Proceso que cuenta con varias etapas cuyo objetivo es ... catiónico Fase estacionaria cargada...
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Proceso que cuenta con varias etapas cuyo objetivo esseparar una proteína de interés de una mezcla de proteínas.
Características Procedimiento
Solubilidad 1. Precipitación por pH2. Precipitación por solventes orgánicos3. Precipitación por salado4. Precipitación por calor
Carga eléctrica 1. Cromatografía de intercambio iónico2. Electroforesis en una o dos dimensiones
Polaridad 1. Cromatografía de adsorción2. Cromatografía en papel3. Cromatografía fase inversa4. Cromatografía interacción hidrófoba
Tamaño/Masa 1. Diálisis2. Ultrafiltración3. Cromatografía de filtración en gel (exclusión molecular)4. Ultracentrifugación5. Electroforesis en gel
Especificidad de unión
1. Cromatografía de afinidad2. Técnicas inmunoquímicas (ELISA, Western)
La selección de técnicas de purificación depende de las propiedades de las proteínas.
MASA
TAMAÑO
Å
Å
kDa
La distribución de las cargas en la superficie de la proteínadepende de la estructura.
Cromatografía
Cromatografía de exclusión molecular (o filtración en gel)
Cromatografía de intercambio iónico
Cromatografía de interacción hidrofóbica
Cromatografía de afinidad
Método de separación que se basa en el reparto de especies entre unafase estacionaria y una móvil.
Es un conjunto de técnicas basadas en el principio de retención selectiva, cuyo objetivo es separar los distintos componentes de una mezcla, permitiendo identificarlos.
Cromatografía
Volumende columna
Muestraaplicada
Matriz
Tapónporoso
Eluyente
Eluyente Proteínas separadas
Matriz. Sustancia con la que se empaqueta la columna. También se denomina fase estacionaria o lecho de la columna.
Fase Móvil (Eluyente). Solución tamponada (buffer) que se empleapara transportar solutos a través de una fase estacionaria.
Volumen de la columna. Volumen total de la sustancia con la quese empaqueta en una columna cromatográfica.
Volumen muerto de la columna. Cantidad de solvente que tieneque atravesar la columna para asegurar que se ha reemplazadocompletamente.
Volumen de elución de un soluto: Cantidad de solvente necesaria para eluir el soluto de la columna.
PRINCIPIO:El material de la columna es poroso.Las moléculas de mayor tamaño no entran
a los poros por lo que eluyen primero, mientras que elmaterial retiene partículas de menor tamaño.
Cromatografía de exclusión molecular o filtración en gel.
Cromatografía de exclusión molecular
El material debe ser:•Un polímero inerte•No cargado•Con tamaño de poro uniforme
TIPOS DE MATRIZGRANULOS DE UN MATERIAL
ESPONJOSO E HIDRATADO
Dextranos con enlaces cruzadosAgarosaPoliacrilamidaSephadex
Cromatografía de exclusión molecular
Aplicaciones de la cromatografía de exclusión molecular
Desalado de proteínas
Purificación de proteínas
Determinación del peso molecular de las proteínas. El volumen de elución es proporcional al logaritmo del peso molecular.
Cromatografía de intercambio iónicoIntercambiador
aniónicoIntercambiador
catiónico
Las proteínas de unen al intercambiador a través de interacciones electrostáticas reversibles.
La separación se logra por una interacción electrostática entre los residuos cargados de la matriz y los residuos de la proteína con carga contraria. Esta interacción se puede romper luegopor cambios en fuerza iónica o de pH.
Intercambio aniónico
Fase estacionaria cargada positivamente
Intercambio catiónicoFase estacionaria cargada negativamente
Punto isoeléctrico (pI)Es el pH al cual se iguala el número de cargas positivas y
de cargas negativas en la proteína, por lo que la carga neta es = 0.
Intercambiador catiónico (-)
Intercambiador aniónico (+)
(+) (-)
La distribución de la carga neta en la superficie de la proteína determina la interacción de la proteína con los grupos cargados en la superficie del material de empaque.
La carga de las proteínas depende del pH en el que se encuentren.
Materiales de las columnas de intercambio iónico
Intercambiador catiónico Intercambiador aniónico
Estructuras de grupos químicos que le dan cargaa las matrices intercambiadoras de iones
Grupos de intercambiador aniónico
Aminas cuaternariasDietilaminoetil (DEAE)
Grupos de intercambiador catiónico
Sulfopropil (S- o SP)Carboximetil
Para eluir a la proteína se utilizan soluciones que modifican el pH o la concentración de sales.
GRADIENTE DE CONCENTRACIÓN
Cromatografía de Afinidad
Ligandos: anticuerpo, ión metálico, sustrato (análogo), cofactor.
Método basado en la interacción específica con un ligando inmovilzado.
Utiliza la alta especificidad entre las moléculas biológicas para separar componentesespecíficos de mezclas complejas.
Cromatografía de afinidad
VENTAJAS:No hay restricción por volumen. EspecificidadPureza del producto final
DESVENTAJAS:Precio (alto)Condiciones de elución drásticasLigando específico no disponible o inadecuado
El experimento
Objetivos:
Obtener una proteína pura o con mínimas trazas de contaminantes.
Llevar a cabo el desalado de la muestra por cromatografía de exclusión molecular.
Emplear las técnicas de cromatografía de intercambio iónico y/o cromatografía de afinidad.
FASE ESTACIONARIA
Tipo Peso molecularLímite de
fraccionamiento
Agua retenida(g/g gel sec)
Volumen de gel hidratado (ml/g gel
seco)
G10 Hasta 700 1.0 2
G15 Hasta 1500 1.5 3
G25 1000 ‐ 5000 2.5 5
G50 1500 ‐ 30 000 5.0 10
G75 3000‐80 000 7.5 12‐15
G100 4000 ‐ 150000 10.0 15‐20
G150 5000 – 400 000 15.0 20‐30
G200 5000 – 800 000 20.0 30‐40
