Gema Ancillo

Germoplasmadecítricos y filogenética(Citrus germplasm and phylogenetics')

Centro de Protección Vegetal yBiotecnología. Instituto Valenciano deInvestigaciones Agrarias (IVIA)Carretera Moncada-Náquera, Km. 4.5,

| 46113. Moncada (Valencia), Spain.

Email: ancillo E ivia.es

La agricultura actual ha supuesto elabandono de las variedades tradiciona-les ya que esta basada en unas pocasvariedades seleccionadas de alto rendi-miento. Esta situación, junto con la pérdi-da de muchas especies silvestres queesta teniendo lugar como consecuenciade la deforestación, esta produciendouna fuerte erosión y pérdida de recursosfitogenéticos que son el fruto de miles deaños de evolución y que contienen losgenes o combinaciones de genes rela-cionados con caracteres de interés,como pueden ser la resistencia a patóge-nos, a condiciones ambientales adver-sas, la producción, la calidad y compues-tos nutricionales de los frutos, etc.

Los recursos fitogenéticos son labase para la mejora genética de los culti-vos y son esenciales para la adaptacióna los cambios imprevisibles del medioambiente y las necesidades humanasfuturas.

El establecimiento de políticas globa-les para la conservación y utilización delos recursos fitogenéticos llevó a la FAO(que a nivel internacional, tiene una polí-tica muy activa en este campo)a la firmadel Tratado Internacional de RecursosFitogenéticos para la Alimentación y laAgricultura en el 2001. El Tratado facilitala participación en la utilización de recur-sos fitogenéticos a través del intercambiode información, el acceso a la tecnologíay su transferencia, y la creación de capa-cidad. También consta de programas deayuda destinados, sobre todo, a los

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pequeños agricultores de países endesarrollo. En 2004 se creo el FondoMundial para la Diversidad de Cultivosque lidera los esfuerzos internacionalespara dotar de recursos a las coleccionesde material filogenético de importanciainternacional. El Fondo constituye un ele-mento muy importante en la estrategia definanciación del Tratado, apoyando deforma específica la conservación ex situde la diversidad genética de los cultivos.El Tratado y la Comisión contribuyen, enformas distintas pero mutuamente com-plementarias, a asegurar la conservacióny la utilización sostenible de los recursosfitogenéticos.

La sesión número 1 del XII CongresoInternacional de Cítricos (1CC2012), titu-lada “Germoplasma de cítricos y filo-genética” se enmarca dentro de estecontexto y su principal objetivo fue el deponer en comúnel estado actual del ger-moplasma de cítricos y visualizar losretos y necesidades futuras para crearestrategias globales que permita a loscientíficos adelantarse a ellas. En cítri-cos, existe una gran variabilidad genéticaque incluye características fenotípicas yhortícolas, resistencia a enfermedades,longitud del periodo de juvenilidad, adap-tación a las condiciones del suelo o tole-rancia al frío. Los frutos pueden presen-tar un amplio rango de variabilidad entamaño y color, y diferentes componen-tes relacionados con la salud (vitaminas,carotenoides, antocianos, etc). Parapoder ser utilizada, esta variación debeser caracterizada e identificada adecua-damente, ya que esta caracterización esfundamental en cualquier estrategia deconservación y de mejora genética.

En esta sesión se presentaron untotal de 18 comunicaciones procedentesde ocho países diferentes: EstadosUnidos, España, Francia, China, Japón,Italia, India y Túnez. Seis de ellas fueron

seleccionas en forma de comunicaciónoral tratando de incluir la mayor repre-sentatividad posible de países y utilizan-do como criterio la calidad e interés delos trabajos.

España y Francia mantienen desdeel2005 un acuerdo marco de colabora-ción entre el grupo de genética de cítri-cos del CIRAD-INRA de la Estación deSan Giuliano en Córcega (Francia) lide-rado por los doctores. P. Ollitrault y F.

Luro (respectivamente) y el grupo demejora genética y sanitaria del IVIA(España) liderado porel prof. L. Navarro.Esta colaboración garantiza una coordi-nación muy estrecha entre los dos ban-cos de germoplasma de España yFrancia, en aspectos relacionados con elintercambio de genotipos y el estable-cimiento de protocolos similares para lacaracterización morfológica y molecu-lar de los genotipos incluidos. El principalobjetivo para este acuerdo fue el de crearun fuerte grupo de genética y mejora decítricos en la Unión Europea que puedaser líder en esta área a nivel internacio-nal. Así parece demostrarlo la cantidad ycalidad trabajos presentados por ambosgrupos que muestran una gran actividadinvestigadora en el campo tanto en elmarco de la colaboración como indepen-dientemente, con un total de 6 comunica-ciones presentadas (2 orales y 4 pos-ters), constituyendo un tercio del total delas comunicaciones presentadas en estaárea. Entre estos trabajos se encuentrael presentado por A. Garcia-Lor titulado“Diversidad genética y estructura pobla-cional del germoplasma de mandarinarevelado por análisis de marcadoresnucleares y mitocondriales”. Este trabajoes de gran importancia ya que las man-darinas (C. reticulata) están considera-das como una de las cuatro especiesancestrales involucradas en el origen detodos los cítricos cultivados. Sinembargo, la clasificación del germoplas-

ma de mandarina es todavía muy contro-vertida y se sabe, o se sospecha, queexisten numerosos casos de introgresiónde otras especies en este germoplasma.El objetivo principal de este trabajo fueanalizar la estructura de la diversidadgenética de germoplasma de mandarinay su relación con las otras especies decítricos. Para ello se genotiparon 50 mar-cadores microsatélites (SSR), 25 marca-dores de inserción-deleción (indel) nucle-ares y cuatro marcadores indel mitocon-driales para 223 accesiones. Posterior-mente se aplicó el programa informático'Structure' para verificar y cuantificar lasposibles introgresiones interespecíficasen el germoplasma de mandarina, sobretodo del genoma de pomelo y papeda.Se seleccionaron aquellos mandarinosen los que no se identificaron introgresio-nes y se volvió a analizar esta selecciónmediante el programa “Structure”. Losresultados clasificaron este germoplas-ma en siete grupos, cinco de ellos demandarinos básicos y otros dos en losque se incluyen genotipos de origenhibrido (conocido o supuesto). Se estimóla contribución de estos grupos a losgenotipos de mandarinos. El análisismitocondrial INDEL reveló ocho mitoti-pos, en cuatro de los cuales esta repre-sentado el germoplasma de mandarina.Este trabajo aporta nuevos conocimien-tos en la organización del germoplasmade mandarina y su estructura y gracias aello, se han podido establecer diferentescolecciones nucleares. Esto permitiráuna mejor gestión y uso de las coleccio-nes de germoplasma de cítricos y seráde gran utilidad para realizar estudios degenética de asociación. La genética deasociación es aquella que busca identifi-car variables genéticas causales implica-das en la variación de un carácter deinterés (en este caso de interés agronó-mico) en una población.

Dentro del mismo grupo de coopera-ción franco-española, otra presentaciónde gran interés tanto por la importancia desus resultados como por la utilización demetodología de primera línea fue la pre-sentada por F. Curk y titulada “Identifi-cación de haplotipos multilocus porsecuenciación paralela para descifrar laestructura interespecífica en mosaico delgenoma de los cítricos cultivados”. Eneste trabajo se parte de la base de quelos genomasde la mayoría de loscítricosque se cultivan actualmente son mosai-

cos formados por grandes fragmentos deADN procedentes de un número limitadode eventos mejióticos interespecíficos. El

grupo ha desarrollado una nueva meto-dología que permite realizar la asigna-ción filogenética de esos grandes frag-mentos de ADN para las principales espe-cies cultivadas, que consiste en el diseñode primers universales para amplificar losfragmentos de ADN en dos pasos dePCR (uno que da especificidad de frag-mento y otro que da la especificidad degenotipo) que posteriormente sonsecuenciados por la tecnología de 454(Roche). Este método se aplicó a 192fragmentos de DNA para la identificaciónde haplotipos multilocus, y a 48 genotiposde cítricos. El nivel de polimorfismoencontrado fue suficiente para diferenciarineguívocamente las especies básicas(ancestrales) y permitir la asignación delorigen filogenético para cada haplotipo delas especies secundarias. Esto ha permi-tido sacar conclusiones muy importantescomo por ejemplo, que la naranja dulceno es un híbrido directo entre C. reti-culada y C. maxima como se pensaba,sino un híbrido entre una mandarinacon introgresión de C. maxima y unpumelo con introgresión de C. reticula-ta. La metodología puesta a punto poreste grupo supone una herramienta muypoderosa para descifrar la estructura inte-respecífica en mosaico del genoma deloscítricos cultivados.

David Karp presentó la comunicacióntitulada “Germoplasma de cidro enYunnan, China”. En ella se palanteó que apesar de que el suroeste de China, nores-te de India y regiones adyacentes son elcentro de origen y diversidad del cidro(Citrus medica L.), se conoce muy pocoacerca de los recursos de germoplasmade cidro en este área. Estos recursosestán siendo rápidamente erosionadosdebido al aclarado de los bosques y alabandono del cultivo de cidro por parte delos agricultores, cambiándolo por otroscultivos más beneficiosos. En el año 2008comenzó el Proyecto Chino de Germo-plasma de Cidro y científicos chinos yestadounidenses viajaron por la provinciade Yunnan y sus alrededores para obser-var y recolectar nuevo germoplasma decidro así como prácticas hortícolas, usoseconómicos, así como usos de esquejes ysemillas, y todo ello se utilizó para esta-blecer un banco de germoplasma con 30accesiones en Jianshui, Yunnan. Algunos

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[€]07.0 ¡[Teleaede los resultados de sus observacionesson que los cidros silvestres suelen tenerfrutos más pequeños y cortezas más del-gadas que los cultivares comerciales.Dado que la corteza es la parte económi-camente más valiosa, para conservar ycomer en fresco, es probable que a lolargo de los siglos, los agricultores hayanido seleccionando este carácter en lasvariedades comerciales. La mayoría delos cidros sin digitaciones que crecen enYunnan tiene albedos espesos y dulces, yno presentan vesículas de zumo. Algunoscrecen hasta alcanzar incluso los 15 kg, lo

que hacedeellos los cítricos mas grandesconocidos (puede observarse el tamañode estos cidros en la figura 1, fotografíacedida por D. Karp). Los cidros digitados(Mano de Buda) se cultivan principalmen-te como plantas ornamentales, y se usantambién en medicina tradicional china y,confitado, como alimento en cocina.Existen multitud de cultivares de cidrosque varían en color de la flor, el tamaño, elgrosor de los dedos, y el punto en el quelos dedos se ramifican desde el cuerpo dela fruta (en la figura 2 puede verse comoejemplo uno de estos cidros en una foto-grafía cedida por D. Karp)

El doctor Ding Feng y su grupo delAgricultural Collage de la Universidad deGuangxi, presento la comunicación titula-da “Estudio de la diversidad genética de39 accesiones de germoplasma de cidrocon marcadores Scot y ISSR”, aunque enrealidad los resultados que se mostraronhacían referencia a la utilización demarcadores moleculares para examinarla diversidad genética y las relacionesfilogenéticas entre 39 accesiones no decidros, sino de limas y limones. Los 18iniciadores utilizados (9 SCoT y 9 ISSR)permitieron calcular los porcentajes depolimorfismosy dividir las 39 accesionesen seis grupos y cinco grupos (en el casode los marcadores SCoT y ISSR respec-tivamente). Cabe destacar de entre susresultados que todas las accesiones deCitrus limonia aparecieron en un grupodiferente a las accesiones introducidasdesde Europa y América. Otra conclusiónimportante de este trabajo fue que aun-que ambos tipos de marcadores pudierondiscriminar grupos entre si (como laslimas y los limones), el análisis con losmarcadores SCoT da mucha mayor infor-mación y es masútil en la identificaciónde cultivares muy próximos.

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Figura 1. Puesto de venta de cidros a pie de carretera en Yunnan (China)(Fotografía cedida por D. Karp).

, [A as N xoe E Figura 2. Cidro (mano de Buda) sin pulpa ni semillas recolectado porZ “ _ D. Karp en Yunnan (China) (Fotografía cedida por D. Karp).o d NR E 7 A(|PALITO

; Ur — S Figura 3. Ejemplo de diversidad del Banco de Germplasma del INRA-CIRAD de la- o. - Estación de San Giuliano en Córcega (Francia). (Fotografía cedida por F. Curk)

Figura 4. Parcelas y ejemplares de la colección de campo del Banco de Germoplasmadel IVIA. (Fotografía cedida por C. Navarro)

Figura 5. En los recintos de malla anti-pulgón las plantas se mantienen en contenedoresde 70 cm de diámetro con fertirrigación automatizada.

GERMOPLASMA Y FILOGENETICA

El grupo del doctor T. Shimizu delNARO Institute of Fruit Tree Science deJapon presentó un estudio sobre el ori-gen de las variedades enanas y sinespinas de naranjas trifoliadas deduci-do del análisis de genotipado a nivelgenomico. El Poncirus trifoliata L. escomúnmente utilizado en Japón comopatrón. Disponen de varias variedadesque difieren en cuanto a la altura o mor-fología del árbol pero no se conoce nadaacerca de su origen filogenético. Con elfin de profundizar en ello este grupo rea-lizó una comparación de tres variedades,una naranja trifoliada que carece deespinas en la axila de la hoja y dosnaranjas trifoliadas enanas. El genotipa-do se realizó con 289 marcadores SSRrepartidos a lo largo de todo el genoma ylas conclusiones que se pudieron extraerdel análisis fueron que una de las naran-jas enanas, la variedad “Hiryu” (Flyingdragon), es una mutación espontánea dela accesión de Poncirus trifoliata queexiste en su colección, mientras que laotra variedad enana, la “Unryu” se ha ori-ginado por autopolinización y mutaciónen un locus determinado.

Las semillas de cítricos pierdenrápidamente la viabilidad y la mayoríade ellas son sensibles a la desecación,por lo que no existen métodos que ase-guren su conservación. Las coleccionesde plantas cultivadas en recintos demalla tiene riesgo de pérdida de genoti-pos (especialmente sensibles a las bajastemperaturas) y las de campo son vulne-rables a los daños causados por enfer-medades, plagas, climatologías adver-sas o desastres naturales. La criocon-servación es una alternativa segura quepermite garantizar la conservación alargo plazo y que permitiría disminuir elnúmero de plantas vivas que se mantie-nen de cada genotipo en campo o recin-to de malla, lo que permitiría una reduc-ción a medio/largo plazo de los costos demantenimiento de los bancos de germo-plasma, sin perder ninguna ventaja. Losprotocolos que en la actualidad se estánutilizando para la crioconservacion degenotipos consisten en llevar tejidos ycélulas vegetales a condiciones talesque la división celular y el metabolismose encuentren totalmente parados y sepuedan conservar a temperaturas muybajas (generalmente nitrógeno liquido a -

196*%C). Es lo que se denomina un calloembriogénico. Esta forma de mante-

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ner el germoplasma mantiene todaslas ventajas de las colecciones decampo o de malla pues los callosembriogénicos crioconservados puedenutilizarse directamente para la mejora delos cítricos mediante técnicas de fusiónde protoplastos y de transformacióngenética, es un método rápido, sencillo,no altera la estabilidad genética delmaterial y reduce sustancialmente elesfuerzo y los costes que representan elmantenimiento de colecciones de germo-plasma vegetal in vivo o in vitro, al elimi-nar casi por completo la mano de obra yevitar los riesgos fitopatológicos y fisioló-gicos que habitualmente aparecen. Aun yasí es una metodología que requieremano de obra especializada, que requie-re de entrenamiento y no todos los ban-cos de germoplasma de cítricos la hanimplementado. En este contexto, elUnited States Department of Agriculture,Agricultural Research Service (USDA-ARS) representado por la doctoraG.M.Volk, presentó los últimos avancesen “Criopreservación de cítricos para suconservación a largo plazo” que está lle-vando a cabo su grupo. El método queellos están tratando de poner a punto,parte de yemas cortadas directamente dela planta fuente en el campo o en el recin-to de malla. Posteriormente se esterilizala superficie de las yemasy se tratan concrioprotectores que las desecan y lespermiten sobrevivir a la exposición alnitrógeno líquido. De esta manera, lasplantas pueden ser recuperadas pormicroinjerto dejando descongelar layema en una plántula de “carrizo” usadacomo patrón. Las ventajas que presentaeste nuevo método es que no hay rever-sión de las plantas al estado juvenil por loque es mas rápido regenerar plantas(algunos genotipos florecen a los 13-15meses tras la crioexposición). Las des-ventajas son, en primer lugar, su baja efi-ciencia de recuperación (50% frente al100% obtenido con el método de callosembriogénicos que se usa por ejemploen el IVIA), y en segundo lugar, que sibien puede ser utilizado ampliamentepara conservación de material sano, enel caso de material infectado solo es apli-cable en aquellos caso en la enfermedadpueda ser erradicada por técnicas decrioterapia.

También dentro de la temática de lasesión se organizó el Workshop “Estra-tegia global de conservación para los

recursos genéticos de cítricos”.Existen colecciones de germoplasma decítricos de mayor o menor extensión enmultitud de países del mundo: España,Francia, Estados Unidos, China, Brasil,Australia, Italia, Japón, Israel, Sudáfrica,Tailandia, Marruecos, Vietnam, Argen-tina, Uruguay, Argelia, Turquía, y algunasotras de menor importancia. El objetivoprincipal de este wor-shop era tratar deorganizar una estrategia global para laconservación del germoplasma de cítri-cos según se había especificado en elInternational Treaty on Plant GeneticResources for Food and Agriculture(ITPGR) y surge de la necesidad de rea-lizar una revisión del germoplasma exis-tente a nivel internacional. Para ello seha propuesto realizar una encuesta atodos los bancos de germoplasma decítricos del mundo que quieran participaren esta iniciativa con el, quizá, objetivoultimo de unificar toda la información enuna base de datos conjunta que puedaestar disponible públicamente. Esto a suvez permitirá, entre otras múltiples cues-tiones, tener una visión global de cuantoestán afectando enfermedades y plagas,también actualizar los protocolos para elmovimiento seguro de germoplasmaentre diferentes países, etc. Un breveresumen del contenido del taller es lasiguiente:

1) Discusión de la encuesta a realizarpara resumir información institucional delas colecciones, diversidad in situ, formasde conservación, instalaciones, efecto delas plagas y enfermedades en la recogi-da, tipos de datos recogidos, almacena-miento de datos y métodos de gestión,distribución, seguridad a largo plazo delas colecciones, costos anuales, proce-dencia de los fondos, etc

2) Establecimiento de grupos de tra-bajo para desarrollar o actualizar los pro-tocolos para el movimiento seguro delgermoplasma.

3) Discusión de estrategias alternati-vas de conservación (criogenia, cultivode tejidos).

4) Estrategias para conseguir el

apoyo de la industria para la conserva-ción de germoplasma.

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GERMOPLASMA Y FILOGENÉTICA

Los países con las colecciones másimportantes a nivel internacional presen-taron sus bancos de germoplasma y susmodelos de gestión al resto de la comu-nidad científica a través de sus máximosresponsables. China es uno de los paí-ses mas importantes no solo por suscolecciones ex situ, si no por la gran can-tidad de germoplasma in situ que posee.No hay que olvidar que es un centro deorigen y diversificación de germoplasmade cítricos y debido a ello cuentan conuna riqueza incalculable. El profesorXiung Deng presentó el Banco deGermoplasma de la Universidad deWuhan (China) que, junto con el delCitrus Research Institute de Chaonggingson los más importantes a nivel nacional.Estados Unidos posee dos bancos degermoplasma uno en Florida y otro enRiverside (California) de mayor importan-cia y en mejor estado de conservación.Tracy Khan presentó el banco de germo-plasma de la Universidad de California,una de los mejor caracterizados delmundo con más de 1.000 accesiones. El

doctor Marcos Machado presentó lacolección del Centro de Citricultura SylvioMoreira de Cordeiropolis (Sao Paulo) conmás de 2.000 accesiones. El doctorFrancois Luro del INRA presentó elbanco de germoplasma del INRA-CIRADde la Estación de San Giuliano enCórcega (Francia, figura 3)* que constade 1.111 accesiones y que junto con elespañol es el más importante de Europa.La doctora Shara Ashmore presentó lacolección australiana focalizando la aten-ción de la comunidad científica en el peli-gro de la pérdida de algunas especies sil-vestres endémicas australianas de graninterés (principalmente del genero Micro-citrus y Eremocitrus) debido a la falta desoporte económico que está sufriendo ensu país el área de los recursos fitogenéti-cos. Y, finalmente el Banco de Germo-plasma de cítricos del Instituto Valen-ciano de Investigaciones Agrarias fuepresentado por la doctora Gema Ancillo.Dicho banco se inició en 1975 y su obje-tivo principal fue, y es, el mantenimientode genotipos que incluyan la mayorvariabilidad genética posible en el géne-ro Citrus y los géneros afines de la sub-familia Aurantioideae. Tiene como carac-terísticas fundamentales, en primer lugar,que todos los genotipos se someten a unproceso de saneamiento y sólo se man-

*Fotografía cedida por F. Curk

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tienen genotipos libres de patógenostransmisibles por injerto y, en segundolugar, que gracias al minucioso y conti-nuado proceso de evaluación y caracteri-zación de genotipos que se llevan a cabode manera rutinaria y sistemática en elbanco, no existen genotipos duplicadosen la colección española, por ello elnumero de accesiones es menor que elde otros bancos de germoplasma de cítri-cos en los que si que existen duplicacio-nes (algunos bancos mantienen variasaccesiones de un mismo genotipo). Elbanco del IVIA consta de 620 genotipos(330 seleccionados en España y 290introducidos del exterior a través de laestación de cuarentena). Incluye 425genotipos de 51 especies del géneroCitrus, 53 genotipos de 44 especies de20 géneros afines de los cítricos y 142híbridos intra e interespecíficos. Constade 3 colecciones: La de campo en la quese realiza la evaluación y caracterizaciónde los genotipos (en la figura 4 puedenverse unas parcelas y ejemplares de lacolección, fotos cedidas por C. Navarro).La de recinto de malla anti-pulgón paramantener el material sano y evitar larecontaminación y las pérdidas debidasa estreses abióticos (puede verse unejemplo en la figura 5) y la colección decallos embriogénicos crioconservadosque cuenta con 60 genotipos.

El intercambio de material de cítricosentre diferentes países constituye unriesgo elevado de introducción de nue-vas plagas y enfermedades que en algu-nos casos pueden tener efectos devasta-dores. Por ello existe la necesidad derevisar y actualizar los diferentes proto-colos para el movimiento del germoplas-ma que existen en los diferentes países.A este respecto el modelo español esuna referencia internacional ya queposee el mejor Programa de Sanea-miento a nivel mundial. En España latotalidad del material propagado por losviveros es material sano que parte delBanco de Germoplasma. La Dra. MsCarmen Vives del IVIA, presentó el pro-tocolo español utilizado dentro delPrograma de Saneamiento, explicandodentro de él, la aplicación de la técnicade microinjerto en ápices caulinares a laobtención de plantas sanas a partir deplantas enfermas y puso de manifiestoque la importación de material a través

de las estaciones de cuarentena minimi-zan los riesgos de la importación dematerial de otros países.

Como conclusión de esta reunión derepresentantes de los diferentes paísesen el área del germplasma y la filogeniade los cítricos, podríamos decir que exis-te la conciencia internacional de que adiversidad fitogenética incrementa lasopciones y proporciona un segurocontra futuras condiciones adversas,como por ejemplo los entornos extremosy variables. Sin embargo no solo es fun-damental conservar la diversidad fito-genética, también lo es la utilizaciónsostenible de los recursos fitogenéti-cos. La comunidad científica tiene lacapacidad de mejorar variedades y patro-nes utilizando la extensa fuente de recur-sos fitogenéticos con que cuentan loscítricos, pero antes, esta variabilidadgenética debe ser caracterizada e identi-ficada adecuadamente, ya que estacaracterización es fundamental encualquier estrategia de conservacióny de mejora genética. En el futuro nece-sitaremos de un enfoque global e inte-grado en forma de redes o asociaciones,que reúna internacionalmente a todas laspartes implicadas, desde agricultoreshasta los gestores de los bancos degenes, pasando por los investigadorespara desarrollar mecanismos que permi-tan a los sistemas de cultivo adaptarse alos cambios, como por ejemploel climáti-co, y satisfacer las nuevas necesidadesque irán surgiendo.