PRODUCCIÓN DE INÓCULOS MICROBIANOS Y CURVA DE CRECIMIENTO PARA BACTERIAS NO FILAMENTOSAS

1*Laura Emilia Córdoba Cerquera, 1**Salua Sabad Caro1Facultad de Ciencias, Departamento de Microbiología Industrial,

Pontificia Universidad Javeriana, Bogotá, Colombia.(*cordoba.l@javeriana.edu.co) (** ssabad@javeriana.edu.co )

RESUMEN.

La práctica de laboratorio tiene como objetivos comprender la importancia de la preparación de inóculos para fermentaciones discontinuas; realizar una curva de crecimiento para bacterias, mediante la técnica de densidad óptica para identificar sus fases. A partir de un cultivo estéril de E. coli se igualó un tubo con 10mL de caldo BHI con el Nº2 de la escala de Mcfarland; se incubó durante 12h a 37ºC. Luego se añadió el contenido del tubo a un erlenmeyer con 90mL de caldo BHI estéril; se tomaron 5mL y se tomó absorbancia a 540nm. Se realizó coloración de Gram y se prepararon diluciones seriadas hasta 10-12 en tubos con agua peptonada 0,1% (P/V) y se sembraron por superficie desde 10-8 en agar BHI. Se realizó fermentación discontinua durante 8h, 37ºC y 150rpm; se tomaron muestras a las 0, ½, 1, 1½, 2, 4, 6, 8 horas, a las cuales se les midió absorbancia a 540nm, se realizaron diluciones y se sembró en agar BHI. A partir de alícuotas de cada hora se realizaron diluciones seriadas hasta 10-14 y se sembró desde 10-5 en agar BHI; se incubó por 24h a 37ºC. La absorbancia registrada para el inóculo fue 0,341nm y se observaron bacilos Gram negativos. Concluimos que la implementación de más de una técnica de cuantificación de biomasa garantiza la correcta realización de la curva, con una sola técnica algún factor interno o externo puede afectarla. La sensibilidad del recuento es placa es mucho mayor al reportado por la densidad óptica.

Palabras claves: Inóculo, fermentación, cuantificación, recuento en placa, densidad óptica.

INTRODUCCIÓN

La producción de inóculos y la determinación de la curva de crecimiento de un microorganismo de interés, son importantes en procesos industriales y biotecnológicos; por medio de estos mecanismos es posible optimizar técnicas para la obtención de un metabolito específico (Hoyos, 2004) producido durante una de las fases del crecimiento, por lo tanto, se requiere conocer el tiempo de

duración de dicha fase y el volumen de inóculo necesario para la producción de determinada cantidad de producto.

La preparación del inóculo es el primer paso en el proceso de escalado industrial, pues es a partir de un vial recuperado, y del cultivo de éste, que se hace la es posible la activación de la cepa, posteriormente la producción del microorganismo y, una vez éste se encuentre en fase exponencial, verter dicho inóculo en un volumen mucho mayor de medio para incrementar la producción de biomasa. Cuando se consigue un crecimiento optimo del microorganismo, este comienza la producción del metabolito de interés. Para dichos procesos de escalado industrial, e incluso para los de laboratorio, es necesario el cumplimiento de proporciones entre el volumen del inóculo y el volumen al que se requiere llegar; estas condiciones dependen del tipo de proceso y fermentación que se desee.

De esta manera se busca preparar un inóculo, asociando dicho proceso de fermentación con el desarrollo de curvas de crecimiento, y determinar la importancia enfocada hacia la aplicación de técnicas de cuantificación de biomasa (densidad óptica y recuento en placa), habiendo identificado cada una de las fases de crecimiento de un microorganismo, en procesos de producción de metabolitos de interés industrial.

METODOLOGIA.

Tras la recuperación y activación de una cepa de E. coli conservada, se sembró y homogenizó 0,5mL del contenido del tubo eppendorf en una caja con agar BHI. A partir de dicho cultivo se igualó por técnica netamente cualitativa un tubo con 10mL de caldo BHI con el tubo Nº2 de la escala de Mcfarland. Una vez igualados los tubos, se incubó la suspensión de caldo BHI durante 12h a 37ºC. Cumplido el periodo de incubación se vertió el contenido del tubo incubado (10mL) a un erlenmeyer con 90mL de caldo BHI estéril. Se homogenizó la mezcla y se tomaron 5mL de esta, a partir de los cuales se determinó biomasa por densidad óptica a 540nm; se realizó coloración de Gram para determinar la pureza del cultivo y se prepararon diluciones seriadas en tubos con agua peptonada 0,1% (P/V) hasta 10-12, de las cuales se sembraron por superficie desde 10-8 en agar BHI como método alterno de cuantificación de biomasa.

Culminada la preparación del inóculo, se realizó una fermentación discontinua haciendo uso de un inóculo teniendo en cuenta que éste fuera el 10% del Volumen Efectivo de Trabajo (VET) y de igual manera la relación de dicho volumen con el volumen del erlenmeyer (relación ⅕). Terminada la inoculación se tomó la muestra del tiempo inicial (hora 7), a la cual se le cuantificó la biomasa por espectrofotometría a 540nm y por el método de recuento en placa en agar BHI. La

fermentación tuvo una duración de 8h a 37ºC y 150rpm. Durante el proceso se tomaron muestras a las ½, 1, 1½, 2, 4, 6, 8 horas, a las cuales se practicaron las mismas pruebas que a la muestra inicial.

A partir de alícuotas de cada una de las horas del proceso de fermentación se realizaron diluciones seriadas en solución salina 0,85% (P/V) hasta 10-14 y se sembraron en superficie desde 10-5 en agar BHI. Las cajas sembradas se incubaron por 24h a 37ºC. Se leyeron las cajas e informó.

RESULTADOS.

En la siguiente tabla se reporta lo observado en la coloración de Gram realizada a partir del caldo BHI sembrado a partir del cultivo puro en el que se recuperó la cepa de E. coli.

Cultivo crecido en Caldo BHIColoración de Gram

Bacilos Gram Negativo

Tabla 1. Análisis microscópico mediante coloración de Gram (Aguirre, 2011)

La tabla 2 registra la absorbancia registrada del cado BHI pos-incubación.

Absorbancia 540nm

(hora 0 del inóculo)

Absorbancia Dilución

0,341nm 1/7,5

Tabla 2. Cuantificación de biomasa mediante espectrofotometría (Aguirre, 2011)

Los siguientes resultados fueron los obtenidos a partir de las alícuotas analizadas en el proceso de fermentación discontinua.La tabla 3 muestra los datos de la absorbancia de los tubos de McFarland con las diferentes concentraciones de células/mL.

Concentración (Células/mL)

Promedio de Absorbancia (540 nm)

3,00E+08 0,1946,00E+08 0,2549,00E+08 0,3461,20E+09 0,4221,50E+09 0,5901,80E+09 0,6402,10E+09 0,7382,40E+09 0,802

2,70E+09 0,9033,00E+09 0,9743,00E+08 0,194

Tabla 3. Datos de curva patrón para Nefelómetro de McFarland (Pedroza,2007).

Con los datos de la tabla 3 se realizó la figura 1 y se determinó la ecuación de la recta de la regresión lineal.

Figura 1. Regresión lineal de la curva patrón de McFarland.

Por medio de la ecuación que se halló con la regresión lineal de la figura 1, se determinó la concentración de células/mL para los datos obtenidos en la práctica. La tabla 4 muestra los datos obtenidos en la práctica, además de lo anteriormente mencionado y el logaritmo en base 10 de las UFC/mL.

Tiempo

(h)

Abs. 540nm (nm) Dilución UFC/mlConcentración (Cel./mL)

Log (UFC/mL)

Réplica 1

Réplica 2

PROMEDIO

0 0,185 0,361 0,176 -

0,5 0,419 0,530 0,141 -

1 0,486 0,173 -1,51x1

016

1,5 0,675 0,710 0,278 -

2 N/D 0,445 -

4 0,668 0,083 0,948 1/10

7 0,388 0,341 0,458 1/7,5

Tabla 4. Resultados generales de la práctica (Pedroza,2007).

La figura 2 presenta la variación de la absorbancia según transcurre el tiempo a lo largo de la fermentación.

Figura 2. La figura muestra las diferentes etapas de la bacteria.

La figura 3 es una gráfica integrada donde se relacionan las dos formas de cuantificación de biomasa respecto al tiempo durante la fermentación.

Figura 3. Comportamiento bacteriano según dos métodos de cuantificación de biomasa a lo largo del proceso de fermentación.

ANÁLISIS DE RESULTADOS.

Los resultados de la coloración de Gram demuestran la pureza del cultivo y son determinantes para continuar con la preparación de inóculo, ya que la presencia de otro microorganismo representaría

una lectura errónea en las absorbancias, ya que la turbidez no estaría ligada la crecimiento de E. coli sino del ente contaminante en la muestra.

La absorbancia determinada en la preparación del inóculo se encuentra dentro de los parámetros de la ley de Beer, ya que si el dato se encontrara fuera de ésta carecería de confianza, y por ende, de relevancia en cuanto a lo que esto implica en cuanto a la concentración de la muestra para la preparación del inóculo (Díaz, 2006).

Utilizando la ecuación de regresión lineal para determinar la cantidad de células/mL que se encuentran en la muestra, se determinó que para esta absorbancia la concentración es de XXX células/mL,…..

El patrón de McFarland se basa en el conocimiento de una concentración específica y la turbidez que esta genera, para que al momento de analizarse mediante la espectrofotometría se establezca una relación entre la absorbancia y la concentración previamente establecida (Sutton, 2006). Gracias a los valores estipulados en esta escala fue posible realizar una curva patrón, a la cual se le calculó la regresión lineal y se obtuvo el número de células/mL a lo largo del proceso de fermentación, dando como resultado lo observado en la tabla 4.

CONCLUSIONES.

El éxito en la realización de una curva de crecimiento radica en la implementación de más de una técnica de cuantificación de biomasa en caso de que una de ellas se vea afectada por algún factor interno o externo. La sensibilidad del recuento es placa es mucho mayor al reportado por la densidad óptica.

BIBLIOGRAFÍA.

Hoyos, J. L.; Carrera, J. E. (2004). “Desarrollo de un complejo enzimático por fermentación de sustrato sólido con Rhizopus Niveus, para la optimización de la producción de alcohol etílico a partir de melaza”. Revista Biotecnología en el Sector Agropecuario y Agroindustrial, Vol. 2(1). pp. 40.

Aguirre, A. C. (2011). “Producción de Inóculos Microbianos” Guía de laboratorio de Biotecnología Industrial, práctica 8: Preparación de Inóculos. pp. 1-4.

Pedroza, A. M.; Matiz, A.; Quevedo, B. E.; Aguirre, A. C. (2007). “Manual de introducción a la biotecnología”. Colección de apuntes, Editorial Pontifica Universidad Javeriana. pp. 81-86.

Acá quería hacer análisis de la absorbancia obtenida a partir del inoculo pero no sé si se deba sacar promedio de las 4 absorbancias tomadas en el laboratorio

Díaz, N. A.; Bárcena, J. A.; Fernández, E.; Galván, A.; Novo J. J.; Peinado, J.; Meléndez-Valdés, F. T.; Túnez, I. (2006). “Espectrofotometría: Espectros de absorción y cuantificación colorimétrica de biomoléculas”. Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Universidad de Córdoba, España. pp. 4-7.

Agudelo, C.; Ortega, R.; Hoyos, J. L. (2010). “Determinación de parámetros cinéticos de dos Inóculos lácticos: Lactobacillus plantarum A6 y Bacterias Ácido Lácticas de yogurt”. Revista Biotecnología en el Sector Agropecuario y Agroindustrial, Vol. 8(2). pp. 10.