Presentación Células madre, pasado y futuro.Clase impartida en el Master de Bioética

1

CÉLULAS MADRE

PASADO Y FUTURO

JUSTO AZNAR

DIRECTOR DEL INSTITUTO DE CIENCIAS DE LA VIDA

ABRIL 2008

2

CÉLULAS MADRE

PASADO Y FUTURO

3

CÉLULAS MADRE. PASADO Y FUTURO

PASADO FUTURO

Cultivan por primera vez células madre

embrionarias humanas

Obtienen células similares a las embrionarias por reprogramación

de células adultas. Nacen las células iPS

Shinya Yamanaka 2006

James Thomson 1998 2007

Obtienen células iPS humanas

4

¿QUE SON LAS CÉLULAS MADRE?

Las células madre, también denominadas células troncales, estaminales o en inglés células stem, “son células que tienen la

capacidad, no solamente de poder cultivarse y reproducirse a si mismas, sino también de poder producir células adultas de diferente

progenie, es decir de diferentes tejidos”

I.L. Weissman. New England Journal of Medicine 346; 1576-1583, 2002

5

TIPOS DE CÉLULAS MADREPueden ser:

Totipotentes

Pluripotentes

Multipotentes

Unipotentes

Puedendar

lugar a

Capaces de formar célulasde todos los linajes del

organismo. En los mamíferossolamente lo son el cigotoy los primeros blastómeros

Capaces de formar célulasde todos los linajes del cuerpo,

son las denominadascélulas madre embrionarias.

Son las células madreadultas capaces de

formar distintos tiposde células de un mismolinaje, como las célulasmadre hematopoyéticas

Son células madre adultasque producen células de

un solo linaje, como las célulasmadre germinales, entre ellas

las espermatogonias quegeneran el esperma

Células

Po

r su

po

ten

cia

lidad

Células madre embrionarias

Células madre de tejidos adultos

Por suorigen

Textos de: R. Jaenisch y R. Young. Cell 132; 567-582, 2008

6

CÉLULAS MADRE EMBRIONARIAS

Las células madre embrionarias son células derivadas de los

embriones, no las células constituyentes de los

embriones

S. Holm. Journal of Medical Ethics 34; 63-64, 2008

7

//

cigoto

embriones de:

2 células 3 células 4 células

ser humano adulto

blastocisto

DESARROLLO EMBRIONARIO

8

DESARROLLO EMBRIONARIO

J. Rossant Cell 132, 527-531, 2008

CONSTITUCIÓN DE LA MASA CELULAR INTERNA

http://ezproxy.cti.unav.es:2054/science?_ob=MiamiCaptionURL&_method=retrieve&_udi=B6WSN-4RWHV0W-7&_image=B6WSN-4RWHV0W-7-3&_ba=&_user=5252250&_coverDate=02%2F22%2F2008&_rdoc=7&_fmt=full&_orig=browse&_srch=doc-info(%23toc%237051%232008%23998679995%23681011%23FLA%23display%23Volume)&_cdi=7051&_isHiQual=Y&_acct=C000042418&_version=1&_urlVersion=0&_userid=5252250&md5=b8acbdb9824735c67b5736afce32ad53

9

De embriones: • Sobrantes de fecundación in

vitro• Obtenidos por transferencia

nuclear somática (clonación)• Generados por partenogénesis

a partir de ovocitos animales o humanos

¿DE DÓNDE SE OBTIENEN LAS CÉLULAS MADRE EMBRIONARIAS?

10

¿QUÉ NÚMERO DE EMBRIONES CONGELADOS HAY ACTUALMENTE?

Aproximadamente:1. En España .................... 200.0002. En Estados Unidos ...... 400.0003. En todo el mundo .......1.500.000

OBTENCIÓN DE CÉLULAS MADRE EMRIONARIAS DE SOBRANTES DE

FECUNDACIÓN IN VITRO

11

OBTENCIÓN DE CÉLULAS MADRE EMBRIONARIAS A

PARTIR DE BLASTOCISTOS

GENERADOS POR TRANSFERENCIA

NUCLEAR SOMÁTICA

12

TRANSFERENCIA NUCLEAR SOMÁTICA

Ovocito Célula adulta

Enucleación Enucleación

ACTIVACIÓN

TRANSFERENCIA NUCLEAR

Cigoto híbrido

Embrión de dos célulasMasa granulosa interna

Resto embrionario

Células madre embrionarias

Embrión de 64 a 200 células (blastocisto)

13

PARA OBTENERLAS ES NECESARIO CLONAR UN ANIMAL O UN INDIVIDUO

HUMANO

OBTENCIÓN DE CÉLULAS MADRE EMBRIONARIAS

AUTÓLOGAS

14

CLONACIÓN ANIMAL

RESUMEN HISTÓRICO

Heidi Ledford. Nature 445; 800-802, 2007

http://ezproxy.cti.unav.es:2054/science?_ob=MiamiCaptionURL&_method=retrieve&_udi=B6WSN-4RWHV0W-7&_image=B6WSN-4RWHV0W-7-3&_ba=&_user=5252250&_coverDate=02%2F22%2F2008&_rdoc=7&_fmt=full&_orig=browse&_srch=doc-info(%23toc%237051%232008%23998679995%23681011%23FLA%23display%23Volume)&_cdi=7051&_isHiQual=Y&_acct=C000042418&_version=1&_urlVersion=0&_userid=5252250&md5=b8acbdb9824735c67b5736afce32ad53

15

Clonación de lobos

Investigadores de la Universidad de Seúl publican en marzo de 2007 la clonación de

dos lobos, Snuwolf y Snuwolffy

M.K. Kim y col. Cloning and Stem Cells 9; 130-137, 2007

Nature / DOI: 10.1038 / News 070430- 4. 1 de mayo de 2007 )

Un equipo de la propia Universidad de Seúl confirma, el 27 de abril de 2007, que los lobos

clonados son genuinos clones

CLONACIÓN ANIMAL

16

• Se consigue por primera vez en el mundo clonar primates (macacus rhesus)

• A partir de 304 ovocitos obtenidos de 14 hembras macacus rhesus

• Se generaron 2 líneas de células madre embrionarias

Eficiencia 0.7%

J.A. Byrne y col. Nature 450; 497-502, 2007

CLONACIÓN ANIMAL

Clonación de primates

171 No consiguieron obtener células madre de los blastocistos clonados

1. Cibelli JB. J Regener Med 2; 25, 20011

2. Chen Y. Cell Res 13; 251, 2003

3. Guangxin L. Chinose Sci Bull 48, 1240, 20031

4. Hwang WS et al. Science 303; 1669, 2004

5. Hwang WS et al. Science 308; 1777, 2005

6. Stojkovic M et al. Reprod Bio Med Online 11, 226, 20051

7. Zavos P. et al. Archives of Andrology 52; 243, 2006

INTENTOS DE CLONACIÓN HUMANA

18

¿SE HA CONCEGUIDO LA CLONACIÓN HUMANA?

No parece que hasta ese momento existiera evidencia de que se hubiera

logrado la clonación de seres humanos

J. Yu y col. Science 318; 1917-1920, 2006

J. Hanna y col. Science 318; 1920-1923, 2007

T. Kakahashi y col. Cell 131; 861-872, 2007

X Yang y col. Nature Genetics 39; 295-302, 2007

19

CLONACIÓN HUMANA

Sin embargo, existen razones fundadas para creer que se van a poder producir

clones humanos

X Yang y col. Nature Genetics 39; 295-302, 2007

20

• Un equipo de la firma comercial Stemagen Corporation de la Jolla, California, publica un artículo en donde afirman que han podido obtener blastocistos humanos por transferencia nuclear somática utilizando células adultas de piel y ovocitos de mujeres jóvenes (20-24 años) sobrantes de fecundación in vitro

• También han obtenido blastocistos a partir de un pequeño número de ovocitos humanos partenogenéticamente

CLONACIÓN HUMANA

AJ French. Stem Cells 26; 485-493, 2008

21

CLONACIÓN HUMANA

• Aunque hasta el momento no hay evidencia de que se haya logrado obtener líneas celulares embrionarias a partir de embriones humanos

• Existen razones fundadas para creer que se vana poder producir clones humanos

X Yang y col. Nature Genetics 39; 295, 302, 2007

22

POTENCIAL TERAPÉUTICO DE LAS CÉLULAS MADRE EMBRIONARIAS

EXPERIENCIAS PRECLÍNICAS CON CÉLULAS MADRE EMBRIONARIAS HUMANAS

Se demuestra por primera vez que cardiomiocitos generados a partir de células madre embrionarias humanas pueden mejorar la función cardiaca de

corazones de rata infartados

M.A. Laflamme y col. Nature Biotechnology 25; 1015 – 1024, 2007

23

• A partir de células madre embrionarias obtienen células de músculo esquelético.

• Cuando estas células se transfieren a ratones con distrófia muscular se mejora la función muscular sin que se produzcan teratomas

• Estas experiencias sugieren la posibilidad de aplicarlas en pacientes con distrofia muscular, particularmente en la distrofia muscular de Duchenne

EXPERIENCIAS PRECLÍNICAS CON CÉLULAS MADRE EMBRIONARIAS

R Darabi y col. Nature Medicine 14; 134-143, 2008

24

APLICACIONES PRECLÍNICAS

Se describe por primera vez la obtención de células similares a los fotoreceptores de la retina a

partir de células madre embrionarias de ratón, mono e

individuos humanos

F Osaka y col Nature Biotechnology 26; 215-224, 2008

25

No se han aplicado clínicamente por la ineficiencia del proceso de clonación, por la

falta de conocimiento de los mecanismos que lo sustentan, por la necesidad que

existiría de mantener terapia inmunosupresiva durante toda la vida, por el riesgo de inducir el desarrollo de hematomas

y por las dificultades éticas que su uso conlleva

EXPECTATIVAS TERAPÉUTICAS UTILIZANDO CÉLULAS MADRE

EMBRIONARIAS

26

M. Enserink. Science 313; 160-163, 2006

“Nadie podría prometer hoy la falsedad de que con células

madre embrionarias se puede curar a alguien inminentemente,

esto es engañar cruelmente a pacientes y público”

EXPECTATIVAS TERAPÉUTICAS UTILIZANDO CÉLULAS MADRE

EMBRIONARIAS

27

CÉLULAS MADRE DE

TEJIDOS ADULTOS

28

¿DE DONDE SE OBTIENEN LAS CÉLULAS MADRE DE TEJIDOS

ADULTOS?

De: • Diferentes tejidos adultos• Cordón umbilical• Placenta• Fetos abortados. A partir de células madre

germinales• Teratocarcinomas o carcinomas

embrionarios, especialmente de tumores testiculares

29

• Fusionándose con las células del órgano lesionado• Diferenciándose a células específicas de ese órgano

• Favoreciendo la vasculogénesis a partir de células progenitoras endoteliales contenidas en el material celular o de células mononucleares de la médula ósea

• Ejerciendo acciones paracrinas por liberación de factores de crecimiento, proteínas angiogénicas, factores tróficos o factores moduladores del sistema inmunológico

• Remodelando físicamente la arquitectura tridimensional del órgano afectado

MECANISMOS POR LOS CUALES EJERCEN SU FUNCIÓN LAS CÉLULAS

MADRE ADULTAS

Estos mecanismos in vivo no parecen relevantes

30

EXPERIENCIAS CLÍNICAS CON CÉLULAS MADRE ADULTAS

31

OBJETIVAS EXPECTATIVAS CLÍNICAS DERIVADAS DEL USO

DE CÉLULAS MADRE DE TEJIDOS ADULTOS

“Seguramente no hay un precedente así en la

ciencia actual”J. Martin. The Lancet 365; 2070-2071, 2005

32

ENSAYOS CLÍNICOS CON CÉLULAS MADRE ADULTAS APROBADOS POR LA FDA

En enero de 2007 había

ensayos clínicos aprobados por la Food and Drug Administration norteamericana.

De ellos, más de 250 en infarto de miocardio, 24 en linfoma de tipo no-Hodgkin y 5 en

tumores testiculares

A. D. Prentice y G. Tarne Science 315; 328,2007

ENSAYOS CLÍNICOS REALIZADOS

1238

33Updated 14/04/2007

34

ESTUDIOS EN INFARTO DE MIOCARDIO CON CÉLULAS MADRE

ADULTAS

35

ENSAYOS CLÍNICOS PARA TRATAR EL INFARTO DE MIOCARDIO

Hasta ahora en los ensayos clínicos promovidos para tratar el

infarto de miocardio se han utilizado solamente células madre

de médula ósea y células endoteliales progenitoras

VFM Segers y RT Lee Nature 451; 937-942, 2008

36

APLICACIONES CLÍNICAS DE LAS CÉLULAS MADRE ADULTAS

En un interesante artículo del pasado febrero se revisan los estudios realizados entre

enero de 1997 y diciembre de 2007 sobre la utilización de las células madre de tejidos

adultos con fines terapéuticos

FUENTES: MEDLINE, EMBASE, Science Citatim Index, pagmes web FDA y de INS de Estados Unidos

R.K. Burt y col. JAMA 299; 925-936, 2008

37

ENSAYOS CLÍNICOS CON CÉLULAS MADRE ADULTAS

Burt, R. K. et al. JAMA;299,925-936,2008

38Burt, R. K. et al. JAMA;299,925-936,2008

Clinical Trials of Stem Cell Therapy for Acute Myocardial Infarction With >=30 Patients

39

ENSAYOS CLÍNICOS EN INFARTO DE MIOCARDIO AGUDO

VALORACIÓN GLOBAL

• Se observa un modesto beneficio de la fracción de eyección ventrícular izquierda. En los interensayos es de 8’6 % y en los intraensayos del 2’4 %

• No se producen efectos secundarios negativos

Burt, R. K. et al. JAMA;299,925-936,2008

40Burt, R. K. et al. JAMA;299,925-936, 2008

Clinical Trials of Stem Cell Therapy for Chronic Myocardial Ischemia and/or Heart Failure With >=20 Patients

41

ENSAYOS CLÍNICOS EN ENFERMEDAD ISQUÉMICA CORONARIA CRÓNICA

VALORACIÓN GLOBAL

• Aumento de la perfusión regional

• Mejora de la contractibilidad cardiaca

• Modesto aumento de la fracción de eyección ventricular izquierda

• Reducción del dolor anginoso

Burt, R. K. et al. JAMA;299,925-936,2008

42

ACCIONES FUTURAS EN RELACIÓN CON EL INFARTO DE MIOCARDIO

• En la mayoría de los estudios el número de miocardiocitos que se generan y que se integran en el miocardio lesionado es demasiado pequeño para justificar la mejora de la función cardiaca observada

• Esta mejora podría deberse a un efecto paracrino, por lo que la identificación de los factores que condicionan esta acción celular puede ser importante

• Utilizar las células adecuadas en el lugar adecuado y desarrollar métodos más eficientes para generar el tipo celular deseado

• Conocer mejor los mecanismos que regulan el metabolismo de los miocardiocitos

• Conocer mejor los mecanismos del “homing”• Definir los factores presentes en el entorno celular lesionado

que limitan la supervivencia y la integración funcional de las células transplantadas

• Supresión del rechazo inmunológico para mejorar el efecto terapéutico

VFM Segers y RT Lee Nature 451; 937-942, 2008 H.E. Fleming. Cell 132; 505-509, 2008

43

TERAPIA CELULAR

• Terapia celular preparada de forma individual para cada paciente

• Bancos universales de células madre

• Utilización de fármacos que estimulen el aumento endógeno de células madre

G.Q. Daley y D.T. Scadden. Cell 132; 544-548, 2008

OPCIONES FUTURAS

44

CREACIÓN DE ÓRGANOS BIOARTIFICIALES.

INGENIERÍA DE ÓRGANOS

POSIBLES ALTERNATIVAS AL TRANSPLANTE DE

ÓRGANOS

45

PROBLEMAS FUNDAMENTALES DEL TRANSPLANTE DE ÓRGANOS

• Limitación de órganos disponibles

• Necesidad de inmunosupresión durante toda la vida

46

INGENIERÍA DE ÓRGANOS

Depositando cardiomiocitos sobre delgadas láminas de material

biocompatible se ha conseguido formar estructuras orgánicas de

tres dimensiones

A.W. Feinberg y col. Science 317; 1366-1370, 2007

CONSTRUCCIÓN DE ÓRGANOS SOBRE UNA MATRIZ ARTIFICIAL

47

PRODUCCIÓN DE UN CORAZÓN ARTIFICIAL

• El equipo de Doris A. Taylor, de la Universidad de Minessota ha conseguido por primera vez crear un corazón bioartificial

HC Ott. Nature Medicine 14; 213-221, 2008

48


METÓDICA PARA OBTENERLO

•Descelularización de corazones de cadáver de rata por perfusión con detergentes

•Mantenimiento de la matriz extracelular, con conservación de una estructura espacial cardiaca acelular

•Reperfusión con células cardiacas neonatales o células endoteliales aórticas de rata

•Cultivo de estas estructuras recelularizadas en un medio similar al que se utiliza para el mantenimiento de órganos

•Mantenimiento de la perfusión durante 28 días


49

• A los 4 días de finalizar la reperfusión celular la estructura cardiaca generada se contrae

• A los 8 días adquiere la función de la bomba cardiaca


RESULTADOS


50

• La misma técnica de descelularización se ha utilizado con corazones de cerdo, de un tamaño similar al humano

• También han conseguido descelularizar, pulmones, hígado, riñón y tejido muscular de diversos mamíferos


PERSPECTIVAS FUTURAS


51

ALTERNATIVAS PARA LA ALTERNATIVAS PARA LA OBTENCIÓN OBTENCIÓN

DE CÉLULAS MADRE DE CÉLULAS MADRE DE TIPO EMBRIONARIO. DE TIPO EMBRIONARIO.

CONSIDERACIONES BIOLÓGICAS Y CONSIDERACIONES BIOLÓGICAS Y ÉTICASÉTICAS

52

ALTERNATIVAS AL USO DE CÉLULAS MADRE EMBRIONARIAS

Para obtener células madre embrionarias hay que destruir al embrión del cual se obtienen, lo que indudablemente supone un importante problema ético. Por ello, hace unos años se

planteó el reto de obtener células madre similares a las de los embriones humanos por procedimientos que no requirieran la

destrucción de embriones

Best Practical Research Clinical Obstetrics and Gynecology 18; 929-940, 2004

53


Esta inquietud fue recogida por el Consejo Asesor de Bioética

del presidente de Estados Unidos, que en 2005 propuso cuatro posibles alternativas

White Paper Alternate Sources of Human Pluripotent Stem Cells. Washington DC. President’s Councel on Bioethics. 2005

54


Estas cuatro propuestas se han ampliado ocho:• Embriones en fase muy temprana de

desarrollo

• Estructuras biológicas no embrionarias generadas por transferencia nuclear somática alternada (ATN)

• Estructuras biológicas obtenidas por transferencia nuclear somática alterada (ATN) con reprogramación asistida del ovocito (OAR)

55


• Por fusión de núcleos de células somáticas adultas con células madre embrionarias

• De pseudoembriones• De células madre germinales• De ovocitos activados por partenogénesis • Por reprogramación de células somáticas

adultas

56

OBTENCIÓN DE CÉLULAS MADRE A PARTIR DE

CÉLULAS DE EMBRIONES EN FASE MUY TEMPRANA DE

DESARROLLO

58

OBTENCIÓN DE CÉLULAS MADRE DE EMBRIONES EN FASE MUY TEMPRANA

DE DESARROLLO

Los primeros en proponer esta técnica fueron Strelchenko y col, del Instituto de Genética Reproductiva de Chicago, dirigido por Verlinsky, que las obtuvieron de embriones de 60 a 70 células, es decir solamente un día antes de que el embrión llegara a la fase de blastocisto

N. Strelchenko y col. Reproduction BioMedicine Online 9; 623-629, 2004

59

OBTENCIÓN DE CÉLULAS TRONCALES DE EMBRIONES EN FASE MUY TEMPRANA DE DESARROLLO

Posteriormente Robert Lanza y colaboradores de la Advanced Cell Technology, consiguen extraer blastómeros de embriones de ocho células y a partir de ellos generar líneas celulares que pudieron diferenciarse a células de distintos tejidosLos embriones de siete células resultantes se implantaron en hembras subrrogadas pseudogestantes, obteniendose ratones aparentemente normales, con una eficiencia similar a cuando se obtenían a partir de embriones de 8 células

Cheng Y. y col. Nature 439; 216-219, 2006

60

OBTENCIÓN DE CÉLULAS TRONCALES DE EMBRIONES EN FASE MUY TEMPRANA DE DESARROLLO

• Los embriones donantes proceden de los sobrantes de la fecundación in vitro. Por ello,

las células madre así obtenidas podrían ocasionar problemas de rechazo

inmunológico similares a los de los trasplantes alogénicos si se utilizaran con

fines terapéuticos• Estas células tendrían por tanto una

aplicación fundamentalmente experimental

DIFICULTADES TÉCNICAS

61

GENERACIÓN DE ESTRUCTURAS BIOLÓGICAS

NO EMBRIONARIAS POR TRANSFERENCIA NUCLEAR SOMÁTICA ALTERADA (ANT)

62

TRANSFERENCIA NUCLEAR SOMÁTICA ALTERADA

Célula de tejido adulto

Célula genéticamente modificada

MODIFICACIÓN GENÉTICA

Ovocito

Ente biológico no embrionario

Células similares a las células madre

embrionarias

ACTIVACIÓN

Pseudoembrión

63

UTILIZACIÓN DE LA TRANSFERENCIA NUCLEAR

SOMÁTICA ALTERADA (ANT)

La ANT fue propuesta por William B Hurlbut, de la Universidad de Stanford

Perspectives in Biology and Medicine 48; 211-228, 2005

64

UTILIZACIÓN DE LA TRANSFERENCIA NUCLEAR SOMÁTICA ALTERADA (ANT)

La propuesta teórica de Hulburt fue llevada a la práctica por A. Meissner y R. Jaenish

En sus experiencias utilizaron fibroblastos de ratones que modificaron genéticamente para que no pudieran expresar

el gen Cdx2 que produce un factor de trascripción necesario para que se forme adecuadamente el trofoblasto

Si este gen no se expresa el embrión, en teoría, no podría implantarse

Nature 439; 212-215, 2005

66

TRANSFERENCIA NUCLEAR SOMÁTICA ALTERADA (ANT)

DIFICULTADES ÉTICAS DE LA TRANSFERENCIA

1. No se tiene la certeza de que el gen Cxd2 cumpla la misma función en humanos que en ratones

2. No se puede tener la seguridad de que cada una de las entidades biológicas creadas sea incapaz de desarrollar un embrión viable

3. No se puede tener la certeza de que durante los tres o cuatro primeros días de vida esa entidad biológica no sea diferente de un embrión humano creado in vitro por transferencia nuclear somática

4. Necesidad de utilizar un gran número de ovocitos humanos

Solter D. N. Engl. J. Med. 353; 2321-2323, 2005

67

CREACIÓN DE ESTRUCTURAS

BIOLÓGICAS PSEUDOEMBRIONARIAS POR TRANSFERENCIA NUCLEAR SOMÁTICA

ALTERADA CON REPROGRAMACIÓN

ASISTIDA DEL OVOCITO (ANT - OAR)

68

ANT - OAR

Resto celular

Núcleo genéticamentemodificado

TRANSFERENCIA NUCLEAR

Ovocito enucleado

Ente biológicoembrionario

ACTIVACIÓN

Pseudoembrión

Células madre similares a las embrionarias

Célula de tejido adulto

69

CREACIÓN DE ESTRUCTURAS

BIOLÓGICAS PSEUDOEMBRIONARIAS

POR FUSIÓN DE LAS CÉLULAS SOMÁTICAS

ADULTAS GENÉTICAMENTE MODIFICADAS CON CÉLULAS MADRE EMBRIONARIAS

70

FUSIÓN CON CÉLULAS MADRE EMBRIONARIAS

Para solventar el grave problema del uso de ovocitos humanos que la ANT y la ANT-

OAR tienen, se propuso fusionar el núcleo de las células somáticas adultas

genéticamente modificadas con células madre embrionarias en lugar de

transferirlas a ovocitos enucleados

71

EXPERIENCIAS DE COWAN Y COLABORADORES

Célula madre embrionaria

Célula adulta genéticamente

modificada

ACTIVACIÓN

Híbrido

Células pluripotentes

FUSIÓN

FUSIÓN DE NÚCLEOS DE CÉLULAS ADULTAS CON CÉLULAS MADRE EMBRIONARIAS

72

FUSIÓN DE NÚCLEOS DE CÉLULAS ADULTAS CON CÉLULAS MADRE EMBRIONARIAS

Esta propuesta ha sido aplicada en humanos, fusionando el núcleo de células somáticas con

células troncales embrionarias

Tras la fusión se ha conseguido que el genoma de las células somáticas se

reprogramara hasta un estado evolutivo similar al de las células pluripotentes, a partir del cual se pudieron obtener líneas celulares

similares a las embrionarias

Cowan CA. Science 309; 1369-1373, 2005

73

DIFICULTADES TÉCNICAS

Dificultades técnicas:• Por ser células tetraploides no podrían ser utilizadas con fines

terapéuticos• Para hacerlas terapéuticamente útiles habría que desarrollar un

método para convertir la célula tetraploide en diploide

B.M. Kuehn. JAMA; 1475-1476, 2005

• Actualmente es posible una eliminación selectiva de algunos cromosomas derivados de las células madre embrionarias pero parece difícil generar células diploides reprogramadas por este mecanismo debido al riesgo de producir inestabilidad genómica

• Por la baja eficiencia del proceso de fusión ha sido difícil estudiar los mecanismos responsables de la reprogramación de la célula somática

H. Matsumura y col. Nature Methods 4; 23-25, 2007

R. Jaenisch y R. Young. Cell 132; 567- 582, 2008

74

OBTENCIÓN DE CÉLULAS MADRE A

PARTIR DE PSEUDOEMBRIONES

75

EMBRIONES ANEUPLOIDES

PARTENOTES

ANDROGENOTES

PSEUDOEMBRIONES

76

OBTENCIÓN DE CÉLULAS MADRE A PARTIR DE PSEUDOEMBRIONES

De embriones aneuploides se pueden obtener células madre de tipo embrionario

normalesE. Suss-Toby y col. Human Reproduction 19; 670 – 675, 2004

77

• Se consigue generar blastocistos a partir de partenotes humanos

OBTENCIÓN DE CÉLULAS MADRE A PARTIR DE PARTENOTES

• Los partenotes se producen por activación de ovocitos sin el material cromosómico procedente de los espermatozoides

• De ellos se pueden obtener células madre embrionarias que podrían tener un hipotético papel terapéutico

Editorial. Cloning and Stem Cells 9; 291, 2007

JB Cibelli y col. Journal of Regenerative Medicine 2; 25-31, 2001

78

fg

fg

Parthenote (only maternal genome)

(in mice) can develop only till day 12,

exhibiting heart beating and blood

circulation

Androgenote(only paternal genome)

Can implant, but produces a

hydatiform mole without proper

embryo

Tomado de: A. Suárez, M. Lang y J. Huarte(www.embryoperson.org) Febrero 2006

OBTENCIÓN DE CÉLULAS MADRE

A PARTIR DE PSEUDOEMBRIONES

http://www.embryoperson.org/

79

OBTENCIÓN DE CÉLULAS MADRE SIMILARES A LAS EMBRIONARIAS A

PARTIR DE CÉLULAS GERMINALES

80

OBTENCIÓN DE CÉLULAS MADRE SIMILARES A LAS EMBRIONARIAS A PARTIR

DE CÉLULAS MADRE TESTICULARES

Se confirma la pluripotencialidad y plasticidad de las células germinales masculinas inmaduras obtenidas de ratones adultos. Se han denominado

células madre germinales multipotenciales adultas o células

maGSCs

Guan y col. Nature 440; 1199 – 1203, 2006

81

Neuronal differentiation of maGSCs

Striated muscleNeural tissueCartilage

Epithelial cell/hepatocyte differentiation

Intestine tissue

OBTENCIÓN DE CÉLULAS DE DIFERENTES TEJIDOS A PARTIR DE CÉLULAS MADRE TESTICULARES

a-c: células neurales g-i: teratomasd-f: células epiteliales hepáticas j-l: células epiteliales intestinales

Guan y col. Nature 440; 1199 – 1203, 2006

82

OBTENCIÓN DE CÉLULAS MADRE SIMILARES A LAS EMBRIONARIAS A PARTIR

DE CÉLULAS MADRE TESTICULARES

A partir del estroma testicular se pueden obtener células progenitoras de las

espermatogonias (SPCs) y de las SPCs se pueden derivar células madre adultas

multipotentes (MACs)A partir de las células MACs obtienen células cardíacas contráctiles y trasplantándolas a un animal vivo, vasos sanguíneos funcionantes

M. Seandel y col. Nature 449; 346 – 350, 2007

83

OBTENCIÓN DE CÉLULAS MADRE SIMILARES A

LAS EMBRIONARIAS A PARTIR DE OVOCITOS

NO ACTIVADOS

84

OVOCITO NO ACTIVADO

BLASTOCISTO

CÉLULAS MADRE SIMILARES A LAS EMBRIONARIAS

HUMANAS

CÉLULAS DE DIVERSOS TEJIDOS

ACTIVACIÓN (PARTÉNOGÉNESIS)

OBTENCIÓN DE CÉLULAS MADRE SIMILARESA LAS EMBRIONARIAS A PARTIR

DE OVOCITOS NO ACTIVADOS

E. Revazova y col. Cloning and Stem Cells 9; 432-450, 2007

85

Esta técnica también ha sido utilizada en ratonas evitando

el rechazo inmunológico

K. Kim. Science 315; 482-486, 2007

OBTENCIÓN DE CÉLULAS MADRE SIMILARES

A LAS EMBRIONARIAS A PARTIR DE OVOCITOS NO ACTIVADOS

86

LIMITACIONES

OBTENCIÓN DE CÉLULAS MADRE SIMILARESA LAS EMBRIONARIASA PARTIR


Se requiere utilizar un gran número de ovocitos humanos

Sólo podría utilizarse para tratar a mujeres

87

Para evitar el uso de ovocitos se podrían utilizar ovocitos creados in

vitro, lo cual ya se ha logrado a partir de células madre de

embriones de ratón o de células madre de piel de fetos de cerdo

OBTENCIÓN DE CÉLULAS MADRE SIMILARESA LAS EMBRIONARIASA PARTIR


1

2

1. K Hulner y col Science 300; 1251-1256, 2003

2. P W Dyce y col Nature Cell Biology 8; 384-390, 2006

88

OBTENCIÓN DE CÉLULAS MADRE SIMILARES

A LAS CÉLULAS MADRE EMBRIONARIAS POR REPROGRAMACIÓN

DIRECTA DE CÉLULAS ADULTAS

89


PASADO FUTURO








90

Célula adulta

Célula pluripotente Células de todo

tipo de tejidos

REPROGRAMACIÓN

REPROGRAMACIÓN DE CÉLULAS ADULTAS

Célula totipotente Embrión

OBTENCIÓN DE CÉLULAS MADRE SIMILARESA LAS CÉLULAS MADRE EMBRIONARIAS

POR REPROGRAMACIÓN DIRECTA DE CÉLULAS ADULTAS

91

CÉLULAS ADULTAS

CÉLULAS SIMILARES A LAS EMBRIONARIAS

(CÉLULAS iPS)

CÉLULAS DE TODO TIPO DE TEJIDOS

Genes codificadores de proteínas de transcripción

Proteínas de transcripción

Genes reprogramadores

REPROGRAMACIÓN DE CÉLULAS ADULTAS ANIMALES

K. Takahashi y S. Yamanaka.

Cell 126; 652-655, 2006

92

REPROGRAMACIÓN DE CÉLULAS SOMÁTICAS A UN ESTADO PLURIPOTENTE

Célula somática

Oct4 Sox2 c-Myc Klf4

Proceso de reprogramación

Reprogramada

parcialmente Reprogramada

totalmente

Célula pluripotente

Fbx15 NanogOct4

No expresan Oct4 y Nanog endógenos

No generan chimeras

Producen teratomas

Expresan Oct4 y Nanog endógenos

Modificado de: R. Jaenisch y R. Young Cell

132; 567-582, 2008

93


K. Okita y col. Nature 448; 313-317, 2007

Estos resultados fueron ampliados y confirmados en un trabajo posterior del

mismo grupo. Además, si las células iPS se inyectaban en blastocistos murinos se consiguían quimeras

adultas de ratones que eran capaces de transmitir sus características

genéticas a la siguiente generación

94

Confirman las experiencias realizadas en animales por Takahashi y Yamanaka

M. Wernig y col. Nature; 318-324, 2007


Confirman las anteriores experiencias y además consiguen producir quimeras que si son inyectadas en blastocistos murinos pueden generar embriones

vivosN. Maherali y col. Cell Stem Cell 1; 55-70, 2007

95

REPROGRAMACIÓN DE CÉLULAS ADULTAS HUMANAS

Pero el paso de las experiencias animales a humanos no parecía fácil

Así, Janet Rossant se preguntaba el pasado mes de julio:

“¿Serán eficientes los mismos mágicos factores moleculares para generar células iPS humanas?

Diversos grupos están intentándolo, pero trasladar estas pruebas a humanos tiene muchas dificultades”

J. Rossant. Nature 448; 260-262, 2007

96


EXPERIENCIAS DE LOS GRUPOS DE SHINYA YAMANAKA Y JAMES

THOMSON

97


PASADO FUTURO








98

CÉLULAS DE PIEL HUMANA

CÉLULAS iPS

GENES REPROGRAMADORES

CÉLULAS DE TODO TIPO DE TEJIDOS


J. Yu y col. (grupo Thomson).

Science 318; 1917-1920, 2007

K. Takahashi y col. (grupo Yamanaka).

Cell 131; 861-872, 2007

99


Takahashi y col. (grupo Yamanaka):Genes reprogramados: Oct ¾, Sox2, c-Myc y Klf4Medio para transferirlos: retrovirusFuente de células adultas: prepucio de recién nacido

Yu y col. (grupo Thomson): Genes reprogramados: Oct ¾, Sox2, Lin 28 y NanongMedio para transferirlos: lentivirusFuente de células adultas: fibroblastos fetales y neonatales

100

Las células iPS generadas muestran expresión genética y modelos de metilación muy parecidos a los de las células madre embrionarias, crecen internamente mientras expresan telomerasa, tienen un cariotipo normal y forman teratomas si se trasplantan a ratones inmunosuprimidos

Ch.E. Murry y G. Keller. Cell 132; 661-680, 2008


101

I-H. Park y col. (grupo de G.Q. Daley) Derivan células iPS de células adultas, especialmente fibroblastos de fetos neonatos y sujetos adultos, utilizando los

cuatro mismo genes reprogramadores. Comprueban que los factores de reprogramación

fundamentales son el Oct-4 y el Sox2. Las células iPS se asemejan a las embrionarias

humanas en morfología y expresión genética y tienen la capacidad de producir teratomas en

ratones inmunodeficientes

CONFIRMACIÓN DE LAS EXPERIENCIAS DE YAMANAKA Y THOMSON


I-H. Park. Nature 451; 141-146, 2008

102

Consiguen generar células iPS a partir de fibroblastos de piel

humana que pueden diferenciarse a todo tipo de tejidos, lo que avala

su pluripotencialidad

WE Lowry y col. PNAS 105; 2883-2888, 2008


103

UTILIDAD EXPERIMENTAL DE LAS CÉLULAS iPS

Las células iPS podrían suplir mucha de la información que ahora

proporcionan las células madre embrionarias en investigación y en

medicina

MF Pera Nature 451; 135-136, 2008

104

El grupo de Yamanaka demuestra que las células iPS pueden ser

directamente derivadas a cardiomiocitos y células

neuronales

UTILIDAD EXPERIMENTAL

K. Takahashi y col.

Cell 131; 861 – 872, 2007

105

CLONACIÓN DE ANIMALES UTILIZANDO CÉLULAS iPS

Estos ratones tienen tres progenitores biológicos: el macho que aporte el

esperma y la hembra que da el óvulo para la generación del embrión de ratón por fecundación in vitro y el

tercer ratón del que se extrae la célula de piel con que se generaran las

células iPS

S Connor The independent 14-IV-2008. Experiencias del grupo de Robert Lanza de Advanced Cell Technology

106

.

.

.

Reprogramar

Fibroblasto Células iPS

Clon parcial

Clon completoCélula iPS Embrión de ratón

Fusión

CLONACIÓN DE ANIMALES UTILIZANDO CÉLULAS iPS

S Connor The independent 14-IV-2008. Experiencias del grupo de Robert Lanza de Advanced Cell Technology

107

Consiguen mejorar los síntomas clínicos de ratones con anemia falciforme

utilizando células iPSLos tres animales que las recibieron

sobrevivieron más de 20 semanas, mientras los que no, murieron antes de

la séptima semana

EXPERIENCIAS PRECLÍNICAS EN ANIMALES UTILIZANDO CÉLULAS

iPS

J. Hanna y col. Science 318; 1920 – 1923, 2007

108

• Demuestran que células iPS se pueden diferenciar en células madre precursoras neurales que en cultivo puede generar células neurales o de glia

• Si las células generadas se transfieren al cerebro de fetos de ratones, migran a distintas regiones y se diferencian en glia y neuronas

• También las células iPS se diferencian a neuronas dopaminérgicas

• Cuando las neuronas dopaminérgicas se transplantan a cerebro de ratas con Parkinson se consigue mejorar sus síntomas clínicos

• Estos resultados demuestran el potencial terapéutico de células iPS procedentes de fibroblastos para el reemplazo de células neuronales patológicas en un modelo animal

M Wernig y col PNAS 105; 5856-5861, 2008 (publicado 15-IV-2008)

EXPERIENCIAS PRECLÍNICAS EN ANIMALES UTILIZANDO CÉLULAS iPS

109

OTRAS APLICACIONES DE LAS CÉLULAS iPS

• Las células iPS pueden ser el más práctico y eficiente camino para

producir grandes bancos de células humanas pluripotentes de los

haplotipos deseados • Esto evitaría el uso y destrucción de

miles de embriones

MF Pera y K Hasegawa Nature Biotechnology 26; 59-60, 2008

110

VENTAJAS ÉTICAS

NO SE REQUIERE LA DESTRUCCIÓN DE

EMBRIONES HUMANOS

111

RAZONES DE YAMANAKA PARA SUS INVESTIGACIONES

• “Cuando vi el embrión, rápidamente me di cuenta de que no había diferencia entre él y mis hijas”

• “Pensé que no podemos permitirnos destruir embriones para nuestras investigaciones”

• “Tiene que haber otro camino”

M Fackler “The New York Times” 11-XI-2007

112

VENTAJAS TÉCNICAS

• No inducen rechazo inmunológico Lo que abre la posibilidad de crear fármacos específicos para un paciente determinado

• No requiere la utilización de ovocitos humanos

• Facilidad técnica

• Coste reducido

113

INCONVENIENTES TÉCNICOS

• Posibilidad de transmisión de enfermedades virales

• Posibilidad, aunque menor, de producir tumores

• Posibles problemas genéticos debido a la introducción del ADN de los genes reprogramadores

114

OTROS INCONVENIENTES TÉCNICOS

Los actuales protocolos para generar células iPS tienen el peligro de facilitar una integración genómica aleatoria y el riesgo de ocasionar mutagénesis

Además, aunque los genes reprogramadores son generalmente silenciados después de la reprogramación, la activación epigenética del Oct-4 y Sox2 podría inducir efectos no deseados en las células iPS transferidas

MF Pera y K Hasegawa Nature Biotechnology 26; 59-60, 2008

115

Técnicos:• Sustituir los vectores virales• Sustituir el oncogén c-MycBiológicos:• Conocer mejor los mecanismos de la

reprogramación celular, especialmente si es debida a modificaciones epigenéticas o a modificaciones genéticas todavía no identificadas

PROBLEMAS A RESOLVER

J. Cibelli. Science 318; 1879, 2007

116

• Un aspecto crucial es establecer qué genes son suficientes y necesarios para la reprogramación y son requeridos para inducir la proliferación de las células generadas

• Parece ser que los genes Oct-4 y Sox2 son los necesarios para la reprogramación

MF Pera Nature 451; 135-136, 2008

PROBLEMAS A RESOLVER

117

El mismo grupo de Yamanaka, en el reducido tiempo de tres meses

consigue reprogramar hepatocitos y células de epitelio de mucosa gástrica sin utilizar el c-Myc, tanto en humanos como en ratones, sin que se generaran

tumores

PROBLEMAS RESUELTOS

N. Nakagama y col. Nature Biothecnology 26; 101-106, 2008

118

También comprueban que al reprogramar células de estómago e

hígado murinas, utilizando retrovirus, estos no penetran en la célula adulta a reprogramar y por

tanto no alteran su genoma

PROBLEMAS RESUELTOS

T. Aoki y col. Science: DOI 10.1126 / science 1154884 (14 – 2 – 2008)

119

A la vista de las anteriores experiencias J. Cibelli se preguna:

“¿Será la clonación humana con fines terapéuticos necesaria?”

“La respuesta inmediata es no. Es cuestión de tiempo el que todas las

hipotéticas ventajas de la clonación terapéutica puedan

mejorarse utilizando células iPS”

J. Cibelli. Science 318; 1879, 2007

120

¿PUEDEN LAS CÉLULAS iPS HACER INNECESARIO EL USO DE CÉLULAS MADRE

EMBRIONARIAS?

• Sería un importante error llegar a la conclusión de que la obtención de las células iPS evita la necesidad de usar células madre embrionarias

• D Melton: Es prematuro afirmar esto• GQ Daley: En el momento actual no estamos seguros de que

las células iPS sean absolutamente equivalentes a las células madre embrionarias

• K Egan: Para estar seguro de la utilidad de las células iPS se necesita hacer un gran número de experiencias con células iPS de diferentes individuos y compararlos con células madre embrionarias

C Holden y G Vogel Science319; 560-563, 2008

I Hyun y col. Cell Stem Cell 1; 367-368, 2007

121

La investigación con células iPS debería continuar junto con la

investigación con células madre embrionarias

I-Hyun Park. Hastings Center Report 38; 20-22, 2008


EMBRIONARIAS?

BM Kuehn JAMA 299; 26, 2008

122

Sin embargo la gran mayoría de los investigadores que trabajan en este campo creen que las células iPS sustituirán con ventaja a las

células madre embrionarias, tanto con fines experimentales como

terapéuticos


EMBRIONARIAS?

123

CONSECUENCIAS DEL DESCUBRIMIENTO DE LAS

CÉLULAS iPS

Es este un gran avance experimental, que hay que saludar como una gran esperanza para encontrar caminos

éticos que permitan el desarrollo que la medicina reparadora y regenerativa

requiere

124

Sin embargo la gran mayoría de los investigadores que trabajan en este campo creen que las células iPS sustituirán con ventaja a las

células madre embrionarias, tanto con fines experimentales como

terapéuticos


EMBRIONARIAS?

125

Por ello, Ian Wilmut el creador de la oveja Dolly, manifiesta que abandona la clonación para utilizar

las células iPS

Y el propio James Thomson comentaba (Gina Kolata. The New York Times, 22/11/2007) que probablemente “dentro de una década la guerra de las células madre embrionarias será solo una nota al pie de una página

curiosa de la historia de la ciencia”

CONSECUENCIAS DEL DESCUBRIMIENTO DE LAS

CÉLULAS iPS

R Highfield Daily Telegraph (http://www.telegraph.co.uk) 16-XI-2007

http://www.telegraph.co.uk/

Presentación Células madre, pasado y futuro.Clase impartida en el Master de Bioética

Health & Medicine

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