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CINÉTICA ENZIMÁTICA

Dra. Leticia Bucio Ortiz. Depto. Ciencias de la Salud. DCBS. UAM-Izt. México.

E + S SE E + P


• Proteínas con actividad catalítica de los seres vivos.

• Unidades del Metabolismo

• Regulan la vel. de las reac. quím. espontáneas (DG-).

• No promueven reacciones no-espontáneas (DG +).

• Incrementan la Vel. de reacción 103 a 1012 veces sin

afectar el sentido de la reacción.

• No forman parte del producto de la reacción.


PROPIEDADES GENERALES• AUMENTAN LA VELOCIDAD DE REACCIÓN

– De 106 to 1012 veces vs sin enzima.

– Aún más rápido que los catalizadores químicos.

• CONDICIONES DE REACCIÓN– Temperatura 25-40 oC (algunas hasta 75 oC)

– pH neutro (5-9), la mayoría 6.5 – 7.5

– Presión atmosférica normal

• CAPACIDAD DE REGULACIÓN– Por concentración de sustrato

– Por concentración de enzima

– Por inhibidores competitivos (semejantes al sustrato)

– Por inhibidores no competitivos (modificación covalente de la enzima)

– Por regulación alostérica

• ALTA ESPECIFICIDAD DE REACCIÓN– Interacción estereoespecífica con el sustrato

– No hay productos colaterales


ALTA

ESPECIFICIDAD

DE REACCIÓN

INTERACCIÓNESTEREO

ESPECÍFICA CON SU

SUSTRATO


Los Substratosse acercan a la Enzima

(sitio Activo)

Enzima

Substratos

HO-

H-


Cambia la configuración de la enzima


Los reactivos interaccionan

con la enzima (sitio activo)

La unión del sustrato produce un cambio conformacional

de la enzima hexoquinasa (cinasa), la cual es monomérica.

Substrato

de glucosa

Sitio de enlace


Se realiza la reacción

catalítica


Actividad enzimática finales del siglo XIX.

En 1882: complejo enzima-sustrato como intermediario del proceso de catálisis enzimática.

En 1913: Leonor Michaelis y Maud Menten desarrollaron esta teoría y propusieron una

ecuación de velocidad que explica el comportamiento cinético de los enzimas.

http://www.ehu.eus/biomoleculas/enzimas/enz3.htm#mm

[ET] = [E] + [ES]

Como [E] = [ET] - [ES], resulta que: v1= k1[S] [ET] - k1 [S] [ES]


Leonor Michelis y Maud Menten (1913)

Tiempo

Co

nc

en

t.


E + S ESK1

K-1

ES E + PK2

K-2

[Et ] = Concentración de E total libre y combinada

[ES]

[Et ] – [ES] = Concentración de E libre

[S] normalmente > a [Et ] de tal forma [ES] es despreciable Vs [S]

1.- Vel. de formación ES = K1 ( [Et ] – [ES] ) [S]

La deducción comienza por considerar

las Velocidades de Formación y de Descomposición de ES

La velocidad de formación de ES a partir de E + P es muy pequeña y puede despreciarse

[ES]

[E] + [S]K1 =

K1 ( [E] + [S] ) = [ES]

2.- Vel. de descomposición de ES = K-1 [ES] + K2 [ES]

3.- Estado estacionario.

Vel. de formación de ES = vel. de descomposición. La [ES] se mantiene constánte

4.- Separación de las constantes de velocidad

K1 ( [Et ] – [ES] ) [S] = K-1 [ES] + K2 [ES]

K1 [Et ] [S] – K1 [ES] [S] = (K-1 + K2) [ES]

K1 [Et ] [S] = K1 [ES] [S] + (K-1 + K2) [ES]Dra. Leticia Bucio Ortiz. Depto. Ciencias de la Salud. DCBS. UAM-Izt. México.

K1 [Et ] [S] = K1 [ES] [S] + (K-1 + K2) [ES]

K1 [Et ] [S] = ( K1 [S] + (K-1 + K2) ) [ES] simplificando

K1 [Et ] [S]

K1 [S] + (K-1 + K2) [ES] =

5.- Definición de la velocidad inicial (Vo) en función de [ES]

La Vel. Inicial de acuerdo con la Teo. de M-M, está determinada por la

vel. de descomposición del [ES], K2 ,

ES E + PK2

K-2

Vo

K2

[ES] =

[Et ] [S]

[S] + (K-1 + K2)

K1

[ES] =

Vo = K2 [ES]

[ES]

[ES]

K2 [Et ] [S]

[S] + (K-1 + K2)

K1

Se puede simplicar:

Vo = Definiendo KM

Cte. De Michaelis-Menten como(K-1 + K2)

K1

Vmax como K2 [Et] que es la Vel. Cuando todo el

enzima disponible E, se halla presente en forma de ES.Vmax [S]

[S] + KM

Vo =Ecuación de Michaelis-Menten o Ecuación de Velocidad

para una reacción de un solo S catalizada por un E.


ECUACIÓN DE MICHAELIS-MENTEN Vo = Vmax [S]

Km + [S]

1

2 Vo = Vmax

De la ecuación de M-M se deduce una rel. numérica importante

Cuando la Vo es la mitad de la Vmax

Vmax Vmax [S]

2 KM + [S] =

1 [S]

2 KM + [S] =

KM = 2 [S] – [S]

KM = [S]


Vo =Vmax [S]

KM + [S]

E E-S E

S P

Velocidad: cantidad de producto formado en una unidad de tiempo

S E P

100 1000 100

1000

1000

1000

1000

1000

1000

250 250

500 500

750 750

1000 1000

2000 1000

3000 1000

Vmax

(mM) mU (mM/ min)


Cinética enzimática en función de la concentración

de sustrato

KM

1

2 Vo = Vmax

KM = [S]

Vmax


Catalasa H2O2 25.0

Hexoquinasa ATP 0.4

D-Glucosa 0.05

D-Fructosa 1.5

Anhidrasa carbónica HCO3- 9.0

Quimotripsina Gliciltirosinilglicina 108.0

N-Benzoiltirosinamida 2.5

-Galactosidasa D-Lactosa 4.0

Treonina deshidrogenasa L-Treonina 5.0

ENZIMA SUSTRATO Km (mM)


• La KM es inversamente proporcional con la

actividad de la enzima.

• Valor de KM grande, baja actividad

• Valor de KM pequeño, alta actividad

La KM

es un parámetro de

Actividad Enzimática


Catalasa H2O2 25.0

Hexoquinasa ATP 0.4

D-Glucosa 0.05

D-Fructosa 1.5







En ayunas 95 mg/dl. 950 mg/L = 5.27 mM

Después de comer …. Dra. Leticia Bucio Ortiz. Depto. Ciencias de la Salud. DCBS. UAM-Izt. México.

H2O

Quimotripsina Ac-Phe-Ala Ac.Phe + Ala 150

H2O

Pepsina Phe-Gly Ac-Phe + Ala 0.3

H2O

Ribonucleasa Citidina 2’,3’ Citidina 3’ 7.9

fosfato cíclico fosfato

Anhidrasa Carbónica

Km de algunas enzimas


Mathews C.K. y Van Holde K.E 1998. .Bioquímica 2ª. Ed. McGraw-Hill Interamericana. España. Pag 418


Hexosa Cerebral

Azúcar Km

(mol/ L)

Cinasas

D-Glucosa 8 X 10 -6 Glucocinasa

Hexocinasa IV

D-Fructosa 2 X 10 -3 Fructocinasa

D-Manosa 5 X 10 -6 Manocinasa

D-Galactosamina 8 X 10 -5 Galactocinasa

Km

(mmol/ L)

8

2000

5

80

Km

(mmol/ L)

0.008

2.0

0.005

0.08


ATP + Glucosa ADP + 6-fosfato de glucosa

2 Rutas

Enzimas: pueden catalizar reacciones donde hay 2 S =

Hexocinasa

•Desplazamiento Simple, los 2 S se unen a la E

A + B + E EAB C + D

•Doble desplazamiento o ping-pong

A + B + E AE BE + C

D


Determinación Cuantitativa de la Cinética Enzimática

1. La reacción global

2. Procedimiento analítico para determinar el S que

desaparece o el P que aparece

3. Sí el E requiere Cofactores (iónes o coenzimas)

4. La dependencia de la actividad enzimática con la

[S] o sea la KM de la Enzima.

5. El pH óptimo

6. Un intervalo de temperatura en la que la E es

estable y muestra actividad elevada.


Catalasa H2O2 25.0

Hexoquinasa ATP 0.4

D-Glucosa 0.05

D-Fructosa 1.5







Glucosa en ayunas 95 mg/dl. 950 mg/L = 5.27 mM

Después de comer ….


Pepsina 1.5

Tripsina 7.7

Catalasa 7.6

Arginasa 9.7

Fumarasa 7.8

Ribonucleasa 7.8

Enzima pH óptimo

Vo


4 37 85

Temperatura oC)

Vo

10 50 100

Coenzima

Vo

10 30 50 70 100

Tiempo (min)

Vo


1.0 Unidad de Actividad Enzimática (U):

La cantidad que transforma 1.0 mmol (10-6 M) de S /min,

a 25 0C, en las condiciones de medida óptima.

Actividad específica:

Es el no. de U de una E / mg de proteína.

Es decir: una medida de la pureza de la E.

Al purificarla, el valor llega a un máximo y es estable.

Número de recambio

No. de moléculas de S transformadas /unidad de tiempo,

por una molécula de E ( o por un solo sitio catalítico)

Enzima No. de Recambio

Anhidrasa carbónica 36 000 000

B-Amilasa 1 000 000

B-Galactosidasa 12 000

Fosfoglucomutasa 1 240


[S] (mM) Vo (mM/ min)

1.25 0.86

1.67 1.02

2.5 1.32

5 1.67

10 2.09

¿Vmax?

¿KM?


y = m x + b

Transformación de la M-M. Representación Doble Recíproco

Vmax [S]

[S] + KM

Vo =

Vmax [S]

KM + [S]Vo =

1 KM + [S]

Vo Vmax [S] =

Sí se toman los recíprocos de ambos

1 KM 1 [S]

Vo Vmax [S] Vmax [S] =

Separando los componentes de numerador

+

1 KM 1 1

Vo Vmax [S] Vmax

=

Simplificando

+Ecuación de

Lineweaver-Burk


Dra. Leticia Bucio Ortiz. Depto. Ciencias de la Salud. DCBS. UAM-Izt. México.Km= 37.48

0.00

0.20

0.40

0.60

0.80

1.00

1.20

1.40

1.60

1.80

2.00

0.00 0.10 0.20 0.30 0.40 0.50 0.60

Vo

(mm

ol/

L m

in)

[S] mM

Michaelis Menten

S (mM) Vo (mmol/L min)

0.05 0.71

0.10 1.07

0.20 1.50

0.35 1.80

0.50 1.88

1/S 1/Vo

20.0 1.4

10.0 0.9

5.0 0.7

2.9 0.6

2.0 0.5y = 0.0494x + 0.4257

R² = 0.9991

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

1.4

1.6

-10.0 -5.0 0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0

Linewever-Burk

1/[S]

1/ V

o

1 KM 1 1

Vo Vmax [S] Vmax

= +

y = m x + b


Gráfica de Eadie-Hofstee

Vmax [S]

KM + [S]Vo =

(KM + [S]) Vo = Vmax [S]

KM Vo [S] Vo Vmax [S]

[S] [S] [S]=

+

Vo = - KM Vo Vmax

[S]

+

y = - m x + bVo

[S]

V max

KM

Vo

Vmax


KM Vo [S] Vo Vmax [S]=+

KM Vo Vo Vmax

[S] =+

S (mM) Vo (mmol/L min)

0.05 0.71

0.10 1.07

0.20 1.50

0.35 1.80

0.50 1.88

1/S 1/Vo

20.0 1.4

10.0 0.9

5.0 0.7

2.9 0.6

2.0 0.5

Vo/S Vo

14.200.71

10.701.07

7.501.5

5.141.8

3.761.88

y = -0.1168x + 2.3571R² = 0.9947

0

0.5

1

1.5

2

2.5

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22

Vo

Vo/S

E-H

7


Cuando:

Vo= Vmax Todos los sitios activos están ocupados y

no hay moléculas de E libre.

KM= [S] Sí... ½ Vmax.

KM representa la cantidad de sustrato necesaria para fijarse

a la mitad de la E disponible y producir la mitad de la Vmax.

KM representa la concentración del sustrato en una célula.


Gracias


Inhibidores Enzimáticos


E E-S E

S

P

Velocidad: cantidad de producto formado en una unidad de tiempo

0.00

0.20

0.40

0.60

0.80

1.00

1.20

1.40

1.60

1.80

2.00

0.00 0.10 0.20 0.30 0.40 0.50 0.60

Vo

(mm

ol/

L m

in)

[S] mM

Michaelis MentenS (mM) Vo (mmol/L min)

0.05 0.71

0.10 1.07

0.20 1.50

0.35 1.80

0.50 1.88

1/S 1/Vo

20.0 1.4

10.0 0.9

5.0 0.7

2.9 0.6

2.0 0.5

1 KM 1 1

Vo Vmax [S] Vmax

= +

y = m x + b

Vo = V max [S]

Km + [S]


Inhibidores

Reactivos químicos específicos que pueden

inhibir a la mayor parte de las enzimas.

INHIBIDORES

Irreversibles

Reversibles


Inhibidor Irreversible

• Inhibición permanente

• Unión irreversible por medio de enlaces covalentes.

• Modificaciones químicas de los gps. catalíticos.

• Modificada la enzima, está siempre inhibida.

Para distinguirlo de los reversible se someten a

diálisis y si no se separan: enzima e inhibidor, éste es

permanente.


Diálisis

S + E SE E + P

E + I EI EI



Acetilcolinesterasa

Acetilcolina

Acetato + Colina



Acetilcolina

Acetato + Colina

Fluorofosfato de di-isopropilo (DFP)

Enz

Enz

Acetilcolinesterasa


Inhibidor Irreversible Fluorofosfato de di-isopropilo (DFP)

1914- 1918



Acetilcolinesterasa

Tripsina

Elastasa

Fosfoglucomutasa

Cocoonasa (larvas de gusanos de

seda)

Fluorofosfato de diisopropilo (DFP)

Plaguicidas de tipo organofosforados y carbamatos


Fluorofosfato de di-isopropilo (DFP) Serina

Cisteína

HistidinaIodoacetamida


• La unión del inhibidor y la enzima es reversible.

• Al quitar el inhibidor del medio, se recupera la actividad.

Hay 3 tipos:

Competitiva

No Competitiva

Acompetitiva (Alostérica)

Inhibidor Reversible


Antibióticos

Insecticidas

Hervicidas

Venenos

Diferentes Medicamentos

Dolor

Inflamación

Infecciones virales

Cáncer

Inhibición

enzimática


Inhibición Competitiva


Vmax igual

KM diferente


Malonato Deshidrogenasa del ácido succínico

Sulfas Infecciones microbianas

Antihipertensores: Captopril y Enalopril

Alopurinol Controla la gota

Fluoruracilo Cáncer

Inhibidores Competitivos

Inhibidor de la Angiotensina. Polipéptido sanguíneo

produce vasoconstricción, aumento de presión arterial

Análogo Inhibe Xantina-oxidasa

Hipoxantina xantina ácido úrico

Inhibe Dihidropteroato sintetasa

precursores de ácido fólico

CK, Cad. Resp.


El inhibidor NO se une al sitio activo

Inhibición No Competitiva

NO se puede revertir con un exceso de sustrato


Vmax diferente

KM igual


Cinéticas de Inhibición Competitivo

Vmax igual

KM diferente

No competitivo

Vmax diferente

KM igual

No inhibitor

1

V

1/[S]0


Inhibición acompetitiva

I

El inhibidor se une a una SUBUNIDAD reguladora

La subunidad catalítica

une al sustrato y

cataliza la reacción


S (mM) Vo (mmol/L min) Vo (mmol/L min)

0.05 0.71 0.43

0.10 1.07 0.71

0.20 1.50 1.05

0.35 1.80 1.41

0.50 1.88 1.60

1/S 1/Vo 1/Vo

con Inhib.

20.0 1.4 2.3

10.0 0.9 1.4

5.0 0.7 1.0

2.9 0.6 0.7

2.0 0.5 0.6


Hay enzimas que no obedecen la

ecuación de Michaelis-Menten.

Cinética no es Michaeliana.

Enzimas alostéricos,

pequeñas variaciones en la [S] en una zona crítica (cercana a

la KM) se traduce en grandes variaciones en la velocidad de

reacción.


Gracias


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