1. Explique detalladamente como el pH afecta la actividad de una enzima.

Los enzimas poseen grupos químicos ionizables (carboxilos -COOH; amino -NH2; tiol -SH; imidazol, etc.) en las cadenas laterales de sus aminoácidos. Según el pH del medio, estos grupos pueden tener carga eléctrica positiva, negativa o neutra. Como la conformación de las proteínas depende, en parte, de sus cargas eléctricas, habrá un pH en el cual la conformación será la más adecuada para la actividad catalítica (Figura de la derecha). Este es el llamado pH óptimo.  La mayoría de los enzimas son muy sensibles a los cambios de pH. Desviaciones de pocas décimas por encima o por debajo del pH óptimo pueden afectar drásticamente su actividad. Así, la pepsina gástrica tiene un pH óptimo de 2, la ureasa lo tiene a pH 7 y la arginasa lo tiene a pH 10 (Figura de la izquierda). Como ligeros cambios del pH pueden provocar la desnaturalización de la proteína, los seres vivos han desarrollado sistemas más o menos complejos para mantener estable el pH intracelular: Los amortiguadores fisiológicos.

 

2. Explique brevemente que isoenzimas digestivas funcionan en el intestino para digerir proteínas.Isozimas or Isoenzimas son proteinas con diferente estructura pero que catalizan la misma reaccion. Con frecuencia, las isoenzimas son oligomeros de diferentes cadenas peptidicas, y usualmente difieren en los mecanismos de regulacion y en las caracterisiticas cineticas. Desde el punto de vista fisiologico, la existencia de isoenzimas permite que haya enzimas similares con diferentes caracteristicas, “personalizadas” de acuerdo a los requerimientos especificos del tejido o a determinadas condiciones metabolicas.   Un ejemplo de las ventajas que ofrecen las isoenzimas al permitir un ajuste “fino” del metabolismo, en diferentes condiciones metabolicas y en diferentes organos, es el siguiente:   Glucoquinasa y Hexokinasa son ejemplos tipicos de isoenzimas. De hecho, hay cuatro Hexoquinasas: I, II, III y IV. Hexokinasa I esta presente en todos los tejidos, y la Hexoquinasa IV, tambien conocida como Glucoquinasa, esta presente principalmente en el higado, el pancreas y el cerebro.  Ambas enzimas catalizan la fosforilacion de la glucosa:   Glucosa + ATP —– Glucosa 6 (P) + ADP Hexokinasa I tiene un bajo Km y es inhibida por Glucosa 6 (P).  Glucokinasa no es inhibida por Glucosa 6 (P) y tiene un alto Km. Estos dos hechos indican que la actividad de Glucoquinasa depende de la disponibilidad de substrato y no de la demanda del producto.   Debido a que la Glucoquinasa no es inhibida por Glucosa 6 (P). en condiciones en que la concentracion de glucosa es alta, esta enzima continua fosforilando glucosa, la cual puede ser usada para la sintesis de glucogeno en el higado. Ademas, debido a que la Glucoquinasa tiene un alto Km, su actividad no compromete el suministro de glucosa a otros organos; en otras palabras, ya que la Glucoquinasa no es inhibida por glucose 6 (P), si esta enzima tuviera un bajo Km, continuaria convirtiendo glucosa a glucosa 6 (P) en el higado, haciendo que la glucosa no estuviera disponible para otros organos (recuerde que despues de las comidas, la

glucosa llega primero al higado antes que a los otros organos, a traves del sistema porta.)   Debido a que las isoenzimas tienen diferente distribucion tisular, su estudio es un importante instrumento en la determinacion del dano sufrido por organos especificos. 

3. Como explica el hecho que la alfa amilasa tenga actividad en el rango de pH 6 a 8.

Acciones: Como es sabido, el almidón está formado por la fracción amilosa de cadena recta de moléculas de glucosa unidas por enlaces glucosídicos alfa-1,4; en tanto que la fracción amilopectina, además de la cadena recta, presenta ramificaciones con enlaces glucosídicos 1,6.

La alfa-amilasa cataliza la hidrólisis de la cadena lineal (amilosa) y la ramificada (amilopectina) del almidón, rompiendo enlaces 1,4 interiores (endoamilasa) para formar una mezcla de dextrinas; por ello se la conoce como enzima dextrinogénica (mezcla de amilodextrina, eritrodextrina, acrodextrina y maltodextrina) con poca producción de maltosa.

Por su acción, la alfa-amilasa provee de fragmentos menores que pueden ser utilizados por la enzima beta-amilasa. La enzima alfa-amilasa requiere de un activador como, por ej., cloruro de sodio. Es sensible a una acidez elevada y se vuelve inactiva a pH 3,3 o a pH menor a 0°C por 15 min. El pH óptimo de acción está dentro del rango 5-7, siendo de 6,5 para la alfa-amilasa bacteriana y pancreática. La enzima es resistente al calor, pues a 70°C conserva un 70% de su actividad. Actúa sobre almidones crudos y gelatinizados.

La beta-amilasa se la conoce con el nombre de enzima sacarogénica, pues actúa sobre la amilosa, rompiendo unidades 1,4, dando maltosa. Sobre la amilopectina actúa en las uniones alfa-1,4 de la cadena recta, y detiene su acción a distancia de 2 unidades de glucosa antes de atacar las uniones alfa-1,6. Se trata de una exo-amilasa, ya que actúa sobre el terminal de la molécula; mientras la amilosa es transformada totalmente en maltosa, la cadena ramificada de la amilopectina se conserva en un 40-45% sin hidrolizar (38).

La beta-amilasa no necesita de activador para actuar, pero es menos estable al calor, inactivándose a 70°C por 15 min. El pH óptimo de la beta-amilasa es de 4,5.

Explicar la via Embden Meyerhof Parnas.

Glucosa + 2NAD+ + 2ADP + 2 2Piruvato + 2NADH + 2ATP + 2H+ + 2H2O

Explicar la degradación del almidón en el metabolismo bacterianoSelección y evaluación de bacterias del géneroBacillusproductoras de amilasa en cultivo sumergido. Vargas Apaza,Silver Luis.Elaboración y diseño en formato PDF, por la Oficina General del Sistema de Bibliotecas yBiblioteca Central UNMSMI.- INTRODUCCIÓNLas amilasas son enzimas extracelulares que hidrolizan el almidón, y quepueden ser producidos por diferentes microorganismos, entre ellos las bacterias yhongos. Estas enzimas tienen diferentes aplicaciones en la industria, se utilizanpara modificar las características de almidones naturales, es así, que en panaderíay molinería se usa para la reducción de la viscosidad de las pastas, aceleracióndel proceso de fermentación, incremento del volumen de pan, mejoramiento de lamiga y textura, mantenimiento de frescura y suavidad, mejoramiento de la texturade las pastas, reducción del tiempo de mezclado, incremento del volumen demasa; en cervecería, para el proceso del malteado; cereales, alimentación conprecocidos para infantes, alimentos instantáneos; Chocolate y cocoa, para la

manufactura de jarabes; en industria alimentaría para la producción deedulcolorantes, jarabe de maíz, para la manufactura de jarabes de alto contenidode maltosa, producción de jarabe de bajo índice de dextrosa; bebidas destiladas;en fundición, confieren mayor solidez; en textilería, para el proceso de engomado ydesengomado; en saborizantes, como clarificantes; en alimentos vegetales, paraliquefacción de purés y sopas. En la industria del papel; piensos y detergentes.Actualmente en nuestro medio, no se han profundizado estudios deproducción de amilasa, utilizando bacterias silvestres y sustratos de origen agrícolacon alto contenido de almidón, este polisacárido es ideal para la inducción de laspermeasas que hidrolizan el almidón en productos como dextrinas, maltosa yglucosa, que luego de hidrolizarlos hasta monosacáridos, son aprovechados porlas bacterias para su metabolismo, la expresión de la enzima amilasa excedente,queda en el medio fermentado que puede ser recuperada

Explicar la degradación de lactosa. porque algunas bacterias la degradan y por que otras no 

La fermentación láctica es una ruta metabólica anaeróbica que ocurre en el citosol de la célula, en la cual se oxida parcialmente la glucosa para obtener energía y donde el producto de desecho es el ácido láctico.

Este proceso lo realizan muchos tipos de bacteriasbacterias (llamadas bacterias lácticas), hongos, algunos protozoos y muchos tejidos animales; en efecto, la fermentación láctica también se verifica en el tejido muscular cuando, a causa de una intensa actividad motora, no se produce una aportación adecuada de oxígeno que permita el desarrollo de la respiración aeróbica. Cuando el ácido láctico se acumula en las células musculares produce síntomas asociados con la fatiga muscular. Algunas células, como los eritrocitos, carecen de mitocondrias de manera que se ven obligadas a obtener energía por medio de la fermentación láctica; por el contrario, el parénquima muere rápidamente ya que no fermenta, y su única fuente de energía es la respiración aeróbica.

Un ejemplo de este tipo de fermentación es la acidificación de la leche. Ciertas bacterias (Lactobacillus, Streptococcus), al desarrollarse en la leche utilizan la lactosa (azúcar de leche) como fuente de energía. La lactosa, al fermentar, produce energía que es aprovechada por las bacterias y el ácido láctico es eliminado. La coagulación de la leche (cuajada) resulta de la precipitación de las proteínas de la leche, y ocurre por el descenso de pH (acidificación) debido a la presencia de ácido láctico. Este proceso es la base para la obtención del yogur. El ácido láctico, dado que otorga acidez al medio, tiene excelentes propiedades conservantes de los alimentos. Ejemplos de esto último son el chucrut y el ensilado de granos para forraje. glucosa celular

1. Describa y comente tres técnicas para purificar PLÁSMIDOS.Método para la separación de plásmidos del ADN genómico en extractoscelulares bacterianos por lisis alcalina.Esta técnica se basa en la fragmentación lineal que ocurre durante la lisiscelular del ADN genómico. Al incrementar su pH acerca de 12 puedeneliminarse los puentes de hidrogeno y separarse cada una de las cadenasdel ADN. Los plásmidos (especialmente aquellos de bajo PM empleadospara clonación génica) son resistentes y no se alteran por lisis celular,permaneciendo como ADN bacteriano circular superenrrollando. Cuandoel pH es reducido, las uniones entre las cadenas en el plásmido seremueven y entran en un estado más relajado(1)

. Sin embargo, losfragmentos lineales de ADN genómico no tienden a re-naturalizarse, por loque pueden agregarse en una malla insoluble que se remueve por centrifugación, mientras que los plásmidos permanecen en solución(2).Otros componentes celulares que incluyen restos de pared celular yproteínas, se remueven por este procedimiento, así que la extracción por fenol no es necesaria. La preparación del plásmido obtenido con estametodología es puro por lo que es útil aun en casos de digestión conenzimas de restricción

** electroforesis

Un método que permite visualizar ADN plasmídico o fragmentos del mismo es la electroforesis en gel de agarosa, en la cual se separan en función de su tamaño. Esta técnica consiste en someter la mezcla de moléculas de ADN embebidas en un gel de agarosa a un campo eléctrico. Las moléculas de ADN son atraídas al polo positivo debido a la carga neta negativa de ambas cadenas consecuencia de sus grupos fosfato. Las moléculas más pequeñas migran más rápido que las grandes al verse menos “frenadas” por el gel de agarosa en su desplazamiento. Cuando los fragmentos se han separado,el gel se sumerge en una solución que contiene bromuro de etidio y luego se ilumina con luz UV.El bromuro de etidio (EtBr) es una molécula plana con afinidad por el ADN que se intercala entre las pares de bases y que tiene la particularidad de que fluoresce cuando está unido a él. Al iluminar el gel con luz UV se ven bandas de fluorescencia que corresponden a moléculas de ADN.La obtención de altas cantidades de ADN plasmídico puro es fundamental a la hora de analizarlo o utilizar a éste como vector en aplicaciones posteriores. El avance de la ingeniería genética y de las técnicas de ADN recombinante ha supuesto un aumento del número y variedad de técnicas de purificación de ADN. En comparación con métodos tradicionales (que utilizan fenol u otros reactivos tóxicos), los nuevos métodos utilizan reactivos no peligrosos, mientras que mantienen un alto rendimiento y pureza del producto final.El objetivo de esta práctica es el aislamiento y purificación de un ADN plasmídico que contiene un fragmento de cDNA correspondiente a un gen que se expresa en el proceso de maduración del fruto de fresa. Este paso es previo y necesario para la caracterización posterior del gen. Se utilizará un “kit” de aislamiento y purificación de plásmidos que se usa de modo rutinario en laboratorios de Biología Molecular. Posteriormente, se visualizará, mediante electroforesis en gel de agarosa

3.1. Obtención de un lisado celular y purificación del ADN plasmídicoNota:Se suministrará el cultivo bacteriano para la realización de esta práctica. 1.Transferir un cultivo de noche (1-2 ml) de células portadoras del plásmido a un tubo eppendorf (1,5 ml) de microcentrífuga. Centrifugar las células durante 30 s. Eliminar el sobrenadante por aspiración o con una pipeta. 2.Añadir 200μl de Solución 1 (solución de resuspensión celular) y mezclar mediante agitador (“vortex”) o pipeteando arriba y abajo hasta que la resuspensión sea homogénea. 3.Añadir 250 μl de Solución 2 (solución de lisis celular) y mezclar suavemente invirtiendo el tubo cerrado una 10 veces (no mezclar con agitador).La solución debe hacerse viscosa ligeramente transparente, señal de que las células se han lisado.

4.Añadir 250μl de Solución 3 (solución de neutralización) y mezclar suavemente invirtiendo el tubo unas 10 veces (NO AGITAR!). Un precipitado blanco debe de aparecer. 5. Centrifugar en una microfuga durante 10 min. Nota: a) (Mientras que la centrifugación se realiza insertar un Filtro de Centrifugación (“Spin Filter”) en uno de los tubos de 2 ml (Tubos de lavado) que se suministran. b) Mezclar la solución 4 (“Quantum Prep Matrix”) que contiene la matriz purificadora mediante agitación del bote en la que se suministra hasta asegurar que la matriz está totalmente resuspendida) 6.Transferir el sobrenadante (lisado) al Filtro de centrifugación, añadir 200μl de la Solución 4 resuspendida y mezclar todo mediante pipeteo arriba y abajo. (Suponiendo que haya varias muestras, primero se transfiere el lisado de todas, luego se añade la matriz a todas y se mezcla) 7.Centrifugar durante 30 s. 8.Retirar con cuidado el Filtro de Centrifugación, descartar el filtrado del tubo y colocar de nuevo el Filtro en el mismo tubo (ya vacío). Añadir 500 μl de Solución 5 (“Wash buffer”) y lavar la matriz mediante centrifugación durante 30 s. 9.Repetir el paso anterior, pero esta vez centrifugar durante 2 min para eliminar cualquier residuo de etanol. 10.Retirar el Filtro de Centrifugación y colocarlo en un tubo eppendorf limpio de 1,5 ml. Añadir 100μl de H2O calentada a 70 ºC y dejar humedecer 1 min. 11.Recuperar la solución que contiene el ADN, mediante centrifugación durante 1 min. 12.Descartar el Filtro de Centrifugación y guardar el ADN a -20 ºC. Nota: Todas las centrifugaciones se realizan en centrífuga de tubos eppendorf y a velocidad máxima (12-14.000 rpm).

3.2. Electroforesis de ácidos nucleicos en gel de agarosa1.Fabricación del gel de agarosa al 1 %: En un matraz mezclar una cantidad adecuada de agarosa (1 g) con tampón TBE (100 ml). Calentar la mezcla (agarosa + TBE) con la ayuda de un microondas u hornillo eléctrico hasta fundir y disolver completamente la agarosa (¡cuidado al agitar el matraz, que la agarosa al calentarse puede salpicar abruptamente fuera del matraz y producir serias quemaduras!). Añadir 5 μl de una solución de bromuro de etidio (10 mg/ml).

Dejar enfriar ligeramente la mezcla (gel) hasta que alcance una temperatura de entre 50 ºC a 60 ºC y verterla, seguidamente, sobre una “cama electroforética”, previamente preparada, colocando el “peine” adecuado para formar los pocillos. Dejar enfriar SIN MOVER a temperatura ambiente hasta que gelifique completamente. 2.En un tubo eppendorf limpio añadir 20 μl (10 μl del ADN aislado anteriormente + 10 μl de agua) de la disolución de ADN y 3 μl de “tampón de carga”. 3.Centrifugar ligeramente la mezcla SÓLO si hay demasiadas gotas repartidas dentro del tubo, con objeto de recoger todo el volumen de muestra. 4.Depositar la muestra en uno de los pocillos del gel de agarosa al 1%previamente fabricado (éste se ha colocado con anterioridad sumergido en tampón TBE en una cubeta de electroforesis) 5.Cerrar o tapar la cubeta de electroforesis, colocar los electrodos de tal forma que el polo negativo quede al lado de los pocillos y el polo positivo en el extremo opuesto del gel, hacia donde va a migrar el ADN, y aplicar una corriente eléctrica continua de 100-120 voltios 6.Detener la electroforesis tras unos 60 minutos o cuando el colorante haya recorrido las tres cuartas partes del gel. Visualizar el ADN con ayuda de un transiluminador de luz ultravioleta de onda corta.