Primer Bloque Guía de Problemas

Química Biológica 1

Instituto de Investigaciones Biológicas

UNMDP/CONICET

1. Espectrofotometría

☺ 1) Con el objetivo de determinar el contenido de proteínas presentes en un extracto de

hojas de Arabidopsis thaliana. El homogenato se realizó 0.5 gr de hojas utilizando fricción

(mortero) y N2 líquido. El polvo de nitrógeno así obtenido se resuspendió en 2 volúmenes de

buffer A, luego se centrifugó durante 20 min a 10.000 g, obteniéndose un sobrenadante con

un volumen de 1.2 ml.

A continuación se determinó el contenido de proteínas del sobrenadante mediante el uso de

un método colorimétrico:

Tabla: Determinación de la concentración de proteínas en hojas de A. thaliana

Tubo Muestra BSA (0.1 mg/10 ml)

H2O Reactivo Abs 330 nm

(µl) (µl) (µl)

1 - 0 100 300 0,06

2 - 10 90 300 0,18

3 - 20 80 300 0,31

4 - 30 170 600 0,24

5 - 40 60 300 0.56

6 - 50 50 300 0,58

7 50 - 50 300 0,62

8 50 (1/5) - 50 300 0,25

9 25 (1/2) - 75 300 0,32

1) Realizar la curva standard, justificando si descarta algún valor. 2) Proponga un protocolo para pipetear otro tubo (volumen y/o dilución distintos a

los presentados) que le permitan calcular la concentración de proteínas. 3) Determine la concentración de proteínas por ml de sobrenadante. 4) ¿Cuál es el contenido de proteínas /gramo de hoja? 5) Qué explicación puede dar al valor de absorbancia del tubo sin muestra? 6) Visto que la absorbancia es proporcional a la concentración, cómo justifica la

realización de una curva de calibración con unidades de masa en las abscisas?

☺ 2) Se quiere determinar la concentración de glucosa en una muestra. Para ello se realiza

una reacción colorimétrica según el siguiente protocolo:

Curva de calibración:

Tubo H2O

(ml)

Solución de glucosa

(1mg/ml)

(ml)

Reactivo

(ml)

A500

1 1 0 2 0,33

2 0,9 0,1 2 0,45

3 0,8 0,2 2 0,57

4 0,6 0,4 2 0,81

5 0,4 0,6 2 0,96

6 0,2 0,8 2 1,05

Determinación de la concentración de glucosa en la muestra:

Tubo Muestra H2O Reactivo A500

Dilución Vol (ml) (ml) (ml)

7 1/5 0,4 0,6 2 1,17

8 1/10 0,5 0,5 2 0,87

9 1/10 0,25 0,75 2 0,69

10 1/10 0,125 0,87 2 0,50

a) Determine la concentración de glucosa en la muestra estudiada.

b) Justifique si descarta algún tubo para dicho cálculo.

3) Un estudiante de Química Biológica diseñó un protocolo para obtener una curva estándar

de proteínas. Después de realizar las mediciones de absorbancia armó la siguiente tabla:

Tubo Nº BSA (0.2mg/ml)

(l)

H2O

(l)

React. Bradford

(ml)

A 595 nm

1 -- 100 1 0,35

2 10 90 1 0,445

3 20 80 1 0,56

4 40 60 2 0,565

5 30 70 1 0,634

6 20 30 0.5 0,720

7 50 50 1 0,785

8 75 25 1 0,875

9 100 -- 1 0,950

10 200 -- 1 1,045

a) ¿Cuáles de los tubos utilizaría para confeccionar una curva estándar? Justifique

brevemente.

b) Confeccione la curva estándar.

0 1 2 3 4 5 60.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

mg glucosaA

54

5

c) Si se cuenta con un homogenato de hígado preparado con 4 partes de buffer por cada

gramo de tejido tiene una concentración de proteínas que varía entre 50 y 75 mg / ml.

¿Cómo procedería para conocer en una sola medición la concentración de proteínas de un

homogenato de ese tipo?

☺ 4) Ud. se encuentra analizando el contenido de glucosa en muestras de concentración

desconocida. Para esto dispone de una curva estándar realizada con una solución de glucosa

de concentración conocida y un reactivo que permite detectar los grupos reductores. El

protocolo para la confección de la curva y sus resultados son los siguientes:

Glucosa 10 mg/ml

(ml)

H2O

(ml)

Reactivo

(ml)

0,05 0,95 2

0,15 0,85 2

0,3 0,7 2

0,4 0,6 2

0,5 0,5 2

0,6 0,4 2

Sabiendo que la concentración de glucosa en las muestras varía entre 5 y 20 mg/ml. Cuál

de los siguientes protocolos (a, b, c, d, e, f) a emplear parecen correctos y cuáles

incorrectos? Justifique brevemente cada uno.

Muestra

(ml)

H2O

(ml)

Reactivo

(ml)

H2O

(ml)

a) 0.05 0,45 1 --

b) 2 0,5 2 --

c) 0.5 0,5 2 5

d) 1 1 4 --

e) 0.15 0,85 2 --

f) 0.1 1,9 2 --

Todos los reactivos se agregan en el orden indicado.

5) Se desea determinar por espectrometría el contenido de hemoglobina en sangre entera.

Para ello se realiza el siguiente procedimiento:

a) 10 ml de sangre heparinizada se centrifugan, se decanta el plasma y se guardan las

células sedimentadas.

b) La totalidad de las células sedimentadas se suspenden en agua destilada y se

completa el volumen a 50 ml totales. El lisado se centrifuga, se decanta y se conserva la

solución de hemoglobina.

c) 0,5 ml de la solución de hemoglobina se diluyen con agua destilada hasta un

volumen final de 100 ml.

d) La solución final se coloca en una cubeta de 2 cm de camino óptico y se mide en

espectrofotómetro a 415 nm.

Medida de la T = 31,8 % ε de la oxihemoglobina 128,5 x 106 cm2/mol; PM=68000.

Pregunta: ¿Cuál es el contenido de hemoglobina en la muestra de sangre?

(Expresado en gramos de hemoglobina x 100 ml de sangre).

Rta: 12.9 g/100 ml de sangre.

6) Con el objetivo de conocer la concentración de proteínas presente en diferentes muestras, se

preparó una solución de albúmina bovina (BSA) diluyendo 250 mg de albúmina en 25 ml de agua

destilada. Las soluciones estándares de albumina y las muestras se analizaron por el método de

Biuret. Para ello, en cada tubo de ensayo se colocaron distintos volúmenes de BSA o muestra, se

completaron a 1 ml con agua y se adicionaron 3 mL de reactivo de Biuret, se agitaron en un vortex

y se incubaron por 20 min. Posteriormente, se midió la absorbancia a 540 nm, ajustando a cero

con el blanco.

El resultado de las mediciones para BSA es el siguiente:

Tubo BSA (mg/ml)

Abs 540 nm

Blanco 0 0

1 0.1 0.079

2 0.2 0.15

3 0.3 0.21

4 0.4 0.27

5 0.5 0.33

6 0.6 0.40

7 0.7 0.46

8 0.8 0.51

9 0.9 0.56

10 1 0.57

Las determinaciones para las muestras dieron los siguientes resultados:

Tubo Muestra (ml) Abs 540 nm

11 Muestra 1 0.5 1

12 Muestra 1 1/10 0.5 0.41

13 Muestra 1 1/50 0.5 0.08

14 Muestra 2 0.5 0.40

15 Muestra 2 1/10 1 0.09

1- Complete la tabla con el protocolo de trabajo que utilizaron los investigadores para

hacer el ensayo de determinación de proteínas.

Tubo BSA (conc. de la

solución madre) ml

Muestra

(ml)

H2O

(ml)

Reactivo

(ml)

1 (Curva st)

2 (Curva st)

11 (Muestra 1)

15 (Muestra 2)

2- Graficar la curva estándar

3- Calcular la concentración de proteínas en las muestras. Justifique si descarta algún

dato.

2. AMINOÁCIDOS Y PÉPTIDOS

Datos útiles

* El β-mercaptoetanol reduce las cistinas rompiendo los puentes disulfuro y el SDS otorga carga negativa

homogénea a las proteínas determinando que su movilidad electroforética en un SDS-PAGE ( dodecyl

dulfto de sodio – polyacrilamide gel electroforesis) sea debida exclusivamente a su tamaño.

* PM promedio de un aminoácido = 120; de la glucosa libre = 180; de la glucosa formando parte de la

cadena = 162.

* Tripsina: corta el enlace peptídico dejando libre el carboxilo de Arg y de Lys.

* Quimotripsina: corta el enlace peptídico dejando libre el carboxilo de Phe, Tyr y Trp.

* Bromuro de cianógeno: rompe enlaces peptídicos con carbonilo aportado por met.

* Cistina= Cys (S-S)Cys

Disociación de grupos ionizables de aminoácidos

GRUPO pK del aa libre RANGO de pK

En polipéptido

- carboxilo (Ct) 1,8-2,5 1,8-2,5

- amino (Nt) 8,9-9,7 7,5-8,5

- carboxilo (Glu,Asp) 3,8-4,3 3,0-4,7

- amino (Lys) 10,5 9,4-10,6

- OH fenólico (Tyr) 10,1 9,8-10,4

- Imidazol (His) 6 5,6-7,0

- Guanidinio (Arg) 12,5 11,6-12,6

- Sulfidrilo (Cys) 8,3 9,4-10,8

Problemas

1- Las estructuras y las propiedades químicas de los aminoácidos son cruciales para entender cómo las proteínas llevan a cabo sus funciones biológicas. A continuación se muestran las cadenas laterales de 16 amino ácidos. Nombre los aminoácidos que contienen tales estructuras y asocie cada grupo R con la descripción más apropiada de sus propiedades.

a) El grupo R tiene un pKa aproximado de 10.5, lo que determina que esté cargado positivamente a pH fisiológico. b) Único amino ácido con un grupo R ionizado con un pKa cercano a 7; es importante en el sitio activo de algunas enzimas.

c) Único amino ácido que tiene un grupo -amino sustituido; influencia el plegamiento de las proteínas forzando la formación de una curvatura en la cadena. d) Grupo R con un pK cercano a 4; cargado negativamente a pH 7. e) Grupo R aromático capaz de formar puentes hidrógeno; pKa cercano a 10. f) Forma enlaces disulfuro entre cadenas polipeptídicas; el pKa de su grupo funcional es aproximadamente 10. g) Grupo R con un pKa aproximado a 12, cargado positivamente a pH fisiológico.

☺ 2- 100 ml de una solución de glicina 0.1 M a pH 1.72 fue titulada con NaOH 2 M. Durante la titulación el pH fue monitoreado y el resultado se muestra en el gráfico. Para cada una de las consignas que se indican a continuación, identifique a cuál de los puntos de la curva de titulación (I a V) corresponden y justifique su elección.

a) ¿En qué punto la glicina estará predominantemente como +H3N—CH2—COOH? b) ¿En qué punto el pH será igual al pKa del grupo carboxilo? c) ¿En qué punto el pH será igual al pKa del grupo amino protonado? d) ¿A qué pH tendrá la glicina su máxima capacidad buffer? e) ¿En qué punto la carga neta promedio será cero? f) ¿En qué punto la estructura de la especie predominante será +H3N — CH2 — COO-? g) ¿En qué punto la carga neta promedio será –1? h) ¿Qué punto corresponde al punto isoeléctrico? i) ¿En qué punto la carga neta promedio será -1/2? j) ¿Qué punto representa el final de la titulación? k) Se desea utilizar la glicina como buffer, ¿qué puntos representan la peor región de pH para la capacidad buffer? 3-La curva de titulación de la alanina muestra la ionización de los dos grupos funcionales con valores de pKa de 2,34 y 9,69, correspondiente a la ionización del carboxilo y del grupo amino protonado, respectivamente. La titulación de di, tri y oligopéptidos mayores de alanina también muestran la ionización de sólo dos grupos funcionales, aunque los valores experimentales de pKa son diferentes.

a) Dibuje la estructura de Ala-Ala-Ala. Identifique los grupos funcionales asociados con pK1 y pK2. b) ¿Por qué el largo de la cadena afecta el carácter ácido del compuesto? ☺ 4- Un método para separar polipéptidos se basa en la solubilidad diferencial de los mismos. La solubilidad en agua de polipéptidos grandes depende de la polaridad relativa de sus grupos R, particularmente del número de grupos ionizables. Indicar de los siguientes pares, cuál es más soluble a los pHs indicados.

a) (Gly)20 o (Glu)20 a pH 7 b) (Lys-Ala)3 o (Phe-Met)3 a pH 7 c) (Ala-Ser-Gly)5 o (Asn-Ser-His)5 a pH 6 d) (Ala-Asp-Gly)5 o (Asn-Ser-His)5 a pH 3

5-Establecer el patrón de ruptura de los polipéptidos siguientes por los agentes que se indican.

a) Ser-Ala-Phe-Lys-Pro por quimotripsina b) Thr-Cys-Gly-Met-Asn por Bromuro de cianógeno (NCBr) c) Leu-Arg-Gly-Asp por carboxipeptidasa A

Amino ácido o péptido pK1 PK2

Ala 2,34 9,69

Ala-Ala 3,12 8,30

Ala-Ala-Ala 3,39 8,03

Ala-(Ala)n-Ala n 4 3,42 7,94

d) Val-Trp-Lys-Pro-Arg-Glu por tripsina

☺ 6- Existen enfermedades humanas que están asociadas a mutaciones puntuales en la secuencia de

aminoácidos de una proteína, como por ejemplo la Anemia falciforme la cual se origina en la mutación

de Glu ---> Val en el gen de la hemoglobina A (Figura 1), pasando a hemoglobina S

A

Figura 2: Perfiles cromatográficos obtenidos por HPLC. A: separación de aminoácidos estándares. B. separación de aminoácidos

obtenidos de la hidrólisis ácida de la hemoglobina presente en la muestra 1.

Figura 1: Secuencias parciales de aminoácidos correspondientes a la Hemoglobina de humanos. A:

corresponde a individuos sanos, S: corresponde a individuos con anemia falciforme.

Cuando se aisla la hemoglobina de un individuo, se somete a hidrólisis ácida y posteriormente,

se realiza el análisis de la composición de aminoácidos de la misma (mediante una

cromatografía cuyo fundamento de separación consiste en las diferencias en la hidrofobicidad,

dada por las diferncias en la composición de aminoácidos, de los diferentes péptidos/proteínas

mediante la utilización de HPLC) se puede determinar si corresponde a un individuo con

hemoglobina A o S.

Co

nte

nid

o d

e aa

c./

mg.

de

pro

teín

a

B

Analice el siguiente cromatograma (Figura 2B) correspondiente a la muestra. Podría decir qué tipo de hemoglobina se analizó?

Justifique.

3. Proteínas: Estructura y purificación.

☺ 1- El estudio del transporte de oxígeno en mamíferos ha mostrado que las curvas de saturación

de O2 de la sangre fetal y materna son marcadamente diferentes cuando se miden en las mismas

condiciones. Los eritrocitos fetales contienen una variante estructural de la hemoglobina, la

hemoglobina F, que consiste en dos subunidades alfa y dos gama (22), mientras que los eritrocitos

maternales contienen la hemoglobina A (22).

a) ¿Qué hemoglobina tiene más afinidad por oxígeno bajo condiciones fisiológicas, hemoglobina A o F? Explique. b) ¿Cuál es el significado fisiológico de las diferentes afinidades por oxígeno? Explique

☺ 2- Mediante la utilización de la técnica de electroforesis en SDS- PAGE se desea estimar el peso

molecular (PM) de la bandas presentes en la calle 7 de la Figura 1, las cuales se estima corresponderían

a la proteína denominada como D1.

Figura 1: Análisis electroforético de las muestras obtenidas del trabajo práctico 4 . Las muestras se

incubaron con sample buffer (buffer de muestra) conteniendo β-mercaptoetanol y SDS como agentes

desnaturalizantes, y se calentaron durante 3 min. A 100°C. Posteriormente se enfriaron, se

centrifugaron y sus sobrenadantes se sembraron en el gel. La tinción se realizó con el colorante

Coomasie-blue

1- Calcular el Rf (Relacion de Frente) de los 3 marcadores de PM y graficar Rf vs Log de PM 2- Calcule el PM aproximado de la proteína D1.. 3- Considera adecuado el porcentaje de acrilamida/bis-acrilamida utilizado en el gel para

estimar el PM de D1? Justifique.

4- Puede asegurar que el PM estimado es el peso molecular de la proteína nativa? Justifique.

5- Hubiese obtenido el mismo resultado si las muestras no se incubaran con β-mercaptoetanol?

Justifique.

6- A partir de los resultados obtenidos podría estimar el PM correspondiente a las bandas del

gel señaladas como X e Y? Justifique.

7- A partir de los resultados obtenidos, podría predecir cuál sería el resultado del análisis de las

muestras en un gel nativo? Justifique.

☺ 3- Con el objetivo de analizar las proteínas contenidas en el fluido epididimario de ratón, un

investigador sometió un extracto de proteínas de este fluido a una electroforesis en dos dimensiones

(2D-GE) y se obtuvo el siguiente resultado.

GEL SDS 12% 1 2 3 4 5 6 7

X

D1

Y

66

43

14,3

St. PM

kDa

Figura 1: Patrón proteico por electroforesis en 2D-GE de las proteínas del fluido epididimario de ratón

Una de las manchas (spots) obtenidas le resultó de interés y decidió cortarla y enviarla a secuenciar por

espectrometría de masas (MS).

La MS permite identificar proteínas por un método denominado, huella peptídica, para lo cual la

proteína se digiere con tripsina y se compara la masa de los péptidos obtenidos con una base de datos

que contiene las masas de todos los productos teóricos de la digestión con tripsina de todas las

proteínas del organismo del cual proviene la muestra, en este caso de ratón. Esta comparación la hace

un software ya que la base de datos es muy grande. En este ejercicio, como ejemplo vamos a realizarlo

en forma manual con unas pocas proteínas para comprender como funciona.

1- PGDS: MAALRMLWMGLVLLGLLGFPQTPAQGHDTVQPNFQQDKFL

2- Glutation peroxidasa: MAYIAKSFYDLSAIGLDGEKIDFNTFRGRAVLIENVASLU

3- Calmodulina: MADQLTEEQIAEFKEAFSLFDKDGDGTITT

Figura 2: Secuencias de aminoácidos provenientes de la base de datos de proteínas del fluido

epididimario de raton.

a) Realice la digestión teórica con tripsina de todas las tres proteínas

b) Calcule la masa de cada péptido obtenido

Dados los siguientes resultados del análisis de MS del spot enviado:

M/Z

1748.82 1020.09 954.07

c) Compare las masas de los péptidos obtenidos como producto de la digestión del spot con las masas

de los péptidos obtenidos de la digestión teórica de los las proteínas detalladas en la figura 2.

d) Trate de identificar a que proteína corresponde el spot.

e) Cuantos péptidos pudo identificar del total?

f) d) Si hubiera podido identificar menos péptidos, el porcentaje de certeza en el resultado hubiera

sido mayor o menor?

e) Podrías señalar cuál fue el spot que se corto del gel?

4- La zimografía zimograma es una técnica electroforética que permite observar actividad de

enzimas. Se realiza una electroforesis en geles de poliacrilamida, sin embargo, a diferencia de las

electroforesis de proteínas en condiciones desnaturalizantes (SDS-PAGE) se trata de utilizar

condiciones suaves (sin agentes reductores) para evitar la pérdida de actividad de las enzimas

estudiadas. La polimerización de la poliacrilamida se realiza generalmente, en presencia del

sustrato (Por ejemplo para proteasas, el sustrato es gelatina). De esta manera el gel resultante

contendrá el sustrato polimerizado con la poliacrilamida. Luego de realizar la corrida

electroforética de las muestras el gel se lava y se incuba en un buffer apropiado que favorece la

actividad de la/s enzimas a analizar. El resultado se visualiza con una tinción específica permite

detectar la actividad enzimática en la zona donde se ubicó la proteína responsable de dicha

actividad, posteriormente a la electroforesis.

En la figura 1 se muestra el comportamiento electroforético en un gel SDS-PAGE (A) y en un

zimograma (B) de una proteína de origen vegetal con actividad de proteasa (Pro). La misma fue

sembrada en un gel SDS-PAGE 18% posteriormente a ser incubada con el buffer de siembra con o

sin β-mercaptoetanol y siendo o no sometida a desnaturalización por calor.

Alanina

ALA; A

MW: 89.09

Arginina

ARG; R

MW:

174.20

Leucina

LEU; L

MW:

131.17

Lysina

LYS; K

MW: 146.19

Asparagina

ASN; N

MW:

132.12

Acido

aspartico

ASP; D

MW:

133.10

Metionina

MET; M

MW:

149.21

Fenilalanina

PHE; F

MW: 165.19

Cysteina

CYS; C

MW:

121.16

Acido

glutamico

GLU; E

MW:

147.13

Prolina

PRO; P

MW:

115.13

Serina

SER; S

MW: 105.09

Glutamina

GLN; Q

MW:

146.15

Glycina

GLY; G

MW:

75.07

Threonina

THR; T

MW:

119.12

Tryptophano

TRP; W

MW: 204.23

Histidina

HIS; H

MW:

155.16

Isoleucina

ILE; I

MW:

131.17

Tyrosina

TYR; Y

MW:

181.19

Valina

VAL; V

MW: 117.15

A B

SDS + + + + SDS + + + +

- + - + - + - +

ME - - + + ME - - + +

Figura 1. Análisis por SDS- PAGE (A) y Zimograma (B) de la proteasa (Pro). Las muestras

fueron tratadas com SDS, incubadas durante 3 min a 100°C () y/o incubadas con

Mercapto Etanol (ME) según se indica.

1- Describa los resultados presentados en la Figura 1.

2- A partir de los resultados presentados en la Figura 1, que podría decir acerca de la

estructura cuaternaria de la proteasa?

3- A partir de los resultados obtenidos, como relacionaría la estructura de esta proteína con su actividad?

60 KDa

9 KDa

60 KDa

9 KDa

☺5-En un laboratorio se desea conocer la estructura cuaternaria de la proteína X, para esto dos fracciones

purificadas a homogeneidad de la misma se someten al siguiente análisis electroforético:

1 2 kDa/pI 3 5 7 10 kDa/pI 3 5 7 10

_60 60_ 60_

_40 40_ 40_

_15 15_ 15_

SDS-PAGE 12 % GEL 2D (1) GEL 2D (2)

Calle 1: calor + SDS 1) La muestra fue tratada con: calor + SDS

Calle 2: calor + SDS + β-mercaptoetanol 2) La muestra fue tratada con: calor + SDS + β-mercaptoetanol

Preguntas

1- Describa e interprete las figuras. Analice teniendo en cuenta PM y PI de cada banda/spot. 2- Esquematice la estructura cuaternaria de la proteína X de acuerdo a los resultados obtenidos. 3- Esquematice los perfiles que se obtendrían en una columna de filtración en gel conteniendo una

matriz con un rango de exclusión molecular de 5000 – 100000 Da. Si se siembra y eluye la proteína X en: 1: Buffer 2: Buffer + SDS 3: Buffer + SDS + β-mercaptoetanol Justifique.

☺ 6- Parte A:

Con el fin de purificar una enzima que cataliza la reacción S P se hizo un homogenato con

5 g de tejido y 25 ml de buffer pH 7. Se filtró y centrífugo a 26000 g. Con una alícuota del

sobrenadante (volumen final 27 ml) se hicieron determinaciones de proteínas y actividad

enzimática (tabla 1).

Tabla 1 Determinación de proteínas: se aplicó el método de Lowry, el volumen final fue de 1

ml y se usó BSA (2 mg/ml) como patrón.

Actividad enzimática: La actividad fue de 124 unidades por ml de sobrenadante

Luego se pasaron 20 ml del sobrenadante por una columna de afinidad que tiene S unido

covalentemente a Sepharosa. Se lavó con 20 ml de buffer usado en la homogenización y se

eluyó con 15 ml de S 5 mM. A continuación se muestran las determinaciones de actividad y

proteína de lo eluido de la columna de afinidad. Se colectaron fracciones de 3 ml/tubo

Tabla 2:

Tubo A280 Unidades de

actividad /tubo

1 0,02 0

2 2,8 5,1

3 1 42

4 3,2 18

5 0,4 0,5

6 0,04 0

7 0,02 0

8 0,04 0,5

9 0,38 15

10* 0,98 823

11* 0,52 158

12 0,05 0,4

a.- Completar la tabla de purificación teniendo en cuenta que una solución de BSA de 1

mg/ml tiene una A 280=0.8.

Tubo BSA

(μl)

Muestra

(μl)

A500nm

1 -- -- 0,07

2 20 -- 0,15

3 40 -- 0,25

4 80 -- 0,41

5 -- 30 0,09

6 -- 60 0,30

7 -- 90 0,55

* Con los tubos 10 y 11 se

realizó un pool.

Muestr

a

Vol

ml

Prot.

mg/ml

Prot

Totales

mg

Actividad

U/ml

Actividad

Total

U

Actividad

Específica

U/mg

Purificación Rendimiento

%

Homog.

Pool

b- Sabiendo que la masa de enzima que se está purificando es el 45 % de la proteína

recuperada en el pool (10+11), ¿Cuántos mg de la misma se podrían preparar a partir de

100 g de tejido y con el mismo grado de pureza?

Parte B

Se tomaron 3 alícuotas del pool. A la primera se la trató con bromuro de cianógeno y la

actividad enzimática no se modificó; la segunda se pasó por una columna de intercambio

aniónico a pH 7 (DEAE) y la última por un intercambio catiónico a pH 7 (CM). En los últimos

dos casos resultaron los siguientes perfiles de elusión:

Finalmente se corrieron en geles desnaturalizantes de poliacrilamida las muestras

provenientes de:

Calle A: pool 10 + 11, eluido de la columna de afinidad A

Calle B: muestra tratada con bromuro de cianógeno.

Calle C: proteínas no retenidas en DEAE.

Calle D: retenido en DEAE.

Calle E: no retenido en CM.

Calle F: retenido en CM.

a- ¿Cuál es el PM y el pI de la proteína en estudio.

b- Ordene las proteínas presentes en el pool según su pI.

c- ¿Por qué se ven dos picos proteicos tanto en DEAE como en CM?

d- ¿Por qué se detectaron 5 proteínas después del tratamiento con BrCN?.

e- Diseñe un protocolo para purificar la enzima a homogeneidad.

☺ 7-Células mantenidas en cultivo se lisaron por sonicación (en buffer a pH 7), los restos celulares se separaron por centrifugación. El sobrenadante así obtenido se precipitó con sulfato de amonio al 40 % (P/V), se centrifugó y el sobrenadante se llevó a un 70 % (P/V) de saturación con la misma sal. Posteriormente, los precipitados obtenidos (40 y 70 %) se resuspendieron en buffer a pH 7. a) Describa el principio de fraccionamiento por sulfato de amonio. ¿Espera que todas las

proteínas precipiten a la misma concentración de sal?, ¿Por qué, por qué no? b) Sugiera dos métodos para remover el SO4 (NH4)2 de la preparación.

Luego se realizó un gel de poliacrilamida-SDS (PAGE-SDS) para analizar ambos precipitados.

Del análisis del gel se determinó que las proteínas “Y” y “X” se encuentran en el precipitado

de 40-70 % de saturación. Para separar ambas proteínas se realizan otros pasos de

purificación.

Se realizó un análisis en SDS- PAGE con el fin de estimar el peso molecular de las proteínas

“Y” y “X” en el precipitado de 40-70 % de SA:

A B C D E F KDa

6655

45

23

Proteína PM (kDa) Migración (mm)

Albúmina bovina 67 11

Ovoalbúmina 45 23

Anhidrasa carbónica 32 34

Inhibidor de tripsina 21,5 46

Lisozima 14,4 59

Proteína X ¿? 28

Proteína Y ¿? 54

Distancia frente de corrida = 6,5 cm

c) Estime el PM de “Y” y “X”.

Paralelamente se procedió a la purificación y determinación del PM de “Y” y “X” mediante el

una cromatografía de filtración en gel.

d) ¿Cómo puede determinarse el volumen muerto de la columna de filtración en gel? e) Si la columna tiene un diámetro de 7,5 mm y una longitud de 300 mm. ¿Cuál es el

volumen total de la columna?

Teniendo en cuenta que el volumen muerto de la columna es de 5,2 ml y los volúmenes de

elución de las diferentes proteínas son los siguientes:

Proteína PM (kDa) Ve (ml)

Tiroglobulina 669 7,7

Catalasa 232 9,4

Alcohol deshidrogenasa 150 9,8

Albúmina bovina 67 10

Ovoalbúmina 43 10,7

RNAsa 13,7 12

Proteína X ¿? 9,9

Proteína Y ¿? 10,3

f) ¿Cuál es el PM de “Y” y “X” por este método? Compare estos valores con los resultados obtenidos por SDS-PAGE.

g) En el gel SDS ¿qué proteína migró más rápidamente? ¿Coincide con el orden de elución de la columna de filtración en gel? ¿Por qué, o por qué no?

h) Sugiera la posible razón por la que los resultados del análisis por filtración en gel y SDS-PAGE no concuerdan. ¿Alguno de los métodos es mejor para determinar el PM de las proteínas?

i) La carga de una proteína afecta su solubilidad. Sabiendo que el pI de la proteína “X” es 7,2 y el de la proteína “Y” es 5, ¿Qué pH debería utilizarse para optimizar la separación de “Y” y “X” por precipitación con SO4 (NH4)2?

La cromatografía de intercambio iónico es uno de los métodos cromatográficos más

utilizados.

j) ¿Qué tipo de intercambiador y a qué pH lo utilizaría para separar las proteínas “Y” y “X”? ¿Cómo eluiría las proteínas de la columna?

Se desea evaluar los diferentes pasos de purificación en relación a la proteína “Y”, para lo

cual se realizó el siguiente cuadro de purificación:

Fracción Act.Total (U) Rendimiento (%) Proteína (mg) Act. Específica

(U/mg)

Extracto crudo 1000 100

40-70% SA 800 50

Filtración gel 600 20

Interc. iónico 500 1

k) ¿Cuál es el rendimiento y la actividad específica para cada paso? 8- Con el fin de purificar una enzima se hizo un homogenato con 5 gr de tejido en 15 ml de

buffer (pH 7). Luego se tomaron 10 ml del homogenato y se precipitaron con acetona fría

(volúmenes iguales). El precipitado, que se separa por centrifugación, se disuelve en 10 ml

de buffer acetato de sodio 0,5 M. Estos 10 ml se fraccionaron en partes iguales: 5 ml se

pasaron por una columna de Sephacryl S-200 (A) en buffer acetato de sodio 0,5 M y se

recogieron fracciones de 2 ml. Se leyó la absorbancia a 280 nm y se determinó la actividad.

Los restantes 5 ml se cromatografiaron por una columna de CM-celulosa (B) en buffer

acetato de sodio 0,5 M (pH 7) eluyéndose con un gradiente de 0 a 0,5 M NaCl. Se recogieron

fracciones de 1 ml. Se leyó la absorbancia a 280 nm y se determinó la actividad.

Se obtuvieron en cada caso los siguientes esquemas de elusión:

Determinaciones de proteínas y actividad:

Fracción A 280 nm Actividad (U/ml)

Homogenato 1:10 0,5 25

Prec. Acetona 1:10 0,3 20

Pool A 0,96 85

Pool B 0,48 90

Datos: 1 mg/ml de proteínas tiene una A 280nm= 1,2

Rango de PM de Sephacryl S-200 = 5000-300000.

a- Confeccionar la tabla de purificación incluyendo todos lo pasos de purificación.

b- ¿Qué características presenta la enzima en cuanto a PM y carga?

c- ¿Cuál de las dos columnas elegiría para purificar la enzima?, ¿Por qué?

d- ¿A qué concentración de NaCl eluyó la enzima en la columna de CM?

4. Catálisis Biológica:

☺ 1- Para sobrepasar la barrera energética entre reactivos y productos, se debe proveer energía

para que la reacción comience. Esta energía se denomina:

a) Energía de activación b) Energía de iniciación

c) Energía de reacción d) Energía cinética

e) Energía potencial

☺ 2- Las enzimas: (indique V o F y justifique) a) Están compuestas primariamente de polipéptidos, que son polímeros de amino ácidos. b) Pueden unirse a grupos prostéticos tales como iones metálicos que participan en las reacciones enzimáticas. c) Se unen al sustrato en los sitios activos d) Todos los estamentos son ciertos

☺ 3- ¿Cuál/es de los siguientes estamentos acerca de la velocidad de una reacción no son ciertos?

a) La velocidad de reacción es la velocidad a la cual la reacción procede hacia el equilibrio. b) La velocidad de reacción esta gobernada por la barrera de energía entre reactivos y productos c) Las enzimas pueden acelerar la velocidad de una reacción d) La velocidad de reacción no es sensible a la temperatura e) Ninguno

4- Muchas enzimas se inhiben irreversiblemente por iones de metales pesados (Hg2+, Cu2+ o Ag+), los

que reaccionan con los grupos sulfhidrilos esenciales para formar mercáptidos:

Enz----SH + Ag+ Enz----S----Ag + H+

La afinidad de Ag+ por los grupos sulfidrilos es tan grande que la Ag+ puede ser utilizada para titular los

grupos –SH cuantitativamente. A 10 ml de una solución 1 mg/ml de enzima pura se le agregó una

cantidad suficiente de AgNO3 para inactivar completamente la enzima. Se utilizaron un total de 0.342

umoles de AgNO3. Calcule el peso molecular mínimo de la enzima. Por qué el valor obtenido de esta

forma es el PM mínimo?

5- La actividad enzimática de la lisozima es óptima

a pH 5,2. El sitio activo de la lisozima contiene

dos amino ácidos esenciales para la catálisis:

Glu35 y Asp52. Los valores de pKa de los grupos R

carboxilos de estos dos residuos son 5,9 y 4,5,

respectivamente. Cuál es el estado de ionización

Enzi

ma

(μl)

Sustrato Y

10 mM

(μl)

Buffer

(μl)

Tiempo 0 min.

mmoles de

Producto/ml

Tiempo 10 min.

mmoles de Producto/ml

1 300 0 700 0.02 0.02

2 300 70 630 0.10 0.44

3 300 103 597 0.11 0.49

4 300 179 521 0.12 0.55

5 300 286 414 0.13 0.58

6 300 0 700 0.02 0.02

7 300 70 630 0.09 0.36

8 300 103 597 0.1 0.42

9 300 179 521 0.105 0.49

10 300 286 414 0.115 0.53

(protonado o deprotonado) de cada residuo al pH óptimo de la lisozima? En función del estado de

ionización de estos dos residuos explique el perfil de actividad-pH que se muestra.

☺ 6- Una mutación produce un cambio de Ala a Val en el interior de una proteína, y esto conduce a la

pérdida de actividad. Sin embargo, la actividad se recupera cuando una segunda mutación en otra

posición cambia una Ile por Gly. Cómo puede esta segunda mutación restaurar la actividad?

☺ 7 -Se desea evaluar un nuevo fármaco para el VIH el cual posee actividad de inhibidor de aspartil

proteasas. Para esto se analizó la actividad de la aspartil proteasa presente en el VIH en las siguientes

condiciones:

La mezcla de reacción posee un volumen final de 2 ml y contiene (0-0.6 ml de enzima); 5 mM de sustrato y

buffer Acetato de Sodio 100 mM. La reacción se incubó durante 0; 10 y 20 min.; posteriormente se agregó

NaOH y se determinó la Abs a 335 nm en cada uno de los tubos (ver tabla).

Tiempo de incubación ml de enzima 0 min. 10 min 20 min

0 0.02 0.02 0.03

0.2 0.08 0.26 0.55

0.4 0.14 0.42 0.68

0.6 0.36 0.95 >1

1- Explique cuál es el objetivo de realizar el ensayo a distintos tiempos. Justifique. 2- Analice los valores de absorbancia obtenidos en la segunda columna (correspondiente al

tiempo cero). Proponga una posible explicación para estos valores. Justifique. 3- Qué concentración de enzima y que intervalo de tiempo elegiría para analizar el efecto del

inhibidor. Justifique tanto porqué elige un valor cómo porqué descarta los restantes. 4- Determine gráficamente los parámetros cinéticos para la aspartil proteasa en ambas

condiciones. 5- En base a los resultados obtenidos, que puede decir acerca de la caracterización del

inhibidor con respecto a la enzima? Justifique.

8- Se desean comparar los parámetros cinéticos de las enzimas X y Z aisladas de músculo e hígado de

ratón, respectivamente. Para ello se realizan ensayos tendientes a determinar estos parámetros: enzima

X (tubos 1; 2; 3; 4; 5 y 6), enzima Z (tubos 6; 7; 8; 9 y10).

1- En base a los resultados obtenidos en la tabla, que podría decir acerca de la identidad de las enzimas?. Justifique.

2- Para realizar estos experimentos se eligió previamente la concentración de enzima a ensayar. Que criterios hubiese utilizado para tal elección?. Justifique.

3- Suponiendo que en las condiciones del tubo 3 la producción de sustrato a medida que transcurre el tiempo es proporcional hasta los 30 min de transcurrida la reacción. Grafique curvas de P vs. T que contemplen:

a- el doble de enzima. b- [S]>10 veces Km c- [S] = Km

☺ 9- Dibujar en un mismo gráfico las curvas de tiempo que corresponden a los puntos A, B y C de

la curva v = f([S]) que se muestra. Justificar.

☺ 10 - En el gráfico la curva A fue obtenida a una concentración de enzima [E] de 0,2 mg/ml; la B

con [E] = 0,4 mg/ml, y la C fue obtenida con [E] = 0,2 mg/ml en presencia de 5 mM de un

inhibidor.

a) Dibujar las curvas P = f (t) correspondientes a los puntos 1 a 6. Indicar claramente los cambios de escala.

b) Trazar las curvas V-1 en función de [S]-1 correspondientes a las curvas A, B y C. c) Calcular el Ki e indicar qué tipo de inhibidor se trata.

Rta: Ki: 1,67 mM.

☺ 11-Se estudió el efecto de dos inhibidores A y B (A permeable, B impermeable a membranas

biológicas) sobre la actividad de una enzima, unida a membrana, en vesículas microsomales de riñón.

Los estudios cinéticos realizados arrojaron los siguientes resultados:

Sustrato Velocidad inicial (ηmol/min)

(mM) Sin inhibidor Con inhibidor

A (6µM) B (6µM)

0,20 16,67 6,25 16,50

0,50 33,33 14,29 33,33

1,0 50,00 25,00 49,70

2,0 66,67 40,00 66,60

5,00 83,33 62,50 83,00

Posteriormente se extrajo la enzima de la membrana y se estudió el efecto del inhibidor B sobre su

actividad.

Sustrato Velocidad inicial (nmol/min)

(mM) Sin inhibidor Con inhibidor B (6uM)

0,20 16,67 4,68

0,25 20,00 5,77

12.5-

0,33 24,98 7,60

0,50 33,33 10,70

1,00 50,00 20,40

2,00 66,67 34,48

2,50 71,40 40,00

3,33 76,92 47,60

4,00 80,00 52,60

5,00 83,33 58,80

a) Interprete los resultados obtenidos en cada experimento con respecto a la inhibición por A y B.

b) ¿Qué puede concluir acerca de la localización del sitio activo de esta enzima unida a membrana?.

Justifique.

c) ¿Qué tipo de inhibidor es B? Justifique.

12- Dada la siguiente reacción enzimática S 3P + Q, se obtuvieron las siguientes curvas:

- La curva 1 se obtuvo utilizando 2 concentraciones de sustrato (S1 y S2) siendo S2 = 2S1. la mezcla de

reacción contenía además, buffer borato 40 mM pH 7,5 y 3 mg/ml de proteína.

- Para la curva 2 se utilizó una concentración de sustrato inicial (S3)= 20 mM.

- La acción del inhibidor (I), se ensayó con dos concentraciones de sustrato:

[S]= S2 (curva 1)

[S]= S3 (curva 3)

- Luego de transcurridos 30 minutos de reacción con una concentración de sustrato inicial =S1, la

velocidad se mantuvo constante. A partir de ese momento se diluyó la mezcla de reacción 1/500

manteniendo constantes las concentraciones de buffer y enzima (curva 4).

Calcule:

a) las constantes de Michaelis Menten

b) ¿cuál es la concentración de sustrato S1?

c) ¿qué tipo de inhibidor es I?. Justifique. De ser posible calcule Ki, Kmi y Vmi.

Rta: a) Km: 59 mM; b) S1: 49,2 M; c) Kmi: 143 mM, Vmi: 3.6 µM/min.

13- A partir de una solución de enzima pura, que cataliza la reacción S P, se realizaron ensayos

de actividad manteniéndose la dilución de la enzima y la temperatura constantes y variando el pH

del medio de incubación. Se obtuvieron los siguientes resultados:

[S] µmoles de P/ min . mg de enzima

(mM) pH 5 pH 6 pH 7 pH 8

2 9,1 14,3 8,3 7,2

5 17,9 25,0 16,7 14,7

10 26,3 33,3 25,0 22,7

a) Explique cuál es el efecto del pH sobre la actividad de esta enzima. Justifique su respuesta.

b) ¿Qué concentraciones de sustrato debería utilizarse para alcanzar una velocidad inicial de 10

umoles de P/min.mg de enzima a pH 5 en condiciones similares a las empleadas para

elaborar la tabla?

c) ¿Cuál será la velocidad máxima a pH 8 si se empleara el doble de concentración enzimática

que la empleada en la confección de la tabla? Justifique su respuesta.

Rta: b) [S]= 2,5mM c)Vmax = 74 µmoles/min.mg enzima.

14- Indique a cuáles puntos (A, B, C, D, E y F) del gráfico v vs [S] corresponden cada una de las curvas (1, 2, 3, 4, 5 y 6) del gráfico P vs t. Justifique su respuesta.

5. TERMODINÁMICA: Energía libre, equilibrio

químico.

1-Ordene los compuestos siguientes en orden creciente de su estado de oxidación.

2- Cierta reacción metabólica tiene la forma A B. Su cambio de energía libre estándar es 7,5 kJ.mol-

1. (a) Calcule la constante de equilibrio para la reacción a 25 °C. (b) Calcule el G a 37 °C cuando la

concentración de A es de 0,5 mM y la concentración de B es de 0,1 mM. ¿Es espontánea la reacción

bajo estas condiciones? (c) ¿Cómo podría proceder la reacción en la célula?

☺ 3- La energía libre requerida para la síntesis de ATP a partir de ADP y Pi es de 30.5 kJ/mol cuando los reactivos y productos están a una concentración 1M (estado estándar). Debido a que en condiciones fisiológicas las concentraciones de ATP, ADP y Pi no son 1 M, la energía libre

requerida para sintetizar ATP en condiciones fisiológicas es diferente al G°´.

a) Calcule la energía libre requerida para sintetizar ATP en los hepatocitos humanos cuando las concentraciones de ATP, ADP y Pi son 3.5, 1.5 y 5 mM, respectivamente.

b) Un adulto normal de 68 kg requiere una ingesta diaria de 2000 cal (8.36 kJ). El alimento es metabolizado y la energía libre es utilizada para la síntesis de ATP. Asumiendo que la eficiencia de conversión del alimento en ATP es del 50 %, calcule el peso de ATP utilizado por un adulto en un día. ¿Qué porcentaje del peso del cuerpo representa?

Aunque los adultos sintetizan grandes cantidades de ATP diariamente, el peso del cuerpo no

cambia significativamente durante este período. Explique esta aparente contradicción.

☺ 4- Prediga si a 25 °C cuando [ATP]=4 mM, [ADP] = 0,15 mM, [fosfocreatina] = 2,5 mM y la

[creatina] = 1 mM, la creatina kinasa operaría en la dirección de la síntesis de ATP? o la síntesis de

fosfocreatina?

5-Cuando el pH aumenta de 5 a 6 ¿la magnitud del cambio de energía libre para la hidrólisis aumenta

o disminuye?

6-La reacción para la activación de un ácido graso tiene un G°’= +4,6 kJ . mol-1 ¿Cuál es la fuerza

termodinámica conductora de esta reacción?

ATP + CoA + RCOO- RCO-CoA + AMP + PPi

7 -Si la {ATP] intracelular = 5 mM, [ADP] = 0,5 mM y [Pi] = 1 mM, calcule la concentración de AMP a

pH 7 y 25 °C bajo la condición en la que la reacción de la adelinato kinasa está en equilibrio.

☺ 8- En la última reacción del ciclo del ácido cítrico, el malato es deshidrogenado para regenerar el

oxalacetato necesario para la entrada del acetil-CoA vía la reacción de la citrato sintetasa.

L-Malato + NAD+ oxalacetato + NADH + H+ G°’= 30 kJ/mol

a) Calcule la constante de equilibrio para la reacción a 25 °C. (RTA: 5,51 10-6) b) La medida de la concentración de L-malato en la mitocondria de hígado de rata es

aproximadamente de 0.20 mM cuando [NAD+]/[NADH] es 10. Calcule la concentración de oxalacetato a pH 7 en la mitocondria.

Rta:a) 5.51 10-6 b) 0,11 M

☺ 9- Calcule los cambios en la energía libre estándar (G°´) de la siguiente reacción metabólicamente

importante, a 25 °C y pH 7 a partir de la constante de equilibrio.

Aspartato aminotransferasa

Glutamato + oxalacetato aspartato + -cetoglutarato

K´eq = 6.8

RTA: ∆Gº¨= -4,7 KJ /mol

10- Calcular el G fisiológico de la reacción de la isocitrato deshidrogenasa a 25°C y pH 7, sabiendo que:

[NAD+]/[NADH] = 8; [-oxoglutarato] = 0.1 mM; [isocitrato] = 0.02 mM; suponer condiciones estándar

para el CO2 (G°’= -2,1 Kcal/mol ). Esta reacción es un sitio probable de control metabólico? Por qué?

☺ 11- Al estudiar la ruta metabólica que permite la conversión de un metabolito A P se han

seleccionado las siguientes reacciones como pasos metabólicos posibles:

1- A B

2- B + C D

3- C + E F

4- D P

Simultáneamente se han determinado las concentraciones intracelulares de estos metabolitos en

hígados de rata resultando

B: 25 mM; C: 20 mM; D: 1.5 mM; E: 1 mM F: 5 mM y P: 4 mM

Las constantes de equilibrio de las reacciones mencionadas son:

Keq1: 8 Keq2: 0.2 Keq3: 2 Keq4: 3

a-Proponga la secuencia de reacciones intermedias que permiten la producción de P a partir de A en

las condiciones fisiológicas mencionadas y a 25 C. Justifique.

b- Qué concentración de A intracelular sería necesaria para que la ruta propuesta sea

energéticamente favorable?

12- El citrato se forma por la condensación de acetil-CoA con oxalacetato. En mitocondrias de corazón

de rata a pH 7 y 25°C, la concentración de reactantes y productos son: oxalacetato 1 uM; acetil-CoA 1

uM; citrato 220 uM y CoA 65 uM. Sobre la base de estas concentraciones y el valor del cambio de

energía libre estándar para la reacción de la citrato sintetasa (-32.2 kJ/mol), determine la dirección del

flujo de metabolitos a través de la reacción de la citrato sintetasa en la célula. Explique.

13- Considere la siguiente interconversión que ocurre en la glucólisis

Fructosa-6-fosfato glucosa-6-fosfato K´eq = 1.97

a) ¿Cuál es el G°´ para la reacción (a 25°C)? b) Si la concentración de fructosa-6-fosfato se ajusta a 1.5 M y la de glucosa-6-fosfato a 0.5

M, cuál es el G?

c) ¿Por qué G°´ y G son diferentes?