i

PRESENTACIÓN

Señores Miembros del Jurado Dictaminador:

Dando cumplimiento con lo dispuesto en el Reglamento de Doctorado de

la Escuela de Post Grado de la Universidad Nacional de Trujillo, pongo a vuestra

consideración el trabajo de tesis para optar el Grado Académico de Doctor en

Ciencias Biológicas, titulado:

“Evaluación de diferentes concentraciones de etanol rectificado en la

producción del “bioaroma” acetato de etilo y proteína unicelular por

Candida utilis var. .major C.E.C.T . 1430”

El mismo que dejo a su criterio para su dictamen, esperando reunir los

requisitos para vuestra aprobación

Trujillo, 06 de marzo del 2008

MsC. Carlos A. León Torres

ii

JURADO DICTAMINADOR

________________________________Dr. FEDERICO GONZÁLES VEINTIMILLA

PRESIDENTE

________________________________DR. FREDDY MEJÍA COICO

SECRETARIO

________________________________DR. JOSÉ MOSTACERO LEÓN

MIEMBRO

iii

DEDICATORIA

A DIOS

iv

A

Sofía Isabel, mi hijita,

motor y motivo de mi

constante superación en mi vida.

v

A

ROSA y VALENTÍN, mis padres

Quienes representan el motivo de mi

constante superación

Con amor y admiración a mi esposa.

BETSY

por compartir su vida, alegría, sueños y

deseos de superación familiar, personal

y profesional.

A mis hermanos, compañeros

incondicionales, quienes con su ejemplo

de lucha y esfuerzo por seguir adelante

me enseñaron el camino del éxito.

A mis sobrinos, por regalarme una

mirada, una sonrisa y todo su amor; en

especial a los más pequeños Mizaki,

Kenshiro, Diego, Rodrigo, Joel,

Estefani, Esther, Fernandito, Claudia,

Renzo, Andrea, Paúl, Ariana, Fabio y

Dieguín con todo cariño.

vi

AGRADECIMIENTO

Al Dr. José Mostacero León, por su invalorable amistad y valiosa

orientación y contribución brindada.

Al maestro, Dr. Julio César Arellano Barragán, por su valiosa, oportuna y

acertada orientación.

A mis maestros y amigos del Departamento de Química Biológica y

Fisiología Animal de la Facultad de Ciencias Biológicas de la Universidad

Nacional de Trujillo.:

Dr. Marco Salazar Castillo

Dr. Steban Ilich Zerpa

Dr. José Llanos Quevedo

Dra. Margarita Román de Llanos

Dr. Félix Castillo Viera

MsC. Orlando Pretel Sevillano

MsC. Carlos A. Nomberto Rodríguez

MsC. Walter Bautista Cerna

Blgo. Wilson Canchachi Sánchez

De igual manera a mis maestros y amigos:

Dr. Enrique A. Martín Alva, Dr. Freddy Mejía Coico,

MsC. Alfredo Martín Alva, MsC. Miguel Ángel Barrera Gurbillón,

Blgo. Martha Mejía Arocca.

MsC. Carlos A. León Torres

vii

ÍNDICE

PRESENTACIÓN ......................................................................................................i

JURADO DICTAMINADOR ....................................................................................ii

DEDICATORIA ....................................................................................................... iii

AGRADECIMIENTO ...............................................................................................vi

INDICE GENERAL……………… …………………………………………….....vii

ÍNDICE DE TABLAS ................................................…………………………x

ÍNDICE DE FIGURAS ……………………………………………. ..............… xii

RESUMEN .....................................................................…………….. ……… xiv

ABSTRACT……………………………………………………………… .. xv

I. INTRODUCCIÓN…………………………………………………………...…1

II. MATERIAL Y MÉTODOS………………………………………………….. 11

1 Material……………………………………………………………..…… 11

1.1. Materia prima………………………………………………..………11

1.2. Material biológico………………………………………….….…….11

1. Métodos y Técnicas…………………………………………………..… 11

2.1. Acondicionamiento de los biorreactores………………………..…..11

2.2. Acondicionamiento del sustrato…………………………………….12

2.3. Reactivación de la cepa………………………………………..……12

2.4. Preparación del inóculo…………………………………… ……...12

2.5. Proceso de producción del la biomasa y del “bioaroma” acetato de etilo...13

viii

2.6. Determinación de la influencia de la concentración ………………..13

del etanol rectificado en la producción del acetato de etilo

y proteína unicelular.

2.6.1. Cuantificación de la proteína unicelular…………………….13

2.6.2. Cuantificación del acetato de etilo…………………………..14

2.6.3. Determinación del rendimiento “y” en base al

sustrato suministrado…………………………………………14

2.6.3.1. Rendimiento de proteína unicelular……………........ 14

2.6.3.2. Rendimiento del acetato de etilo……………………..14

2.6.4. Cálculo de la productividad…………………………………..15

2.7. Análisis Estadístico…………………………………………………. 15

III. RESULTADOS………………………………………………………………..16

IV. DISCUSIÓN…………………………………………………………………...36

V. PROPUESTA………………………………………………………………….46

VI. CONCLUSIÓN………………………………………………………………..52

VII. REFERENCIA BIBLIOGRÁFICA……………………………………….......53

ix

ANEXOS:

ANEXO 1. Diseño del biorreactor tipo tanque agitado………………………………...62

ANEXO 2. Cámara de esterilización del sistema de fermentación ……………………63

ANEXO 3. Observación microscópica y proceso de reactivación y

preparación del inóculo de la levadura Candida utilis………………………64

ANEX0 4. Sistema de producción batch del acetato de etilo y proteína

unicelular de candida utilis. var. major C.E.C.T. 1430 …………..........65

ANEX0 5. Determinación de la proteína unicelular neta producida de

Candida utilis. var. major C.E.C.T. 1430...............................................66

ANEXO 6. Cuantificación del acetato de etilo ………………………………….67

ANEXO 7. Valoración de acetato de etilo por el método de

Saponificación y cuantificación ………………………………………68

ANEXO 8. Valores originales del consumo de diferentes concentraciones

de etanol rectificado “E” (g/l) como fuente de sustrato ……………….69

ANEXO 9. Valores originales de proteína unicelular neta producida ……………..70

ANEXO 10. Valores originales de producción del “bioaroma”

acetato de etilo …………………………………………………………71

ANEXO 11. Valores originales de rendimiento “Y” (%) en relación al

“bioaroma” acetato de etilo y sustrato consumido ………………… ..72

ANEXO 12. Valores originales de productividad “P” (g/L-h) del

“bioaroma” acetato de etilo ………………………………………… 73

ANEXO 13. Valores originales de productividad “P“ (g/L-h) de

proteína unicelular ……………………………………………………74

ANEXO 14. Valores originales de rendimiento “Y” en relación a la proteína

unicelular neta producida y el sustrato consumido …………………..75

ANEXO 15. Análisis de varianza de consumo de Sustrato, Producción

de Proteína Unicelular, rendimiento y productividad ……………… 76

ANEXO 16. Análisis de varianza de consumo de sustrato, producción de

Acetato de Etilo, Rendimiento y Productividad ……………………..77

x

ÍNDICE DE TABLAS

Página

Tabla 1. Resultados promedio de la producción, aprovechamiento,

rendimiento y productividad del bioproceso en la evaluación

de diferentes concentraciones de etanol rectificado en la

producción del “bioaroma” acetato de etilo y proteína

unicelular por Candida utilis. var.major C.E.C.T. 1430

durante 60 horas de fermentación a 25ºC. ……………………………….20

Tabla 02: Valores de “t” calculado al comparar promedios (método “t”)

del consumo de diferentes concentraciones de etanol rectificado ……….29

Tabla 03: Valores de “t” calculado al comparar promedios (método “t”)

de la producción de proteína unicelular de

Candida utilis var.major C.E.C.T. 1430 ………………………………..30

Tabla 04: Valores de “t” calculado al comparar promedios (método “t”)

del rendimiento “Y” en relación a la proteína unicelular neta

producida y el sustrato consumido …………………………………… 31

Tabla 05: Valores de “t” calculado al comparar promedios (método “t”)

de la Productividad “P” de la proteína unicelular producida ……………32

xi

Tabla 06: Valores de “t” calculado al comparar promedios (método “t”)

de la producción del “bioaroma” acetato de etilo por

Candida utilis var.major C.E.C.T. 1430 ………………………………..33

Tabla 07: Valores de “t” calculado al comparar promedios (método “t”)

del rendimiento “Y” en relación al “bioaroma” acetato de etilo

producido del sustrato consumido ……………………………………….34

Tabla 08: Valores de “t” calculado al comparar promedios (método “t”)

de la productividad “P” del “bioaroma” acetato de

etilo producido …………………………………………………………..35

xii

ÍNDICE DE FIGURAS

Página

Figura 1: Consumo del sustrato etanol rectificado y etanol

Absoluto “testigo” (g/L) por Candida utilis. var. major CECT 1430

durante 60 horas de fermentación. ………………………………………20

Figura 2: Producción de proteína unicelular (g/L medio) de

Candida utilis. var. major C.E.C.T. 1430 a diferentes

concentraciones de etanol rectificado y etanol absoluto

“testigo” (g/L) durante 60 horas de fermentación. ……………………….21

Figura 3: Producción de acetato de etilo (g/L medio) por Candida utilis.

var. major C.E.C.T. 1430 a diferentes concentraciones de

etanol rectificado y etanol absoluto “testigo” (g/L) durante

60 horas de fermentación. ………………………………………………..22

Figura 4: Rendimiento de la proteína unicelular producida en relación

al sustrato consumido “Yx/s” por Candida utilis var.major

C.E.C.T. 1430 durante 60 horas de fermentación ………………………..23

Figura 5: Rendimiento “Y” del “bioaroma” Acetato de etilo producido en

relación al sustrato consumido por Candida utilis. var. major

C.E.C.T. 1430 durante 60 horas de fermentación ………………………..24

Figura 6: Productividad de la proteína unicelular neta producida en el

sistema “P” (g/L-h) por Candida utilis. var. major C.E.C.T. 1430

durante 60 horas de fermentación ………………………………………..25

xiii

Figura 7: Productividad “P” del “bioaroma” acetato de etilo en el

Sistema “P” (g/L-h) por Candida utilis. var. major

C.E.C.T. 1430. …………………………………………………………..26

Figura 8: Comparación del Rendimiento “Y” (%) teórico y experimental de

Candida utilis. var. major C.E.C.T. 1430. a diferentes

concentraciones de etanol rectificado en la producción de proteína

unicelular ………………………………………………………………..27

xiv

RESUMEN

El trabajo tuvo como objetivo evaluar diferentes concentraciones de etanol

rectificado en la producción del “bioaroma” acetato de etilo y proteína unicelular

por Candida utilis var.major.

Se construyó un biorreactor de 16 cm de altura tipo tanque agitado con

turbina Rushton. La preparación del inóculo fue realizada a partir de la cepa

Candida utilis var.major C.E.C.T. 1430. El medio de cultivo fue formulado a

partir de diluciones de etanol rectificado desde 10 hasta 35 g/L en intervalos de

cada 5 unidades. El bioproceso se llevó a cabo a 25ºC, pH de 4.5 – 5.5. y durante

60 horas. Se encontró que la biomasa y la productividad aumentan

progresivamente, de 4.82 a 7.90 g/L y de 0.082 a 0.108 g/L-h respectivamente.

Así mismo se determinó que a medida que aumenta la concentración (g/L) de

etanol rectificado, la producción y la productividad disminuyen.

El rendimiento de acetato de etilo, fue máximo a la concentración de 15 g/L

de etanol rectificado (5.7%) y mínimo a 35 g/L y (1.97%) respectivamente.

Se concluye que el incremento de la concentración de etanol rectificado no

influye aumentando la producción y rendimiento del “bioaroma” acetato de etilo

y de la proteína unicelular de Candida utilis var. major.

xv

ABSTRACT

The present research was carried out with the purpose to evaluate the differents

concentration of rectificated ethanol in the production of “bioscent” acetate etyle

and the single cell protein Candida utilis var.major for it a stirred – tank reactor

of 16 cm of height with turbina Rushton was built.The preparation of the inoculo

was carried out starting from Candida utilis var.major C.E.C.T. 1430. The

médium of culture was formulated starting from rectificated etanol dilutions from

10 to 35 g/L each 5 units.The bioprocess was carried out at 25ºC to

pH 4.5 – 5.5 and during a time of 60 hours. It was found that the biomasa

productivity increase progressively from4.82 to 7.90 g/L and from0.082 a 0.108

g/L-h) respectively. Such as increase the rectificated ethanol concentration (g/L)

the production and the yield was down. The yield acetate etyle was top to

concentrations of 15 g/L of rectificated ethanol (5.7%) and smallest to

concentrations of 35 (g/L) of rectificated ethanol (1.97%). Finally the increase of

rectificated ethanol concentrations do not influence increasing the production of

acetate etyle and the single cell protein Candida utilis var.major.

1

INTRODUCCION

Según Brown (1998) en los últimos tiempos se ha presentado

un desmedido crecimiento poblacional en el mundo; situación que

unida al patrón decreciente que ha seguido la producción agrícola ha

originado un importante déficit de alimentos en los diversos países del

mundo, sobretodo en aquellos subdesarrollados, por lo que la

Organización Mundial de la Salud (O.M.S, 2000 ) estima que 12

millones de personas mueren de inanición y enfermedades

relacionadas con la malnutrición cada año, causadas principalmente

por la baja ingesta de alimentos especialmente de aquellos alimentos

formadores o constitutivos como las proteínas.

Esta demanda insatisfecha de proteínas pone de manifiesto la

necesidad de un incremento de la productividad agrícola. Sin embargo,

esto requiere urgentemente la modernización de la agricultura, lo cual,

se ha convertido en una misión casi imposible debido a la falta de

inversión para implementar técnicas apropiadas, escasez de agua,

fenómenos climatológicos adversos y empobrecimiento gradual del

suelo. Además, la necesidad por explotar medios no agrícolas de

producción de proteínas, como la pesca, no pueden ser sobre

explotados, debido a que estos recursos renovables debido a su

explotación intensiva pueden ser depredados ocasionando un gran

desequilibrio ecológico (Miller, 1985 y Box, 1993 ).

Por ello Scragg (1996), frente a esta situación, propone diversas

propuestas para producir proteínas de consumo humano y animal por

métodos no convencionales. Una de las más prometedoras para

incrementar la disponibilidad de proteínas en el mundo es la

2

producción de proteínas microbianas o unicelulares mediante

fermentación de residuos industriales y agrícolas.

Frazier y Westhoff, (1991) y García y et al. (1993). La proteína

unicelular está constituída por células muertas y deshidratadas de

microorganismos tales como levaduras, bacterias, hongos y algas, los

que previamente crecieron en diferentes fuentes de carbono y se

producen con fines alimenticios debido a su gran valor proteico (55%).

En la mayoría de los países ex-socialistas, la proteína unicelular es

usada como un concentrado proteico importante en la preparación de

alimentos balanceados para animales y en los Estados Unidos, la

producción se destina casi exclusivamente al campo de los aditivos y

saborizantes para consumo humano (Crueger y Crueger, 1993, De La

Torre y Flores-Cotera, 1993).

Comercialmente se cultivan a partir de sustancias tales como: el

licor de cocción al sulfito o lactosuero; especies de los géneros

Saccharomyces, Candida y Kluyveromyces, los últimos poseen una

gran importancia económica en la producción de alimentos,

saborizantes o alcohol (Lee, 2000). Siendo C. utilis y S. cereviseae las

que mayormente producen las empresas, tanto en Estados Unidos,

como en la Unión Europea y Japón. En el período 1992 – 2000, estas

levaduras representaron en los mercados de Estados Unidos, Unión

Europea y Japón el 80.63%, 80% y 65.20% de la producción total

respectivamente. Los precios de venta en dicho período oscilaron entre

2.20 – 2.75 dólares el Kg. en los Estados Unidos, mientras que en el

mercado de la Unión Europea entre 1.78 – 2.23 dólares el Kg. y en el

mercado japonés entre 2.58 – 2.83 dólares el Kg. (Exebio, 2003), lo

cual representa un gran valor comercial con respecto a otras fuentes de

proteínas convencionales (Israelidis y Coduonis, 1982).

3

Ahora se conocen que existen tres razones principales de tipo

comercial para la producción de proteína unicelular: el rápido

crecimiento de los microorganismos, la alta eficiencia o productividad

alimenticia y el bajo costo de la materia prima o sustrato.Las dos

primeras razones dadas están en relación directa con el corto tiempo de

generación que presentan la mayoría de los microorganismos; con un

tiempo de generación de 20 minutos y sin ningún factor limitante, (una

sola bacteria con una biomasa de solamente 10-12g. puede producir 2,2

x 1025 toneladas de biomasa es decír 4,000 veces la masa de nuestro

planeta en un período de 2 días). Esto significa que, una sola bacteria

puede, en un ambiente no restringido producir 1011 veces su propia

biomasa de proteína en un solo día (Israelidis y Evangelopoulos,

1980); a parte que la productividad depende de una acertada selección

de una cepa adecuada capaz de crecer y sacar provecho de los

diferentes componentes del sustrato (Quintero, 1981).

Las especies que han demostrado mayor productividad industrial

son Saccharomices. cereviseae y Candida. utilis; sin embargo la que

mayormente se utiliza en la producción de proteína unicelular es

C. utilis conocida como “torula” y cuya composición química es

aproximadamente 9.0% de nitrógeno, 55% de proteína, 7% de grasas,

5% de fibra y 8% de cenizas, además contiene elevada cantidad de

lisina y vitaminas de complejo B (Marchand, 1997; Farmland, 1999).

Actualmente vienen usando dos variedades especiales de C.

utilis variedad major y termophila. Debido a que las células de C. utilis

variedad termophila, son por lo general pequeñas y que dificultan la

separación; por lo tanto el rendimiento resulta muy escaso, por lo que

4

resulta mejor utilizar la variedad major de células más grandes

(Frazier y Westhoff, 1991; Wainwright, 1995).

Además C. utilis tiene la capacidad de crecer en una amplia

variedad de sustratos carbonados, como: azúcares derivados de la caña

de azúcar, almidones de desperdicios de papa, granos y yuca

(García, Quintero y López, 1993). Asimismo, se ha observado

crecimiento en sustratos como etanol, metanol y en desechos o

subproductos industriales como licores sulfíticos y melazas (De La

Torre y Flores-Cotera, 1993); así como también en ácidos como el

acético, acetoacético, fumárico, málico, láctico, pirúvico, succínico; y

derivados celulósicos (Fennema, 1982; Wainwright, 1995).

La factibilidad económica de la producción de proteína

unicelular depende básicamente del uso eficiente de un sustrato barato

por el microorganismo, el cual debe proceder de actividades

industriales propias de la zona en donde se desea producir la proteína

unicelular (Nigan, 2000), esto logra que el sustrato empleado sea de

bajo costo, disponible durante todo el año y sobretodo el proceso

contribuye a limpiar el medio ambiente de los desechos industriales; lo

cual hace de esta actividad una alternativa económica, social y

ecológica (Carter, 1996).

A pesar de su costo relativamente elevado, el etanol ha sido

utilizado como sustrato para la producción de proteína unicelular

proveniente de C. utilis. El proceso ha sido desarrollado por la Amoco

Company en los Estados Unidos y el producto obtenido ha sido

aprobado por la Food and Drug Administration (FDA) en Estados

Unidos; siendo comercializado bajo el nombre de “TORUTEIN”

5

obteniendo licencia para ser comercializada en Canadá, Suecia y

Alemania (PAG, 1987). La levadura obtenida mediante este proceso

contiene alrededor de 52% de proteína y debido a su relativamente

bajo contenido de metionina, posee una alta tasa de asimilación

protéica aproximadamente de 1.7 comparada con la del trigo que va

desde 1.1 hasta 2.0 (Watteeuw, et al., 1979).

La razón del relativo éxito de este proceso a pesar de que el

sustrato es costoso, radica en la calidad del producto, de ser un

excelente mejorador del sabor y de alto valor nutricional (Skinner,

1995); razón por la cual se usa para mejorar las características

organolépticas de carnes procesadas, embutidos, quesos y los

concentrados de proteína de huevo. Esto ha conducido a que estas

proteínas compitan en el mercado con los saborizantes químicos, los

cuales en muchos casos están prohibidos por la FDA debido a sus

propiedades cancerígenas. Todo esto ha generado que la levadura tenga

un mercado establecido y potencialmente atractivo en el futuro

(García, et al. 1993).

Como se sabe, el etanol es un sustrato relativamente costoso, por

ello en los últimos años se han dado diversas propuestas para obtener

por acción de C. utilis productos derivados del mismo tales como los

denominados bioaromas, lo cual hace más rentable el proceso.

El aroma en un alimento puede ser definido como la fracción

volátil percibido por receptores ubicados en las fosas nasales

(Montes, 1966). El aroma tiene que ser diferenciado del aceite

esencial constituido por la fracción no volátil del alimento y que está

compuesto por moléculas más pesadas.

6

La investigación relacionada con la producción de aromas por

vía biotecnológica se inició hace aproximadamente cuarenta años en

base a observaciones realizadas a principios de siglo por

Omelianski (1922); quien fue el primero en realizar una síntesis

bibliográfica de los diferentes aromas observados durante el cultivo de

microorganismos (bacterias, levaduras y hongos filamentosos) a los

cuales denominó bioaroma. En el transcurso de las últimas tres

décadas, los enormes avances logrados en el campo de la química

analítica (cromatografía en fase gaseosa, cromatografía líquida de alta

resolución y espectrometría de masa principalmente), así como la

creciente demanda por parte del público de aditivos alimentarios

naturales, han hecho resurgir el interés por la biotecnología y

su aplicación en la producción de bioaromas alimenticios

(Christen, 1995).

El primer avance en la obtención de bioaroma por C. utilis, fue al

ser inoculada en ajo picado, produciendo bioaromas a partir de la

síntesis de diversos compuestos volátiles, particularmente ésteres

(Olesen et al, 2000).

La mayoría de ésteres naturales tienen un olor muy agradable y

ellos ó los productos sintéticos correspondientes tienen aplicación en

confitería y en la industria de bebidas, perfumes, cosméticos y jabones

(Kirk y Othmer, 1998). El acetato de etilo, es un éster presente en

muchos vinos, coñac, vinagre de vino y algunas frutas como la piña. Se

usa en esencias artificiales de frutas, como disolvente de nitrocelulosa,

barnices y lacas, en la manufactura de piel artificial, películas, placas

fotográficas, seda artificial, perfumes y limpiadores de telas, entre

otros (Wiseman, 1986). En la industria de alimentos es usado como

7

aromatizante. Así, los aromas artificiales para frutas como la manzana

tienen la siguiente composición: 20% acetato de etilo, 30% valerianato

de amilo, 20% malonato de etilo, 10% acetaldehído, 10% glicerina, 5%

cloroformo, 4.5% butirato de geranilo y 0.5% vainilla; mientras que

para el aroma artificial de la frutilla, el acetato de etilo está en una

proporción del 30%. Estos aromas artificiales, son utilizados en la

elaboración de mezclas con aditivos para alimentos, así para helado de

fresa, dicha mezcla contiene 0.4% del aroma artificial. Dichas mezclas

se utilizan en proporción de 1 parte por cada 60 partes de helado

(Montes, 1966).

El acetato de etilo es un líquido incoloro con olor a frutas,

inflamable, tiene un punto de ebullición de 77.2º C, es menos denso

que el agua y ligeramente miscible con ella, 1 mL es miscible con 10

mL de agua (a 25º C), su solubilidad aumenta al bajar la temperatura.

Miscible en etanol, acetona, cloroformo y éter. Sus vapores son más

densos que el aire (Perry, 1993). Industrialmente se obtiene por

destilación lenta de una mezcla de ácido acético, alcohol etílico y ácido

sulfúrico, o bien, a partir de acetaldehído anhidro en presencia de

etóxido de aluminio. Estos procesos son considerados tóxicos razón

por la cual la biotecnología plantea bioprocesos más eficientes y

seguros para la obtención de acetato de etilo a partir de

microorganismos (Tabachnick et al, 1953).

Los bioaromas son una importante alternativa tecnológica en la

bioconversión del etanol, para darle un mayor valor agregado en

acetato de etilo por C. utilis (Domenech et al, 1995).

8

C. utilis utiliza el etanol como fuente de carbono,

transformándolo en CO2 y agua además de asimilarlo para su

crecimiento (Domenech et al, 2002). Cuando el etanol no es usado

únicamente para el crecimiento de C. utilis, también puede seguir la

siguiente ruta metabólica cuyo producto final es acetato de etilo

(Watteeuw et al, 1979).

O2 O2 Etanol

Etanol Acetaldehído Ácido acético Acetato de etilo

Experiencias realizadas por diversos investigadores han

demostrado que el etanol, especialmente el alcohol rectificado se

comportó como un excelente sustrato para C. utilis, debido a que es

un producto carbonado con alto grado alcohólico y libre de impurezas

como aldehídos, ésteres, ácidos y otros compuestos que pueden afectar

el normal desarrollo de la levadura, interfiriendo el proceso

(Vegas y Castro, 2002). Diferentes trabajos muestran una producción

de biomasa entre 2.0 y 2.8 g/L para una concentración inicial de etanol

de 16 g/L de medio; y de 3.3 g/L a partir de una concentración inicial

de 32 g/L de medio (Doménech et al, 1999). En un estudio

comparativo entre la melaza y el etanol rectificado como sustratos para

C. utilis se encontró una producción de biomasa de 6.90 g/L y 5.94 g/L

respectivamente partiendo de una concentración de 22.43 g/L

(Vejarano, 2005); también se ha encontrado una mayor producción de

biomasa 10.25 g/L utilizando melaza a 15 g/L de ART como sustrato

(León, 2005).

Si bien es cierto que los valores de biomasa obtenidos utilizando

melaza como sustrato son mayores que con el etanol; este brinda la

ventaja de obtener un producto de mejor calidad para el mercado de

9

saborizantes; por lo cual su valor económico es mayor. Así también el

etanol brinda la oportunidad de agregar un proceso adicional a la

producción de biomasa por C. utilis con la finalidad de obtener acetato

de etilo, lo cual hace más rentable el proceso.

La bioconversión del etanol a acetato de etilo por C. utilis; es

una importante alternativa biotecnológica para darle mayor valor

agregado al proceso. Así, estudios realizados muestran una producción

de 0.80 g de acetato de etilo/L usando etanol rectificado como

sustrato a una concentración de 32 g/L (Domenech, 2004), también

presentan una producción de 0.44g de acetato de etilo a partir de una

concentración de 22.43g de etanol rectificado por litro

(Vejarano, 2005).

Por lo antes descrito se puede afirmar que C. utilis es la vía más

prometedora en la producción de acetato de etilo (Lee, 2000),

poniendo especial énfasis en los efectos que tiene la concentración del

sustrato etanol rectificado sobre los rendimientos finales, considerando

a este factor un punto crítico a tener en cuenta al inicio del proceso

(Domenech et al, 1995)

Teniendo en cuenta que la información sobre la relación

rendimiento-concentración del sustrato, posee una especial

importancia, ya que desde el punto de vista técnico-económico las

ofertas de instalaciones industriales a nuestra disposición nos sitúan

ante la alternativa de tecnologías de fermentación a altas y bajas

concentraciones y además que la oferta y demanda de proteína

unicelular destinada al consumo humano y animal en el período

1992-2001, estuvo liderada por la levadura C. utilis tanto en Estados

10

Unidos, la Unión Europea y Asia, esto hizo necesario realizar el

presente trabajo de tesis, el cual estuvo orientado a la evaluación de

diferentes concentraciones del etanol rectificado en la producción de

Candida utilis “torula” var. major; así como también en la producción

de acetato de etilo, el mismo que tiene un mercado potencial en nuestro

país a nivel industrial como bioaromatizante de productos alimenticios

tales como el yogurt, helados, bebidas con sabor a frutas y en el rubro

de las golosinas; lo cual puede contribuir a reemplazar los saborizantes

y aromatizantes químicos que son usados actualmente y que en

muchos casos están prohibidos por la FDA por sus propiedades

cancerígenas.

11

II. MATERIALES Y METODOS

1. Material Biológico

1.1. Materia prima

Etanol rectificado grado comercial.

Etanol absoluto grado reactivo pa. Merck .

1.2. Material biológico

Cepa liofilizada de Candida utilis var. major C.E.C.T

1430, adquirida de la Colección Española de Cultivos

Tipo (CECT) Valencia, España.

2. Métodos y técnicas

2.1. Acondicionamiento de los biorreactores

Se emplearon 7 biorreactores tipo tanque agitado

y aireado de 1 L de capacidad; con 16 cm de altura,

10 cm de diámetro y 10 cm de base y se les adaptó una tapa

a presión de jebe Microporoso de 2 pulgadas de grosor

(León, 2005) (Anexo 1).

Cada reactor fue equipado con un sistema de

aireación y agitación previamente desinfectados en la

cámara UV durante tres tiempos de 1 hora con un descanso

de 5 minutos entre ellos (León, 2005) (Anexo 2).

El aire insuflado a los biorreactores fue esterilizado a

través de una solución salina al 20% y se suministró a

42 mL/seg. Los biorreactores fueron colocados en un

ambiente cerrado a una temperatura de 25 – 30º C

(Torres, 1995).

12

2.2. Acondicionamiento del sustrato (etanol rectificado y absoluto)

Al etanol rectificado y absoluto no se les practicó

ningún tratamiento previo; estos fueron agregados a los

biorreactores junto con los nutrientes disueltos en agua

destilada previamente autoclavada, hasta conseguir las

diluciones siguientes: 10, 15, 20, 25, 30, y 35 % (g/L)

(Vejarano, 2005).

A estos caldos de cultivo se les adicionó 0.7 g. de

sulfato de amonio como fuente nitrogenada (Bailon, 2001).

Además se contó con un biorreactor a 30 g/L de alcohol

absoluto, como testigo del bioproceso.

2.3. Reactivación de la cepa

La cepa se reactivó según Bailón (2001) en

caldo sabouraud y medio de mantenimiento

(Difco Manual, 1985).

2.4. Preparación del inóculo

A partir de la cepa de C. utilis var. major

mantenida en refrigeración, se realizó un sembrado en el

medio de mantenimiento y se incubó por 48 horas a

temperatura ambiente (Marchand, 1997). Del desarrollo de

este cultivo se hizó un traspaso al medio de propagación,

compuesto por Caldo Sabouraud – Oxitetraciclina

(Difco Manual, 1985) el cual se mantuvo a temperatura

ambiente durante 48 horas. La pureza del cultivo se verificó

por observación microscópica. El inóculo constó de un

volumen de microbio (3 x 107 cel/mL) al 10% del volumen

de trabajo del biorreactor (Gómez, 1999). (Anexo 3)

13

2.5. Proceso de producción de la biomasa y del “bioaroma”

Acetato de etilo.

En cada biorreactor se adicionó 630 mL del caldo de

cultivo a las concentraciones de estudio (5, 10, 15, 20, 25,

30, 35 g/L de etanol), la fuente nitrogenada (sulfato de

amonio, al 1%) y 70 mL del inóculo previamente

preparado.

El Bioproceso se realizó a un Ph de 4 – 5.5 a la

temperatura de 25 ºC por un tiempo de 58 horas

(Vejarano, 2005).

Además se realizó un ensayo control (630 mL de

caldo fermentativo conteniendo 30 g/L de alcohol absoluto

y 70 mL de inóculo), todo este proceso se repitió 2 veces

(Torres, 1997). (Anexo 4)

2.6. Determinación de la influencia de la concentración del

etanol rectificado en la producción de acetato de etilo y

poteína unicelular de Candida utilis var. major

2.6.1. Cuantificación de la Proteína unicelular.

La producción de proteína unicelular por C. utilis

var. major, C.E.C.T. 1430 se realizó durante 58 horas

(Vejarano, 2005) transcurrido dicho tiempo, se

centrifugaron los caldos fermentativos a 3000 g durante 20

minutos, se eliminó el sobrenadante y el sedimento se lavó

3 veces con agua destilada estéril, los sedimentos fueron

colocados en placas petri de peso conocido y llevados a

estufa a 70ºC hasta peso constante, las cuales luego fueron

pesadas con la finalidad de obtener el peso seco de la

biomasa (Gómez, 1999). (Anexo 5).

14

2.6.2. Cuantificación del Acetato de etilo:

El líquido sobrenadante se utilizó para cuantificar el

acetato de etilo (g/L) de acuerdo a lo estipulado por

(Vega y Castro, 2002). (Anexo 6 y 7).

2.6.3. Determinación del rendimiento “Y” en base al

sustrato suministrado

Se determinó según (Herbert, 1999).

2.6.3.1 Rendimiento de biomasa (Y x/s)

Yfo

oF

SS

YXsx

/

Donde:

Xo = Biomasa inicial g/L

Xf = Biomasa final g/L

So = Sustrato inicial g/L

Sf = Sustrato final g/L

2.6.3.2 Rendimiento del acetato de etilo (Y p/s)

YfooF

SSPP

s/p

Donde:

Po = Producto inicial g/L

Pf = Producto final g/L

So = Sustrato inicial g/L

Sf = Sustrato final g/L

15

2.6.4 Cálculo de la productividad (“P” g/L. h )

Se determinó según (Herbert, 1999)

tPPy

tXP

Donde:

X = Biomasa neta producida g/L

P = Producto neto formado g/L

t = Tiempo del bioproceso en horas

2.7. Análisis estadístico

Los resultados obtenidos de las variables biomasa, acetato

de etilo, rendimiento y productividad fueron evaluados

mediante la estimación de medidas de tendencia central y

dispersión, ANVA y comparación de medidas según el

método “t” (Freese, 1988).

16

III. RESULTADOS

En la tabla 1, se presentan los resultados promedio de la producción de

proteína unicelular y del “bioaroma” acetato de etilo en (g/L)

respectivamente; así mismo sus indicadores de rendimiento y productividad

dentro del sistema; donde se resalta que el consumo de la fuente de sustrato

etanol rectificado va desde 10 hasta 16.67 (g/L) por C. utilis. var. major

C.E.C.T. 1430 durante 60 horas de fermentación y que para mejor detalle se

muestra en la figura 1 y Anexo 8; además se indica también que la proteína

unicelular neta producida la cual va desde 4.82 hasta 7.90 (g/L) y en la que

sobresale la concentración de 15 g/L de sustrato etanol rectificado; hecho que

igualmente se ilustra en la gráfica 2 y Anexo 9 ; donde se destaca dicha

producción.

Y por último también se detalla en dicha tabla que la producción de

acetato de etilo que va desde 0.27 hasta 0.74 (g/L) y en la que destaca la

concentración de 15 g/L de sustrato, tal como se puede apreciar de manera

gráfica en la figura 3 y Anexo 12; respectivamente.

En las figuras 4 y 5 asi como tambien en el anexo 11 se observa el

rendimiento de la producción de la proteína unicelular y acetato de etilo en ( % )

a partir del sustrato etanol rectificado consumido por C. utilis. var. major

17

C.E.C.T. 1430, en donde se puede apreciar un porcentaje de 58% resalta para la

proteína unicelular, es de 58% a la concentración de 10 g/L de etanol rectificado

y para el acetato de etilo un porcentaje de 5.17% a la concentración de 15 g/L de

sustrato, respectivamente.

Del mismo modo en dicha tabla 1se aprecia la productividad del sistema,

en términos de producción de proteínas unicelular, la cual es máxima (0.104

g/L-h) a 15 g/L de etanol rectificado, mostrándose así también la máxima

producción de acetato de etilo (0.013 g/L-h) a la misma concentración de etanol

rectificado. Esto es también graficado en las figuras 6 y 7 y los Anexos 12 y 13,

respectivamente.

La comparación del rendimiento téorico y el experimental de la levadura

Candida utilis. var. major C.E.C.T. 1430. a diferentes concentraciones de etanol

rectificado en la producción de proteína unicelular se presenta en las figura 8 y

Anexo 14.

En las tablas 2, 3, 4, 5, 6, 7 y 8 se presentan los valores de “t” calculados

como resultado de la comparación de promedios (método “t”) de los siguientes

indicadores indicador de sustrato consumido, producción de proteína unicelular y

acetato de etilo, así mismo los rendimientos y productividad de Candida utilis

var.major C.E.C.T. 1430 a diferentes concentraciones de etanol rectificado como

18

sustrato, es preciso señalar que todas las tablas y sus respectivos diagramas han

sido trabajados estadísticamente a un nivel de confianza del 95%.

El diagrama 1 en la tabla 2, muestra que las concentraciones de sustrato

10, 15, 30, 35 y testigo “T”, son iguales para la variable consumo de sustrato, del

mismo modo las concentraciones 35, 15 y 20 son iguales entre sí, de tal forma

las concentraciones de 20 y 25 g/L de etanol rectificado respectivamente.

El diagrama 2 en la tabla 3, muestra que las concentraciones 10, 25, 30,

25 y Testigo “T” son iguales estadísticamente para la variable producción de

proteína unicelular, pero la concentración 20 difiere de las anteriores, del mismo

modo la concentración 15 difiere de todos los demás.

El diagrama 3 en la tabla 4, compara el rendimiento de C. utilis var.major

C.E.C.T. 1430 en la producción de proteína unicelular, destacando que el más

alto rendimiento se da en las concentraciones 10 y 15; 58 y 55.113%

respectivamente. Así mismo el diagrama 4 en la tabla 5, destaca que la más alta

productividad se da entre las concentraciones de 15 y 20 g/L de sustrato

El diagrama 5 en la tabla 6, destaca la producción del “bioaroma” acetato

de etilo a la concentración de 15 g/L, diferenciándose de todos los demás

concentraciones sin embargo las concentraciones 10, 25, 30 y “T” son iguales.

El diagrama 6 en la tabla 7, indica que el más alto rendimiento (5.17%) en

la producción del “Bioaroma” acetato de etilo por Candida utilis var.major

19

C.E.C.T. 1430, se da a la concentración de 20 g/L de sustrato etanol rectificado

seguidos de las concentraciones 10 y 20 respectivamente.

Así mismo la misma concentración 15 g/L da la más alta productividad

(0.013 g/L-h ), seguida de la concentración 20 g/L de sustrato etanol rectificado.

20

TABLA 1. RESULTADOS PROMEDIO DE LA PRODUCCIÓN, APROVECHAMIENTO, RENDIMIENTO YPRODUCTIVIDAD DEL BIOPROCESO EN LA EVALUACIÓN A DIFERENTES CONCENTRACIONESDE ETANOL RECTIFICADO EN LA PRODUCCIÓN DEL “BIOAROMA” ACETATO DE ETILO YPROTEÍNA UNICELULAR POR Candida utilis. var.major C.E.C.T. 1430 DURANTE 60 HORAS DEFERMENTACIÓN A 25ºC.

So Sf Sc “X” “AE”[ g/L] X (g/L) A (%) Yx/s(%) Px(g/L-h) AE (g/L) A (%) YAE/s(%) PAE(g/L-h)

101520253035

Testigo

0.000.703.708.3316.0024.3316.00

10.0014.3016.3016.6714.0010.6714.00

5.807.905.965.745.504.825.31

58.0052.6129.8022.9618.3313.7717.71

58.0055.1136.8034.4435.7135.2338.00

0.0980.1040.0990.0970.0920.0800.089

0.420.740.540.440.360.270.35

4.174.932.721.761.200.781.16

4.175.173.332.642.571.972.48

0.0070.0130.0090.0070.0060.0060.006

Leyenda:

Testigo*: Concentración de alcohol absoluto a 30 g/LSo: Concentración inicial de sustrato (g/L)Sf: Concentración final de sustrato (g/L)Sc: Concentración de sustrato consumido (g/L)x: Proteína unicelular = biomasa en (g/L)A: Aprovechamiento de azúcares suministrados (%)yx/s: Rendimiento de la biomasa con relación al sustrato consumido (%)yp/s: Rendimiento del producto “bioetanol” con relación al sustrato consumido (%)AE: Producto “Bioaroma” acetato de etilo (g/L)P: Productividad del sistema en base a “X” y “AE” producido (g/L-h)

21

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

10 15 20 25 30 35 30*

So(g/L)

Consumo deSustrato (g/L)

Figura 1: Consumo del sustrato, etanol rectificado y etanol absoluto como testigo*

(g/L) por Candida utilis. var. major C.E.C.T. 1430 durante 60 horas de

fermentación.

22

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10 15 20 25 30 35 30*

[S] g/L

Biomasa g/L

Figura 2: Producción de proteína unicelular (g/L medio) de Candida utilis. var. major

C.E.C.T. 1430 a diferentes concentraciones de etanol rectificado y etanol

absoluto como testigo* (g/L) durante 60 horas de fermentación.

23

00,10,20,30,40,50,60,70,8

10 15 20 25 30 35 30*

[S] g/L

"AE"(%)

Figura 3: Producción de acetato de etilo (g/L medio) por Candida utilis. var. major

C.E.C.T. 1430 a diferentes concentraciones de etanol rectificado y etanol

absoluto como testigo* (g/L) durante 60 horas de fermentación.

24

0102030405060708090

100

10 15 20 25 30 35 30*

So (g/L)

Yx/s%

Figura 4: Rendimiento de la proteína unicelular producida en relación al sustrato

consumido “Yx/s” por Candida utilis var.major C.E.C.T. 1430 durante 60

horas de fermentación

25

0123456789

10

10 15 20 25 30 35 30*

So (g/L)

"Y"AE/s%

Figura 5: Rendimiento “Y” del “bioaroma” Acetato de etilo producido en relación

al sustrato consumido por Candida utilis. var. major C.E.C.T. 1430

durante 60 horas de fermentación.

26

00,010,020,030,040,050,060,070,080,09

0,10,11

10 15 20 25 30 35 30*

So (g/L)

"PX"(g/L-h)

Figura 6: Productividad de la proteína unicelular neta producida en el sistema “P”

(g/L-h) por Candida utilis. var. major C.E.C.T. 1430 durante 60 horas de

fermentación.

27

00,0020,0040,0060,008

0,010,0120,0140,0160,018

0,02

10 15 20 25 30 35 30*

So (g/L)

"PAE"(g/L-h)

Figura 7: Productividad de “P” del “bioaroma” acetato de etilo en el Sistema “P”

(g/L-h) por Candida utilis. var. major C.E.C.T. 1430.

28

0

10

20

30

40

50

60

10 15 20 25 30 35

[S] g/L

Biomasa g/L

Figura 8: Comparación del Rendimiento “Y” (%) teórico y experimental de

Candida utilis. var. major C.E.C.T. 1430. a diferentes concentraciones de

etanol rectificado en la producción de proteína unicelular “X”.

Rendimiento teórico: 56.7%

“Y”%

29

TABLA 02: VALORES DE “t” CALCULADO AL COMPARAR PROMEDIOS

(MÉTODO “t”) DEL CONSUMO DE DIFERENTES

CONCENTRACIONES DE ETANOL RECTIFICADO EN LA

PRODUCCIÓN DEL “BIAROMA” DE ACETATO DE ETILO Y

PROTEINA UNICELULAR Candida utilis var.major C.E.C.T. 1430

Ri 1 2 3 4 5 6 7

[S] 10 T 30 35 15 20 25

R x 10 14 14 14 14,33 16,33 16,667

1 10

2 T 6,9282** -

3 30 9999,1** 0 -

4 35 3,46* 0 0 -

5 15 13** 0,4999 1 0,2774 -

6 20 7,18** 2,21358* 2,646* 1,606 2,1213* -

7 25 20** 3,999* 8 2,219* 4,9497** 0,354 -

Leyenda: * Diferencias significativas (p < 0.05)

DIAGRAMA 1:

Ri 1 2 3 4 5 6 7

[S] 10 T 30 35 15 20 25

x 10 14 14 14 14,33 16,33 16,667

------- ----------------------------------------------------------

----------------

30

TABLA 03: VALORES DE “t” CALCULADO AL COMPARAR PROMEDIOS

(MÉTODO “t”) DE LA PRODUCCIÓN DE PROTEÍNA

UNICELULAR DE Candida utilis var.major C.E.C.T. 1430 EN LA

EVALUACIÓN DE DIFERENTES CONCENTRACIONES DE

ETANOL RECTIFICADO

Ri 1 2 3 4 5 6 7

[S] 35 T 30 25 10 20 15

R x 4,82 5,31 5,5 5,74 5,8 5,96 7,893

1 35 -

2 T 0,3522 -

3 30 1.2263 0,52386 -

4 35 1,865 1,70161 0,7495 -

5 15 1,944 1,793 0,8911 0,2705 -

6 20 2,2954* 2,51319* 1,4138 1,0769 0,6981 -

7 25 6,3469* 11,0994* 7,8196* 12,5778* 10,4219* 10,6624* -

Leyenda : * = Diferencias significativas (P < 0.05)

DIAGRAMA 2:

Ri 1 2 3 4 5 6 7

[S] 35 T 30 25 10 20 15

x 4,82 5,31 5,5 5,74 5,8 5,96 7,893

------------------------------------------ ------- -------

31

TABLA 04: VALORES DE “t” CALCULADO AL COMPARAR PROMEDIOS

(MÉTODO “t”) DEL RENDIMIENTO “Y” EN RELACIÓN A LA

PROTEÍNA UNICELULAR NETA PRODUCIDA Y EL SUSTRATO

CONSUMIDO “Y”X/S (%) EN LA EVALUACIÓN DE DIFERENTES

CONCENTRACIONES DE ETANOL RECTIFICADO.

Ri 1 2 3 4 5 6 7

[S] 25 35 30 20 T 15 10

R x 34,44 35,233 35,71 36,797 38 55,113 58

1 25 -

2 35 0,1341 -

3 30 0,8218 0,0808 -

4 20 2,91099* 0,238 0,3829 -

5 T 3,0899* 0,4602 1,98816 0,3928 -

6 15 17,3157* 3,31* 17,3101* 6,0027* 10,6477* -

7 10 13,2348* 3,7022* 12,8691* 6,3772* 9,61597* 1,3992 -

Leyenda: * = Diferencias significativas (P<0.05)

DIAGRAMA 3:

Ri 1 2 3 4 5 6 7

[S] 25 35 30 20 T 15 10

x 34,44 35,233 35,71 36,797 38 55,113 58

---------------------------------------------------------- ---------------

32

TABLA 05: VALORES DE “t” CALCULADO AL COMPARAR PROMEDIOS

(MÉTODO “t”) DE LA PRODUCTIVIDAD “P” DE LA PROTEÍNA

UNICELULAR PRODUCIDA EN LA PRODUCCIÓN DEL

“BIOAROMA” ACETATO DE ETILO POR Candida utilis var.major

C.E.C.T. 1430 A DIFERENTES CONCENTRACIONES DE

ETANOL RECTIFICADO.

Ri 1 2 3 4 5 6 7

[S] 35 T 30 25 10 20 15

R x 0,08 0,089 0,092 0,097 0,098 0,099 0,104

1 35 -

2 T 0,982113 -

3 30 1,2301 0,4966 -

4 25 2,0345 1,9113 0,9666 -

5 10 2,1099 1,99336 1,0951 0,4459 -

6 20 2,3117* 2,422* 1,3794 0,6444 0,3322 -

7 15 2,9107* 3,6329* 2,2729* 2,0494 1,5667 1,341 -

Leyenda: * = Diferencias significativas (P<=.05)

DIAGRAMA 4:

Ri 1 2 3 4 5 6 7

[S] 35 T 30 25 10 20 15

x 0,08 0,089 0,092 0,097 0,098 0,099 0,104

--------------------------------------------------------------------

----------------

33

TABLA 06: VALORES DE “t” CALCULADO AL COMPARAR PROMEDIOS

(MÉTODO “t”) DE LA PRODUCCIÓN DEL “BIOAROMA” ACETATO DE

ETILO POR Candida utilis var.major C.E.C.T. 1430 EN LA EVALUACIÓN DE

DIFERENTES CONCENTRACIONES DE ETANOL RECTIFICADO.

Ri 1 2 3 4 5 6 7

[S] 35 T 30 10 25 20 15

R x 0,273 0,35 0,36 0,417 0,44 0,543 0,74

1 35 -

2 T 2,15862* -

3 30 3,329* 0,3383 -

4 10 6,7155* 1,92368 1,95 -

5 25 5,0767* 2,11564 2,0889 0,6614 -

6 20 7,3334* 4,16881* 4,3895* 3,2466* 2,2314* -

7 15 12,2788* 8,18323* 8,8749* 8,0554* 6,3481* 3,9246* -

Leyenda: * = Diferencias significativas (P<0.05)

DIAGRAMA 5:

Ri 1 2 3 4 5 6 7

[S] 35 T 30 10 25 20 15

x 0,273 0,35 0,36 0,417 0,44 0,543 0,74

------- ---------------------------------- ------- -------

34

TABLA 07: VALORES DE “t” CALCULADO AL COMPARAR PROMEDIOS

(MÉTODO “t”) DEL RENDIMIENTO “Y” EN RELACIÓN AL

“BIOAROMA” ACETATO DE ETILO PRODUCIDO DEL

SUSTRATO CONSUMIDO “Y”AE/S (%) EN LA EVALUACIÓN DE

DIFERENTES CONCENTRACIONES DE ETANOL

RECTIFICADO.

Ri 1 2 3 4 5 6 7

[S] 35 T 30 25 20 10 15

R x 1,97 2,48 2,57 2,64 3,33 4,17 5,17

1 35 -

2 T 1,8553 -

3 30 0,2981 0,3692 -

4 25 2,4707* 0,6322 2,0928 -

5 20 5,1777* 3,05189* 2,9928* 2,6963* -

6 10 8,7701* 6,2772* 6,6052* 6,2614* 3,1835* -

7 15 8,9447* 7,26286* 7,3968* 7,1687* 5,0286* 2,8182* -

Leyenda: * = Diferencias significativas (P<0.05)

DIAGRAMA 06:

Ri 1 2 3 4 5 6 7

[S] 35 T 30 25 20 10 15

x 1,97 2,48 2,57 2,64 3,33 4,17 5,17

----------------------------------------- ------- ------- -------

35

TABLA 08: VALORES DE “t” CALCULADO AL COMPARAR PROMEDIOS

(MÉTODO “t”) DE LA PRODUCTIVIDAD “P” DEL

“BIOAROMA” ACETATO DE ETILO PRODUCIDO (g/L-h)

POR Candida utilis var.major C.E.C.T. 1430 A DIFERENTES

CONCENTRACIONES DE ETANOL RECTIFICADO

Ri 1 2 3 4 5 6 7

[S] 35 T 30 10 25 20 15

R x 0,005 0,006 0,006 0,007 0,007 0,009 0,013

1 35 -

2 T 1,95 -

3 30 2 0 -

4 10 5,6569* 1,95 2 -

5 25 5,6569* 1,95 2 0 -

6 20 6,5* 3,6742* 3,6742* 2,5* 2,5* -

7 15 10,7331* 7,4291* 7,5593* 7,1554* 7,1554* 4,1576* -

Leyenda: * = Diferencias significativas (P<0.05)

DIAGRAMA 7:

Ri 1 2 3 4 5 6 7

[S] 35 T 30 10 25 20 15

x 0,005 0,006 0,006 0,007 0,007 0,009 0,013

----------------------------------------------------------- ------- -------

36

IV. DISCUSION

Según sostiene Estévez (1998), en la producción de proteína unicelular de

Candida utilis. var. major C.E.C.T 1430 es necesaria la adición de sustancias

nitrogenadas y carbonadas al medio de cultivo que puedan ser asimiladas y

transformadas en nutrientes esenciales para el crecimiento; y para estar acorde

con ello, en el presente trabajo, se usó sulfato de amonio 1 g/L tal como también

lo propone Bailón (2001), puesto que si se cultiva en un medio con limitación de

nitrógeno, la producción de C. utilis var major es baja (Israelidis y

Evangelopoulos, 1980). Por otro lado hay que considerar también que la

cantidad de fuente carbonada presente en el medio fermentativo, es un factor

influyente en el rendimiento de proteína unicelular “biomasa” de C. utilis. var.

major.

El consumo de la fuente de carbono que va desde 10 hasta 16.67 (g/L) de

etanol rectificado, nos indica que C. utilis. var. major C.E.C.T. 1430, utilizó

dichos sustratos para su respiración, lo cual significa que la levadura transformó

el etanol rectificado en CO2 y agua, además de asimilarlo para su crecimiento;

hecho que ya fuera puesto de manifiesto por los investigadores de Doménech et

al ( 2002).

Igualmente Doménech et al. (2002) mencionan que en condiciones

adecuadas ésta levadura, puede degradar hasta 0.25 g de etanol por hora y por

37

litro de reactor en sustrato sólido. Otras investigaciones también realizadas por

los mismos autores, demuestran que en cultivo sumergido al evaluar la

producción de metabolitos a partir de etanol por C. utilis, se obtuvieron niveles

de consumo de 0.13 y 0.21 g etanol/Litro-hora a partir de concentraciones

iniciales de 16 y 32 g etanol/L medio respectivamente tras 72 horas de

fermentación (Doménech et al, 1999).

El cálculo de los niveles de consumo de 0.17 y 0.25 g etanol/L-h de

etanol rectificado; nos indica que la levadura trabajó adecuadamente y que los

niveles de consumo de estos sustratos están dentro de los valores reportados por

la literatura existente para fuentes carbonadas de etanol tipo rectificado ya que

éstos alcoholes no contienen sustancias como ácidos, ésteres, aldehídos, entre

otros (Vegas y Castro, 2002). En el presente experimento se trabajó utilizando al

alcohol grado reactivo (etanol absoluto) como testigo, el cual nos permitió

indicar la similitud de asimilación por C. utilis. var. major.

La producción de proteína unicelular (g/L) de C. utilis var. major a

diferentes concentraciones de etanol rectificado en 60 horas de fermentación

donde ésta alcanza la fase estacionaria de crecimiento; también encuentran su

correlato en los resultados de los trabajos de Vejarano (2005).

38

Según Wainwright (1995), C. utilis. alcanza su producción máxima en 24

horas de fermentación al ser cultivada en hidrolizados de papa. En un trabajo

realizado por Bailón (2001), para producir proteína unicelular de C. utilis.

utilizando como sustrato algarrobina diluida, se alcanzó la fase estacionaria de

crecimiento en un lapso de 25 – 28 horas de fermentación; mientras que

Ferrer et al. (2004), trabajando con hidrolizados de bagacillo de caña de azúcar

inoculados con dicha levadura alcanzaron la fase estacionaria a las 20 horas de

fermentación. Esto indica que la degradación y asimilación del etanol es más

lenta; hecho que también se ha demostrado en esta investigación y fue

previamente corroborado por Vejarano, ( 2005).

En ese sentido Doménech et al. (1999), reportan una producción máxima

de biomasa a las 48 horas de fermentación trabajando con C. utilis a partir de

concentraciones iniciales de 16 y 32 g etanol/L. Posiblemente este tiempo

alcanzado se deba a las condiciones del medio, ya que en el experimento no se

utilizaron reguladores de pH, y de acuerdo a resultados, los valores de pH

descienden hasta valores entre 2.50 y 2.80 para los tratamientos con etanol como

fuentes de carbono, lo que puede afectar la actividad respiratoria de la levadura.

Por otro lado Kirk y Othmer (1998), recomiendan mantener el pH entre

4.5 - 5.5, mientras que Lee (2000), recomienda un pH de 7.0 cuando se utiliza

C. utilis. para la producción de acetato de etilo. En cambio en el presente trabajo

39

se ha encontrado mejores resultados; trabajando con etanol rectificado como

fuente de sustrato.

También podría considerarse, como sostiene Doran (1995), el oxígeno

disponible en el medio como otra causa, ya que al no estar en cantidades

suficientes puede actuar como sustrato limitante, y tratándose de un proceso

aeróbico el problema de la transferencia de oxígeno es muy importante Además

de la naturaleza química del etanol, tal como sostiene Lee (2000), en las

fermentaciones de hidrocarburos requieren una mayor entrada de aire que las

basadas en carbohidratos y si bien el etanol, no es un hidrocarburo desde el

punto de vista puramente químico, ésta referencia podría utilizarse para explicar

su más lenta degradación por la levadura.

La tasa específica de crecimiento () varía en relación al tipo de sustrato,

así C. utilis en un medio a base de glucosa presenta una tasa específica de

crecimiento de 0.40 h-1; en melazas 0.15 - 0.38 h-1 y en alcanos 0.28 h-1

aproximadamente. Mientras que los tiempos de generación (tg) son menores en

comparación con otros microorganismos como hongos y algas, de

aproximadamente 100 - 210 minutos (Crueger, 1993 y Quintero, 1999).

40

Lo mencionado en el párrafo precedente posiblemente se deba a alguna

de las condiciones en la fermentación como puede ser el suministro de

oxígeno, como ya se ha mencionado, además para los tratamientos con etanol

puede explicarse por el hecho de que éste a partir de determinadas

concentraciones, empieza a inhibir el crecimiento y metabolismo de la levadura

(Doménech et al, 2002), o sea inhibición por sustrato. Armstrong et al (1984),

reportan que una concentración de etanol a partir de 35 g/L disminuye la

actividad metabólica de la levadura; hechos que se han comprobado en la

presente investigación

La mayor producción de proteína unicelular de Candida utilis. var. major

C.E.C.T. 1430 hallada en este trabajo , se da para la concentración de sustrato de

15 g/L, con un valor de 7.90 g/L medio, puesto que es un valor menor al

reportado por Ferrer et al. (2004), quienes con C. utilis. var. major obtuvieron un

valor de 9.45 g/L medio a partir de hidrolizado de bagacillo de caña de azúcar;

pero que se encuentra dentro del rango reportado por Quintero et al. (1999), cuya

producción de proteína unicelular reportada está entre 6 y 25 g/L medio,

proceso desarrollado en Cuba a partir de melaza de caña de azúcar en cultivo

continuo. Por otro lado Bailón (2001), obtuvo una producción de proteína

unicelular de 2.42 g/L medio tras 40 horas de fermentación a partir de

algarrobita. En cambio León (2005), ha encontrado una mayor producción de

41

proteína unicelular 10.25 g/L utilizando melaza a 35 g/L de ART como sustrato

tras 24 horas de fermentación.

Lo sostenido, puede explicarse por el hecho antes mencionado de la

presencia de ciertos nutrientes en la melaza, además de la disponibilidad de

azúcares más simples en el medio, previamente hidrolizada, han permitdo una

mejor asimilación y metabolismo por parte de la levadura, además de la

suplementación con los minerales necesarios para el crecimiento de C. utilis.

tal como lo indican Thomas et al. (1980).

Domenech et al. (1999), trabajando con C. utilis. obtuvieron una

producción de biomasa de 2.0 – 2.8 g/L medio para una concentración inicial de

etanol de 16 g/L medio; y de 3.3 g/L medio a partir de una concentración inicial

de 32 g etanol/L medio. Los valores obtenidos en el presente trabajo son mayores

a los reportados por dichos autores, lo cual posiblemente se debe al hecho de que

no todas las cepas de la levadura son productoras de biomasa, ya que de acuerdo

al catálogo de la Colección Española de Cultivos Tipo – C.E.C.T., existen cepas

destinadas a la producción de enzimas y otras al desarrollo de otros metabolitos.

(C.E.C.T, 2005).

Los valores de producción de acetato de etilo por Candida utilis. var.

major C.E.C.T. 1430, correspondientes a valores que van de 0.27 a 0.74 g/L a

diferentes concentraciones de etanol rectificado y etanol absoluto como testigo;

42

no dan diferencias significativas respecto al tratamiento testigo 30 g/L y su

respectivo par con etanol rectificado.

Aunque según Watteeuw et al. (1979), cuando el etanol no es utilizado

exclusivamente para el crecimiento de la levadura, también puede seguir otra ruta

metabólica; ruta que implica la participación de enzimas sintetizadas por la

levadura, la cual además produce dichos catalizadores para contrarrestar el efecto

del pH bajo que llega hasta valores de 2.50, y la esterificación hasta acetato de

etilo puede ser una vía para superar estos efectos negativos por la acumulación de

ácido acético (Tabachnick et al 1953).

Los valores de producción de acetato de etilo obtenidos, son menores a los

reportados por Doménech et al (1999), quienes a partir de una concentración

inicial de etanol de 32 g/L medio inoculado con Candida utilis obtuvieron tras 72

horas de operación hasta 0.80 g acetato de etilo/L de medio en el mejor de los

casos, pero coinciden a partir de 16 g etanol/L medio alcanzando producciones

de acetato de etilo de 0.10 — 0.60 g/L medio, indicando los mismos autores que

debido a la alta volatilidad del éster, las cantidades determinadas probablemente

no sean las realmente producidas por la levadura. Además según Zoecklein et al

(2000), otras especies de la levadura, como por ejemplo Candida krusei forma

acetato de etilo a concentraciones desde 0.22 - 0.73 g/L.

43

En base a las referencias de Vejarano (2005), la producción de acetato de

etilo en la presente investigación estaría dentro de los rangos reportados, sobre

todo para el tratamiento con etanol rectificado a 15 g/L, el cual es de 0.74 g

acetato de etilo/L medio; mientras que para el etanol sin rectificar es tan sólo de

0.10 g/L medio. Ello probablemente se deba a la alta volatilidad del acetato y

más aún a la presencia de congenéricos en el etanol sin rectificar lo que pudo

haber afectado la capacidad metabólica de la levadura.

Estadísticamente, utilizando el Análisis de Varianza y la prueba F,

indican la diferencia entre los promedios de producción de acetato de etilo para

los tres tratamientos. Ello motivó la realización de la comparación múltiple de

medias mediante el método “t”, para determinar el mejor tratamiento y

cuantificar dicha diferencia entre los tratamientos; lo cual permite afirmar que la

mejor producción de acetato de etilo corresponde al tratamiento con etanol

rectificado de 15 g/L, mientras que estadísticamente entre los otros tratamientos

sí existe una relativa diferencia significativa, inclusive en el tratamiento control

con su respectivo par no presenta diferencias altamente significativa.

En ese trabajo también se ha encontrado que cuando la levadura consume

el sustrato existe la producción de metabolitos como ácidos orgánicos que hacen

disminuir el pH; hecho que ya fue demostrado por Brock (1994).

44

Igualmente lo sostenido por Hough (1990) Candida utilis. var. major

consume los azúcares presentes en la melaza y los metaboliza por medio de la

ruta glicolítica EMP complementada con el metabolismo aerobio de los

productos de esta ruta por el Ciclo de los ácidos tricarboxílicos, dando como

producto final ácidos orgánicos; además otras veces lo hace por otra ruta, la del

monofosfato de hexosa, no solo para obtener energía, sino produciendo además

pentosas importantes para la síntesis de nucleótidos y ácidos nucleicos.

A pesar de ello este fenómeno no fue observando en los tratamientos con

etanol, pues el pH disminuyó hasta valores de alrededor de 3.50 – 3.80, lo que

indica que hubo mayor producción de ácidos de acuerdo a la ecuación propuesta

por Watteeuw et al (1979). Por ello sería más fácil para C. utilis. producir ácido

acético por dicha vía a partir del etanol como fuente de carbono, ya que la

conversión del etanol hasta éste ácido implica dos pasos y la acción de dos

enzimas, mientras que en las rutas antes, mencionadas para la melaza, es más

complejo y lo haría en mayor tiempo; ello se traduce en el hecho de que con los

tratamientos con etanol, se produjo mayor cantidad de ácido, razón por la cual el

pH continúo disminuyendo hasta un nivel en que posiblemente la levadura

empezó a regular su medio con la síntesis de acetato de etilo, tal como lo

mencionan Tabachnick et al (1953).

45

El rendimiento y la productividad de acetato de etilo (%) y proteína

unicelular a partir de etanol rectificado, que dan un rendimiento del 4.93% para

el tratamiento con 15 g/L de etanol rectificado, y un menor rendimiento fue el

tratamiento con 35 g/L de etanol rectificado 1.97(%); son resultados que podrían

explicarse por la asimilación de la fuente carbonada ya que a mayor

concentración de la misma esta podría inhibir algunas enzimas de la levadura

imposibilitando su degradación o generando una inhibición por saturación de

sustrato tal como lo sostiene Doménech ( 2004).

Sin embargo el rendimiento para la producción de proteína unicelular

encontrada en ésta investigación está entre 58% y 55% para las concentraciones

de 15 y 10 g/L de etanol rectificado, incluso superan al valor propuesto como

rendimiento teórico 55.67%, por Estévez (1998).

46

V. PROPUESTA

Como ya se ha visto, son muchos los elementos que deterioran el medio

natural, y muchas las actividades del hombre que tienen consecuencias negativas

en los recursos naturales de la Tierra. Entonces, cada vez es mayor el número de

alarmas que alertan de los riesgos, no existe ningún medio que no esté afectado,

o con grandes posibilidades de afectarse, y no existe ninguna solución que

garantice la plena resolución de los peligros.

El vertido de sustancias tóxicas se hace cada año más incalculable, los

organismos nacionales e internacionales publican cifras aproximadas, que

siempre se refieren a millones de toneladas. Esta llegada de miles de compuestos

químicos, creados en laboratorios y utilizados por las diferentes industrias de los

sectores productivos, y sín políticas ni planes de desarrollo más que un afan

netamente lucrativo alteran el funcionamiento de los ecosistemas y atenta contra

la salud de sus habitantes.

Son cada vez mayores las conexiones entre contaminación y salud, ya nadie

duda, que no se puede soslayar el hecho de que un ambiente contaminado

provoca numerosas enfermedades, desde las relacionadas con la piel o el aparato

respiratorio (alergias, dermatitis, asmas), a procesos mucho más graves de tipo

degenerativo. Como consecuencia de esta situación, la comunidad científica y los

47

poderes públicos deben establecer estrategias para luchar contra la contaminación

y su repercusión en nuestra calidad de vida.

Para lograr estas metas, tanto la Organización Mundial de la Salud (OMS)

como la Agencia Europea del Medio Ambiente, y la FAO han establecido

programas conjuntos a escala mundial que propugnan un ambiente más sano,

propiciando la generación y desarrollo de tecnologías limpias y tecnologías para

limpiar así mismo de aditivos y colorantes de origen animal, vegetal o

microbiano tratando de reemplazar los aditivos y saborizantes químicos ya que

por su origen causan un gran impacto negativo sobre el medio ambiente. Para tal

caso se vienen analizando los distintos bioprocesos del medio natural, y su

relación con la deposición de residuos peligrosos. Entre estos medios está la

atmósfera, el agua, tanto superficial como subterránea, y el suelo.

Por ello, este trabajo pretende dar un aporte a las soluciones que se están

estudiando, para la recuperación de ambientes contaminados producto de la gran

explosión industrial que ha experimentado todo el mundo, pero en especial

nuestro país, en uno de sus sectores con más auge en los ultimos años como es la

industria de la alcoquímica y sus derivados así también incursionar en una área

prioritaria para la humanidad, como es la generación de elementos estructurales

para la dieta como son las proteínas, muy escasas en países en desarrollo como el

nuestro, más aún cuando las áreas para el desarrollo de la agricultura son cada

48

vez menores. Por ello urge la generación de la utilización de técnicas

biorremediadoras y tecnologías que nos permitan producir mas y mejor alimento

por vías más accesibles y baratas a nuestra realidad., es decir, generar un

ambiente determinado mediante procesos biológicos.

Dentro de ese contexto, los hallazgos de la presente investigación, sobre la

evaluación de diferentes concentraciones de etanol rectificado en la producción

del “bioaroma” acetato de etilo y proteina unicelular por Candida utilis var

major C.E.C.T. 1430. A pesar de ser obtenidos a nivel de laboratorio, generan la

posibilidad de realizar un escalamiento a nivel de planta piloto y así escalar en el

bioproceso final, hasta optimizar sus variables. Una vez conseguido estos

propósitos , se podría plantear la idea de bionegocios con la generación de

nuevas tecnologías y bioprocesos para obtener bioproductos, los cuales no dañen

al medio en el cual se producen, y puedan ser fuente de ingresos por

exportación y venta de productos no tradicionales, como son los aditivos,

colorantes y saborizantes muy empleados en diversos sectores industriales como

son el sector de la industria cosmética, alimenticia, farmacéutica etc En tal

sentido se plantea el desarrollo de planes y políticas a la generación de un

programa de desarrollo de la biotecnología y bioingeniería articulando a los

sectores productivos estatales, privado ,universidad y gobiernos regionales,

evaluando potencialidades para desarrollar dichas tecnologías que permitan

identificar a una localidad como pionera y líder en uno de los bioprocesos.

49

Objetivo:

Evaluar y analizar las potencialidades “FODA” para desarrollar un

programa piloto de producción de proteína unicelular y de bioaromas.

Aprovechar los residuos lignocelulósicos de la agroindustria abundante en

nuestra localidad .

Alcance:

Producir proteína unicelular a gran escala tanto para la alimentación

humana y animal.

Mitigar el impacto de la sobrecarga de material lignocelulósico en

nuestra región y convertir a nuestro departamento en una zona potencial

en el desarrollo de nuevas biotecnologías y bioproductos; tales como los

aditivos y saborizantes de origen microbiano.

Infraestructura requerida:

Reactor de 1000 L. de capacidad un zona estratégica a la zona de generación de

matéria prima para el bio proceso.

50

Beneficios esperados:

Complementar la dieta con un alimento rico en proteínas de fácil

asimilación, bajo costo de producción y accesibilidad para su consumo

masivo.

Generar el interés de núcleos familiares y pequeños empresarios para

hacer uso de las tecnologías limpias y tecnologías para limpiar,

consiguiendo satisfacción económica.

Metas:

Alcanzar altos valores de rendimiento y productividad haciendo un

bioproceso económicamente rentable.

Despertar el interés para incursionar en los bioprocesos y bionegocios.

Realizar eventos científicos de trascendencia mundial para intercambiar

experiencias en el área de estudio.

Involucrar al gobierno, universidad y empresa para generar planes de

desarrollo estratégicos

El reactor air loop sería el utilizado para la generación de proteína

unicelular ya que es de fácil construcción, equipamiento, y económico en

su operación. Ya que no lleva turbinas que demandan mucha energía.

La cual genera la demanda de energía y el en carecimineto del

bioproducto. Este reactor, estaría ubicado en laboratorio de Tecnología

51

enzimática del Departamento de Química Biológica y Fisiología Animal,

Facultad de Ciencias Biológicas de la Universidad Nacional de Trujillo; y

se plantea comprometer a las diferentes empresas agroindustriales par el

suministro de material lignocelulósico, el gobierno regional, la

Municipalidad Provincial de Trujillo y sus consejos menores a fin de

realizar un trabajo interinstitucional y multidisciplinario con los colegios

profesionales.

52

VI. CONCLUSIONES

La mayor producción de proteína unicelular de Candida utilis. var. major

C.E.C.T. 1430 se obtiene en la concentración de 15 g/L de etanol rectificado

correspondiendo a un valor de 7.90 g/L; seguida de la concentración de 10

g/L de etanol rectificado donde se encontró una producción de proteína

unicelular de 5.80 g/L; así mismo el tratamiento con menor producción de

proteína unicelular fue el de 35 g/L de etanol rectificado con un valor de 4.82

g/L de medio.

La mayor producción de acetato de etilo por Candida utilis var major

C.E.C.T. 1430 se obtuvo en el tratamiento de 15 g/L de etanol rectificado

dando una producción de 0.74 g/L; seguido del tratamiento de 20 g/L de

etanol rectificado con una producción de 0.54 g/L de acetato de etilo, así

mismo el tratamiento con menor producción de acetato de etilo fue el de 35

g/L de etanol rectificado con un valor de 0.27 g/L.

Estadísticamente, no existe diferencia significativa entre el control de etanol

absoluto 30 g/L y su par etanol rectificado; tanto para la producción de

proteína unicelular como para acetato de etilo

53

VII REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS:

Armstrong, D.; S. Martin y H. Yamazaki. 1984. Production of ethyl

acetato from dilute ethanol solutions by Candida utilis.

Biotechnology and Bioengineering. Biotechnology Report.

Ottawa. Canada.

Bailón, S. 2001. Influencia del sulfato de amonio, nitrato de potasio y

urea en la producción de proteína unicelular de Candida utilis var.

major. Tesis para optar el grado de Maestro en Ciencias. Mención

Microbiología Industrial y Biotecnología. Universidad Nacional de

Trujillo. Trujillo. Perú.

Box, M. 1993. Biotecnología, Agricultura y Alimentación. Ediciones

Mundi Prensa. Madrid. España.

Brock, T. y M. Madigan. 1994. Microbiogía. 6ta edición. Editorial

Prentice Hall. España. p:374, 407

Brown, L. 1998. World Food Problems, Single Cell Protein. Mateless

and Tannebaum eds. Massachussets. Estados Unidos.

Carter, G. 1996. Comercial Biotechnology: An International Análisis.

Webered. New York. Estados Unidos

CECT. 2005. Colección Española de Cultivos Tipo. Universidad de

Valencia. España. Página Principal: http://www.cect.org

54

Christen, P. 1995. Producción de Aromas por Fermentación en Medio

Sólido. Universidad Nacional Autónoma de México. Facultad de

Estudios Superiores Zaragoza. Tópicos de Investigación y

Postgrado. Junio de 1995. Vol. IV N° 2. pp: 102-109.

Crueger, W. y A. Crueger. 1993. Biotecnología: Manual de

Microbiología Industrial. Editorial Acribia S.A. Zaragoza. España.

p: 353-355.

De La Torre, M. y Flores-Cotera, L. 1993. Proteínas Unicelulares en

Biotecnología Alimentaria. Compiladores: M. García, R. Quintero

y A. López-Munguia. Limusa Noriega Editores. México. p: 383-

396.

Difco Manual. 1985. Dehidrated cultivo médium and reagent for

microbiology. 10th edition. Edit. Difco Laboratories. Detroit. USA.

Domenech F.; G. Michelena; R. Auria y S. Revah. 2002. Biofiltration

of volatile etanol using sugar cane bagase with Candida utilis.

Journal of Hazardous Materias, 89, 251-263 (2002).

Domenech P; F. Christen y S. Revah. 1995. Evaluación de diferentes

cepas de Candida utilis sobre la bioconversión de etanol en medio

líquido y estudio de la bioconversión de etanol en medio sólido.

UAM – Iztapalapa. México.

Domenech F, P. Christen; J. Paca y S. Revah. 1999. Ethanol utilization

for metabolite production by Candida utilis strains in liquid

medium. Acta Biotecnológica, 19, 27-36 (1999).

55

Domenech, G. 2004. Jefe del grupo de alcohol y bebidas.

Departamento de Bioingeniería del Instituto Cubano de

Investigaciones de Derivados de Caña de Azúcar (ICIDCA). La

Habana. Cuba. Comunicación personal:

domenechfidel@yahoo.com

Dorán, P. 1995. Principios de Ingeniería de Bioprocesos. Editorial

Acribia S.A. Zaragoza. España. p: 289-292.

Estévez, R.1998. Influencia de la concentración de azúcares sobre la

producción de levadura torula. Rev. ICIDCA. 7 (3) 61-63. La

Habana. Cuba.

Exebio, J. 2003. Diagnóstico de la oferta y demanda del mercado de la

Unión Europea, asiático y estadounidense de proteína unicelular.

Tesis. U.N.T. Trujillo. Perú. p: 57, 59-61.

Farmland Industries. 1999. “Torula driest yeast”. Disponible en:

http://www.tessenderlo.com/c/m1201.htm

Fennema, O.R. 1982. Introducción a la ciencia de los alimentos.

Editorial Reverté S.A. España. p: 291 – 293.

Ferrer, J.; Y. Davadillo; C. Chandler; G. Páez; Z. Marmol y E.

Ramones. 2004. Producción de proteína microbiana a partir de

desechos del procesamiento de la caña de azúcar (bagacillo).

Proyecto financiado por el Consejo de Desarrollo Científico y

Humanístico (CONDES). La Universidad del Sula. Venezuela.

Frazier, W; Westhoff, D. 1991. Microbiología de los alimentos. 3ª

edic. Edit. Acribia S.A. España.

56

Freese, F. 1988. Métodos estadísticos elementales para técnicas

forestales. Edit. Departamento de Agricultura de U.S.A. U.S.A

García, M; Quintero, R; López, A. 1993. Biotecnología Alimentaria.

Edit. Limusa S.A. México.

Gómez, J. 1999. Variación de la concentración de aminoácidos

obtenidos a partir de la fermentación de suero láctico con

Kluveromyces fragilis. Tesis para optar el grado de bachiller en

Farmacia y Bioquímica. Universidad Nacional de Trujillo. Perú.

Herbert, D. 1999. Some principles of continues culture. Recent

progress in Microbiology. Edit. G. Tunerall. Canadá.

Hough, J. 1990. Biotecnología de la cerveza y de la malta. Editorial

Acribia. S.A. Zaragoza. España.

Israelidis, C. y M. Coduonis. 1982. Utilization of Agricultural Wastes

for Animal Feed and Energy. Agricultural Research. Atenas.

Grecia.

Israelidis, C. y A. Evangelopoulos. 1980. Enzimatic and Microbial

Convertion of Cellulose Agricultural by Products for the

Production of Animal Feed, Etanol and Chemicals. Chimica

Crónica, 9, pp. 337-352.

Kirk, R; Othmer, D. 1998. Enciclopedia de Tecnología Química. Edit.

Limusa. México.

57

Lee, B. 2000. Fundamentos de Biotecnología de los Alimentos.

Editorial Acribia S.A. Zaragoza. España.

León, C. 2005. Influencia de la concentración de melaza de

Saccharum officinarum L. “caña de azúcar” en la producción de

proteína unicelular de Candida utilis var. major. Tesis para optar

el grado de Maestro en Ciencias. Mención Biotecnología y

Bioingeniería. Universidad Nacional de Trujillo. Trujillo. Perú.

Marchand, G. 1997. Inorganic: Spray torula yeast. www.tessenderlo,

com/c120123.htm

Miller, G. 1985. Living in the Environment. Wadswork Publishing Co.

California. Estados Unidos.

Montes, A. 1966. Bromatología. Tomo III. Editorial Universitaria de

Buenos Aires. Buenos Aires. Argentina.

Nigan, J. 2000. Cultivation of Candida langeronii in sugar cane

bagasse hemicellulosic hydrolyzate for the production of single

cell protein. Weekly Journal of Microbiology and Biotechnology,

p. 367-372.

Omelianski, V. 1922. Aroma producing microorganisms. Journal

Bacterial 8: 393 – 419.

58

Olesen, P.; T. Stahnke y L. Séller. 2000. The influence of

Debaryomyces hansenii y Candida utilis on the aroma formation

in garlic spiced fermented sausages and model minces. Department

of Biotechnology. Technical University of Denmark. Denmark.

OMS, Organización Mundial de la Salud. 2000. Washington.

Estados Unidos.

Pag. Guideline N° 12. 1987. Productions of Single Cell Protein for

Human Consumption. United Nation Press. New York. Estados

Unidos.

Perry, J. 1993. Manual del Ingeniero Químico. Tomo I. 6º Edición.

Editorial Mc Graw-Hill. México.

Quintero, R. 1981. Ingeniería Bioquímica. Teoría y Aplicaciones.

Editorial Alambra Mexicana. S.A. México.

Quintero, R.; A. López y M. García. 1999. Biotecnología Alimentaria.

Editorial Limusa S.A. México. Capítulo 11.

Scragg, A. 1996. Biotecnología para Ingenieros. Editorial Acribia.

Zaragoza. España.

Skinner, K. 1995. Single Cell Protein Moves Toward Market.

Chemical and Engineering News. Mayo. pp: 24 – 26.

Tabachnick, J. y M. Joslyn. 1953. Formation of Esters by Yeast. I. The

production of Ethyl Acetate by Standing Surface of Hansenula

anomala. J. Bacteriol. 65, (1953), 1 – 9.

59

Thomas, K.; P. Dawson y B. Gamborg. 1980. Differential growth rates

of Candida utilis mother and daughter cells under phased

cultivation. Prairie Regional Laboratory. National Research

Council of Canada. Canada. Journal of Bacteriology. Vol. 141.

p: 1-9.l

Torres, A. 1995. Producción de K. fragilis ATCC8556 con

concentraciones diferentes de lactosuero de vacuno y estiércol de

cerdo a temperatura y pH óptimos. Tesis para optar el grado de

Maestro en Microbiología Industrial y Biotecnología. Universidad

Nacional de Trujillo. Perú.

Torres, B.C. 1997. Metodología de la investigación científica. 5ª ed.

Edit. “San Marcos”. Lima – Perú.

Vegas, R. Y W. Castro. 2002. Evaluación de la calidad de alcohol

etílico a diferentes valores de reflujo en una columna rectificadora

de una destilería prototipo, con una altura equivalente al plato

teórico determinada experimentalmente. Tesis. U.N.T. Trujillo.

Perú.

Vejarano, R. 2005. Estudio comparativo de la producción de biomasa

con acetato de etilo por Candida utilis CECT 10704 a partir de

melaza de caña de azúcar (Saccharum officinarum), etanol

rectificado y etanol sin rectificar como fuentes de carbono. Tesis

para optar el título profesional de Ingeniero Agroindustrial.

Facultad de Ciencias Agropecuarias. Universidad Nacional de

Trujillo. Trujillo. Perú.

60

Wainwright, M. 1995. Introducción a la biotecnología de los hongos.

2da edic. Edit. Acribia. España.

Watteeuw, C. W. Armiger; D. Ristroph y A. Humphrey. 1979.

Production of Single Cell Protein from ethanol in a Fed-batch

process. Biotech. Bioeng. 21, (1979), 1221 – 1237.

Wiseman, A. 1986. Principios de Biotecnología. Editorial Acribia S.A.

Zaragoza. España.

Zoecklin, B.; K. Fugelsang; B. Gump y F. Nury. 2000. Análisis y

producción de vino. Editorial Acribia S.A. Zaragoza. España.

61

62

ANEXO 1. DISEÑO DEL BIORREACTOR TIPO TANQUE AGITADO

63

ANEXO 2. ESTERILIZACIÓN DEL SISTEMA DE FERMENTACIÓN EN

CÁMARA UV SE APRECIA EL FLUORESCENTE DE LUZ UV EN “ON”

EN LA PARTE SUPERIOR DE LA CÁMARA Y TODOS LOS

ACCESORIOS DEL SISTEMA DE FERMENTACIÓN EN LA PARTE

INFERIOR DE LA CÁMARA DE ESTERILIZACIÓN

64

ANEXO 3. OBSERVACIÓN MICROSCÓPCA Y PROCESO DE

REACTIVACIÓN Y PREPARACIÓN DEL INÓCULO DE LA

LEVADURA Candida utilis. var. major C.E.C.T. 1430

Foto A : Observación miscroscópica de Candida utilis var.major C.E.C.T. 1430.

Foto B : Proceso de reactivación y preparación del inóculo de la cepa de

levadura Candida utilis. var.major C.E.C.T. 1430.

FOTO A

FOTO B

65

ANEX0 4. SISTEMA DE PRODUCCON BATCH DE ACETATO DE

ETILO Y PROTEINA UNICELULAR DE Candida utilis.

var. major C.E.C.T. 1430

66

ANEX0 5. DETERMINACIÓN DE LA PROTEÍNA UNICELULAR NETA

PRODUCIDA DE Candida utilis. var. major C.E.C.T. 1430

67

ANEXO 6. CUANTIFICACIÓN DEL ACETATO DE ETILO

La cuantificación del acetato de etilo se realizó tomando como referencia la

NTP 030:2002. Norma Técnica Peruana para Caracterizar el Alcohol Etílico

Rectificado.Todo para determinar el contenido de ésteres (Vegas y Castro, 2002).

NTP tiene como fundamento la saponificación del acetato de etilo por una

base,OH.

Neutralización y cuantificación de ácido acético:

- Se tomarón 25 mL de muestra examen.

- Se agregó 3 gotas de fenolftaleína al 0.5% como indicador.

- Se tituló la muestra con solución de NaOH 0.1N, hasta que el color

ligeramente grosella permaneciera por 20 segundos dando por finalizada la

titulación, y si esto no sucedía se seguiría titulando hasta mantener dicha

coloración.

- Se anotó el gasto (mL NaOH) y se procedió a calcular el contenido de ácido

acético:

Saponificación y cuantificación de acetato de etilo:

- A la muestra utilizada anteriormente se le agregó un exceso de 10 mL NaOH

0.1 N.

- Se calentó por 30 minutos para saponificar el éster, luego se enfrió.

- Se tituló con HCl 0.1N, pasando de color grosella a incoloro.

- Se anotó el gasto (mL HCl) y se cuantificó mediante la siguiente fórmula:

muestramL60*NaOHNormalidad*NaOHmL)medioL/g(acéticoÁcido

muestramL)HClmL10(*40*NaOHNormalidad)medioL/g(etilodeÁcido

68

ANEXO 7. VALORACIÓN DE ACETATO DE ETILO POR EL MÉTODO DE

SAPONIFICAICÓN Y CUANTIFICACIÓN

69

ANEXO 8. VALORES ORIGINALES DEL CONSUMO DE DIFERENTES CONCENTRACIONES DE ETANOL

RECTIFICADO “E” (g/L) COMO FUENTE DE SUSTRATO EN LA PRODUCCIÓN DEL “BIOAROMA”

ACETATO DE ETILO Y PROTEÍNA UNICELULAR DE Candida utilis. var.major C.E.C.T. 1430 DURANTE

60 HORAS DE FERMENTACIÓN A 25ºC; Y SUS ESTIMADORES ARITMETICOS

SEr(g/L)Xni

10 15 20 25 30 35 Testigo

1

2

3

10

10

10

15

14

14

16

18

15

16

17

17

14

14

14

14

12

16

13

15

14

30.00 43.00 49.00 50.00 42.00 42.00 42.00

10.00 14.30 16.30 16.67 14.00 14.00 14.00

0 0.33 2.33 0.33 0.00 4.00 1.00

0 0.57 1.53 0.58 0.00 2.00 1.00

0 0.33 0.88 0.33 0.00 1.15 0.58

xi

x

S2

S

E.S.

C.V. 0 4.03 9.35 3.46 0.00 14.29 7.14

70

ANEXO 9. VALORES ORIGINALES DE PROTEÍNA UNICELULAR NETA PRODUCIDOS “X” (g/L) DE Candida utilis.

var.major C.E.C.T. 1430 EN LA EVALUACIÓN DE DIFERENTES CONCENTRACIONES DE ETANOL

RECTIFICADO SOBRE LA PRODUCCIÓN DEL “BIOAROMA” ACETATO DE ETILO Y PROTEÍNA

UNICELULAR DURANTE 60 HORAS DE FERMENTACIÓN A 25ºC; Y SUS

ESTIMADORES ARITMETICOS

SEr(g/L)Xni

10 15 20 25 30 35 Testigo

1

2

3

5.50

5.80

6.10

7.99

7.69

8.00

5.96

5.70

6.22

5.50

5.78

5.74

5.00

6.00

5.50

4.00

5.64

4.82

4.91

5.42

5.61

17.40 23.68 17.88 17.22 16.50 14.46 15.94

5.80 7.90 5.76 5.74 5.50 4.82 5.31

0.09 0.03 0.07 0.06 0.25 0.67 0.13

0.30 0.18 0.26 0.24 0.50 0.82 0.36

0.17 0.10 0.15 0.14 0.29 0.47 0.21

xi

x

S2

S

E.S.

C.V. 5.17 2.23 4.36 4.18 9.09 17.01 6.81

71

ANEXO 10. VALORES ORIGINALES DE PRODUCCIÓN DEL “BIOAROMA” ACETATO DE ETILO “AE” (g/L) POR

Candida utilis. var.major C.E.C.T. 1430 A DIFERENTES CONCENTRACIONES DE ETANOL

RECTIFICADO COMO FUENTE DE SUSTRATO DURANTE 60 HORAS DE FERMENTACIÓN A 25ºC; Y

SUS ESTIMADORES ARITMETICOS

S (g/L)Xni

10 15 20 25 30 35 Testigo

1

2

3

0.39

0.45

0.41

0.72

0.69

0.81

0.48

0.60

0.55

0.42

0.40

0.50

0.36

0.40

0.32

0.25

0.28

0.29

0.35

0.40

0.29

1.25 2.22 1.63 1.32 1.08 0.82 1.04

0.42 0.74 0.54 0.44 0.36 0.27 0.35

0.0009 0.004 0.0004 0.028 0.016 0.0004 0.003

0.003 0.006 0.006 0.05 0.04 0.021 0.055

0.002 0.003 0.003 0.03 0.023 0.012 0.0317

xi

x

S2

S

E.S.

C.V. 7.332 8.439 11.093 12.02 11.11 7.6158 15.88

72

ANEXO 11. VALORES ORIGINALES DE RENDIMIENTO “Y” (%) EN RELACIÓN AL “BIOAROMA” ACETATO DE

ETILO Y SUSTRATO CONSUMIDO “Y”P/S POR Candida utilis. var.major C.E.C.T. 1430 EN LA

EVALUACIÓN DE DIFERENTES CONCENTRACIONES DE ETANOL RECTIFICADO COMO FUENTE

DE SUSTRATO DURANTE 60 HORAS DE FERMENTACIÓN A 25ºC; Y SUS

ESTIMADORES ARITMETICOS.

SEr(g/L)Xni

10 15 20 25 30 35 Testigo

1

2

3

3.90

4.50

4.10

4.80

4.93

5.79

3.00

3.33

3.67

2.63

2.35

2.94

2.57

2.86

2.29

1.79

2.33

1.81

2.69

2.67

2.57

12.5 15.52 10.00 7.92 7.72 5.93 7.43

4.17 5.17 3.33 2.64 2.57 1.97 2.48

0.093 0.289 0.111 0.087 0.0812 0.093 0.1241

0.305 0.537 0.335 0.0290 0.0285 0.030 0.3523

0.176 0.3106 0.193 0.1685 0.0164 0.176 0.2034

xi

x

S2

S

E.S.

C.V. 7.33 10.399 10.05 10.97 11.07 15.48 14.22

73

ANEXO 12. VALORES ORIGINALES DE PRODUCTIVIDAD “P” (g/L-h) DEl “BIOAROMA” ACETATO DE ETILO

“AE” (g/L) EN LA PRODUCCIÓN DE PROTEÍNA UNICELULAR Y ACETATO DE ETILO POR

Candida utilis. var.major C.E.C.T. 1430 A DIFERENTES CONCENTRACIONES DE ETANOL

RECTIFICADO COMO FUENTE DE SUSTRATO DURANTE 60 HORAS DE FERMENTACIÓN A 25ºC; Y

SUS ESTIMADORES ARITMETICOS.

SEr(g/L)Xni

10 15 20 25 30 35 Testigo

1

2

3

0.007

0.008

0.007

0.012

0.012

0.014

0.008

0.010

0.009

0.007

0.007

0.008

0.006

0.007

0.005

0.004

0.005

0.005

0.006

0.007

0.005

0.022 0.038 0.027 0.022 0.018 0.014 0.018

0.007 0.013 0.009 0.007 0.006 0.006 0.006

0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000

0.000 0.001 0.001 0.000 0.001 0.000 0.001

0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000

xi

x

S2

S

E.S.

C.V. 7.872 9.116 11.11 7.87 16.66 12.37 16.66

74

ANEXO 13. VALORES ORIGINALES DE PRODUCTIVIDAD “P“ (g/L-h) DE PROTEÍNA UNICELULAR “X” (g/L) EN

LA PRODUCCIÓN DEl “BIOAROMA” ACETATO DE ETILO Y PROTEÍNA UNICELULAR DE Candida

utilis. var.major C.E.C.T. 1430 A DIFERENTES CONCENTRACIONES DE ETANOL RECTIFICADO COMO

FUENTE DE SUSTRATO DURANTE 60 HORAS DE FERMENTACIÓN A 25ºC; Y SUS

ESTIMADORES ARITMETICOS.

S (g/L)XNi

10 15 20 25 30 35 Testigo

1

2

3

0.092

0.100

0.102

0.100

0.104

0.108

0.099

0.095

0.104

0.092

0.099

0.100

0.083

0.100

0.092

0.067

0.094

0.080

0.082

0.090

0.094

0.294 0.312 0.298 0.291 0.275 0.241 0.266

0.098 0.104 0.099 0.097 0.092 0.080 0.089

0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000

0.005 0.004 0.005 0.004 0.008 0.013 0.006

0.003 0.002 0.003 0.002 0.005 0.008 0.004

xi

x

S2

S

E.S.

C.V. 5.399 3.846 4.539 4.494 9.278 16.809 6.89

75

ANEXO 14. VALORES ORIGINALES DE RENDIMIENTO “Y” EN RELACIÓN A LA PROTEÍNA UNICELULAR NETA

PRODUCIDA Y EL SUSTRATO CONSUMIDO “Yx/s” (g/L) DE EN LA EVALUACIÓN DE DIFERENTES

CONCENTRACIONES DE ETANOL RECTIFICADO SOBRE LA PRODUCCIÓN DEL “BIOAROMA”

ACETATO DE ETILO Y PROTEÍNA UNICELULAR POR Candida utilis. var.major C.E.C.T. 1430 DURANTE

60 HORAS DE FERMENTACIÓN A 15ºC; Y SUS ESTIMADORES ARITMETICOS.

SOX

Ni10 15 20 25 30 35 Testigo

1

2

3

55.00

58.00

61.00

53.27

54.93

57.14

37.25

31.67

41.47

34.38

35.18

33.76

35.71

35.71

35.71

28.57

47.00

30.13

37.77

36.13

40.10

174.00 165.34 110.39 103.32 107.13 105.70 114.00

58.00 55.11 36.80 34.44 35.71 35.23 38.00

9.00 3.77 24.16 0.51 0 104.45 3.98

3.00 1.94 4.92 0.71 0 10.22 1.99

1.73 1.12 2.84 0.41 0 5.90 1.15

xi

x

S2

S

E.S.

C.V. 5.17 3.52 13.36 2.87 0 29.00 5.25

76

ANEXO 15. ANÁLISIS DE VARIANZA DE CONSUMO DE SUSTRATO

PRODUCCIÓN DE PROTEÍNA UNICELULAR, RENDIMIENTO Y

PRODUCTIVIDAD EN LA PRODUCCIÓN DE PROTEÍNA

UNICELULAR POR Candida utilis. var.major C.E.C.T. 1430 A

DIFERENTES CONCENTRACIONES DE ETANOL

RECTIFICADO.

Variables F.V. S.C. g.L C.M: Fc Probabilidad

Consumo desustrato

Concentrac.

Error

Total

85.111

14.000

99.111

5

12

17

17.022

1.167

14.590

***

9.600E-05

p < 0.01

Producción deproteína

unicelular

Concentrac.

Error

Total

15.968

2.337

18.305

5

12

17

3.194

0.195

16.396

***

5.341E-05.

p < 0.01

Rendimiento

Concentrac.

Error

Total

1787.196

283.779

2070.975

5

12

17

357.439

23.648

15.115

***

8.049E-05

p < 0.01

Productividad

Concentrac.

Error

Total

1.0169E-03

6.7600E-04

1.6929E-03

5

12

17

2.0339E-04

5.633E-05

3.610

***

0.0318

p < 0.01

Leyenda: *** Diferencias altamente significativas (p < 0.01)

77

ANEXO 16. ANÁLISIS DE VARIANZA DE CONSUMO DE SUSTRATO

PRODUCCIÓN DE ACETATO DE ETILO RENDIMIENTO Y

PRODUCTIVIDAD EN LA PRODUCCIÓN DE “BIOAROMA”

ACETATO DE ETILO POR Candida utilis. var.major C.E.C.T. 1430

A DIFERENTES CONCENTRACIONES DE ETANOL

RECTIFICADO.

Variables F.V. S.C. g.L C.M: Fc Probabilidad

Consumo desustrato

Concentrac.

Error

Total

85.111

14.000

99.111

5

12

17

17.022

1.167

14.590

***

9.600E-05

p < 0.01

Producción deproteína

unicelular

Concentrac.

Error

Total

0.397

0.027

0.424

5

12

17

0.079

2.2167E-03

35.848

***

8.239E-07

p < 0.01

Rendimiento

Concentrac.

Error

Total

20.914

1.508

22.422

5

12

17

4.183

0.126

33.276

***

1.243E-06

p < 0.01

Productividad

Concentrac.

Error

Total

1.1583E-03

6.5557E-06

1.2450E-04

5

12

17

2.3167E-05

7.2222E-07

32.077

***

1.521E-06

p < 0.01

Leyenda: *** Diferencias altamente significativas (p < 0.01)