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Inhibición enzimática y actividad antioxidante de polifenoles de frutilla nativa Chilena tras digestión in vitro

Samanta Thomas Valdés, MSc ,PhD

Escuela de Nutrición y Dietética

Universidad de Valparaíso, Valparaíso, Chile

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Declaración de Intereses: - No tengo ningún interés que declarar

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Introducción

Fragaria chiloensis spp. chiloensis f. patagonica

Elevado contenido de POLIFENOLES

Retamales et al (2005) HortScience, 40:1633–1634; Simirgiotis et al (2009) Food Chemistry, 113, 377–385

3

4

Atribuciones de polifenoles

In

tr

od

uc

ció

n

Fotoreceptores

Agente antimicrobiano

Pigmentos

Repelentes

Anti-inflamatorio

Antioxidante

Inhibición enzimática

4

Aguilera et al (2016) Phytochemistry Reviews, 15, 405–423.

5

Biodisponibilidad y

procesos de metabolización

• Tamaño molecular

• Polimerización

• Glicosilación

• Solubilidad

• Conjugación con matriz alimentar

• Actividad enzimática

• Factores relacionados al indivíduo

• Microflora intestinal

• Otros

Métodos de digestión in vitro

Minekus et al (2014) Food & Function 5:1113-1124; Carbonell-Capella et al (2014) Comp Rev Food Sci Food Safety 13:155-171

5

6

• Describir el perfil de compuestos fenólicos de la frutilla F. chiloensis spp. chiloensis f. patagonica tras la digestión in vitro

• Relacionar el perfil de fenólicos con su capacidad antioxidante in vitro y en modelo celular, y con inhibición enzimática

Objetivos

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Preparación de los extractos

Extracto PEE

Extracto Metanólico

Thomas-Valdés et al (2018) Food Res Int 105:10–18

7

8

Simulación Intestinal

PEE

Fluido gátrico (30 min)

Ajuste del pH 4.5 con NaOH

Amiloglucosidasa

(30 min)

Centrifugado

(10 min)

Ajuste pH 6.9 con NaOH , α-

amilasa

(45 min)

Sobrenadante mantenido a -80 oC para demás analisis

Fluido intestinal (30 min)

Adición de lipasa y extracto biliar

(pH 7.5) (30 min)

Centrifugado

(10 min)

Sobrenadante mantenido a -80 oC

para demás analisis

Minekus et al (2014) Food & Function 5:1113-1124; USP 23-NF 18, 1995

Simulación Gástrica

Controles

1) Enzimas inactivadas

por temperatura

2) Estándares

Cianidina-3-hexosido,

(+)-Catequina, Ácido

clorogénico,

Ácido elágico

Quercetina-3-rutinosido

Digestión in vitro

Cartridge C18

Agitación constante, oscuridad, 37 oC

8

9

Análisis de los extractos

Fenoles totales

Flavonoides totales

DPPH

FRAP

TEAC

Ánion superóxido

9 Simirgiotis & Schmeda-Hirschmann (2010) J Food Comp Anal

23:545; Simirgiotis et al (2013) Food Chem 139:289

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Inhibición enzimática

α-glucosidasa: p-nitrofenil-D-glucopiranosido

• Costamagna et al (2016) Food Chem 190: 392

α-amilasa: almidón

• Tan et al (2017) Food Chem 214: 259

Lipasa pancreática: p-nitrofenil palmitato

•McDougall et al (2009) Food Chem. 115: 193

10

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Citotoxicidad

Células AGS confluentes PEE

0-500 μg/mL

Viabilidad

celular

Cheli & Baldi (2011) J Food Sci. 76:197 11

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Citoprotección

Células AGS confluentes

PEE

overnight

Agente agresor (H2O2)

Viabilidad celular

Cheli & Baldi (2011) J Food Sci. 76:197 12

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Perfil de compuestos fenólicos

Tiempo ACN 1% HCOOH

0 5 95

60 25 75

70 60 40

75 5 95

Bomba: LC-20AT pump

Columna: 100 RP 18-5 μ, 250 × 4.6 mm,25 °C

Flujo: 1mL/min

Vol. inyección: 20 μL

Espectros UV-vis: 200 to 600 nm

Espectro masa: m/z 150 - 2000 amu

Ionización: modo negativo

Gas nebulizador: Nitrogeno, 27.5 psi, 365 °C

Flujo: 8 L/min

Colisión: helio

Identificación tentativa: tR, espectro UV-visible y patrón MS/MS

fragmentación comparado a literatura o con estándares 13

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RESULTADOS Fenólicos y flavonoides totales

Muestras TP

(g GAE/kg muestra) % rec.

TF

(g CE/kg muestra) % rec.

PEE

PEE-ND 301.1 ± 14.0a 214.1 ± 9.0a

PEE-DG 290.8 ± 15.5b 96.6 84.7 ± 8.2b 39.6

PEE-DI 171.7 ± 16.0c 59.0 19.5 ± 0.3c 23.0

Control enzima inactivada temperatura

PEE-ND 301.1 ± 14.0a 214.1 ± 9.0a

PEE-DG 229.1 ± 20.6b 76.1 131.9 ± 3.8b 61.6

PEE-DI 87.8 ± 7.1c 38.3 81.3 ± 4.9c 61.6

ND: no digerido; DG: digestión gástrica; DI: digestión intestinal; PEE: extracto enriquecido en polifenoles

14

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Actividad Antioxidante In vitro

Muestras DPPH

(SC50 µg/mL)

FRAP

(mmol TE/kg muestra)

TEAC

(mM TE/kg muestra)

Ánion Superóxido

(SC50, µg/mL)

PEE

PEE-ND 5.27 ± 0.97a 2550.72 ± 21.68a 3692.62 ± 100.77a 13.11 ± 0.64a

PEE-DG 12.56 ± 1.16b 1400.11 ± 30.06b 2241.89 ± 67.30b 23.09 ± 1.10b

PEE-DI 17.11 ± 0.98c 1250.70 ± 6.88c 1570.77 ± 82.17c 47.23 ± 0.56c

Control enzima inactivada temperatura

PEE-ND 5.27 ± 0.97a 2550.72 ± 21.68a 3692.62 ± 100.77a -

PEE-DG 13.19 ± 0.35b 1594.16 ± 5.47b 1887.02 ± 90.45b -

PEE-DI 17.68 ± 1.03c 1476.40 ± 13.44c 1324.68 ± 37.38c -

ND: no digerido; DG: digestión gástrica; DI: digestión intestinal; PEE: extracto enriquecido en polifenoles

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16

RESULTADOS Citotoxicidad

Ru

bu

s g

eo

id

es

• Todos los extractos analizados no presentaron citotoxicidad contra células AGS, con

IC50 > 250 μg/mL

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RESULTADOS Citoprotección frente H2O2

Giampieri et al (2014) Food & Function, 5, 1939–1948

Avila et al (2017) Oxidative Medicine and Cellular Longevity

13p. 17

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RESULTADOS Inhibición enzimática

Muestras

α-Glucosidasa

(IC50 µg/mL)

α-Amilasa

(% inhibición en 100

µg/mL)

Lipasa pancreatica

(% inhibición a 50 µg/mL o

IC50)

PEE-ND 0.80 ± 0.06a Inactivo 41.36 ± 0.30a

PEE-DG 1.16 ± 0.02b Inactivo 30.09 ± 1.20b

PEE-DI 1.82 ± 0.08c Inactivo 4.30 ± 0.60c

Compuestos de referencia

Acarbosa 120.86 ± 1.99 28.48 ± 0.29 -

Orlistat - - 0.04 ± 0.00

ND: no digerido; DG: digestión gástrica; DI: digestión intestinal; PEE: extracto enriquecido en polifenoles

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RESUTADOS Estadística

Fenólicos totales Flavonoides totales

Coeficiente de Pearson p valor Coeficiente de Pearson p valor

DPPH -0.876 < 0.01 -0.723 < 0.05

FRAP 0.865 < 0.01 -0.543 > 0.05

TEAC 0.945 < 0.01 -0.748 < 0.05

Ánion Superóxido -0.798 < 0.05 -0.755 < 0.05

α-Glucosidasa -0.723 < 0.05 0.100 > 0.05

Lipasa pancreatica 0.817 < 0.01 -0.202 > 0.05

19

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Identificación tentativa compuestos fenólicos

300

600

600

PEE-ND

PEE-GD

PEE-ID

20

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Comp Rt (min) [M-H]- MS/MS Identificación tentativa PEE

ND DG DI

1 10.2-11.9 783.73 481.00, 300.76 Bis HHDP hexosido 1 X X X

2 15.3 783.13 481.10, 300.90 Bis HHDP hexosido2 X X X

3 17.5-17.6 783.44 480.91, 300.75 Bis HHDP hexosido 3 X X X

4 20.2-21.4 577.30 451.10, 425.18, 289.40 (epi)C-(epi)C dimero X X X

5 21.8 467.47 303.80, 285.80 DHQ hexosido X X X

6 23.6 288.77 244.79, 205.16 (epi)catequina X X X

7 24.2-24.5 483.90 270.89 Pelargonidina derivativo X X X

8 25.0-26.1 633.00 463.00, 300.87 HHDP galoil hexosido 1 X X X

9 26.9 599.32 435.95, 303.00 DHQ hexosido pentosido X X X

10 27.3 633.96 463.10, 300.78 HHDP galoil hexosido 2 X X X

11 28.3 451.15 286.80 Cianidina hexosido X X

12 32.5 449.05 284.77 K hexosido 1 X X X

13 33.1-33.9 635.64 465.14, 301.00 HHDP galoil hexosido 3 X X X

14 34.0 611.61 447.97, 284.91 K dihexosido X X X

15 35.1 594.82 462.90, 300.90 Ác. elagico pentosido hexosido X X X

16 35.8 432.69 268.76 Apigenina hexosido X X

17 38.5-38.6 464.91 300.68 Ác. elagico hexosido X X X

18 38.5-38.8 935.05 633.26, 301.39 Bis-HHDP galoil hexosido 1 X

19 38.9-39.0 633.84 464.91, 316.05 Miricetina rhamnosido derivativo X X X

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Comp Rt (min) [M-H]- MS/MS Identificación tentativa PEE

ND DG DI

20 39.8-40.9 935.46 633.30, 301.49 Bis-HHDP galoil hexosido 2 X

21 43.7 933.91 631.04, 450.92, 300.80 Bis-HHDP galoil hexosido 3 X X

22 44.9-45.0 435.46 302.89, 150.70 DHQ pentosido 1 X X X

23 46.7 433.38 300.61 Q pentosido 1 X X X

24 47.0 579.47 447.05, 301.00 Q pentoside rhamnoside X X X

25 47.5 435.79 302.85, 150.80 DHQ pentoside 2 X X X

26 48.3-48.7 448.91 300.03 Q rhamnoside X X X

27 48.7-49.0 625.13 300.77 Q dihexoside X

28 49.3-49.7 435.22 302.88 DHQ pentoside 3 X X X

29 49.7 463.31 300.80 Q hexoside X X X

30 49.9-50.4 477.25 300.84 Q glucuronide X X X

31 55.0 433.89 300.82 Q pentoside 2 X X X

32 55.8-56.1 449.08 284.79 K hexoside 2 X X X

33 56.3 448.82 314.86 Isorh pentoside X X X

34 61.2 491.30 284.82 K acetyl hexoside X X X

35 67.9-68.2 593.55 446.98, 284.83 K rhamnoside hexoside X X X

22

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Cambios en el perfil de compuestos fenólicos

Digestión gástrica Digestión intestinal

Bis-HHDP galoil hexosido 1 (18) Cianidina hexosido (11)

Bis-HHDP galoil hexosido 2 (20) Apigenina hexosido (16)

Q dihexosido (27) Bis-HHDP galoil hexosido 1 (18)

Bis-HHDP galoil hexosido 2 (20)

Bis-HHDP galoil hexosido 3 (21)

Q dihexosido (27)

23

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• El contenido de fenólicos y flavonoides totales, y actividad antioxidante in vitro antes de la digestión presentaron mayores concentraciones y actividad

• Los PEEs no presentaron efecto citoprotector significativo contra el estrés inducido por H2O2 en células AGS

• El efecto inhibidor contra enzimas digestivas relacionadas al síndrome metabólico (α-glucosidasa y lipasa) fueron mayores antes de la digestión. Para α-glucosidasa, todos los PEEs mostraron valores de IC50 menores que el inhibidor comercial acarbosa

• Un total de 35 compuestos fueron identificados tentativamente, tras la digestión simulada:

- DG 3 compuestos no fueron identificados: Bis HHDP galloil hexosido y quercetina dihexosido

- DI otros 3 compuestos no estaban hexosidos de cianidina, apigenina y Bis HHDP galloil

Conclusiones

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Agradecimientos

Instituto de Química de Recursos Naturales

Dr. Guillermo Schmeda

Dra. María del Pilar Caramantin Soriano

Sra. Irene Manríquez y Sr. Sergio Reyes

Alberto Burgos

Facultad de Ciencias de la Salud

Cristina Theoduloz

Dr. Felipe Jiménez

CONICYT

FONDECYT 1120096

Beca Doctoral 2013-63130042

Universidad de Valparaíso

Escuela de Nutrición y Dietética

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¡Muchas gracias!