Universidad del MarPuerto Escondido

Minipreps: plásmidos de

DNA

Addy Guzmán ChávezFrancisco Javier Naranjo Luna

Ingeniería Genética

Minipreps: plásmido de DNA

Presenta 2 procedimientos basados en su velocidad y su éxito:

• Miniprep de lisis alcalina• Miniprep por litio

– Almacenamiento de DNA plasmidico

ANTECEDENTES

El aislamiento de plásmidos de DNA de células bacterianas es importante para el análisis de clones.

Muchos protocolos para la elaboración de Minipreps son utilizados.

Los procedimientos presentados permiten la recuperación de plásmido de DNA circular sobre el DNA cromosómico lineal.

Se presenta dos métodos fiables y más utilizados (lisis alcalina y Minipreps en litio.

La elección del método esta en función de:– La experiencia del investigador.– Por las preferencias personales, así como el tamaño y

tipo del plásmido que se requiera.

ANTECEDENTES

• Los tres métodos proporcionan plásmidos de DNA con rendimiento y calidad adecuada.

• El rendimiento del ADN está determinado más por el tipo de plásmido que por el método de aislamiento.

• Los tres métodos son eficaces para el aislamiento de pequeños plásmidos (< 10 kb).

Miniprep de lisis alcalina

• Es el procedimiento mas comúnmente usado.

• El plásmido es preparado de pequeñas cantidades de muchos cultivos diferentes de bacterias conteniendo plásmidos.

• Las bacterias son lisadas por un tratamiento con una solución de SDS y NaOH.

Miniprep de lisis alcalina

• La mezcla es neutralizada con acetato de potasio, haciendo que el DNA plasmidico covalente se cierre rápidamente.

• Mas de DNA cromosómico y bacterial precipitan proteínas y son removidas por centrifugación.

• EL DNA del plásmido removido del sobrenadante se concentra por la precipitación de etanol.

MATERIALES• Medio LB con

antibiótico• Glucosa/ Tris/ EDTA• Buffer TE• Solución de NaOH/SDS • Acetato de potasio• Etanol al 95 y 70%• 10mg/ml DNasa-RNasa• Tubos Eppendorfs 1.5

ml

PROTOCOLO Inocular 5 ml de medio con

una cola colonia

bacterial (crecimiento

saturado)

Centrifugar 1.5 ml de cultivo por 20 s a la

máxima velocidad hasta

formar el pellet.

Resuspender el pellet en 100 µl

de solución GTE y dejar a

temperatura amb x 5 min

Agregar 200 µl de NaOH/SDS. Homogenizar golpeando el

tubo con el dedo. Colocarlo en hielo

por 5 min.

Agregar 150 µl de acetato de

potasio y agitar en vortex por 2 s.

Centrifugar x 3 min los restos celulares y el

DNA cromosómico

Transferir el sobrenadante a

otro tubo, mezclar con 0.8 ml de

etanol al 95% y dejar por 2 min a temperatura amb. hasta pp los ácidos

nucleicos

Centrifugar por 1 min para que se forme el pellet de

DNA y RNA plasmidico

Quitar el sobrenadante, lavar el pellet con 1 ml de

etanol al 70 % y secar a vacio.

Resuspender el pellet en 30 µl TE

98

7

6

5 4

32

1

10

IMPORTANTE

• En el Miniprep de lisis alcalina, el tratamiento con SDS y NaOH rompe las células bacterianas.

• La adición subsiguiente de acetato de potasio realinea covalentemente el DNA plasmidico cerrado, mientras que el DNA cromosómico y las proteínas se encuentran atrapados en un complejo formado entre el potasio y el SDS.

PROBLEMAS Y SOLUCIONES

• El aislamiento exitoso dependerá de la cepa.

• Contaminación por DNasa y RNasa, lo cual se evita utilizando cantidades bajas de la enzima.

• El rendimiento de la lisis alcalina se puede aumentar usando 500 mg/ml de lisozima en el paso 3 del protocolo.

MINIPREPS POR LITIO

• El plásmido es obtenido de cultivos en sólido o líquido de E. coli.

• Las células son secuencialmente tratadas con Triton X-100/LiCl y fenol/cloroformo. Se solubiliza el plásmido de DNA mientras que el DNA Cromosómico se precipita junto con los desechos.

• Los desechos se remueven con centrifugación.

MINIPREPS POR LITIO

• Esto produce los procedimientos de aislamiento del plásmido de DNA que son virtualmente desprovistos de DNA cromosómico.

• La ventaja de esta técnica es por ser fiable de rápida.

• La preparación del plásmido tienen una pureza y calidad que pueden emplearse en la mayoría de sus aplicaciones.

MATERIALES• Solución TELT• Medio LB con antibiótico• 1:1 (w/v) fenol/cloroformo• Etanol al 100%

prerefrigerado a -20ºC• Buffer TE• *10 mg/ml Dnasa libre de

Rnasa A• Tubos Eppendorf de

1.5ml

PROTOCOLO Se aísla el DNA plasmidico de

colonias en crecimiento en

agarCon una

microespatula, se toma una

colonia de 2 a 5 mm de la caja de con agar

Colocarla en un tubo de

microcentrifuga conteniendo 100

µl de TELT.

Agitar en el vortex para

homogenizar la colonia en el

TELT.TODO SE HACE A Tº AMBIENTE.

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PROTOCOLO Se aísla el DNA plasmidico de

colonias en cultivo líquidoInocular una

colonia bacterial en 1.8 ml de medio LB con antibiótico.Incubar con

agitación de 18 a 24 horas a 30 º C.Trasferir

cuidadosamente en un tubo Eppendorf.

TODO SE HACE A Tº AMBIENTE.

Centrifugar a 10,000 rpm

durante 20 s.Retirar el

sobrenadante con una pipeta

Pasteur conectada una línea de vacio.

Agregar 100 µl de TELT y agitar

en vortex por 5 s.

23

PROTOCOLO Agregar 100 µl

1:1 de fenol/cloroformo y agitar 5 s en vortex.

Centrifugar 1 min a 15,000

rpm

Retirar cuidadosamente

75 µl de sobrenadante y trasferir a un tubo nuevo.

Al resto del sobrenadante

agregar 150 µl de etanol al 100%

frio, mezclar con el precipitado del plásmido de DNA.

Quitar el sobrenadante por decantación. El

tubo debe quedar casi seco, retirar

restos cuidadosamente

con papel absorbente.

Lavar el pellet con 1 ml de

etanol al 100% frío y mezclar con el pellet. Repetir

los dos pasos anteriores. Tapar el tubo. Y

abrir un pequeño agujero . Y colocar la

muestra en un desecador con vacio hasta que

este completamente

seco.

Disolver el pellet en 30 µl de TE.

Agitar en vortex . Usar 2 o 5 µl de solución de DNA en una solución

de 20 µl.

3

TODO SE HACE A Tº AMBIENTE.

IMPORTANTE

• El tratamiento con Triton X-100/LiCl el cual actúa en la membrana interna.

• Este no tiene ningún efecto sobre la morfología general de las células, ni tampoco lleva a la liberación de DNA plasmidico de las células.

• La adición subsiguiente de fenol/cloroformo, conduce a la desnaturalización y precipitación de las proteínas intracelulares.

IMPORTANTE

• La contracción rápida de las células expulsa el DNA plasmidico en el medio, sin perder el DNA cromosómico. Las proteínas celulares desnaturalizadas se quedan con la masa celular.

• La morfología bacteriana, de la dotación de la pared celular, se mantiene en estas condiciones durante al menos 30 minutos, al punto que se deriva la lisis celular.

• El DNA cromosómico se retira con los restos celulares por centrifugación, el ADN plasmidico superenrollado se concentra por precipitación con etanol.

ALMACENAMIENTO DE PLÁSMIDOS

• Se conserva por periodos cortos (1 mes) en cepas a 4º C.

• El almacenamiento permanente es muy complejo, el plásmido puede hacerse crecer en presencia de saturación del agente selectivo apropiado. – En un volumen igual se separa la muestra en viales

estériles y se agrega glicerol o una solución base DMSO y se refrigera a -70ºC

• Los plásmidos de DNA pueden ser almacenados en un TE a 4º C por varias semanas o presérvalo por varios años por congelación de -20ºC a -70ºC.

REACTIVOS Y SOLUCIONES

50 mM glucos25 mM Tris·Cl, pH

810 mM EDTAEsterilizar y

guardar a 4ºC

0.2 N NaOH1% sulfato

dodecil de sodioPreparas justo a

su uso

29.5 ml ác. Acético glacial

Pellets KOH a pH 4.8

100 ml H2OMantener a Tº Ambiente no

esterilizar

2.5 M LiCl50 mM Tris·Cl, pH

862.5 mM Na2

EDTATritón X-100 al

4%Guardar

alicuotas con 1-5 ml a -20ºC, no

esterilizar

Sacarosa al 8%Tritón X-100 al

5%50 mM EDTA

50 mM Tris·Cl, pH 8

Esterilizar por filtración y

guardar a 4ºC

Solución de Glucosa / Tris /

EDTA (GTE)

Solución NaOH / SDS

Solución de Acetato de

potasio 5M, pH 4.8

Solución de STET Solución TELT

PROBLEMAS Y SOLUCIONES

• Más breve que otros Minipreps de DNA.• El resultado de calidad obtenido por este método ha

sido verificado por el hecho de que no se encuentran problemas en lo que respecta a la inhibición de algunas actividades de las enzimas de restricción sensibles.

• Cualquier inhibición de la fragmentación del DNA es probable que sea debido a la contaminación del DNA con los restos celulares en la fase fenol / cloroformo.

– esto puede ser fácilmente superado por la reducción del volumen de DNA en la mezcla de reacción.

Wiley & Sons. 1987. Current Protocols in Molecular Biology.

DUDAS??? NO!!!

Gracias

!!

REFERENCIAS

Wiley & Sons. 1987. Current Protocols in Molecular Biology.