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Primera Prctica

Hidrlisis Qumica e hidrlisis Enzimtica

I. INTRODUCCIN

Con la hidrlisis del almidn se obtienen azucares que son utilizados por los

microorganismos para producir alcohol y desarrollar aromas que aumentan la

calidad y valor nutritivo de las bebidas que son elaboradas mediante en el

proceso de fermentacin.

El proceso de fermentacin industrial utiliza materiales ricos en azcar o

sustancias capaces de hidrolizar el almidn en azcares, siendo afectado por

factores como concentracin de azcar, etanol, oxgeno, dixido de carbono,

p y acidez y componentes nitrogenados, de acuerdo a la composicin

qumica de los diferentes granos.

!a hidrlisis del almidn es una reaccin qumica que rompe el enlace entre

azcares por accin del agua, siendo catalizado por "cidos, "lcalis o enzimas.

#ebido a esto, en la pr"ctica se realizaran dos tipos de hidrlisis$ qumica y

enzim"tica, teniendo como ob%etivos$

Comparar los dos procesos de hidrlisis utilizando como material

amil"ceo granos de arroz. &dentificar los factores a considerar en ambas hidrlisis.

&dentificar los factores que rigen el proceso de una fermentacin

alcohlica.

II. RE!I"IN DE #ITER$TUR$

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II.%. &ateria Primas 'ara la 'r(duccin de alc(h(l

&aterias $zucaradas

'us componentes son principalmente disac"ridos (sacarosa, lactosa, maltosa) ymonosac"ridos (glucosa, fructosa, galactosa).Mostos y jugos de diversas frutas (*+ - / de azcares$ sacarosa, glucosa,fructosa).Melazas de caa y de remolacha(0/-1+ de sacarosa).Miel de abeja(1+-2+ de glucosa y fructosa).Miel de algarrobo, suero de leche, etc.(atta, ++3).

&aterias $milceas'u componente principal es el almidn, dentro de estas tenemos$

Tubrculos y races$ papa, camote, yuca (*+-/ de almidn).Cereales$ maz (1+ almidn), cebada (1/), trigo (1/), arroz (1+) y sorgo(3+).

&aterias Celulsicas#entro de estas materias se tienen$ madera no explotadas, pa%a, residuosagrcolas y agroindustriales$ cascaras de cereales, frutas y hortalizas, bagazo deca4a. 'u componente principal es la celulosa, hemicelulosa y lignina (atta,++3).

II.). Hidrlisis del $lmidn

5ara el caso de materias amil"ceas, atta (++3) menciona que es necesariogelatinizar el almidn, lo cual ocurre en presencia de agua y calor, siendo elrango de temperatura para la gelatinizacin$ 1+-3+6C.#espu7s de este tratamiento se realiza la hidrlisis, la cual es un tipo de reaccinqumica en la cual se rompe necesariamente un enlace entre dos "tomos omol7culas mediante la intervencin del agua, reaccin que puede ser catalizadamediante la accin de otros elementos tales como$ "cidos, "lcalis o enzimas.

5ara el caso del almidn, la hidrlisis permite romper los enlaces glucosricos

*,0 y *,1, que mantienen a las unidades de glucosa unidas que conforman tanto la amilosa (*+-+) como la amilopectina (3+-8+) en la estructurapolisacarida del almidn, formando unidades de menor peso molecular talescomo $ glucosa, maltosa, dextrinas, principalmente (atta, ++3).

9era et.al.(++/) menciona que la hidrlisis del almidn se puede hacer por dosvas$ "cida o enzim"tica.

Hidrlisis cida

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En la hidrlisis acida se suele emplear el acido sulfrico, los productos que hande convertirse en azcar se maceran o se muelen y se mezclan con un ciertovolumen de agua en recipientes resistentes a los "cidos. 'e a4ade entonces unacantidad dada de acido y se hidroliza la masa, empleando vapor a presin para

facilitar el proceso. Cuando la transformacin ha terminado puede neutralizarsela masa por adicin de carbonato c"lcico o cal, separ"ndose el mosto delprecipitado de sulfato c"lcico por sedimentacin y filtracin. 5uede recuperarseuna cantidad adicional de azcar por extraccin del precipitado con aguacaliente (5rescott, *81).

Es una t7cnica que tiene muchas desventa%as$ formacin de productos nodeseables y flexibilidad muy pobre (el producto final slo se puede modificarcambiando el grado de hidrlisis), por ltimo es necesaria que el equipo resistael "cido y las temperaturas requeridas durante el este proceso.

Hidrlisis enzimticaEn los ltimos :+ a4os ha desplazado la hidrlisis "cida, debido a que se disponede nuevas enzimas. oy en da la mayor parte de la hidrlisis de almidn serealiza usando enzimas, ya que esta t7cnica presenta venta%as como$ control dela formacin de productos no deseables y mayor flexibilidad del producto.

atta (++3) menciona que este tipo de hidrlisis es de alta especificidad, por loque no se producen reacciones secundarias.Este procedimiento implica un mayor control de los par"metros, principalmentela temperatura y el p, y es m"s costoso que la hidrlisis acida, pero ofrece un

mayor rendimiento y pureza en el producto final.!as enzimas amiloliticas son$

!a al*a+amilasa(;lfa *,0-#-

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atta (++3) se4ala que otras enzimas utilizadas son$ -amilasa, pululonasa y lasenzimas =.

En cualquiera de las dos vas el 7xito de una buena fermentacin depende$- #e la eficacia del tratamiento preliminar, en caso haberlo-

#el empleo de una concertacin optima de azcar- #e un p y temperatura optimas- #e la diccin de sustancias nutritivas al mosto si este estuviera falto de un

constituyente esencia- #e la inhibicin del crecimiento bacteriano- #el empleo de una variedad fuerte de levadura con alta tolerancia

alcohlica y capaz, por tanto de producir grandes cantidades de alcohol- #el mantenimiento de las condiciones anaerbicas durante la

fermentacin- #e la inmediata destilacin del mosto (5rescott, *81).

III. &$TERI$#E" - &TODO"

I!.%. Hidrlisis /umica

0.*.*. 9ateriales y Equipos

;utoclave

Erlenmeyers de *lt (0u) 5robeta graduada de /+ ml (0u) 5otencimetro >alanza ;lmidn de arroz (*++ g) ;gua ?a@ (3+) ;cido sulfrico >omba de %ebe ;lgodn ielo !evadura 5apel 5abilo 5ipetas de *+ ml (0u)

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0.*.. 9etodologa

En un Erlenmeyer de *! se puso *++ g de almidn con /++ ml de aguapotable y de acido sulfrico. 'e saco una muestra para hacer an"lisis de

azcar reductor (;=*) y otro para hacer una prueba de yodo 'e tapo con un tapn de algodn, papel y se amarro con un pabilo 'e llevo al autoclave por un espacio de *h a ** AC y */ lbBpulg

'e enfri antes de sacarlo del autoclave 'e saco una muestra para hacer an"lisis de azcar reductor (;=) y prueba

de lugol 'e regulo el p a 0-0./. durante la fermentacin se controlo diariamente

los A>rix hasta que se mantenga constante 'e activo la levadura a se de%o fermentar, al termino de la fermentacin

se saco una muestra para determinar la cantidad de azcar reductor (;=:)

'e destilo el fermentado y se guardo la muestra para hacer el control decalidad del destilado

0i,ura % Hidrlisis /umica del almidn

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uente$ Elaboracin 5ropia (++3).

I!.). Hidrlisis enzimtica

0..*. 9ateriales y Equipos

*++g ;lmidn de ;rroz ;gua Cloruro de calcio (+./gB!t. 9osto) >;? (alfa amilasa comercial) ;9< 0++ (amiloglucosidasa) ;cido fosfrico !ugol !evadura ;utoclave

Dasos de *!t. >aguetas 5robeta graduada de /+ml 5otencimetro ermmetro =efractmetro de ba%a Cocina el7ctrica o un agitador con calentador 5ipetas de *ml, /ml. 5lacas petri

0... 97todos

'e colocaron *++g de almidn en un erlenmeyer de * litro con /++ml deagua, CaCl y +./ml de >;?.

En esta mezcla se midieron los azucares reductores de la mezcla (;=*).

'e calent hasta llegar a la temperatura de 3+6C y se determino el tiempode gelatinizacin de la muestra (cuando la solucin cambie de opaco atransparente). 5osteriormente, se enfri hasta llegar a 1/-2+6C y sea4adi *./ml de >;?, haciendo la prueba de lugol cada / minutos. astaque todo el almidn se desagrego (prueba de lugol con resultado amarillo).

'e saco una muestra y se determino el contenido de azucares reductores(;=).

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'e de% enfriar hasta llegar a 1+6C y se a4adi *./ml de ;9< 0++,determin"ndose los 6>x cada *+ minutos por cerca de *hr hasta que sehicieron constantes.

'e inactivaron las enzimas someti7ndolas a ebullicin por * minuto y sede%o enfriar, separando una muestra para hacer el an"lisis de azucaresreductores (;=:).

El mosto fue acondicionado activando la levadura para proceder afermentar, realizando controles diarios de 6>x. asta que la medida fueconstante, sac"ndose una muestra para realizar la determinacin deazucares reductores (;=0).

'e determin el contenido de alcohol de la muestra fermentada mediante

el m7todo de destilacin.

1.2. Destilacin

'e coloco ++ ml de muestra en un baln de destilacin y se lavo dosveces la fiola utilizada en la medicin con /+ml de agua destilada.

'e prendi la cocinilla y se inicio con la destilacin, cuyo condensadofue depositado en una fiola de ++ml.

'e destilo la muestra hasta tener aproximadamente *0+ml de destiladoy se enraso con agua destilada.

'e determin el grado alcohlico (volumen) en una probeta de /+mlcon el alcoholmetro

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0i,ura ). Hidrlisis enzimtica del almidn


1.4. Clcul(s

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E*iciencia de la hidrlisis5

100xalmidng

azucargEH =

E*iciencia de la *ermentacin

100)(x

GL

ARAREF

finalesiniciales

=

!. RE"U#T$DO" - DI"CU"IONE"

En el Cuadro * se muestran los gastos obtenidos en la titulacin de las muestrasde almidn de arroz en las diferentes etapas que se realizaron para su hidrlisisqumica y enzim"tica.

Cuadr( %. Determinacin de $zucares Reduct(res

$RH. Qumica H. Enzimtica

6ast( 7ml8 $R 7,9#t8 6ast( 7ml8 $R 7,9#t8

$R% F**. G.3 F**. G.3

$R) +. 0.31 0.1 1./

$R2 */ :.* 8.13

$R1 - - 1 /


!a determinacin de los azucares reductores se hizo utilizando el licor deehling, el cual presento un gasto de 1ml de glucosa, equivalente a +.+:g deglucosaB!itro.;plicando la ecuacin del apartado 0.0. se obtuvieron los ;= expresados en g deglucosaB!itro.

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En la hidrlisis qumica, las muestras para determinar azucares reductoresfueron tomados en las etapas inicial (;=*), despu7s del autoclavado (;=) y alfinal de la fermentacin (;=:)

9ientras que en la hidrlisis enzimtica, la determinacin de azucares

reductores se realizo al inicio, despu7s de la gelatinizacin (una vez frio), luegode inactivar la enzima ;9< y al final de la fermentacin.

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5ara realizar la hidrlisis enzimatica del almidn se tuvo que gelatinizarpreviamente la muestra. Este procedimiento se dio durante 0/ minutos, tiempoen el cual la prueba del lugol dio negativo indicando que el almidn se habagelatinizado.'in embargo, el control de la temperatura no fue bueno debido a que superabalos 3+6C y segn 9era (++0), las condiciones optimas para la enzima >;? se daa 2+6C, por lo que se puede decir que las altas temperaturas pudieron haberinactivado la enzima.

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Cuadr( ). Caracterizacin de las Enzimas :$N ; $&6

uente$ 9era (++0).

=especto a la determinacin de los azucares reductores, como se puede observaren el Cuadro *, los ;= iniciales no pudieron determinarse debido a que no sedispona de muestra para seguir titulando ya que el volumen inicial disponible de

muestra fue poco, obteniendo un gasto mayor a **.ml, por lo que se puededecir que la cantidad de glucosa en la muestra fue significante (menor a .3gramos por litro)

En la hidrlisis qumicalos ;= despu7s de efectuado el autoclavado aumentarona 0.31 gBlt (0.31), sin embargo la eficiencia de la hidrlisis resulto ba%a(2*.0) lo cual pudo deberse a que no se llego al p optimo para una buenahidrlisis. 'egn indica atta (++3) una hidrlisis qumica eficiente depende deltipo de almidon, la relacin almidn$ agua, la temperatura y la presion y tiempode traba%o, as como el p del medio.

'egn 5alacios (*8/1), afirma que es conveniente el empleo de "cido sulfrico en el aguade remo%o de la maizena antes de que se autoclavea, pues este e%erce una accindisolvente de las materias nitrogenadas t de las gomas que recubren los gr"nulos dealmidn de la maizena, y de esta forma es posible efectuar la hidrlisis a unatemperatura m"s ba%a. atta (++3) menciona que segn el tiempo de calefaccin seobtiene una hidrlisis m"s o menos completa pero con un tiempo de calefaccindemasiado largo, se degradan azcares y pardea la solucin.

;dem"s se observa que los solidos solubles en la muestra luego del autoclavadofue de * (A>rix), sin embargo los azucares reductores de la muestra fueron solode 0.31, el resto de solidos solubles estara formado por otros azucares noreductores, as como pectinas, gomas no solubles #espu7s de la fermentacion los

azucares reductores disminuyeron a */gBlt debido al consumo de estos por partede la levadura

5or otro lado en la hidrlisis enzimtica, !os azucares reductores en la terceraetapa fueron mayores respecto a la segunda, esto se dio debido a que alincorporar la enzima (;9

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!a actividad de las enzimas >;? y ;9< se muestran en el Cuadro , en donde sepuede observar que el p ptimo es 1 para la >;? y /./ para la ;9

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#ebido a esta limitacin de la levadura es que se debi optar por hidrolizar elalmidn, para que se puedan convertir f"cilmente en alcohol. !a fermentacin serealiz durante un tiempo prolongado, en los que se realizaron controles de 6>x.,los cuales se muestran en el Cuadro 0.

Cuadr( 1. C(ntr(l de la 0ermentacin de las muestras hidr(lizadas de almidnde $rr(z

Hidr(lisis Inicial 2er Da 4t( Da ?t( Da 0inal

Jumica *6>x *2.6>x *0.16>x *06>x *:6>x

Enzim"tica */.6>x 36>x 26>x 16>x 06>x


0i,ura ). !el(cidad de 0ermentacin dela almidn de $rr(z


Como se puedo observar en la igura conforme fueron pasando los das, los 6>xfueron disminuyendo, lo cual se debe a una disminucin de concentracin deazcar fermentecible en el mosto, debido a que las levaduras la utilizan comofuente energ7tica y nutricional.

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!a velocidad de fermentacin pudo determinarse a trav7s de la lnea detendencia de las muestras con hidrlisis qumica y enzim"tica$

idrlisis Jumica$ K L -*.8M N *.2idrlisis Enzim"tica$ K L -.00M N */.:1

!os ndices de correlacin de las lneas de tendencia del gr"fico de la igura fueron ba%os debido a la dispersin de los datos lo cual se explica debido a quelos controles no pudieron realizarse diariamente debido a problemas dedisponibilidad de materiales de laboratorio.

=especto a la velocidad de fermentacin, se puedo observar que la muestra dehidrlisis enzim"tica presento una mayor velocidad debido a que presento unmayor pendiente respecto de la fermentacin de la muestra de almidnhidrolizada qumicamente.

#ebido a esto se puede decir que la muestra hidrolizada enzim"ticamentetermin de fermentar los azucares en un tiempo menor que la hidrolizadaqumicamente.

'egn @gnio (*83+), mediante las operaciones de destilacin y rectificacin, sebusca separar el alcohol producido en la fermentacin de los otros compuestospresentes en el mosto, tales como "cidos org"nicos, glicerol, aldehdos y esteresque se den en el proceso, as como los otros compuestos propios del mosto queno han sido asimilados por la levadura como azcares residuales, sustanciasnitrogenadas, fosfatos y otros. #ebido a esto se realizo la destilacin de lasmuestras antes de determinar el grado alcohlico, obteni7ndose los datos que se

presentan en el Cuadro /.

Cuadr( 4. Dat(s 'ara el clcul( del @ndice de Trans*(rmacin

H. Qumica H. Enzimtica

;= iniciales *3.2/ 8.13

;= finales 3.:: /

6

E 2.31 8.:1

!a eficiencia de la fermentacin o ndice de transformacin fue 2.31 para lamuestra con hidrlisis qumica y +.+8:1 para la muestra con hidrlisisenzim"tica. 'egn atta (++3) en condiciones optimas una levadura necesita *2

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g de azcar para producir * A

En el caso de la hidrlisis qumica es importante controlar laconcentracin materia prima$solvente, p del medio, temperatura, ypresin del autoclave

!as condiciones de operacin de las enzimas ;9< y >;? est"n limitadaspor las propiedades de cada una.

!a hidrlisis enzim"tica en la pr"ctica realizada fue menos eficiente que lahidrlisis qumica debido a que en la primera la enzima fue inactivada, enla hidrlisis qumica se obtuvo una eficiencia de hidrlisis ba%a pero mayora la enzim"tica

!a velocidad de la fermentacin de la hidrlisis enzim"tica fue mayor quela qumica.

!a eficiencia de la hidrlisis qumica fue 2*.0: y de la hidrlisisenzim"tica fue /.1

!a eficiencia de la transformacin en la hidrlisis quimica fue de 2.31gB!xA

!II. RECO&END$CIONE"

=ealizar controles diarios en la fermentacin, no solo de 6>x sino

tambi7n de temperatura y densidad. Encontrar los valores ptimos de p, relacin materia prima$

solvente, 5resin de traba%o para obtener una me%or eficiencia dehidrlisis qumica

Emplear una variedad fuerte de levadura con alta toleranciaalcohlica y capaz por tanto de producir grandes cantidades dealcohol

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!III. :I:#IO6R$0@$

&ER$A I.B C$RRER$A . )>>1.@btencin de glucosa a partir de almidn de

Kuca. #isponible en$http$BBOOO.unicauca.edu.coBbiotecnologiaBedicionesBvol:B;rt:3.pdf.Consultada el *2 de Iulio del ++3.

H$TT$A :.++3. Curso de ecnologa de ;lcoholes. P?;!9. 5er.

PRE"COTTA D.*81. 9icrobiologa &ndustrial. Editorial ;guilar '.;

OR6EN"ENA $. *8/8. 9icrobiologa de las ermentaciones &ndustriales.2ma Edicin. Editorial ;cribia '.;. Espa4a.

O6NIOA ".*88+. @btencin del alcohol a partir de yuca. esis P?;!9.5er.
http://www.unicauca.edu.co/biotecnologia/ediciones/vol3/Art38.pdfhttp://www.unicauca.edu.co/biotecnologia/ediciones/vol3/Art38.pdf

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