PRESENTA: ITZEL URIBE GONZALEZ · Así, los bencimidazoles son compuestos muy eficaces en los...

INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

DEPARTAMENTO DE QUÍMICA ORGÁNICA

“Síntesis de bencimidazoles y el estudio de su actividad antimicrobiana sobre cepas de Mycobacterium tuberculosis”

PROYECTO DE INVESTIGACIÓN TESIS

QUE PARA OBTENER EL TITULO DE

QUÍMICO FARMACÉUTICO INDUSTRIAL

PRESENTA:

ITZEL URIBE GONZALEZ

Asesor: Dr. Rogelio Jiménez Juárez

Co-asesora: Dra. Blanca Estela García Pérez

MEXICO D.F. 2013


Agradecimientos:

Al Dr. Rogelio Jiménez Juárez por su conocimiento y por darme la oportunidad de

pertenecer a este trabajo de investigación, por tenerme paciencia y creer en mí en

cada tropiezo, que fueron aprendizajes que marcaron mi vida.

Al Dr. Javier Peralta Cruz por darme la oportunidad de trabajar con él y por sus

conocimientos brindados ante las dudas, por su apoyo incondicional y sobre todo por

ser un asesor más en el transcurso del trabajo de investigación.

A la Dra. Blanca Estela García Pérez por darme la confianza y facilitarme lo

necesario para realizar las pruebas biológicas de dichos compuestos.

A los Doctores Héctor Jaime Salgado Zamora y Adela Astudillo Vázquez por las

correcciones y mejoras para este trabajo de investigación.

A mis padres, hermanas y compañeros que se convirtieron en mi apoyo

incondicional y me brindaron su cariño que fue para mí un sostén para seguir con

alegría este proyecto de investigación.



Al apoyo analítico recibido de la Escuela Nacional de Ciencias Biológicas del IPN,

Instituto de Química y USAI de la Facultad de Química de la UNAM. RMN (Dr. Javier

Peralta Cruz, Q. Ma. de los Ángeles Peña, Dra. Beatriz Ortiz, M.C. Elizabeth Huerta

y M.C. Héctor Ríos), EM (Dr. Javier Peralta Cruz, I.Q. Luis Velasco y Dr. F. Javier

Pérez), IR (Q. Marisela Gutiérrez)

Parte de los resultados de la tesis ha sido presentado en el marco de las actividades científicas del

48° CONGRESO MEXICANO DE QUÍMICA

Celebrado en la ciudad de Guanajuato, Gto., del 31 de agosto al 4 de septiembre del

2013.



Dedicatoria:

A dios mi gran sostén y fortaleza.

A mi padre Fernando Uribe Cano por darme la confianza y creer en mis

conocimientos y apoyarme incondicionalmente en las buenas y en las malas.

A mi madre Juana González García por darme consejos que en mi quedaron como

aprendizajes y sobre todo por preocuparse por mí.

A mis hermanas Dulce María y Nallely por darme su cariño, amor, comprensión y

aliento de seguir adelante, por quererme con mis defectos y virtudes, por apoyarme

en cada paso y tropiezo que nos marcaron y sirvieron para superar los fracasos y

seguir con los éxitos.



EL TRABAJO FUE DESARROLLADO EN LOS DEPARTAMENTOS DE

INMUNOLOGÍA Y QUÍMICA ORGÁNICA DE LA ESCUELA NACIONAL DE

CIENCIAS BIOLÓGICAS DEL IPN, BAJO LA ASESORIA DE LA DRA. BLANCA

ESTELA GARCÍA PÉREZ Y DEL DR. ROGELIO JIMÉNEZ JUÁREZ,

RESPECIVAMENTE Y CONTO CON EL APOYO FINANCIERO DE LOS

PROYECTOS: SIP 20120756, SIP 20130724, SIP 20130933 Y DEL CENTRO DE

INVESTIGACIÓN E INNOVACIÓN TECNOLÓGICA DEL DISTRITO FEDERAL

PROYECTO ICYTDF/325/2011.



Índice

Índice de tablas..…………………………………………………………..………..I

Índice de figuras.……………………………………………………………...…....I

Índice de esquemas………………………………………………………….........II

Resumen…..……………………………………………………………………….III

1.- Introducción………………………………………………………………….....1

1.1.- Bencimidazoles.…………………………………………………………...1

1.1.1.- Métodos de síntesis..…………………………………………………...1

1.1.2.-Actividad biológica...………………………………………………….....4

1.2.- Mycobacterium tuberculosis……...……………………………………...4

1.2.1.-Etiologia...………………………...……………………………………....5

1.2.2.-Tratamiento..……………………...………………………………….......6

2.- Justificación….…………………………………………………………………..9

3.- Objetivos………………………………………………………………..……....10

3.1.- Objetivo general….………………..………………………….…………10

3.2.- Objetivos particulares…..………...……………………….………….....10

4.- Hipótesis…..………………………………………………….…………….…..11

5.- Metodología..…………………….……………………………………………..12

5.1.- Síntesis de (2-(3´- nitrofenil)-5(6)-cloro bencimidazol…………...…...14

5.2.- Síntesis de (2-(2´-pirido)-5(6)-cloro bencimidazol…….………………15

5.3.- Síntesis de 1((Tien-2´-il) metil)) -2-(tien-2´-il) bencimidazol..………..16

5.4.- Síntesis de metasulfonato de hexadecilo…...…………………………17

5.5.- Síntesis de 1-hexadecil-2-(3´-nitrofenil)-5(6)-cloro bencimidazol..….18

5.6.- Micro ensayo Fluorométrico Alamar Azul…………………………...…19

6.- Análisis y discusión de resultados...…………………………………...…….23

7.- Conclusiones………………………………………………………….…..........35

8.- Referencias bibliográficas……………………………………………………..36



Índice de tablas

Tabla 1.- MICs de los bencimidazoles 5a, 5b, 4a y 4b frente a la cepa de referencia y cepas mono-resistentes

de M. tuberculosis…………………………………………………………………………………………..32

Índice de figuras

Figura 1: Anillo del bencimidazol…………………………………………………………….………………….…….…1

Figura 2: Estructura química de los medicamentos antituberculosos de primera línea….……………….…….…6

Figura 3: Estructura química de algunos medicamentos antituberculosos de segunda línea…………….…..….8

Figura 4: Conversión de resarzurina a resofurina por células viables………………….………………….….…...20 Figura 5: 2-(3´-nitrofenil)-5(6)-cloro bencimidazol 4a,…………………………………….………………….….…..23

Figura 6: Espectro IR del compuesto 2-(3´-nitrofenil)-5(6)-cloro bencimidazol 4a……………………….………23

Figura 7: Espectro de RMN 1H para (2-(3´-nitrofenil)-5(6)-cloro bencimidazol 4a…….……………….………...24

Figura 8: Espectro de RMN 13C del 2-(3´-nitrofenil)-5(6)-cloro bencimidazol 4a……….……………….………..25

Figura 9: Espectro de masas del 2-(3´-nitrofenil)-5(6)-cloro bencimidazol 4a………….…………………………25

Figura 10: 1-(Tien-2’-il) metil-2-(tien-2’-il) bencimidazol 5b…………………………………………….……………26

Figura 11: Espectro IR del compuesto 1-(Tien-2’-il) metil-2-(tien-2’-il) bencimidazol 5b………….……………26

Figura 12: Espectro de RMN 1H del 1-(Tien-2’-il) metil-2-(tien-2’-il) bencimidazol 5b………...…………………27

Figura 13: Espectro de RMN 13C del 1-(Tien-2’-il) metil-2-(tien-2’-il) bencimidazol 5b…………………………..27

Figura 14. 1-hexadecil-2-(3´-nitrofenil)-5(6)-cloro bencimidazol 5a………………………………………………..28

Figura 15: Espectro de RMN 1H de 1-hexadecil-2-(3´-nitrofenil)-5(6)-cloro bencimidazol 5a…………………..29

Figura 16: Espectro de RMN 13C de 1-hexadecil-2-(3´-nitrofenil)-5(6)-cloro bencimidazol 5a……..…………..29

Figura 17: Espectro de masas de 1-hexadecil-2-(3´-nitrofenil)-5(6)-cloro bencimidazol 5a………...…………..30

Figura 18: (2-(2´-pirido)-5(6)-cloro bencimidazol 4b…………………………………………………..……………30

Figura 19: Espectro de RMN 1H del (2-(2´-pirido)-5(6)-cloro bencimidazol 4b……………………...…………..31 Figura 20: Espectro de RMN 13C para 2-(piridin-2’-il)-5(6)-cloro bencimidazol 4b……………………………….31

I QUÍMICO FARMACÉUTICO INDUSTRIAL


Índice de esquemas

Esquema 1: Métodos usuales para la preparación de bencimidazoles……………………………..……2

Esquema 2: In (OTf)3 catalizador, formación de sales………………………………………………………2

Esquema 3: Síntesis de bencimidazoles 2-sustituidos con o-fenilendiamina y aldehídos en presencia

de ácido sulfónico funcionalizado sobre silicio……………………………………………………………….3

Esquema 4: Síntesis de bencimidazoles 2-sustituidos a partir de 2-nitroanilinas………………………-3

Esquema 5: Síntesis de bencimidazoles disustituidos (4a, 4b) y trisustuidos 5a a partir de 2-nitro-4-

cloroanilina 1 y aldehídos aromáticos 3……………………………………………………………………..13

Esquema 6: Síntesis de 2-(3´-nitrofenil)-5(6) cloro bencimidazol 4a a partir de la 4-cloro-2-nitroanilina

1 y meta-nitrobenzaldheído 3a………………………………………………………………………………..14

Esquema 7: (2-(2´-pirido)-5(6)-cloro bencimidazol 4b a partir de 2-nitro-4-cloroanilina 1 y 2-

piridincarboxaldheído 3b……………………………………………………………………………………….15

Esquema 8: Síntesis de 2-tien-2’-il) bencimidazol 4c y 1-(tien-2’-il) metil-2-(tien-2’-il) bencimidazol 5b

…...…………………………………..……………….…………………………………………………………..16

Esquema 9: Síntesis de metasulfonato de hexadecilo 7 a partir de alcohol cetílico 6 y cloruro de

metansulfunilo…………………………………………………………………………………..…………..…..17

Esquema 10: Síntesis del 1-hexadecil-2-(3´-nitrofenil)-5(6)-cloro bencimidazol 5a a partir de 4a y

metansulfonato de hexadecilo 7………………………………………………………………………………18

II QUÍMICO FARMACÉUTICO INDUSTRIAL


RESUMEN En la actualidad, la tuberculosis cobra la vida de aproximadamente dos millones de

personas cada año. La necesidad de alternativas en el tratamiento efectivo contra

Mycobacterium tuberculosis resistente a los fármacos, ha promovido la búsqueda de

nuevos compuestos elaborados por síntesis química o derivados de plantas y

microorganismos.

Los bencimidazoles se han utilizado en diversos tratamientos farmacológicos como

antibacterianos, antivirales, anticancerígenos, antihelmínticos, etc. La potencia de

éstos farmoquímicos son utilizados en el tratamiento de infecciones microbianas.

Así, los bencimidazoles son compuestos muy eficaces en los tratamientos contra

diversas cepas de bacterias, debido a su similitud estructural con las purinas, se ha

propuesto como posible mecanismo de acción la competencia con estas moléculas,

dando como resultado la inhibición de la síntesis de los ácidos nucleicos y proteínas

en las bacterias. Por ello en este trabajo se realizó la síntesis orgánica de

bencimidazoles con sustituyentes en la posición 1, 2, y 5(6) y se analizó su actividad

in vitro en cepas sensibles y mono-resistentes de Mycobacterium tuberculosis

mediante ensayo fluorométrico empleando como indicador Alamar Azul. Todos los

ensayos se evaluaron por fluorometria y por interpretación visual de la microplaca,

se consideró la concentración mínima inhibitoria (MIC) a aquella concentración

correspondiente al último pozo que permaneció azul y cuya intensidad de color fue

igual o menor a la obtenida en el control. Dos de los compuestos analizados

presentaron actividad relevante contra Mycobacterium tuberculosis, destacaron los

compuestos; (2-(3´-nitrofenil)-5(6)-cloro bencimidazol y (2-(2´-pirido)-5(6)-cloro

bencimidazol, lo cual en el ensayo in vitro inhibieron el crecimiento de M.

tuberculosis MtbH37-Rv a concentraciones de 3.125 y 12.5µg/mL respectivamente.

Los compuestos: 1-hexadecil-2-(3´-nitrofenil)-5(6)-cloro bencimidazol y 1-(tien-2’-il)

metil-2-(tien-2’-il) bencimidazol no mostraron actividad relevante contra M.

tuberculosis, dando una CMI de 50 µg/mL. La adición de la cadena hidrocarbonada

en la posición 1 del (2-(3´-nitrofenil)-5(6)-cloro bencimidazol disminuye su actividad

antimicobacteriana y los resultados señalan el papel potencial de los bencimidazoles

contra M. tuberculosis.

III QUÍMICO FARMACÉUTICO INDUSTRIAL


1.-INTRODUCCIÓN

1.1-Bencimidazoles.

El Bencimidazol (Figura 1) es un sistema aromático fusionado de benceno e

imidazol.1 Este núcleo posee características ácidas y básicas y tiene la capacidad

de formar sales, además, presenta tautomería debido al cambio prototrópico rápido

del grupo NH, lo que conduce a las mezclas en equilibrio dinámico de compuestos

sustituidos asimétricamente.2

NH

N

Figura 1. Anillo del bencimidazol.

El bencimidazol está en la estructura de la vitamina B12. Otros bencimidazoles están

disponibles comercialmente en productos farmacéuticos para uso veterinario y en

humanos.3

1.1.1-Métodos de síntesis

Se han reportado gran variedad de métodos para la preparación de bencimidazoles.

La primera estrategia fue descrita por Philips.6 Las estrategias más comunes para la

síntesis de bencimidazoles contemplan la condensación de o-fenilendiamina con

ácidos carboxílicos o sus derivados4 bajo condiciones severas de deshidratación

utilizando ácidos fuertes para tal fin, como ácido polifosfórico, ácido clorhídrico, ácido

bórico o ácido p-toluenosulfónico,7 y la condensación con aldehídos bajo condiciones

de oxidación (Esquema 1).5

1 QUÍMICO FARMACÉUTICO INDUSTRIAL


NH2

NH

X

RR´CHO-H2O

R´COOH-H2O

NH

NH

X

X

R

O

R´

N

HN

R´

R

O

-H2O

X

N

N

R´

R

Esquema 1: Métodos usuales para la preparación de bencimidazoles5

Recientemente se han reportado protocolos de preparación de bencimidazoles

usando catalizadores más suaves, como ácidos de Lewis (In (OTf)3) (Esquema 2) 9 y

arcillas inorgánicas, las cuales han permitido realizar la síntesis de bencimidazoles

bajo condiciones más suaves y mejorando tanto el rendimiento de conversión como

la pureza de los productos obtenidos.2

NH2

NH2

+R H

O

NH

N

R

In(OTf)3

Esquema 2: In (OTf)3 – catalizador, formación de bencimidazoles9.

Una síntesis reportada de bencimidazoles por reacción de o-fenilendiamina con

aldehídos fue en presencia de silica gel funcionalizada con ácido sulfónico como un

catalizador heterogéneo de interface en la síntesis de bencimidazoles (Esquema 3) a

temperatura ambiente.8



NH2

NH2

+Ar H

O

NH

N

Ar

silica gel funcionalizada con ácido sulfónico

CH2Cl2, 02t.a., 1-2 h

72 - 88 %

Esquema 3: Síntesis de bencimidazoles 2-sustituidos con o-fenilendiamina y aldehídos en presencia

de silica tratada con ácido sulfónico.8

Varios de los últimos procedimientos son llevados a cabo por la condensación de

1,2-diaminobencenos con aldehídos aromáticos en la presencia de un reactivo

oxidante para generar el núcleo del bencimidazol.8 Usando este protocolo, los

aldehídos aromáticos y alifáticos han sido convertidos convenientemente en los

correspondientes bencimidazoles 2-sustituidos con rendimientos buenos.

Alternativamente, los bencimidazoles también se han preparado a partir de 2-

nitroanilidas, en un proceso de dos pasos: en la primera etapa, el grupo nitro se

reduce utilizando reductores conocidos (Esquema 4)2 y en segundo paso se

condensa la 2-aminoanilida obtenida con un ácido carboxílico (o alguno de sus

derivados) o un aldehído utilizando los procedimientos mencionados anteriormente.

NO2

NH2R1

SnCl2 . 2H2O

R2COOHmicroondas,130°C,5 min.

R1

NH2

NH R2

ONH

N

R1

R2

R1= H, 4,5-dimetil, 5-OH, 5-OH, 5-OMe, 5-COOH, 5-CN, 5-CF3, 4,6-dicloroR2= H, Me, CF3

Esquema 4: Síntesis de bencimidazoles 2-sustituidos a partir de 2-nitroanilinas2



1.1.2 Actividad biológica

Los bencimidazoles tienen presencia relevante en medicina humana utilizados en

diversos tratamientos farmacológicos como antibacteriales,11 antivirales,10

anticancerígenos,12 antihelmínticos en la medicina veterinaria,13 etc. La potencia de

estos farmoquímicos son utilizados en el tratamiento de infecciones microbianas.16

Así, los bencimidazoles son compuestos muy eficaces en los tratamientos contra

diversas cepas de bacterias.14 Debido a la similitud estructural con las purinas, la

actividad antibacteriana de los bencimidazoles son explicados por su competencia

con las purinas, teniendo como resultando la inhibición de la síntesis de los ácidos

nucleícos y proteínas en bacterias.15 Los bencimidazoles aril ó heteroaril 2-

sustituidos, son considerados bioisósteros estructurales de nucleótidos, que podrían

interaccionar con los biopolímeros y tener actividad farmacológica posiblemente con

menos efectos secundarios.15

1.2.-Mycobacterium tuberculosis

El agente causal de la tuberculosis es Mycobacterium tuberculosis, fue descrito en

1882 por Robert Koch,17 esta bacteria es de forma bacilar pequeño con forma de

bastón delgado, presenta una capa serosa externa, es un bacilo aerobio, inmóvil,

que mide de 0,8 a 4 micras de longitud y no forma esporas; su temperatura óptima

de crecimiento es de 34-37 ºC, es resistente al frío y a la desecación. La tuberculosis

es una enfermedad respiratoria de transmisión que afecta a casi el 32% de la

población mundial, más que cualquier otra enfermedad infecciosa.18 La transmisión

de los bacilos de la tuberculosis se produce casi exclusivamente por medio de los

núcleos suspendidos en pequeñas gotas de saliva que son expulsadas con la

expectoración de las personas afectadas por tuberculosis pulmonar.19 Los bacilos

inhalados se alojan en los espacios de la terminal aérea del pulmón donde entran y

se replican dentro de los macrófagos alveolares.17 La infección inicial o primaria, por

M. tuberculosis consiste en la replicación del microorganismo en el lugar inicial de la

infección pulmonar pudiendo diseminarse a los ganglios linfáticos dentro del pulmón

y de ahí diseminarse a sitios remotos del cuerpo. La infección primaria es casi

siempre asintomática en adultos.20, 21



M. tuberculosis es la bacteria más destacada entre los patógenos por su capacidad

para establecer y mantener un estado de latencia, período durante el cual la persona

infectada no tiene tuberculosis clínicamente aparente, pero alberga organismos

viables de M. tuberculosis que pueden reactivarse en una fecha posterior.22 La

reactivación de la infección latente por M. tuberculosis suele ocurrir en personas

aparentemente sanas, y con mucha frecuencia en las personas con supresión del

sistema inmunitario, como sucede en el síndrome de inmunodeficiencia adquirida

(SIDA) o en la diabetes, 23 etc.

1.2.1 Etiología

La tuberculosis por Mycobacterium tuberculosis es una de las causas globales de

muertes, responsable de 9.4 millones de casos en el 2009 y resultaron 1.6 millones

de muertes.24 En Latinoamérica, aproximadamente 253,000 casos nuevos de

tuberculosis se registraron en 2010, de los cuales 19000 fueron reportados en

México.25 De acuerdo a la organización mundial de la salud en 2011 se estimaron

8.7 millones de nuevos casos y 1.4 millones de muertes.26

Además, personas en el mundo están contrayendo la tuberculosis debido a que sus

sistemas inmunológicos están comprometidos por los fármacos inmunosupresores,

abuso de sustancias, o el SIDA.23 La distribución de la tuberculosis no es uniforme

en todo mundo, así, la población de países asiáticos y africanos dan resultado

positivo en las pruebas de tuberculina aproximadamente el 80%, mientras que sólo

el 5-10% de la población de los EE.UU dan la prueba positiva.27

La aparición de esta enfermedad está relacionada con la falta de higiene, la

densidad de población, la mala nutrición y bajos recursos.28



1.2.2 Tratamiento El tratamiento de la tuberculosis requiere varios antibióticos durante por lo menos

seis meses,30 y la administración de medicamentos de segunda línea hasta 2 años,29

lo cual causa un elevado grado de incumplimiento. Esta situación favorece la

aparición de cepas clínicas resistentes a una o más drogas.30 El tratamiento de

Mycobacterium tuberculosis es prolongado y requiere combinar varios fármacos, ya

que existen poblaciones de bacilos diferentes en cuanto a su actividad metabólica

puesto que tienen lugar mutaciones cromosómicas espontáneas que producen

resistencia.31

Fármacos empleados en el tratamiento contra M. tuberculosis

El éxito del tratamiento se basa en la asociación de fármacos de primera línea.31

N

NH

O

NH2

IsoniazidaN

NNH2

O

Pirazinamida

HOH2CHN

C2H5

NH

CH2OH

C2H5

Etambutol

OO

NH

HO

HO

HO

CH3

OHO

CH3HO

O

OH

OH

N

HO

N

NH2

H2NNH2

H2NEstreptomicinaOH

NHOH

O

H3COH

N

O

NN

CH3

OCH3

CH3

OH

CH3

HO

O

O

OH3C

O

CH3

H3CCH3

Rifampicina

Figura 2. Estructura química de los medicamentos antituberculosos de primera línea: Isoniazida,

Rifampicina, Pirazinamida, Etambutol y Estreptomicina. 32



Todos actúan sobre la síntesis de ácidos grasos complejos de las micobacterias,

excepto la rifampicina que es un inhibidor de RNA polimerasas de células

procariotas y la estreptomicina que es un inhibidor de la síntesis de proteínas.33

Rifampicina (RIF); es un potente inhibidor de la síntesis de RNA mensajero (ARNm)

y, por tanto, de la transcripción genética, al unirse a la polimerasa de ARN

dependiente de ADN de las células procariotas. La inhibición de la transcripción

tiene lugar porque la RIF se fija a la subunidad β. Tiene un efecto bactericida sobre

las células de M. tuberculosis metabólicamente activas. La RIF, en combinación con

la pirazinamida (PZA) en los esquemas terapéuticos, ha permitido acortar el

tratamiento de la tuberculosis no complicada a 6 meses.31, 32

La Pirazinamida (PZA); posee un potente efecto esterilizante sobre los bacilos

tuberculosos latentes en el interior de los macrófagos, cuando se usa asociada a la

RIF permite acortar la duración del tratamiento de la tuberculosis no complicada a 6

meses. No obstante, carece de actividad frente a las demás micobacterias,

incluyendo otros componentes del complejo tuberculosis.34 Es fundamentalmente

bacteriostático aunque también puede actuar como bactericida. Se desconoce su

mecanismo de acción pero se sabe que actúa mejor en los bacilos que se

encuentran dentro de macrófagos en medio ácido. Interrumpe la membrana

plasmática y altera el metabolismo energético.35

La Isoniacida (INH) inhibe una serie de enzimas que las micobacterias necesitan

para sintetizar ácidos micólicos impidiendo la formación de la pared bacteriana. Sin

embargo, se desconoce el mecanismo exacto de su acción.36 La Isoniazida es

bactericida o bacteriostática dependiendo de la concentración del fármaco en el

lugar infectado y de la susceptibilidad del microorganismo.37 La Isoniazida es

bactericida frente a microorganismos en fase de división rápida como los que se

encuentran extracelularmente en las lesiones cavitarias y bacteriostático frente a los

que se encuentran en fase de división lenta como los que se están en los

macrófagos. Frente a estos, la rifampina o la pirazinamida son más efectivos.38


http://www.ecured.cu/index.php?title=%C3%81cido_mic%C3%B3tico&action=edit&redlink=1


El Etambutol (ETB) es un bacteriostático, aunque también muestra efectos

bactericidas si las concentraciones son lo suficientemente elevadas. Actúa

inhibiendo la transferencia de los ácidos micólicos a la pared celular e inhibe la

síntesis de arabinogalactano, un polisacárido clave en la estructura de la pared

celular de las micobacterias y en donde se forman las moléculas de ácido micólico.39

La Estreptomicina (STR); es un antibiótico aminoglucósido que interfiere en la

síntesis proteica bloqueando la traducción del ARNm tanto en su inicio como en la

incorporación de nuevos aminoácidos a la cadena polipeptídica.39

Los fármacos de segunda línea (figura 3) se clasifican de acuerdo con su

actividad.40, 31

bactericida; los aminoglucósidos (amikasina/kanamicina).

bactericida baja; fluoroquinolonas (ciprobloxacina, afloxacina).

bacteriostático; cicloserina, etionamida, acido para-aminosalicílico.

HN

O

O

NH2

CicloserinaN

CH3

S NH2

Etionamida

F

N

NH

N

O

OH

O

Ciprofloxacina

OHH2N

OH

O

Ácido p-amino salicílico

HN

O

ONH2

O

H2N

OH

O

O

OHHO

OH

OH

NH2

OH

H2NOH

Amikacina

Figura 3. Estructura química de algunos medicamentos antituberculosos de segunda línea:

cicloserina, etionamida ácido p-amino salicílico, ciprofloxacino, amikacina.31



2.- JUSTIFICACIÓN

En la actualidad, la tuberculosis cobra la vida de aproximadamente dos millones de

personas cada año y es una enfermedad que causa un alto número de muertes en el

mundo. Las estadísticas recientes de la organización mundial de la salud estiman

que hay aproximadamente 8.4 millones de casos nuevos cada año con una tasa de

mortalidad global de 23% o aproximadamente 2 millones de muertes al año.

Además, los tratamientos de la tuberculosis son de periodo largo (seis meses o

más), por lo que mucha gente no llega a concluirlos.

Como consecuencia, han aumentado las cepas multidrogo-resitentes y cepas

extremadamente resistentes de Mycobacterium tuberculosis. Aunado a esto, también

se ha observado el resurgimiento de la tuberculosis en individuos inmunosuprimidos

e infectados por VIH o enfermos con diabetes.

Por estos motivos existe la necesidad urgente de buscar nuevos fármacos que

contribuyan al control y a la erradicación de la enfermedad. Diversas son las fuentes

para la obtención de nuevos compuestos: extracción de fuentes naturales y por

síntesis química. En el presente trabajo se planteó la preparación de compuestos

químicos y el estudio de la actividad contra Mycobacterium tuberculosis.



3.- OBJETIVOS

3.1.- Objetivo general

Sintetizar bencimidazoles disustituidos y trisustituidos mediante la

condensación de 4-cloro-1,2-fenilendiamina con aldehídos aromáticos y

heteroaromáticos y determinar su potencial actividad sobre Mycobacterium

tuberculosis.

3.2.- Objetivos particulares

Sintetizar el 2-(3’-nitrofenil)-5(6)-cloro bencimidazol como una mezcla de

tautómeros en equilibrio dinámico.

Sintetizar el 2-(piridin-2’-il)-5(6)-cloro bencimidazol como una mezcla de

tautómeros en equilibrio dinámico.

Sintetizar el 1-(Tien-2’-il) metil)-2-(tien-2’-il) bencimidazol como una mezcla de

regioisómeros.

Sintetizar el 1-hexadecil-2-(3’-nitrofenil)-5(6)-cloro bencimidazol como una

mezcla de regioisómeros.

Evaluar la potencial actividad antimicobacteriana de los bencimidazoles

preparados usando como indicador Alamar azul en el ensayo colorimétrico.



4.-HIPOTESIS

Los bencimidazoles disustituidos y trisustituidos tienen actividad biológica sobre

cepas de Mycobacterium tuberculosis.



5.-METODOLOGÍA

Material y métodos

Los reactivos y disolventes utilizados fueron grado reactivo y en algunas ocasiones

las materias primas fueron sintetizadas y purificadas por métodos usuales como

cromatografía en columna. Los disolventes fueron purificados por destilación

fraccionada, previo tratamiento de los mismos como se indica: Acetato de Etilo (3%

en peso NaHCO3 y calentamiento a reflujo durante 3h), Hexano (3% en peso de CaO

y calentamiento a reflujo durante 4h), CH2Cl2 (3% en peso de CaCl2 y calentamiento

a reflujo durante 2h), Acetonitrilo Seco (3% de P2O5 y agitación a temperatura

ambiente durante 24h).

El progreso de las reacciones fue seguido por cromatografía en capa fina (ccf)

usando cromatofolios de gel de sílice 60 con indicador fluorescente F254. Las

cromatoplacas fueron observadas con una lámpara de luz ultravioleta MODEL UVG-

11, MINERALIGHT LAMP con 115 volts, 60 Hz, 0.16 amperes y 254 nm. Las

mezclas de reacción fueron separadas por cromatografía en columna usando gel de

sílice 60 (0.003-0.200mm) HERKC KGA/64271.

Los puntos de fusión fueron determinados en un aparato ELECTROTHERMAL

A29003MB. Los espectros de resonancia magnética nuclear de protón (RMN1H) y

carbono (RMN13C) fueron obtenidos de espectrofotómetro Varian mercury 500 con

una radiofrecuencia de 300 y 500 MHz para RMN 1H y 125 MHz para RMN 13C,

Varian Gemini 200 y Varian Eclipse 300. Fueron disueltas en dimetilsulfóxido

deuterado (DMSO-d6), cloroformo deuterado (CDCl3). La referencia interna fue

tetrametilsilano (TMS).

Los espectros de masas fueron obtenidos del equipo Jeol JMS-AX505HA, utilizando

impacto electrónico directo con voltaje de ionización de 70 Ev. Los espectros de

infrarrojo (IR, pastilla de KBr) se obtuvieron de un espectrofotómetro FT-IR Perkin

Elmer 1605 y FT-IR Nicolet Magna 750.



Obtención de bencimidazoles disustituidos y trisustituidos

Las síntesis de los compuestos 2-(3´-nitrofenil)-5(6)-cloro bencimidazol 4a, 2-(piridin-

2’-il)-5(6)-cloro bencimidazol 4b, 1-hexadecil-2-(3´-nitrofenil)-5(6)-cloro bencimidazol

5a, se realizó como se muestra en el esquema 1.

Esquema 5: Síntesis de bencimidazoles disustituidos (4a, 4b) y trisustuido (5a) a partir de 2-nitro-4-

cloroanilina 1 con los aldehídos aromáticos 3.

Así, la 4-cloro-2-nitroanilina 1 se hizo reaccionar con ditionito de sodio en medio

acuoso y calentamiento a reflujo (alrededor de 2 a 4 horas) para reducir el grupo

nitro y obtener la 4-cloro-1,2-fenilendiamina 2, la cual sin purificar fue condensada

con meta-nitrobenzaldheído 3a o el 2-piridincarboxaldehido 3b promoviendo la

reacción con bentonita activada como catalizador heterogéneo en acetonitrilo seco y

agitación a temperatura ambiente y aire como agente oxidante para formar el

bencimidazol disustituido: 2-(3´-nitrofenil)-5(6)-cloro bencimidazol 4a y el 2-(piridin-2’-

il)-5(6)-cloro bencimidazol 4b. Finalmente el compuesto disustituido 4a se hizo

reaccionar con metasulfonato de hexadecilo 7 en medio básico y calentamiento a

reflujo para obtener el bencimidazol trisustituido, 1-hexadecil-2-(3´-nitrofenil)-5(6)

cloro bencimidazol 5a.



A continuación se describen los procedimientos para realizar la síntesis de cada uno

de los compuestos.

5.1.- Síntesis de (2-(3´-nitrofenil)-5(6)-cloro bencimidazol 4a

Cl NO2

NH2

Na2S2SO4

H2O, Reflujo

1

Cl NH2

NH2

2

CH3CN Anh., bentonitat.a.

HO

3a

4a

NO2

NH

NClNO2

3a4

5

67

7a

2´

4´

5´6´

Esquema 6: Síntesis de (2-(3´-nitrofenil)-5(6)-cloro bencimidazol 4a a partir de la 4-cloro-2-nitroanilina

1 y meta-nitrobenzaldehido 3a.

Procedimiento:

En un matraz balón se colocaron: 0.50 g (2.90 mmoles) de 4-cloro-2-nitroanilina 1, 2.02g (11.60 mmoles, 4 equivalentes molar) de ditionito de sodio (Na2S2SO4) y se

suspendieron en 5 mL de agua. La mezcla de reacción se colocó a reflujo con

agitación magnética vigorosa durante 2 horas aproximadamente. La mezcla de

reacción cambió de color amarilla a café oscuro. El avance de reacción se monitoreó

por cromatografía en capa fina (ccf) usando como fase móvil un sistema

AcOEt/Hexano 1:3, las cromatoplacas se observaron con lámpara luz UV.

Posteriormente se realizó una extracción líquido-líquido AcOEt/H2O (3x20 mL). Se

juntaron los extractos orgánicos, se secaron (Na2SO4 anhidro), filtraron y el

disolvente se evaporó a presión reducida. Al extracto obtenido se agregó 0.35 g

(2.26 mmoles, 0.9 equivalente molar) de 3a y 0.34 g de bentonita activada. Se

suspendieron en acetonitrilo (15 mL) y se agitaron a temperatura ambiente durante 4

horas, aproximadamente. Cuando se observó el término de la reacción, la mezcla de

reacción se filtró al vacío y se lavó muy bien el filtro con acetona y volvió a filtrarse

por gravedad, el disolvente se evaporó a presión reducida. El producto crudo 4a se

purificó por cromatografía en columna usando como fase móvil: AcOEt/hexano 5:95

(100 mL) y AcOEt/hexano 40:60 (100 mL). Las fracciones que contenían al

compuesto 4a se juntaron y el disolvente se evaporó a presión reducida. Se obtuvo



4a como un sólido amarillo crema. Rendimiento de 64 % (0.5055 g) y p.f. 210 °C

(Lit.20 pf 208 oC). Rf 0.45 (AcOEt/hexano). IR (KBr): 3322 (N-H), 1513 (NO2) cm-1.

RMN1H δ: 13.4 (sa, 1H, NH), 8.9 (t, 1H, J=1.2 Hz, H2’), 8.5 (dt, 1H, J=7.8, 1.2 Hz,

H6’), 8.3 (dt, 1H, J=7.8, 1.2 Hz, H4’), 7.8 (t, 1H, J=7.8 Hz, H5’), 7.6 (t, 2H, J=8.4 Hz,

H4, H7), 7.2 (dd, 1H, J=8.4, 2.1 Hz, H6). RMN 13C δ: 151.1, 149.0, 133.2, 131.9,

131.4, 125.2, 123.6, 121.6. MS (m/z, %): 275 (M++2, 33), 273 (M+, 100), 243 (M+-NO,

4), 227 (M+-NO2, 45), 192 (M+-NO2 y Cl, 30).

5.2.- Síntesis de 2-(piridin-2’-il)-5(6)-cloro bencimidazol 4b

Cl NO2

NH2

Na2S2SO4

H2O, Reflujo

1

Cl NH2

NH2

2

CH3CN Anh., bentonitat.a.

HO

3b N

4b

NH

NCl

N

3a4

5

67

7a

2´

4´

5´

6´

3´

Esquema 7: 2-(piridin-2’-il)-5(6)-cloro bencimidazol 4b a partir de la 4-cloro-2-nitroanilina 1 y 2-

piridincarboxaldheído 3b.

Procedimiento:

En un matraz balón se adicionan 0.5 g (2.90 mmoles, 1 equivalente molar) de la 4-

cloro-2-nitroanilina 1 y 5.05 g (29.07 mmoles, 10 equivalentes molar) de ditionito de

sodio (Na2S2SO4), se suspendieron en 20 ml de agua y se calentó a reflujo

aproximadamente 6 horas con agitación vigorosa. Se observa un cambio de color

amarillo a café marrón oscuro. La reacción se monitoreó por ccf en un sistema

AcOEt/hexano 1:2. Posteriormente se pasó a un embudo de separación y se realizó

una extracción líquido-líquido AcOEt/H2O (3X20). Se reunieron las fases orgánicas y

se secaron con sulfato de sodio anhidro, se filtró a presión reducida, posteriormente

el disolvente se evaporó a presión reducida. Al producto obtenido se le adicionó el 2-

piridincarboxaldehído 3b (0.26 mL, 2.80 mmoles, 0.8 equivalentes molar) de

(densidad 1.12 g/mL) y 0.34 g de bentonita activada, se suspendieron con la mínima

cantidad de acetonitrilo (4 mL) y se dejó en agitación a temperatura ambiente



aproximadamente 24 horas. La reacción se monitoreó por ccf sistema AcOEt/hexano

1:3, observando el compuesto 4b en la cromatoplaca como una mancha morada

fluorescente con la lámpara UV. Se filtró la mezcla de reacción al vacío lavando el

filtro con acetona y después se evaporó el disolvente al vacío. El producto de

reacción obtenido se purificó por cromatografía en columna, usando como fase

móvil: AcOEt/hexano 10/90, se obtuvo un líquido viscoso marrón con un rendimiento

de 25%. Rf 0.19 (AcOEt/hexano). RMN1H δ: 13.2 (sa, 1H, NH), 8.7 (m, 1H, H3’), 8.5

(d, 1H, J=7.9 Hz, H4’), 8.0 (t, 1H, J=1.9 Hz, H6’), 7.8 (m, 1H, H4), 7.6 (m,1H, H6), 7.5

(t, 1H, J=6 Hz, H5’), 7.3 (d, 1H, J=8 Hz, H7). RMN 13C δ: 167, 166.5, 144.5, 144, 141,

129.5, 129, 128.6, 128.3, 125.1.

5. 3.- Síntesis de 2-(tien-2’-il) bencimidazol 4c

NH2

NH2

SCHO

CH3CN Anh, bentonitaagitacion, t.a

2´

NH

N S+

3c

4c

N

N S

S

4

5

67

7a

3a

3"

4"

5"

3´4´

5´

5b

Esquema 8: Síntesis de 2-(tien-2’-il) bencimidazol 4c y 1-[(Tien-2’-il) metil]-2-(tien-2’-il) bencimidazol

5b

Procedimiento:

El bencimidazol 4c se preparó de acuerdo el procedimiento general usando las

cantidades de reactivos siguientes: o-fenilendiamina 2´ (434 mg, 4,02 mmol), 2-

tiofencarboxaldehido 3c (500 mg, 4,46 mmol), bentonita (500 mg) y acetonitrilo

anhidro (15mL). El producto obtenido se purificó por cromatografía en columna,

usando como fase móvil acetato de etilo/hexano (30:70). Se obtuvo un sólido amorfo

beige en 63 % de rendimiento; p.f. 333-334 ºC (Lit. 21 Pf 330-332 °C). IR (KBr):

3431 (NH), 1621 (N=C) cm-1. RMN 1H (200 MHz, Acetona-d6) δ: 7.82 (dd, 1H, J=3.6

y 1.2 Hz, H3’), 7.65 (dd, 1H, J=4.8 y 1,2 Hz, H5’), 7.56 (m, 2H, H4 y H7), 7.20 (m,

3H, H5, H6 H4’). RMN 13C (50 MHz, Acetona-d6) δ: 148.1, 147.7, 1351, 129.0,

128.8, 127.0, 123.1, 115.8.



Adicionalmente se obtuvo el bencimidazol 5b, como un sólido amorfo de color café

en 23% rendimiento; p.f. 120-123 ºC (Lit. 22 pf 124-128 °C). IR (KBr): 1611 (N=C)

cm-1. RMN 1H (200 MHz, CdCl3) δ: 7.83 (m, 1H, H4), 7.50 (m, 2H, H5’ y H3’), 7.29

(m, 4H, H6, H7, H5’ y H4’), 7.14 (dd, 1H, J=5 y 3.6 Hz, H5’’), 7.94 (dd, 1H, J=5 y 3.6

Hz, H3’’), 6.86 (m, 1H, H4’’), 5.70 (s, 2H, CH2). RMN 13C (50 MHz, CdCl3) δ: 147.5,

142.7, 138.7, 135.8, 133.8, 131.6, 128.9, 128.1, 127.9, 127.2, 125.5, 125.4, 123.3,

123.0, 119.8, 44.1.

5.4.- Síntesis del metasulfonato de hexadecilo 7

OH14CH3SO2Cl

CH2Cl2/Et3N/K2CO30°C, 24 hr.

O14S

O

O

CH3

6 7

Esquema 9: Síntesis de metasulfonato de hexadecilo 7 a partir de alcohol cetílico 6 y cloruro de

metánsulfunilo.

Procedimiento:

Se pesaron 5 g (2.06 mmoles) de alcohol cetílico 6 y se disolvió con diclorometano

seco (10 mL). Posteriormente se adicionó 1.4 mL (13.83 mmoles, 1.04 g, 0.5

equivalentes molar) de trietanolamina (Et3N), (densidad 0.72 g/mL) y 2.84g (20.54

mmoles, 1 equivalente molar) de carbonato de potasio (K2CO3). La mezcla de

reacción se enfrió con hielo y se agitó magnéticamente. Enseguida 1.95 mL (25.23

mmoles, 1.2 equivalentes molar) del cloruro de mecilo (CH3SO2Cl) se adicionaron

durante 10 minutos. Terminando la adición se tapó el matraz balón y se dejó en

baño de hielo durante 24 horas bajo agitación magnética. Después de evaporar el

disolvente se obtuvo un producto cristalino que se dejó secar 24 horas.

Posteriormente se realizó una extracción líquido-líquido de agua/hexano (3x20 mL).

Se juntaron las fases orgánicas, se secaron (Na2SO4 anhidro), se filtró a gravedad,

seguido de evaporación del disolvente a presión reducida. Se obtuvo 7 como un

sólido blanco cristalino con un punto de fusión de 45 °C, un rendimiento de 79.99 %



(5.29 g). Las propiedades espectroscópicas son consistentes con los de la

literatura.41

5.5.- Síntesis del 1-hexadecil-2-(3´-nitrofenil)-5(6)-cloro bencimidazol 5a.

Cl

N

NNO2

H

O14S

O

O CH3

NaHCO3, CH3CN anhReflujo 120°C 17 hrs

N

N

N

N

Cl

ClNO2

15

NO2

154a

5a

5a´

2´

4´

5´6´

4

67

7a

3a

7

Esquema 10: Síntesis del 1-hexadecil-2-(3´-nitrofenil)-5(6)-cloro bencimidazol (5a, 5a’) a partir de 4a

y metansulfonato de hexadecilo 7

Procedimiento:

En un matraz balón se colocó el bencimidazol 4a 0.11 g (0.42 mmoles) y bicarbonato

de sodio (NaHCO3) (0.08 g, 0.98 mmoles, 2 equivalentes molar) y se suspendieron

en acetonitrilo anhidro (20 mL) y se agitaron a temperatura ambiente durante 30

minutos. Transcurrido este tiempo se adicionó el metasulfonato de hexadecilo 7 (0.16g, 0.51 mmoles 1.2 equivalente molar) y se calentó a reflujo durante 17 horas.

El avance de reacción se monitoreó por ccf eluyendo 1 vez con el sistema

AcOEt/hexano 1:3 y se observó la cromatoplaca con una lámpara UV. Terminada la

reacción se quitó el reflujo y el disolvente se evaporó bajo presión reducida. El crudo

de reacción obtenido se repartió en hexano/agua (60x20 mL).Se reunieron las fases

orgánicas, se secaron (Na2SO4 anhidro), se filtraron por gravedad y el filtrado de

color guinda claro se evaporó a presión reducida. El producto obtenido se cargó en

una columna cromatográfica de gel de sílice 60 (0.063-0.200 mm) con el propósito

de separar la mezcla de regioisómeros eluyendo la columna con AcOEt/hexano

10:90. Los eluatos fueron monitoreados por ccf utilizando el sistema AcOEt/hexano

18



1:3. Se obtuvo 5a como un sólido-viscoso guinda, Rf 0.4186 Rendimiento 18 %

(0.03g). RMN1H δ: 8.53 (s, 1H, H2’), 8.38 (d, 1H, J=8 Hz, H4’), 8.22 (d, 1H, J=7.5 Hz,

H6’), 7.8 (t, 1H, J=8 Hz, H5’), 7.73 (s, 1H, H4), 7.68 (d, 1H, J=8.5 Hz, H6), 7.3 (d, 1H,

J= 8.5 Hz, H7) 4.1 (t, 2H, J=10 y 5 Hz, -H2CN), 1.2 (m, 28H, 14 CH2), 0.8 (t, 3H, J=5

Hz, -CH3). RMN 13C δ: 152.4, 148.4, 143.75, 135.7, 135.08, 135.04, 131.05, 127.3,

125, 124, 123.5, 119.3, 113, 70.8, 33, 31.5, 30.2, 29.3, 29.3, 29.17, 28.97, 28.93,

28.91, 28.7, 26.2, 25.96, 25.34, 22. 53, 14.3.

5.6.- Microensayo Fluorométrico empleando como indicador alamar azul

Se utilizó el microensayo fluorométrico del alamar azul para la evaluación de la

actividad antimicobacteriana de los compuestos: 2-(3´-nitrofenil)-5(6)-cloro

bencimidazol 4a, 2-(piridin-2’-il)-5(6)-cloro bencimidazol 4b, 1-hexadecil-2-(3´-

nitrofenil)-5(6)-cloro bencimidazol 5a y 1-(tien-2’-il)metil]-2-(tien-2’-il)bencimidazol 5b.

Es un método desarrollado para determinar la actividad antimicobacteriana de

fármacos. El ensayo se realiza en una microplaca de cultivo de 96 pozos que ofrece

las ventajas de la miniaturización con el consecuente ahorro de reactivos,

compuestos a probar, tiempo de obtención de resultados y se basa en la utilización

del colorante alamar azul.42

El alamar azul es un indicador de óxido-reducción que bajo un ambiente de

crecimiento bacteriano cambia de su forma oxidada a su forma reducida (figura 4).

Este indicador cambia de color azul (no fluorescente) cuando está en su estado

oxidado a rosa intenso (fluorescente) frente a un ambiente reductor como el

generado durante el metabolismo celular, el cambio de color puede detectarse

visualmente. Esta propiedad ha sido utilizada para medir la viabilidad de

Mycobacterium tuberculosis luego de la exposición a las drogas antituberculosas. Es

un método simple, rápido y de bajo costo que no requiere de un equipamiento

especial para su utilización.44, 48, 49

19



Figura 4. Conversión de resazurina a resofurina por células viables.43

Procedimiento:

Todo el proceso desde la disolución de los compuestos y la manipulación de las

cepas de trabajo y aislados clínicos se realizaron en un gabinete de bioseguridad

nivel II. Al igual que el desarrollo de los ensayos de actividad in vitro, se utilizó el

equipo de protección adecuado como, mascarilla con filtro N95, guantes de látex,

bata y Fenol 5% o benzal para el desecho de material contaminado.

a) preparación de la suspensión bacteriana de trabajo

Se tomó una alícuota de cultivo de M. tuberculosis en fase log (2-5 semanas) y se

transfirió a un tubo con tapón de rosca de 13x100 mm. Se ajustó la suspensión al

tubo No.1 del nefelómetro de McFarland con medio Middlebrook 7H9. El cual se

rotuló como suspensión A. De la suspensión A se realizó una dilución 1:10 con el

medio Middlebrook 7H9 sin tween 80. Por cada placa a ensayar, se prepararon 11

ml de la dilución (suspensión de trabajo B) la cual se realizó en una caja Petri de

60x100.

20

(Azul) (Rosa)



b) Preparación de las soluciones de trabajo de los compuestos de estudio.

En microtubos estériles, se prepararon las disoluciones en DMSO (dimetilsulfóxido)

de los compuestos sintetizados. Los compuestos puros se prepararon a una

concentración de 10 mg/mL. La solución de trabajo se preparó a una concentración

4 veces mayor a la máxima a ensayar en el estudio y que para el caso de los

compuestos puros fue de 200 µg/mL (50 µg x 4). Esta solución se preparó en el

medio Middlebrook 7H9 con OADC y sin tween.

c) Preparación de la microplaca

Se utilizaron placas de 96 pozos, nuevas, en el momento de uso se retiraron de su

empaque y se marcaron adecuadamente. Los pozos de la periferia se dejaron

intactos, y a los 60 pozos restantes se les adicionaron 100 µL medio Mlddlebrook

7H9 con OADC (ácido oleico-albumina-dextrosa-catalasa) sin tween. Se adicionaron

100 µL de la solución de trabajo del compuesto a ensayar, en el pozo que inicia cada

columna de trabajo. Una vez que se agregó la solución de trabajo a los pozos

correspondientes, se realizaron las diluciones seriadas 1:2 a 1:32, mezclando

perfectamente el contenido del primer pozo y posteriormente tomando 100 µL del

mismo y transferirlos al siguiente conjunto de pozos. Se repitió el procedimiento

hasta completar la dilución seriada requerida tomando en cuenta que se eliminaron

los 100 µL de la última dilución realizada de cada compuesto. Una vez realizadas las

diluciones seriadas, se adicionaron 100 µL de la suspensión bacteriana B a cada

pozo con los compuestos diluidos. Una vez que se prepararon los pozos de ensayo

de compuestos, se procedió a preparar los controles del ensayo, los cuales fueron

de tres tipos: el control C se preparó con 100 µL de medio y 100 µL de la suspensión

bacteriana B; el control D se preparó con 90 µL de medio y 10µL de la suspensión

bacteriana B (control de 10% de crecimiento); y el control U conteniendo 98 µL de

medio y 2µL de la suspensión B (control de 2 % de crecimiento). En los pozos de la

periferia se colocaron 200 µL de agua destilada estéril; la placa se cubrió con su

tapa y se aseguró con cinta tipo masking tape. Para evitar la desecación, la placa se

introdujo en una bolsa de plástico y se incubó 5 días A 37 ºC.

21



d) Revelado de la microplaca

Transcurrido el tiempo de incubación, se observó el crecimiento bacteriano en un

microscopio invertido para determinar si en los controles se presentaba suficiente

crecimiento bacteriano. Se adicionaron 20 µL del colorante alamar azul a cada pozo

de ensayo de compuestos y controles. Se permitió la incubación de la microplaca

durante 24 h a 37 °C, y transcurrido este tiempo, los controles del 100% deberán

presentar un color rosa intenso, mientras que los controles del 10 y 2% debieron

permanecer azules.

e) Interpretación

Se realizó la interpretación visual de la placa, considerando la concentración mínima

inhibitoria (MIC) a aquella concentración correspondiente al último pozo que

permaneció azul y cuya intensidad de color fue igual o menor a la obtenida en el

control del 10%.

22



NH

NO2

6.- ANÁLISIS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS

Síntesis de (2-(3´-nitrofenil)-5(6)-cloro bencimidazol

El compuesto 2-(3´-nitrofenil)-5(6)-cloro bencimidazol 4a (Figura 5) se obtuvo como

un sólido amarillo con un rendimiento del 64% y p.f. de 210°C (Lit20 pf 208 oC).

NH

NCl

NO24

6

5

77a

3a2´

4´

5´6´

3´

Figura 5: (2-(3´-nitrofenil)-5(6)-cloro bencimidazol 4a

El espectro infrarrojo del compuesto 4a mostró la banda de absorción intensa de

estiramiento del enlace N-H en 3322 cm-1 y otra en 1513 cm-1 debida al grupo NO2

(figura 6).

Figura 6. Espectro infrarrojo (IR) del compuesto 2-(3´-nitrofenil)-5(6)-cloro bencimidazol 4a.

NH

NCl

NO2



En el espectro de resonancia magnética nuclear de protones del compuesto 4a

mostró una señal ancha en δ 13.42 para el protón del imidazol (NH), en δ 8.9 se

observó una señal triple que integra para un protón y constante de acoplamiento 1.2

Hz que fue asignada al hidrógeno H2’, los hidrógenos H6’ y H4’ dieron señales triples

dobleteadas en δ 8.5 y δ 8.3 respectivamente, ambas con constantes de

acopamiento de 7.8 y 1.2 Hz, mientras que los hidrógenos H5’ y H4 y H7 mostraron

señales triples, una en δ 7.8 y que integra para un protón y constante de

acoplamiento de 7.8 Hz asignada a H5´ y la otra en δ 7.6 que integra para dos

protones y constante de acoplamiento de 8.4 Hz, asignado a H4 y H7 y finalmente el

protón H6 resonó como una señal doble de doble en δ 7.2 con constantes de

acoplamiento de 8.4 y 1.2 Hz (Figura 7).

Figura 7. Espectro de resonancia magnética nuclear de protones (RMN 1H) para 2-(3´-nitrofenil)-5(6)-cloro bencimidazol 4a.

H1

H2’ H4’ H6’ H5’ H6

H7, H4

NH

NCl

H4

H6

H7

´H2 NO2

H5´´H6

H4´



En el espectro de resonancia magnética nuclear de carbono trece del compuesto 4a

mostró las siguientes señales en δ: 151.1, 149.0, 133.2, 131.9, 131.4, 125.2, 123.6,

121.6 (Figura 8).

Figura 8. Espectro de resonancia magnética nuclear de 13C para 2-(3´-nitrofenil)-5(6)-cloro bencimidazol 4a.

En el espectro de masas MS (m/z, %), se observaron los principales fragmentos

siguientes: 275 (M++2, 33), 273 (M+, 100), 243 (M+-NO, 4), 227 (M+-NO2, 45), 192

(M+-NO2 y Cl, 30) (Figura 9).

Figura 9. Espectro de masas (EM) (m/z, %) para 2-(3´-nitrofenil)-5(6)-cloro bencimidazol 4a.

C2’

C5’

C4’ C7, C4

C6’ C-NO2

C6 NH

NCl

NO24

6

5

77a

3a2´

4´

5´6´

3´

2 1´

NH

NCl

NO2



Síntesis del 1-[(tien-2’-il) metil]-2-(tien-2’-il) bencimidazol

El compuesto 1-[(tien-2’-il) metil]-2-(tien-2’-il) bencimidazol 5b (figura 10) se obtuvo

como sólido amorfo café y 23% de rendimiento; p.f. 120-123 ºC (Lit47.pf 124-128 °C).

N

N S

S

4

5

67

7a

3a

3"

4"

5"

3´4´

5´

Figura 10: 1-[(tien-2’-il) metil]-2-(tien-2’-il) bencimidazol 5b

En espectroscopia IR del compuesto 5b mostró una banda de absorción en 1611cm-1 para el grupo N=C (Figura 11).

Figura 11. Espectro infrarrojo del compuesto 1-(Tien-2’-il) metil-2-(tien-2’-il) bencimidazol 5b

26

C=N N

N S

S



H4

H6, H7, H5, H4’

H5’, H3’ H5” H4”, H3”

CH2-N

En espectroscopia RMN 1H se observan las siguientes señales : una señal múltiple

en δ: 7.83 que integra para un protón atribuida a H4, otra señal múltiple en δ: 7.50

que integra para dos protones siendo asignadas a H5’ y H3’, una señal múltiple en δ:

7.29 que integra para cuatro protones siendo atribuidas a H6, H7, H5 y H4’, una señal

doble de doble en δ: 7.14 J=5 y 3.6 Hz, que integra para un protón que fue asignada

a H5’’, otra señal doble de doble en δ: 7.94 J=5 y 3.6 Hz, que integra para un protón y

fue atribuida a H3’’, una señal múltiple en δ: 6.86 que integra para un protón y siendo

asignada a H4’’, y una señal simple en δ: 5.70 que integra para dos protones

atribuidos a CH2 (Figura 12).

Figura 12. Espectro de resonancia magnética nuclear de protones (RMN 1H) para 1-(Tien-2’-il) metil-2-(tien-2’-il) bencimidazol 5b

En espectroscopia RMN 13C el compuesto 5b mostró 16 señales δ: 147.5, 142.7,

138.7, 135.8, 133.8, 131.6, 128.9, 128.1, 127.9, 127.2, 125.5, 125.4, 123.3, 123.0,

119.8, 44.1 (Figura 13).

Figura 13. Espectro de resonancia magnética nuclear de 13C para 1-(tien-2’-il) metil-2-(tien-2’-il) bencimidazol 5b

C=N

C-ipso

CH2

C 4,5,7,3’,4’,5’,3”,4”,5” N

N S

S

4 5 6

7 7 a

3 a

3 " 4 "

5 "

3 ́ 4 ́

5 ́

27

N

N S

S

4 5 6

7 7 a

3 a

3 " 4 "

5 "

3 ́ 4 ́

5 ́

C = N



Síntesis del 1-hexadecil-2-(3´-nitrofenil)-5(6)-cloro bencimidazol

Se obtuvo 1-hexadecil-2-(3´-nitrofenil)-5(6) cloro bencimidazol 5a (figura 14) como un

sólido-viscoso guinda, Rf 0.4186 Rendimiento 18 % (0.03g).

N

N

CH2

CH3

Cl

NO2

14

45

6

3a

7a7

2'

4'

5'6'

Figura 14. 1-hexadecil-2-(3´-nitrofenil)-5(6) cloro bencimidazol 5a

En el espectro de resonancia magnética nuclear de protones del compuesto 5a

mostró señales de protones aromáticos y alifáticos. Así, en δ 8.53 se observó una

señal simple que integra para un protón y fue asignada al hidrógeno H2’, mientas que

los hidrógenos H4´ y H6´ dieron señales dobles en δ 8.38 y 8.22 que integran para un

protón respectivamente con una constante de acoplamiento de 8 Hz para H4´ y 7.5

Hz para H6´, el hidrógeno H5’ a δ 7.8 aparece como señal triple e integra para un

protón con una constante de acoplamiento de 8 Hz, el protón H4 a δ 7.73 aparece

como singulete y la señal doble de H6 se desplaza a δ 7.68 con una constante de

acoplamiento de 8.5 Hz, por otro lado el protón H7 muestra una señal doble a δ 7.3

que integra para un protón y una constante de acoplamiento de 8.5 Hz. A campo alto

se observaron los protones alifáticos. En δ: 4.1 se observó una señal triple que

integra para 2 protones correspondientes al CH2 que se encuentra unido en el

imidazol y que tiene una constante de acoplamiento de 10 y 5 Hz, los 28 protones de

los 14 metilenos (CH2) de la cadena hidrocarbonada resonaron en δ: 1.2 y como una

señal múltiple, mientras que el metilo (CH3) se mostró a δ: 0.8 como una señal triple

que integra para 3 protones y tiene una constante de acoplamiento de 5 Hz (Figura

15).



Figura 15. Espectro de resonancia magnética nuclear de protones (RMN 1H) para 1-hexadecil-2-(3´-nitrofenil)-5(6) cloro bencimidazol 5a.

En el espectro de resonancia magnética nuclear de carbono trece del compuesto 5a

mostró las siguientes señales en δ: 135.746,131.053, 124.936, 124.158, 123.504,

119.317, 112.998, 70.7895, 33. 0053, 31.5519, 30.2240, 29.3153, 29.2623, 29.1694,

28.9734, 28.9366, 28.9191, 28.6952, 26.1762, 25.9672, 25.3477, 22. 5336, 14.4841

(Figura 16).

Figura 16. Espectro de resonancia magnética nuclear de 13C para 1-hexadecil-2-(3´-nitrofenil)-5(6) cloro bencimidazol 5a

3.63.84.04.24.44.64.85.05.25.45.65.86.06.26.46.66.87.07.27.47.67.88.08.28.48.6f1 (ppm)

4.97

8.80

6.13

13.03

6.23

7.06

5.19

5.11

4.95

4.38

3.97

3.98

3.99

4.01

4.02

4.12

4.13

4.15

4.26

4.31

4.32

4.34

6.64

6.85

7.19

7.29

7.30

7.32

7.37

7.39

7.69

7.70

7.73

7.83

7.85

7.86

8.22

8.24

8.36

8.38

8.54

0.60.81.01.21.41.6f1 (ppm)

35.77

38.84

4.80

247.5

4

273.5

9

11.21

17.09

0.79

0.80

0.81

0.82

1.06

1.13

1.15

1.16

1.19

1.25

H2'

H4' H6'

H5'

H4, H6

H7

28H (14, CH2)

3H (CH3)

2H (CH2-N)

N

N

CH2

CH3

Cl

NO2

14

45

6

3a

7a7

2'

4'

5'6'

102030405060708090100110120130140150160170f1 (ppm)

14.30

14.48

22.53

25.34

25.96

28.97

29.16

29.35

29.41

29.44

29.47

29.51

29.57

31.75

33.00

36.97

39.63

39.80

39.97

40.14

40.30

60.14

61.16

70.78

113.0

0

119.2

712

3.48

124.1

412

4.92

127.2

513

1.03

135.7

2

143.7

0

148.3

7

170.6

4

115120125130135140145150f1 (ppm)

113.0

0

119.2

7

123.4

812

4.14

124.9

2

127.2

5

131.0

3

135.7

2

143.7

0

148.3

7

152.3

7

C=N C3-NO2 C5-Cl

C6´ C5´ C6 C4 C2´

CH2N

C (28H)

CH3

C4´ C7

N

N

CH2

CH3

Cl

NO2

14

45

6

3a

7a7

2'

4'

5'6'



En el espectro de masas MS (m/z, %) 461 (M-HCl, 5), 415 (M-HCl+NO2, 4), 240 (M-

C15H31+NO2, 5), 253 (M-NO+C15H31, 20), 55 (C4H7, 100) (Figura 17).

Figura 17. Espectro de masas (EM) (m/z, %) para 1-hexadecil-2-(3´-nitrofenil)-5(6) cloro bencimidazol 5a

Síntesis de 2-(piridin-2’-il)-5(6)-cloro bencimidazol

El compuesto 2-(piridin-2’-il)-5(6)-cloro bencimidazol 4b (figura 18) se obtiene como un líquido viscoso marrón con un rendimiento del 25%.

NH

NCl

N

3´ 4´

5´

6´

45

6

77a

3a

Figura 18. 2-(piridin-2’-il)-5(6)-cloro bencimidazol 4b

30

154-43( )

211-15(CH3)

211-29( )

211-57 ( )

m-NO-C15H31 m-C15H31

m-HCl-NO2

m-HCl

m- C15H31 NO2

N

N

CH2

CH3

ClNO2

14



En el espectro de resonancia magnética nuclear de protón del compuesto 4b mostró

una señal ancha en δ 13.2 para el protón del imidazol (NH), en δ 8.7 se observó una

señal múltiple que integra para un protón que fue asignada al hidrógeno H3’, el

hidrógenos H4’ dio una señal doble a δ 8.5 con una constante de acoplamiento de

8Hz y a δ 8.0 se desplaza una señal triple que integra para un protón asignada a H6´

con una constante de acoplamiento de 8 Hz. Los protones H4 y H6 resonaron como

una señal múltiple que integran para un protón y se encuentran desplazados a δ 7.8

y δ 7.7 respectivamente. A δ 7.5 se desplaza una señal triple que integra para un

protón, con una constante de acoplamiento de 6 Hz que corresponde a H5’. El protón

H7 se encuentra desplazado a δ 7.3 con una señal doble que integra para un protón

y una constante de acoplamiento de 8 Hz (Figura 19).

Figura 19. Espectro de resonancia magnética nuclear de protones (RMN 1H) para 2-(piridin-2’-il)-5(6)-cloro bencimidazol 4b

En el espectro de resonancia magnética nuclear de carbono trece del compuesto 4b

mostró las siguientes señales en δ:167, 166.5, 144.5, 144, 141, 129.5, 129, 128.6,

128.3, 125.1 (figura 20).

Figura 20. Espectro de resonancia magnética nuclear de 13C para 2-(piridin-2’-il)-5(6)-cloro

bencimidazol 4b

31

H3´ H4´ H6´

H4 H6

H5´ H7

H3´

NH

NCl

N

3´ 4´

5´

6´

45

6

77a

3a

C3´ C4´ C6´

C4

C6

C5

C7

NH

NCl

N

3´ 4´

5´

6´

45

6

77a

3a



Evaluación de la actividad

Tabla 1.- Concentración Mínima Inhibitoria (MIC) de los bencimidazoles 5a, 5b, 4a y 4b frente a la cepa de referencia y cepas mono-resistentes de Mycobacterium tuberculosis.

Cepa de referencia de M. tuberculosis (1MtbH37Rv); Etambutol-resistente (2Mtb-ER); Isoniazida-

resistente (3Mtb-IR); Rifampicina-resistente (4Mtb-RR); Estreptomicina-resistente (5Mtb-SR)

La evaluación antimicobacteriana de los compuestos 5a, 5b, 4a y 4b se realizó

usando el microensayo fluorométrico de alamar azul. El alamar azul es un indicador

de óxido-reducción que bajo un ambiente de crecimiento bacteriano cambia de su

forma oxidada (color azul) a su forma reducida (color rosa). Se analizaron diferentes

concentraciones de cada uno de los compuestos (50, 25, 12.5, 6.25 y 3.125 µg/mL)

frente a la cepa de referencia de M. tuberculosis MtbH37Rv y frente a cepas

monoresistentes para los fármacos de primera línea (etambutol, isoniazida,

rifampicina, estreptomicina). Los resultados obtenidos muestran que el compuesto

4a es el que presenta una mayor actividad antimicobacteriana ya que las CMI se

encontraron entre 3.125 frente a la cepa de referencia MtbH37Rv y frente a la cepa

estreptomicina resistente, mientras que para las demás cepas analizadas

presentaron una CMI de 6.25 µg/mL. El compuesto 4b presentó una mejor actividad

antimicobacteriana frente a las cepas isoniazida y estreptomicina resistentes (3.125

µg/mL), seguida por la cepa de referencia 12.5 µg/mL).

Por el contrario, los compuestos con menor actividad antimicobacteriana fueron el 5a y 5b, cuyas MICs para todas las cepas fueron superiores a 50 µg/mL (Tabla 1).

Cepas M-tb MIC µg/mL

del compuesto 5a MIC µg/mL

del compuesto 5b MIC µg/mL

del compuesto 4a MIC µg/mL

del compuesto 4b 1MtbH37-Rv >50 >50 3.125 12.5

2Mtb-ER >50 >50 6.25 50

3Mtb-IR >50 >50 6.25 3.125

4Mtb-RR >50 >50 6.25 50

5Mtb-SR >50 >50 3.125 3.125



Discusión de resultados

Diversas publicaciones han reportado que el núcleo bencimidazol tiene un amplio

potencial terapéutico, se considera un sistema heterocíclico debido a su amplio

rango de compuestos activos con propiedades antiparásitarias, anticonvulsionantes,

analgésicas, antihistamínicas, antihipertensivas, antivirales, antifúngicas y

antimicrobianas.52,56 El núcleo bencimidazol puede ser llamado “llave maestra” ya

que a partir de éste se pueden generar una gran cantidad de compuestos con acción

hacia diferentes blancos. En este trabajo se reporta la actividad antimicobacteriana

de 4 compuestos derivados del bencimidazol. Los resultados señalan que las

modificaciones químicas en el núcleo bencimidazol influyen en la actividad

antimicobacteriana de los compuestos y sugieren que la potencia antimicobacteriana

depende de las propiedades hidrofílicas e hidrofóbicas. Para el caso de los

compuestos que tienen las cadenas hidrofóbicas (5a y 5b) se demostró que la

disminución en la polaridad de estos compuestos causó una disminución en su

actividad antimicobacteriana. En cambio para los compuestos polares (4a y 4b) se

observa un aumento de la actividad antimicobacteriana. El compuesto 4a presenta

una mayor polaridad debido al grupo nitro que contiene en su estructura y es

probable que el grupo nitro este participando en la actividad contra la micobacteria

ya que generalmente los compuestos polares presentan mayor afinidad por los

transportadores de membrana. En conjunto, los efectos inhibitorios de los

compuestos 4a, 4b, 5a y 5b sobre el crecimiento micobacteriano, puede deberse a

que estas moléculas se unan a un sitio celular de enlace específico llamado

receptor45, ya que los receptores de medicamentos son con frecuencia de naturaleza

proteica, y constituyen una ruta de entrada de pequeñas moléculas hidrofílicas y las

moléculas hidrofóbicas se disuelven en la fase lipídica50, 51. Algunos receptores son

moléculas polares y forman parte de las membranas celulares, mientras que otros

están en el citoplasma, los ácidos nucleicos, en particular el ADN, también actúan

como receptores para ciertas clases de sustancias45. Sin embargo, no existen

evidencias directas de que Mycobacterium tuberculosis use de manera selectiva

receptores específicos que le confieran ventajas en su supervivencia intracelular.46

33



El blanco celular de estos compuestos queda aún por estudiarse, aunque los

primeros reportes referentes al núcleo bencimidazol señalan que por analogía con

las purinas pudieran tener un efecto sobre los ácidos nucleicos, en el caso de los

derivados se requiere estudios relacionados a la molécula en conjunto, ya que los

sustituyentes pueden conferir diversas actividades biológicas. Un estudio realizado

por Kazimierczuk y col., señalan que la actividad observada sobre diferentes cepas

de micobacterias depende del sustituyente o de la longitud del sustituyente.57 En

este trabajo se encontró que la adición de una cadena hidrocarbonada en la posición

1 al bencimidazol 4a disminuyó su polaridad y junto con el compuesto 5a que es

hidrofóbico, mostraron una disminución de la actividad contra Mycobacterium

tuberculosis, estos resultados sugieren que la hidrofobicidad de los compuestos

tiene un efecto negativo sobre la actividad biológica.

El compuesto 4a mostro buena actividad contra la cepa MbH37-Rv y las cepas

mono-resistentes H37-Rv SR con una CMI de 3.125 µg/mL y H37-Rv ER, H37-Rv IR, H37-Rv RR con una CMI de 6.25 µg/mL. El compuesto 4b es un compuesto

polar, por la piridina sustituida en C-2 del bencimidazol 4b que obtuvo una CMI de

12.5 µg/mL para la cepa MbH37-Rv, además de que inhibió a las cepas H37-Rv IR, H37-Rv SR a una CMI de 3.125 µg/mL, la actividad de estos compuestos frente a

las cepas de resistencia de M. tuberculosis sugiere que ambos compuestos tienen la

potencialidad de ser usados en tratamientos en donde se presenta multidrogo-

resistencia.

La actividad biológica positiva observada en los diferentes compuestos analizados

permite continuar con estudios sobre su citotoxicidad, su potencial capacidad para

eliminar micobacterias intracelulares, su potencial efecto in vivo y a esclarecer el

blanco molecular de estos compuestos.



7.- CONCLUSIONES

Se sintetizó el compuesto 2-(3’-nitrofenil)-5(6)-cloro bencimidazol 4a como

una mezcla de tautómeros en equilibrio dinámico

Se sintetizó el compuesto 2-(piridin-2’-il)-5(6)-cloro bencimidazol 4b como una

mezcla de tautómeros en equilibrio dinámico

Se sintetizó el compuesto 1-hexadecil-2-(3’-nitrofenil)-5(6)-cloro bencimidazol

5a como una mezcla de regioisómeros.

Se sintetizó el 1-[(Tien-2’-il) metil]-2-(tien-2’-il) bencimidazol 5b como una

mezcla de regioisómeros

Se sintetizaron cuatro bencimidazoles: dos 2,5(6) disustituidos y dos 1, 2, 5(6)

trisustituidos y se probaron su actividad antimicobacteriana en las cepas de

referencia MtbH37Rv y monorresistentes, mostrando que la sustitución en 1

disminuyo la actividad biológica.

Los resultados de actividad biológica indican que las modificaciones químicas

influyen en la actividad antimicobacteriana de los compuestos y sugieren que

la potencia antimicobacteriana depende de las propiedades hidrofílicas e

hidrofóbicas de los compuestos, ya que al disminuir la polaridad de los

compuestos también se disminuyó su actividad antimicobacteriana.

35



8.- REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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PRESENTA: ITZEL URIBE GONZALEZ · Así, los bencimidazoles son compuestos muy eficaces en los...

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