cultivados en un nuevo medio con auxinas
y citoquininas (Varela González, 2015)
2.2.6.2 Enraizamiento
En el enraizamiento los plantines que se logran obtener en la fase de
propagación y multiplicación deben ser transferidos a un medio que provoque la
formación radicular que permita la absorción de nutrientes al ser transplantadas.
Todo depende de la calidad de cada material vegetal utilizado (Orozco, 2012).
2.2.6.3 Aclimatización
La fase de climatización es la de mayor importancia debido a que se da la
adaptación de las vitroplanta a un ambiente ex vitro (Vaca, 2012). En esta etapa es
importante simular un ambiente con características similares al in vitro hasta que el
material vegetal se adapte a las nuevas condiciones. La siembra del material a
aclimatar se realiza en una combinación de sustratos asépticos de origen natural o
artificial que permitan el crecimiento de cada planta en condiciones ambientales
23
controladas. Las raíces deben tener aireación, disponibilidad de agua y sostén
mecánico para un mejor desarrollo (Orozco, 2012).
Se ha explicado que durante la transición de in vitro a ex vitro se presentan los
problemas más acuciantes y es donde ocurren las mayores pérdidas. La
aclimatación de plantas de origen in vitro es considerada como la fase crítica.
Debido a que las plántulas no toleran las nuevas condiciones ambientales del
macetero en el invernadero/vivero y debe empezar a valerse por si sola, es decir a
producir su propio alimento y a defenderse sola de las condiciones que la rodean
totalmente diferentes a las del tubo de ensayo (Gil et al, 2017).
2.2.7 Obtención de embriones somáticos
La embriogénesis somática (asexual o adventicia, es un proceso que consiste
en el desarrollo de embriones a partir de células que no provienen de una fusión de
gametos, se produce una estructura bipolar (embrión) a partir de una célula
somática (Alvard et al., como se citó en Martínez et al., 2010).
Este proceso se produce de forma espontánea en cerca de 70 familias de
plantas, algunas tan importantes como las: Compuestas, Crucíferas,
Cucurbitáceas, Gramíneas, Rosáceas, Leguminosas, Palmáceas, etc. Es pues un
proceso tan natural como la embriogénesis cigótica, con casos tan conocidos como
el de los cítricos, en los que ambos tipos de embriogénesis ocurren casi
simultáneamente en el interior de la semilla (Escalona et al., como se citó en
Martínez et al., 2010).
Prácticamente se pueden obtener embriones somáticos de muy diversas partes
de la planta, empleando explantes provenientes de ápices radiculares y caulinares,
hipocótilos, pecíolos, pedúnculos, hojas jóvenes y en general tejidos y órganos con
características embrionarias, meristemáticas o reproductivas (también embriones e
24
inflorescencias inmaduras, trozos de escutelo, nucela y endospermo, óvulos, tejido
ovárico) (Lorenzo et al., como se citó en Martínez et al., 2010).
Algunos autores reportan sobre resultados que mostraron que el 2,4-D a 5 ppm
empleados en explantes de embriones inmaduros de P. americana Mill.var.Hass
“palto”; dio un 80,7 % de formación de callos a los 20 días, siendo calificada como
una excelente auxina inductora de callos en plantas leñosas (Polo, 2017).
Es recurrente observar en la literatura científica, sobre la necesidad de aplicar
auxinas como el 2,4 D de manera exógena al medio de cultivo, para incentivar la
formación de embriones somáticos (Bao et al, 2013).
Autores como Fuki e Imaeda (Como se citó en Bao et al, 2013) consideran
necesaria la adición de citoquininas o el ácido giberélico, para romper la latencia
embrionaria e inducir a la germinación y la formación de plantines, ya que se han
obtenido pobres resultados durante la transición de embriones maduros a
germinación directamente (sin fitohormonas).
2.3 Marco legal
La presente investigación se apega al Plan Nacional del Buen Vivir en el objetivo 6 Desarrollar las capacidades productivas y del entorno para lograr la soberanía alimentaria y el "Plan Nacional de Desarrollo 2017-2021 Toda una Vida" de Ecuador, ajustado a las políticas y lineamientos estratégicos número 6.1 en donde se promueve fomentar el trabajo y el empleo digno con énfasis en zonas rurales, potenciando las capacidades productivas, combatiendo la precarización y fortaleciendo el apoyo focalizado del Estado e impulsando el emprendimiento (Constitucion de la Republica del Ecuador, 2017). Ley Orgánica del Régimen de la Soberanía Alimentaria Artículo 281. La soberanía alimentaria constituye un objetivo estratégico y una obligación del Estado para garantizar que las personas, comunidades, pueblos y nacionalidades alcancen la autosuficiencia de alimentos sanos y culturalmente apropiados de forma permanente. Para ello, será responsabilidad del Estado: 5. Establecer mecanismos preferenciales de financiamiento para los pequeños y medianos productores y productoras, facilitándoles la adquisición de medios de producción. 8. Asegurar el desarrollo de la investigación científica y de las innovaciones tecnológicas apropiadas para garantizar la soberanía alimentaria.
25
13. Prevenir y proteger a la población del consumo de alimentos contaminados o que pongan en riesgo su salud o que la ciencia tenga incertidumbre sobre sus efectos (Asamblea Nacional, 2009). Constitución Política de la República del Ecuador De acuerdo a la Carta Magna de la República del Ecuador emitida en el año
2008 en el cantón Montecristi, manifiesta lo siguiente: Art. 25.- Las personas tienen derecho a gozar de los beneficios y aplicaciones
del progreso científico y de los saberes ancestrales. En el capítulo cuarto de Derechos de las comunidades, pueblos y
nacionalidades Art 57 menciona que: No ser desplazados de sus tierras ancestrales. 12. Mantener, proteger y desarrollar los conocimientos colectivos; sus ciencias,
tecnologías y saberes ancestrales; los recursos genéticos que contienen la diversidad biológica y la agro biodiversidad; sus medicinas y prácticas de medicina tradicional, con inclusión del derecho a recuperar, promover y proteger los lugares rituales y sagrados, así como plantas, animales, minerales y ecosistemas dentro de sus territorios; y el conocimiento de los recursos y propiedades de la fauna y la flora.
Se prohíbe toda forma de apropiación sobre sus conocimientos, innovaciones y prácticas.
13. Mantener, recuperar, proteger, desarrollar y preservar su patrimonio cultural e histórico como parte indivisible del patrimonio del Ecuador. El Estado proveerá los recursos para el efecto (Asamblea constituyente).
3. Materiales y métodos
3.1.1 Tipo de investigación
El tipo de investigación se planteó de acuerdo al tema propuesto es de campo y
laboratorio, mientras que el nivel de conocimiento es exploratorio, descriptivo y
explicativo acompañado de un componente bibliográfico.
3.1.2 Diseño de investigación
3.2 Metodología
3.2.1 Variables
3.2.2 Tratamientos
La distribución de los tratamientos se presentan en la Tabla 1 y se realizó
empleando dosis de mezclas hormonales siguiendo la metodología de (Arrieta P. &
Rico H., 2005) quienes probaron con éxito estas fitohormonas en la
micropropagación del limón criollo (Citrus aurantifolia).
Tabla 1. Distribución de los tratamientos
No. Factor A (ANA) Factor B (Kinetina) Combinación A x B 1 0.05 mg/L-1 0,1 mg/L-1 0.05 ANA+0,1 kinetina 2 0.1 mg/L-1 0,1 mg/L-1 0.1 ANA +0,1 kinetina 3 0.15 mg/L-1 0,1 mg/L-1 0.15 ANA +0,1 kinetina 4 0.05 mg/L-1 0,2 mg/L-1 0.05 ANA +0,2 kinetina 5 0.1 mg/L-1 0,2 mg/L-1 0.1 ANA +0,2 kinetina 6 0.15 mg/L-1 0,2 mg/L-1 0.15 ANA +0,2 kinetina 7 0.05 mg/L-1 0,3 mg/L-1 0.05 ANA +0,3 kinetina 8 0.1 mg/L-1 0,3 mg/L-1 0.1 ANA +0,3 kinetina 9 0.15 mg/L-1 0,3 mg/L-1 0.15 ANA +0,3 kinetina
Larreta, 2021
3.2.3 Diseño experimental
Se aplicó un diseño completamente al azar (DCA) en el cual se evaluaron los
nueve tratamientos indicados en la Tabla 1. Cada uno de ellos, se valoró mediante
tres repeticiones. La unidad experimental estuvo constituida por una placa Petri,
27
resultando para todo el ensayo un total de 27 unidades experimentales, en las
cuales se colocaron 5 embriones inmaduros.
3.2.4 Recolección de datos
Embriones inmaduros de lima (Citrus x limetta) fueron seleccionados y
desinfectados en una solución de NaClO 3 % (v/v) por 10 minutos, luego de la
eliminación de la testa se sometieron a una disolución de NaClO al 1 % (v/v) por 5
minutos para finalmente sembrarlas en cámara húmeda para su germinación.
Las materiales que desarrollados fueron transferidos a 20 g del medio de cultivo
Murashige y Skoog para su enraizamiento con las concentraciones hormonales
bajo estudio con ANA y Kinetina (ver tratamientos).
Los explantes se sumergieron en seis soluciones diferentes:
1. NaClO al 1%, un (1) minuto.
2. Etanol al 70%, 30 segundos
3. Agua destilada estéril con 2 gotas de Tween80, un (1) minuto.
4. Agua destilada estéril con 1 gota de Tween 80, un (1) minuto.
5. Agua destilada estéril con fungicida Benomil 2 g/L y bactericida Gentamicina
2 ppm, un (1) minuto.
6. Ácido ascórbico 2 ppm 30 segundo.
Posteriormente se sumergió los explantos por triplicado en agua destilada estéril
y se dejó escurrir en papel secante estéril.
La longitud de los plantines fue evaluada midiendo con una regla, por fuera del
tubo, el tallo, cuando el primer crecimiento ocupó la máxima longitud del tubo de
ensayo. Los plantines fueron contados de entre todas las unidades experimentales
y el número de hojas se obtuvo cuando estas alcanzaron un desarrollo
considerable dentro del tubo.
3.2.5 Análisis estadístico
La valoración estadística de los datos se realizó mediante el análisis de varianza,
cuyo modelo se estructuró de acuerdo al arreglo factorial de tratamientos y al tipo
de diseño experimental utilizado, el cual se observa en la Tabla 2. La comparación
de medias, para los efectos de interacción, se realizó mediante la prueba de
Duncan. Estos análisis se llevaron a cabo, considerando un 5% de error tipo I
(p<0.05).
Fuentes de variación Grados de libertad
Total (abr-1) 26 Factor A (ANA) (a-1) 2 Factor B (Kinetina) (b-1) 2 Interacción AB (a-1)(b-1) 4 Error experimental ab(r-1) 18
Larreta, 2021
4. Resultados
4.1 Proponer un protocolo de desinfección de los explantes de lima
El protocolo de desinfección que se propone es el siguiente:
Los embriones inmaduros deben desinfectarse en una solución de NaClO 3 %
(v/v) por 10 minutos, luego eliminar la testa y sumergirlos en una disolución de
NaClO al 1 % (v/v) por 5 minutos para finalmente sembrarlas en cámara húmeda
para su germinación.
Los explantes deben sumergirse en las seis soluciones y en los tiempos que se
describen a continuación:
2. Etanol al 70%, 30 segundos
3. Agua destilada estéril con 2 gotas de Tween80, un (1) minuto.
30
4. Agua destilada estéril con 1 gota de Tween 80, un (1) minuto.
5. Agua destilada estéril con fungicida Benomil 2 g/L y bactericida Gentamicina
2 ppm, un (1) minuto.
6. Àcido ascórbico 2 ppm en agua destilada estéril 30 segundos
Finalmente los explantes deben lavarse y escurrirse tres veces con agua
destilada esteril.
4.2 Identificar la concentración hormonal más eficiente en micropropagación
De los resultados obtenidos se desprende que la concentración hormonal más
eficiente en términos de mejor comportamiento frente a la obtención de los plantines
correspondió al T8 cuyo contenido hormonal fue el siguiente: 0.1
mg/L-1 de ANA en mezcla con 0,3 mg/L-1 de kinetina.
Con la concentración hormonal descrita se logró: mayor longitud (8.37 cm) de
los tallos de los plantines de lima, mayor número de plantines (3.33 unidaades) y
mayor número de hojas promedio.
El números de plantines se muestra en la tabla 3 a continuación. En esta
variable, el comportamiento estadístico fue similar a la anterior. La mayor cantidad
de plantines obtenidos se logró en el T8 (3.33 unidades) con 0.1 mg/L-1 de ANA y
0.3 mg/L-1 de Kinetina y el T9 (3.00 unidades) 0.15 mg/L-1 de ANA y 0.3 mg/L-1 de
Kinetina siendo ambos iguales entre sí pero superiores a los demás tratamientos.
El menor número se alcanzó con el T7 ( 1.67) con 0.1 mg/L-1 de ANA y 0.1 mg/L-1
Kinetina, T5 (1.67) con 0.1 mg/L-1 de ANA y 0.2 mg/L-1 Kinetina y el T4 (1.67) 0.05
mg/L-1 de ANA y 0.2 mg/L-1 Kinetina que a su vez fueron similares entre sí.
31
Error: 0,1852 gl: 18
a3: 0.1 ANA b3: 0.3 Kinetina 3,33a 3 0,25
a3: 0.15 ANA b3: 0.3 Kinetina 3,00a 3 0,25
a3: 0.15 ANA b2: 0.1 Kinetina 2,67ab 3 0,25
a2: 0.15 ANA b1: 0.2 Kinetina 2,00bc 3 0,25
a2: 0.1 ANA b2: 0.3 Kinetina 2,00bc 3 0,25
a2: 0.5 ANA b1: 0.1 Kinetina 2,00c 3 0,25
a1: 0.1 ANA b2: 0.1 Kinetina 1,67c 3 0,25
a1: 0.5 ANA b3: 0.2 Kinetina 1,67c 3 0,25
a1: 0.5 ANA b1: 0.3 Kinetina 1,67c 3 0,25
Medias con una letra común no son significativamente diferentes (p > 0,05) Larreta, 2021
Los resultados de las cantidades de los números de hojas se exhiben en la tabla
4. En esta se reporta que no existió significancia entre los tratamientos, no
obstante, el T8 presentò el mayor número con 2.67 hojas mientras que el T1 logró
apenas 1.67 hojas.
Error: 0,5926 gl: 18
Tabla 4. Resultados de cantidades de hojas obtenidas.
Tabla 3. Resultados de números de plantines.
32
Larreta, 2021
4.3 Obtener plantines viables a partir de explantes por la vía de la
embriogénesis directa
Se logró la obtención de plantines a partir de embriones cigóticos inmaduros de
(Lima x limetta) los cuales lograron caracteristicas de vigorosidad y viabilidad para
su posible transplante.
Los resultados de la longitud de los plantines se presentan en la tabla 5 a
continuación. En ella se observa que las medias de los tratamientos presentaron
significancia, siendo el T8 (8,37 cm) y T9 (8,23 cm) estadisticament iguales y al
mismo tiempo superiores a los demás; ambos se lograron con la misma
concentración de 0.15 mg/L-1 de ANA y 0.2 y 0.3 mg/L-1 de kinetina
respectivamente. El T1 presentó el crecimiento más bajo con las concentraciones
de hormonas de 0.5 mg/L-1 de ANA y 0.1 mg/L-1 de Kinetina alcanzando una altura
de 4,63 cm.
Tabla 5. Resultados de la longitud (cm) de plantines Test de Duncan Alfa=0.05 Error: 0.0141 gl:18
Factor A (ANA)
Factor B (Kinetina)
Media n E.E
a3: 0.15 ANA b2: 0.2 Kinetina 8,37a 3 0,07
a3: 0.15 ANA b3: 0.3 Kinetina 8,23a 3 0,07
a3: 0.15 ANA b1: 0.1 Kinetina 7,43b 3 0,07
a2: 0.1 ANA b2: 0.2 Kinetina 7,37b 3 0,07
a2: 0.1 ANA b2: 0.3 Kinetina 2,33a 3 0,44
a2: 0.5 ANA b1: 0.2 Kinetina 2,33a 3 0,44
a1: 0.1 ANA b2: 0.1 Kinetina 2,00a 3 0,44
a1: 0.5 ANA b3: 0.2 Kinetina 2,00a 3 0,44
a1: 0.5 ANA b1: 0.1 Kinetina 1,67a 3 0,44
Medias con una letra común no son significativamente diferentes (p > 0,05)
33
a2: 0.1 ANA b3: 0.3 Kinetina 7,27bc 3 0,07
a2: 0.1 ANA b1: 0.1 Kinetina 7,13c 3 0,07
a1: 0.5 ANA b2: 0.2 Kinetina 5,27d 3 0,07
a1: 0.5 ANA b3: 0.3 Kinetina 5,10d 3 0,07
a1: 0.5 ANA b1: 0.1 Kinetina 4,63e 3 0,07
Medias con una letra común no son significativamente diferentes (p > 0,05) Larreta, 2021
34
5. Discusión
Los crecimientos de los plantines, cuyo tejido inicial fue desifectado empleando
un protocolo que incluyó 6 disoluciones no presentaron mayor perjuicio a los
explantes dbeido a que no se observó el necrosamiento caracteristico en los tejidos
del ensayo. Esto pudo deberse al tiempo de exposición de los tejidos a las
disoluciones preparadas las cuales no superaron el minuto de inmersión como en
el caso del NaClO cuya concentración utilizada fue de apenas el 1%, durante un
minuto de tiempo de inmersión.
Se han reportado diferencias significativas, en estudios comprobatorios de los
tiempos de inmersión de tejido vegetal, donde se han evaluado tiempos entre 15 y
20 minutos utilizando hipoclorito de sodio resultando en menores tasas de
contaminación frente a tiempos menores a 10 minutos alcanzando una
contaminación de hasta el 45% de los tejidos. (Ayala, 2012)
Los plantines de lima obtenidos in vitro respondieron mejor a la concentración
hormonal de ANA+Kinetina más alta probablemente a que esta dosis pudo generar
mayor estímulo a las células para multiplicarse.
Se consiguió el enraizamiento de plantines de Senecio calvus Cuatr., empleando
0.01 g/L-1ª de ANA y AG3 l por igual ogrando tasas superiores al 70 % dentro de un
tiempo de 48 días a 20,0 ºC ± 2 ºC de temperatura en cámara de incubación y un
fotoperiodo de 16/8 horas de oscuridad/luz (Cueva L., 2015)
Se logró el crecimiento de plantines de melón a partir de embriones cigóticos
sometidos a diferentes temperatura de agua de riego obteniendo los mejores
resultados a partir de los 30 ºC con un tiempo de 18.04 días de germinación
(Escalante F., 2015).
35
Algunos autores revelan que en plantines de Eucalyptus grandis y E. globulus
lograron el crecimiento en sustrato inoculado con Trichoderma harzianum utilizando
semilla escogida de manera artesanal la cual tuvo que ser sometida a un
procesamiento de humedecimiento previo (Kurioka, Martirena, & Mulvany, 2013).
Los platntines de cacao presentaron características de viabilidad debido a que
crecieron fuertes con buena tonalidad y robustez típica de materiales que se han
desarrollado de manera eficiente en medio de cultivo que ha cubierto sus
requerimientos y necesidades nutritivas. Se asume que la respuesta celular fue la
adecuada frente a las condiciones del cultivo.
Hernández y col., (2013) desinfectó semillas de limón (C. aurantifolia) empleando
NaClO al 1.0 % durante 20 minutos alcanzando supervivencias de hasta el 88%
de los tejidos de embriones cigóticos que se convirtieron en plantines. Estos autores
informan que los plantines fueron 95 % viables.
Hurtado (2011), no logró obtener plantines viables de limón mexicano empleando
una concentración hormonal de 5 ml/L de kinetina y 1 ml/L de 2,4 D. Los tejidos los
obtuvieron de embriones cigóticos de la misma especie.
36
6. Conclusiones
En respuesta al problema de investigación: ¿La vía de la embriogénesis directa en
un cultivo in vitro de explantes de lima podría convertirse en un método de
propagación adecuado?, se llega a las siguientes conclusiones:
- Se puede obtener plantines de lima mediante el protocolo desarrollado en la
presente tesis
- Las hormonas ANA y L-Kinetina fueron capaces de promover la formación de
plantines de lima a partir de segmentos caulinares provenientes de semillas
germinadas in vitro
- Los plantines obtenidos presentaron subjetivamente características de viabilidad
En función de los resultados y la discusión planteada, se acepta la hipótesis
“Mediante cultivo in vitro empleando la vía de la embriogénesis directa se pueden
producir plantines de lima”.
En base de las conclusiones se plantean las siguientes recomendaciones:
- Evaluar otros tejidos de lima como los foliares o las yemas axilares para
determinar su totipotencia
- Establecer la efectividad de otras dosis incluso mas bajas de las hormonas
empleadas en el presente estudio
- Comparar si estos procedimientos descritos se pueden aplicar a otros cítricos
38
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ca2723712249429/Protocolos-de-desinfeccion-de-explantes-durante-la-
48
Tabla 6. Análisis de varianza de la longitud de los plantines
Tabla 7. Análisis de vaarianza del número de plantines
9. Anexos
Longitud de Plantines (cm) Variable N R² R² Aj CV Longitud de Plantines (cm).. 27 0,99 0,99 1,76 Cuadro de Análisis de la Varianza (SC tipo III) F.V. SC gl CM F p-valor Modelo 46,43 8 5,80 412,40 <0,0001 Factor A (ANA) 44,18 2 22,09 1569,39 <0,0001 Factor B (Kinetina) 0,62 2 0,31 22,03 <0,0001 Factor A (ANA)*Factor B (K.. 1,64 4 0,41 29,09 <0,0001 Error 0,25 18 0,01 Total 46,69 26 Test:Duncan Alfa=0,05 Error: 0,0141 gl: 18 Factor A (ANA) Factor B (Kinetina) Medias n E.E. a3: 0.15 ANA b2: 0.2 Kinetina 8,37 3 0,07 A a3: 0.15 ANA b3: 0.3 Kinetina 8,23 3 0,07 A a3: 0.15 ANA b1: 0.1 Kinetina 7,43 3 0,07 B a2: 0.1 ANA b2: 0.2 Kinetina 7,37 3 0,07 B a2: 0.1 ANA b3: 0.3 Kinetina 7,27 3 0,07 B C a2: 0.1 ANA b1: 0.1 Kinetina 7,13 3 0,07 C a1: 0.5 ANA b3: 0.3 Kinetina 5,27 3 0,07 D a1: 0.5 ANA b1: 0.1 Kinetina 5,10 3 0,07 D a1: 0.5 ANA b2: 0.2 Kinetina 4,63 3 0,07 E Medias con una letra común no son significativamente
diferentes (p > 0,05)
Plantines/UE Variable N R² R² Aj CV Plantines/UE 27 0,74 0,62 19,36 Cuadro de Análisis de la Varianza (SC tipo III) F.V. SC gl CM F p-valor Modelo 9,33 8 1,17 6,30 0,0006 Factor A (ANA) 2,89 2 1,44 7,80 0,0036 Factor B (Kinetina) 2,89 2 1,44 7,80 0,0036 Factor A (ANA)*Factor B (K.. 3,56 4 0,89 4,80 0,0082 Error 3,33 18 0,19 Total 12,67 26
49
Tabla 8. Análisis de varianza del número de hojas
Test:Duncan Alfa=0,05 Error: 0,1852 gl: 18 Factor A (ANA) Factor B (Kinetina) Medias n E.E. a2: 0.1 ANA b3: 0.3 Kinetina 3,33 3 0,25 A a3: 0.15 ANA b3: 0.3 Kinetina 3,00 3 0,25 A a3: 0.15 ANA b2: 0.2 Kinetina 2,67 3 0,25 A B a3: 0.15 ANA b1: 0.1 Kinetina 2,00 3 0,25 B C a2: 0.1 ANA b2: 0.2 Kinetina 2,00 3 0,25 B C a1: 0.5 ANA b1: 0.1 Kinetina 2,00 3 0,25 B C a2: 0.1 ANA b1: 0.1 Kinetina 1,67 3 0,25 C a1: 0.5 ANA b2: 0.2 Kinetina 1,67 3 0,25 C a1: 0.5 ANA b3: 0.3 Kinetina 1,67 3 0,25 C Medias con una letra común no son significativamente
diferentes (p > 0,05)
Variable N R² R² Aj CV Número de hojas/plantín 27 0,19 0,00 34,07 Cuadro de Análisis de la Varianza (SC tipo III) F.V. SC gl CM F p-valor Modelo 2,52 8 0,31 0,53 0,8179 Factor A (ANA) 0,52 2 0,26 0,44 0,6523 Factor B (Kinetina) 0,96 2 0,48 0,81 0,4594 Factor A (ANA)*Factor B (K.. 1,04 4 0,26 0,44 0,7798 Error 10,67 18 0,59 Total 13,19 26 Test:Duncan Alfa=0,05 Error: 0,5926 gl: 18 Factor A (ANA) Factor B (Kinetina) Medias n E.E. a3: 0.15 ANA b3: 0.3 Kinetina 2,67 3 0,44 A a3: 0.15 ANA b2: 0.2 Kinetina 2,67 3 0,44 A a2: 0.1 ANA b3: 0.3 Kinetina 2,33 3 0,44 A a2: 0.1 ANA b1: 0.1 Kinetina 2,33 3 0,44 A a1: 0.5 ANA b3: 0.3 Kinetina 2,33 3 0,44 A a1: 0.5 ANA b2: 0.2 Kinetina 2,33 3 0,44 A a3: 0.15 ANA b1: 0.1 Kinetina 2,00 3 0,44 A a2: 0.1 ANA b2: 0.2 Kinetina 2,00 3 0,44 A a1: 0.5 ANA b1: 0.1 Kinetina 1,67 3 0,44 A Medias con una letra común no son significativamente
diferentes (p > 0,05) Larreta, 2021
50
tudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión E
Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil tudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión E
Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil tudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión E
Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil tudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión E
Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil tudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión E
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Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil tudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión E
Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil tudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Es
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Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil tudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Es
Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil tudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Es
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Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil tudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Es
Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil
Longitud de Plantines (cm)-b1: 0.1 Kinetina Longitud de Plantines (cm)-b2: 0.2 Kinetina Longitud de Plantines (cm)-b3: 0.3 Kinetina
a1:0.5 ANA a2:0.1 ANA a3:0.15 ANA Factor A (ANA)
4,45
5,47
6,50
7,53
8,55
m )
Longitud de Plantines (cm)-b1: 0.1 Kinetina Longitud de Plantines (cm)-b2: 0.2 Kinetina Longitud de Plantines (cm)-b3: 0.3 Kinetina
tudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudian
Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versió tudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudian
Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versió tudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudian
Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versió tudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudian
Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versió tudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudian
Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versió tudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudian
Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versió tudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudian
Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versió tudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudian
Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versió tudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudian
Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versió tudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudian
Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versió tudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudian
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Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versió tudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudian
Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versió tudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudian
a1:0.5 ANA a2:0.1 ANA a3:0.15 ANA F t A (ANA)
2
2
3
3
3
Figura 1. Longitud de plantines bajo las concentraciones hormonales Larreta, 2021
51
Número de hojas/plantín-b1: 0.1 Kinetina Número de hojas/plantín-b2: 0.2 Kinetina Número de hojas/plantín-b3: 0.3 Kinetina
a1:0.5 ANA a2:0.1 ANA a3:0.15 ANA Factor A (ANA)
2
2
2
2
3
Número de hojas/plantín-b1: 0.1 Kinetina Número de hojas/plantín-b2: 0.2 Kinetina Número de hojas/plantín-b3: 0.3 Kinetina
Figura 1. Número de hojas de los plantines obtenidos bajo las concentraciones hormonales Larreta, 2021
Figura 2. Número de plantines obtenidos bajo las concentraciones hormonales Larreta, 2021
52
Figura 2. Realizando cálculos de los materiales para la preparación de los medios con hormonas. Larreta, 2021
Figura 3. Fitohormonas utilizadas en el experimento. Larreta, 2021
53
Figura 4. Mediciòn de pH para la preparaciòn del medio cultivo. Larreta , 2021
Figura 5. Medio de cultivo preparado para la ditribuciòn en los envases y posterior siembra. Larreta, 2021
54
Figura 6. Realizando la desinfecciòn de la cabina de flujo para proceder a siembrar. Larreta,2021
Figura 7. Realizando siembra en la cabina de flujo. Larreta, 2021
55
Figura 9. Medio de cultivo solidificado con la siembra realizada. Larreta, 2021
Figura 8. Monitorizaciòn en cámara de incubación. Larreta, 2021
56
57
58
Figura 14. Plantines de lima en su último estadio luego del trabajo de investigación en laboratorio. Larreta, 2021
APROBACIÓN DEL TUTOR
Agradecimiento
1.2.1 Planteamiento del problema
1.2.2 Formulación del problema
1.5 Objetivo general
1.6 Objetivos específicos
2. Marco teórico
2.2.6.1 Multiplicación
2.2.6.2 Enraizamiento
2.2.6.3 Aclimatización
2.3 Marco legal
3.1.1 Tipo de investigación
3.1.2 Diseño de investigación
4. Resultados
4.1 Proponer un protocolo de desinfección de los explantes de lima
4.2 Identificar la concentración hormonal más eficiente en micropropagación
4.3 Obtener plantines viables a partir de explantes por la vía de la embriogénesis directa
5. Discusión
6. Conclusiones
7. Recomendaciones
8. Bibliografia
9. Anexos