PREDICCIÓN DE BIOMARCADORES EN MUCOPOLISACARIDOSIS ...
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PREDICCIÓN DE BIOMARCADORES EN MUCOPOLISACARIDOSIS EMPLEANDO UNA RED METABÓLICA HUMANA TRABAJO DE GRADO PARA OPTAR AL TÍTULO DE MAGISTER EN CIENCIAS BIOLÓGICAS DIEGO A. SALAZAR BARRETO TUTORA: JANNETH GONZÁLEZ SANTOS CO-TUTORES: CARLOS JAVIER ALMÉCIGA DÍAZ GEORGE EMILIO BARRETO SAMPAIO PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS MAESTRÍA EN CIENCIAS BIOLÓGICAS BOGOTÁ D.C. COLOMBIA DICIEMBRE 2014
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PREDICCIÓN DE BIOMARCADORES EN MUCOPOLISACARIDOSIS
EMPLEANDO UNA RED METABÓLICA HUMANA
TRABAJO DE GRADO PARA OPTAR AL TÍTULO DE MAGISTER EN CIENCIAS
BIOLÓGICAS
DIEGO A. SALAZAR BARRETO
TUTORA:
JANNETH GONZÁLEZ SANTOS
CO-TUTORES:
CARLOS JAVIER ALMÉCIGA DÍAZ
GEORGE EMILIO BARRETO SAMPAIO
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
FACULTAD DE CIENCIAS
MAESTRÍA EN CIENCIAS BIOLÓGICAS
BOGOTÁ D.C. COLOMBIA
DICIEMBRE 2014
3
ARTÍCULO 23, RESOLUCIÓN #13 DE 1946.
“La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus
alumnos en sus trabajos de tesis. Sólo velará porque no se publique nada
contrario al dogma y a la moral católica y porque las tesis no contengan
ataques personales contra persona alguna, antes bien se vean en ellas el
anhelo de buscar la verdad y la justicia”
5
PREDICCIÓN DE BIOMARCADORES EN MUCOPOLISACARIDOSIS
EMPLEANDO UNA RED METABÓLICA HUMANA
DIEGO A SALAZAR BARRETO
________________________ _______________________
Manuel A. Franco Cortés MD., PhD. Concepción Judith Puerta Bula PhD
Director Posgrado Decana
Facultad de Ciencias Facultad de Ciencias
Bogotá D.C.
Diciembre 2014
6
DEDICATORIA
A Dios,
mi Mamá,
mi hermana
y a María Isabella.
7
CONTENIDO
pág.
1 Resumen .................................................................................................................................... 12
2 Abstract ..................................................................................................................................... 13
3 Alcance y definición del problema de Investigación ................................................................. 14
4 Marco Teórico ........................................................................................................................... 17
4.1 Errores innatos del metabolismo y mucopolisacaridosis .................................................. 17
4.1.1 Errores innatos en el metabolismo ........................................................................... 17
4.1.2 Enfermedades de depósito lisosomal ....................................................................... 18
4.1.3 Glucosaminoglicanos y Proteoglicanos ..................................................................... 22
4.1.4 Mucopolisacaridosis .................................................................................................. 25
4.1.5 Tipos de mucopolisacaridosis .................................................................................... 26
4.2 Diagnóstico y tratamiento de mucopolisacaridosis .......................................................... 30
4.2.1 Biomarcadores para el diagnóstico de mucopolisacaridosis .................................... 32
4.3 Aproximaciones computacionales para la predicción de biomarcadores. ....................... 34
4.4 Biología de sistemas .......................................................................................................... 35
4.4.1 Redes biológicas ........................................................................................................ 35
4.4.2 Tipos de redes biológicas .......................................................................................... 37
4.4.3 Redes metabólicas y su análisis ................................................................................. 38
5 Objetivos e Hipótesis ................................................................................................................. 44
5.1 Objetivo general ................................................................................................................ 44
5.2 Objetivos específicos ......................................................................................................... 44
5.3 Hipótesis ............................................................................................................................ 44
6 Métodos .................................................................................................................................... 45
6.1 Reconocimiento del modelo recon 2. ............................................................................... 46
6.2 Identificación enzimática y generación de modelos. ........................................................ 46
6.3 Definición de la función objetivo y Análisis de balance de flujos. .................................... 47
6.4 Análisis de enriquecimiento génico .................................................................................. 47
8
6.5 Análisis de variabilidad de flujos y determinación de biomarcadores. ............................. 47
6.6 Análisis estadístico. ........................................................................................................... 48
6.7 Validación de resultados. .................................................................................................. 49
7 Resultados y discusión .............................................................................................................. 50
7.1 Consideraciones iniciales. ................................................................................................. 50
7.2 Depuración del modelo ..................................................................................................... 51
7.3 Identificación de reacciones asociadas con MPS y generación de modelos. .................... 54
7.4 Verificación silenciamiento de reacciones en modelos MPS. ........................................... 57
7.5 Optimización por análisis de balance de flujos para los modelos recon 2 y tipos de MPS.
57
7.6 Validación de los flujos para los modelos MPS y EDL. ...................................................... 58
7.7 Comparación por grupos y rutas metabólicas de los modelos MPS contra recon2. ........ 60
7.8 Descripción metabólica de los flujos. ................................................................................ 60
7.9 Reacciones encendidas y apagadas. ................................................................................. 65
7.10 Diferenciación entre modelos MPS. .................................................................................. 72
7.11 Análisis de variabilidad de flujos. ...................................................................................... 73
8 Conclusiones.............................................................................................................................. 78
9 Perspectivas y aplicaciones ....................................................................................................... 79
10 Bibliografía ................................................................................................................................ 80
11 ANEXOS ..................................................................................................................................... 96
9
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla 1. Funciones lisosomales. ------------------------------------------------------------------------------------------------ 19
Tabla 2. Tipos de GAG. ------------------------------------------------------------------------------------------------------------ 25
Tabla 3. Resumen de las características bioquímicas y genéticas de las MPS. ---------------------------- 29
Tabla 4. Diferencias entre recon 1 y recon 2. ----------------------------------------------------------------------------- 42
Tabla 5. Reacciones eliminadas durante la depuración de recon 2. --------------------------------------------- 52 Tabla 6. Número de reacciones asociadas a cada enzima de MPS y presentes en el modelo recon
2. -------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 55
Tabla 7. Comparación de flujos entre los 14 modelos (recon2, MPS y EDL). -------------------------------- 59
Tabla 8. Tendencia de las reacciones en los diferentes grupos metabólicos para los modelos MPS
comparados contra los obtenidos en recon2. ----------------------------------------------------------------------------- 65
Tabla 9. Reacciones que se silenciaron o activaron en los modelos MPS. ----------------------------------- 69
Tabla 10. Comparación metabólica entre los modelos de MPS.--------------------------------------------------- 74
Tabla 11. Tipos de rangos obtenidos para los diferentes modelos MPS. -------------------------------------- 74
Tabla 12. Biomarcadores de alta y baja confidencia predichos por FVA. -------------------------------------- 75
10
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1. Esquema de las diferentes enfermedades de depósito lisosomal. ___________________ 21
Figura 2. Diferentes rutas de degradación de GAG. ________________________________________ 24
Figura 3. Esquema de una red metabólica. ________________________________________________ 37
Figura 4. Diferentes representaciones de una red. _________________________________________ 37
Figura 5. Esquema del procedimiento de análisis para un modelo metabólico. _________________ 41
Figura 6. Solución de la matriz estequiométrica. ___________________________________________ 41 Figura 7. Diagrama de flujo de la metodología seguida para la obtención y análisis de los modelos.
______________________________________________________________________________________ 45
Figura 8. Definición de rangos para determinación de biomarcadores. ________________________ 48
Figura 9. Degradación de queratan sulfato. ________________________________________________ 56
Figura 10. Análisis de componentes principales de los modelos de MPS y recon 2. ____________ 61
Figura 11. Número de reacciones empleadas y alteradas por modelos MPS y recon 2. _________ 63
Figura 12. Numero de reacciones que se silenciaron y se activaron en los modelos de MPS
comparando los flujos contra los obtenidos en recon 2. _____________________________________ 68
Figura 13. Análisis de enriquecimiento génico para los genes que se encendieron en los diferentes
modelos de MPS. ______________________________________________________________________ 70 Figura 14. Análisis de enriquecimiento génico para los genes que se apagaron en los diferentes
modelos de MPS. ______________________________________________________________________ 71
Figura 15. Número de reacciones que se identificaron como biomarcadores por ruta metabólica para
los modelos MPS tipo IVA, IVB, VI y VII. __________________________________________________ 75
11
ÍNDICE DE ANEXOS
Anexo 1. Reacciones específicas para recon 2 que estaban asociadas a las enzimas lisosomales
deficientes en MPS.------------------------------------------------------------------------------------------------------------------ 96
Anexo 2. Valores de flujos (FBA Y FVA) de cada modelo MPS y recon 2. ------------------------------------ 98
Anexo 3. Categorización de rutas metabólicas detalladas en recon 2 en base a la clasificación
realizada en la base de datos KEGG pathway (http://www.kegg.jp/kegg/pathway.html). ---------------- 98
Anexo 4. Comportamiento de los flujos de reacción para los diferentes modelos MPS comparados
contra los obtenidos en recon 2. ---------------------------------------------------------------------------------------------- 102 Anexo 5. Comportamiento de los flujos en los modelos MPS comparados contra recon 2. MAA: metab
de aminoácidos, MGS: metab de grupo sanguíneo, MC: metab de carbohidratos, Ox: fosforilación
oxidativa, Ex: reacciones de intercambio y demanda, MBG: metab y biosíntesis de glicanos, ML:
metab de lípidos, MCV: metabolismo de cofactores y vitaminas, MOA: metab de otros aminoácidos,
MN: metab de nucleótidos, TM: transporte de metabolitos. ------------------------------------------------------- 103 Anexo 6. Conjunto de genes obtenidos del silenciamiento o activación de reacciones en los modelos
MPS. ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 104 Anexo 7. Número de reacciones cuyo flujo aumento en un modelo MPS especifico comparado contra
los flujos de las demás MPS. -------------------------------------------------------------------------------------------------- 106
Anexo 8. Número de reacciones cuyo flujo disminuyó en un modelo MPS especifico comparado
contra los flujos de las demás MPS. ---------------------------------------------------------------------------------------- 107 Anexo 9. Reacciones que presentaron un cambio de límites de flujo en los modelos de MPS IVA,
IVB, VI y VII. -------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 108
12
1 RESUMEN
Las mucopolisacaridosis (MPS) son enfermedades de depósito lisosomal,
caracterizadas por la deficiencia en las enzimas lisosomales encargadas de la
degradación de los glucosaminoglicanos (GAG), esto lleva a su acumulación y al
inicio de una serie de procesos patológicos característicos de esta enfermedad. La
detección e inicio de tratamiento temprano, son importantes para evitar el deterioro
en la calidad de vida del paciente. La medición de GAG en biofluidos es el
biomarcador universal en estas patologías, sin embargo, el procesamiento y análisis
de los resultados de laboratorio pueden llegar a ser de difícil interpretación y varían
según cada paciente, por lo que contar con nuevos biomarcadores tendría un
impacto en el diagnóstico y seguimiento de estas enfermedades, con lo cual se
podría garantizar un mecanismo de aseguramiento en salud adecuado para estas
enfermedades. En el siguiente trabajo se presenta una aproximación computacional
para predecir marcadores biológicos y alteraciones metabólicas a partir de la
variación de flujos (análisis de balance y análisis variabilidad de flujos) de reacción
en la reconstrucción metabólica humana –recon 2- para los diferentes tipos de
mucopolisacaridosis. Sobre recon 2 se silenciaron de forma independiente las
reacciones relacionadas con las enzimas deficientes en 10 tipos de MPS. Se
evidenciaron alteraciones metabólicas a nivel de lípidos, carbohidratos y
aminoácidos además de aumento en la producción de especies reactivas de
oxígeno. Estos procesos se correlacionaron con los sucesos patológicos
secundarios evidenciados para MPS. Los candidatos a biomarcadores se
encontraron para MPS IVB y VII, estos se encontraron en la ruta de síntesis de
esfingolípidos y en el transporte de diferentes moléculas entre las que se encuentran
aminoácidos y aminoazúcares.
13
2 ABSTRACT
Mucopolysaccharidosis (MPS) are lysosomal storage diseases characterized by a
deficiency in the lysosomal enzymes responsible for the degradation of
glycosaminoglycans (GAG), this leads to their accumulation and the onset of a
number of pathological processes characteristic of this disease. The onset of early
detection and treatment are important to prevent deterioration in the quality of life of
the patient. Measuring GAG in biofluids is the universal biomarker in these diseases,
however, the processing and analysis of laboratory results may become difficult to
interpret and vary with each patient, so new biomarkers would have an impact on
diagnosis and monitoring of these diseases, which could guarantee health insurance
mechanism for these diseases. In this paper presents a computational
approximation to predict biological markers and metabolic alterations from flux
variation (balance analysis and flow variability analysis) in human metabolic
reconstruction –recon 2- for different types of mucopolysaccharidoses. Using recon
2, were silenced the deficient enzymes in 10 types of MPS. Metabolic alterations
were in lipids, carbohydrates and amino acids. In addition, there was an increase in
the production of reactive oxygen species. These processes are correlated with
secondary pathological events evidenced for MPS. Biomarker candidates were
found to MPS IVB and VII, these were found in the synthesis pathway of
sphingolipids and transport of different molecules which are amino acids and amino
sugars.
14
3 ALCANCE Y DEFINICIÓN DEL PROBLEMA DE INVESTIGACIÓN
Las MPS están caracterizadas por la deficiencia de la función catalítica de algunas
las enzimas lisosomales encargadas de la degradación de los GAG, llevando a la
acumulación en lisosomas de estos compuestos. Hasta la fecha se han descrito 11
subtipos de MPS, cada una caracterizada bioquímica y genéticamente, permitiendo
así el desarrollo de algunas alternativas terapéuticas y diagnosticas1,2.
Actualmente el diagnóstico de las MPS está basado en la identificación y
cuantificación de los GAG, así como en la medición de la actividad enzimática; sin
embargo, el procesamiento y análisis de los resultados de laboratorio puede llegar
a ser de difícil interpretación y puede variar según las condiciones fisiopatológicas
de cada individuo. Adicional, se ha observado la acumulación de diferentes GAG
independientemente de la enzima deficiente en MPS, por lo que el análisis de un
solo GAG no puede garantizar un diagnóstico certero. Se cree que esta acumulación
secundaria de otros GAG se deba a la acumulación primaria de los sustratos no
degradados por la enzima deficiente, por lo que es de esperarse que otros sistemas
igualmente se alteren por esta misma vía. Los procesos secundarios u otras
alteraciones reportadas para MPS han sido: inflamación, daño mitocondrial y
alteración en el tráfico de lípidos3–6. Gracias a estos procesos alterados se ha
logrado identificar ciertos biomarcadores que se limitan a algunas MPS, se asocian
a diferentes estadios de la enfermedad, son tejido específicos y han sido obtenidos
de modelos animales y líneas celulares luego no se encuentran validados
clínicamente7.
Los avances en la detección de biomarcadores para el seguimiento y evaluación de
terapias y diagnósticos son importantes en enfermedades huérfanas y de alto costo
como las MPS, ya que por ejemplo el precio de la terapia de reemplazo enzimático
para un paciente con MPS II con idursulfasa tiene un valor alrededor de quinientos
mil dólares, precio que puede variar según las condiciones fisiológicas del paciente,
ya que de esto dependerá la dosis a administrar8. Debido a que muchas veces el
diagnostico no se realiza a tiempo9,10, las intervenciones que deben realizarse
aumentan el gasto de cubrimiento por parte del Estado, además que un diagnóstico
tardío trae daños irreversibles sobre el paciente, como retardo mental o
deformaciones óseas2,11. Por tal motivo, la investigación en este tipo de
enfermedades es importante para mejorar el abordaje clínico, epidemiológico, y
social; algunas iniciativas e incentivos legislativos han promovido la investigación
en varios aspectos, por ejemplo, en Colombia existe la Ley 1392 de 2010 la cual
establece que “...las enfermedades huérfanas, representan un problema de especial
15
interés en salud dado que por su baja prevalencia en la población, pero su elevado
costo de atención, requieren dentro del Sistema General de Seguridad Social en
Salud (SGSSS) un mecanismo de aseguramiento diferente al utilizado para las
enfermedades generales…”, luego esta ley favorece la investigación y conocimiento
de estas patologías, por ejemplo la identificación de nuevos biomarcadores.
El enfoque de la nueva investigación de biomarcadores se basa en el empleo de
estudios experimentales y computacionales. Experimentalmente se emplean grupos
o conjuntos de proteínas o genes en diferentes patologías de las cuales se pueden
observar cambios propios de dicha condición, es decir, sobreexpresión o inhibición.
La obtención de estos conjuntos de datos ha formado parte de las omicas, como la
proteómica, genómica y metabolómica entre otras más12,13. Las omicas permiten
obtener grupos masivos de datos biológicos de cierta condición fisiológica o
patológica14, los cuales puedan ser integrados e interpretados por métodos
computacionales, dentro de estas se encuentra la bioinformática con la minería de
datos y el análisis bioestadístico que permiten extraer y relacionar los datos más
relevantes del conjunto de datos 12. Una disciplina naciente conocida como biología
de sistemas, ha permitido integrar y estudiar estos datos biológicos u omicos bajo
la presunción que cada unidad medida (gen, proteína o metabolito) es un
componente de un sistema, por lo que la asociación de cambios o alteraciones
significativas en estas puede representar un biomarcador 12.
El enfoque que establece biología de sistemas ha permitido comprender como es la
integración del funcionamiento de los sistemas o procesos biológicos y profundizar
en el entendimiento de sus propiedades. Con lo cual se ha logrado predecir nuevos
blancos terapéuticos 15, reacciones adversas a fármacos 16, descubrimiento de rutas
metabólicas y de señalización 17, estudio de redes con rutas o genes silenciados 18,
establecimiento de asociaciones entre redes evolutivas 19, y modelamiento de redes
metabólicas, de señalización o de interacción 20–22. En cuanto a la búsqueda de
nuevos biomarcadores, empleando aproximaciones como análisis y reconstrucción
de sistemas o redes metabólicas, se han generado modelos de diferentes errores
innatos en el metabolismo permitiendo obtener potenciales biomarcadores para
estas enfermedades 23. A pesar que las redes metabólicas se han empleado en una
amplia variedad de campos, en el caso particular de MPS no existen reportes que
hagan uso de aproximaciones como biología de sistemas para comprender el efecto
del silenciamiento de las reacciones de degradación de GAG sobre el
funcionamiento celular, de señalización o para la identificación de nuevos
biomarcadores.
16
En resumen, existe evidencia de múltiples cambios que ocurre en MPS, sus daños
irreversibles son procesos relacionados a la acumulación de GAG2,24,25, estos se
han estudiado de forma individual por más de cien años, pero no se dispone de los
mecanismos celulares, moleculares y fisiopatológicos en conjunto para definir el
diagnóstico correcto y a tiempo. Adicional, estas deficiencias o vacíos en el
conocimiento han generado que los costos de tratamiento de estos pacientes sean
elevados. Por lo tanto, marcadores biológicos que puedan ser usados en
diagnóstico, pronóstico, seguimiento y evaluación en estas enfermedades son
factores importantes para conectar los vacíos en el conocimiento y crear interés en
el abordaje investigativo de estas patologías. Por eso estudiar una enfermedad que
compromete diferentes procesos funcionales y estructurales de la célula de manera
sistémica, permitirá determinar nuevas características o propiedades de los cuales
se pueden extraer marcadores biológicos propios de dichos sucesos para su
posterior validación y aplicación en el ámbito clínico.
17
4 MARCO TEÓRICO
4.1 ERRORES INNATOS DEL METABOLISMO Y MUCOPOLISACARIDOSIS
4.1.1 Errores innatos en el metabolismo
Los errores innatos en el metabolismo (EIM) son enfermedades monogénicas,
de herencia autosómica recesiva en su mayoría, que generan alteraciones
bioquímicas debido deficiencia en la función de proteínas involucradas en el
metabolismo de aminoácidos, carbohidratos, lípidos y nucleótidos26. La
acumulación o ausencia de sustratos por el bloqueo de rutas metabólicas
desencadena una serie de procesos patológicos característicos de cada EIM 27.
Algunas clasificaciones de los EIM incluyen26:
- Errores innatos del metabolismo tipo “intoxicación”: en el que
progresivamente se van acumulando metabolitos que se vuelven nocivos.
Por ejemplo, la acumulación del aminoácido fenilalanina por defecto en sus
proteínas de biotransformación.
- Errores congénitos del metabolismo tipo “déficit energético”: se caracteriza
por fallo multi-sistémico general y progresivo y es causado por rutas
metabólicas encargadas de generar energía, por ejemplo defectos en la
fosforilación oxidativa.
- Errores congénitos del metabolismo de los organelos celulares: las
alteraciones en el metabolismo de macromoléculas genera la acumulación
de estos. En esta se encuentra la mucopolisacaridosis que por defectos en
alaguna de las proteínas lisosomales encargadas en la degradación de
glucosaminoglicanos, se genera una acumulación de estos sustratos en
lisosoma.
La presentación clínica de los EIM varía en su edad de inicio y severidad
clínica28. Durante el diagnóstico de un EIM se tienen en cuenta aspectos como
la historia familiar, examen físico (dermatitis, alopecia, dismorfia facial), estudios
iniciales que incluye hemogramas, niveles de electrolitos, glucosa, amonio,
lactato, relación lactato/piruvato, sustancias reductoras, ácidos orgánicos,
aminoácidos, cetonas), análisis de metabolitos propios del metabolismo de la
enfermedad (e.g mucopolisacaridosis, gangliósidos, aminoácidos, ácidos
orgánicos), entre otros28–30. Adicionalmente, algunos países realizan tamizajes
neonatales para identificar estas patologías antes de presentar los primeros
síntomas31,32, sin embargo para algunas enfermedades metabólicas como las
aminoacidopatías, academias orgánicas, defectos en el ciclo de la urea,
18
intolerancia a azucares e intoxicación por metales33 donde se acumulan
metabolitos tóxicos el tratamiento se dirige a una dieta controlada entre los que
se encuentran restricciones dietarías, administración de suplementos dietarios y
estimulación de la actividad residual enzimática por administración de
cofactores28. Otras EIM que involucran enzimas peroximales o lisosomales
deficientes se emplean como tratamientos principales el reemplazo de células
sanas hematopoyéticas y la terapia de reemplazo enzimático; diferentes
tratamientos incluyen moléculas chaperonas, terapia génica e inhibidores de
sustratos28. Todas estas aproximaciones se realizan de acuerdo a las bases
bioquímicas y genéticas de cada patología, por esta razón la búsqueda de
propiedades emergentes del defecto de la enfermedad por interacción con el
resto del organismo es muy interesante de abordar para encontrar nuevas
alternativas terapéuticas y paliativas.
Por otro lado, a pesar de que individualmente tienen prevalencias bajas y por lo
tanto son considerados como enfermedades raras, en conjunto tienen una alta
prevalencia (1/500 recién nacidos vivos) por lo que llegan a ser consideradas
como una prioridad de salud. Aunque se han realizado algunas evaluaciones de
los EIM que se presentan en Colombia, no se ha logrado determinar cómo es la
situación actual en todo el territorio nacional 34. Algunas iniciativas legislativas
como la ley 1392 de 2010 estableció que “Por medio de la cual se reconocen las
enfermedades huérfanas como de especial interés y se adoptan normas
tendientes a garantizar la protección social por parte del Estado colombiano a la
población que padece de enfermedades huérfanas y sus cuidadores.”. Estas
iniciativas buscan mejorar la financiación en el abordaje terapéutico y
diagnóstico, censar las EIM, incentivar la investigación y controlar la correcta
prestación de servicio en salud a estos pacientes.
4.1.2 Enfermedades de depósito lisosomal
Los lisosomas son el compartimento primario del catabolismo en células
eucariotas, en humanos están presentes en todos los tipos de células excepto
en eritrocitos. Estos degradan material extracelular que ha sido internalizado por
endocitosis y componentes intracelulares que han sido secuestrados por
autofagia, manteniendo el balance catabólico-anabólico celular 35. Para el
cumplimiento de estas funciones existen dos clases de proteínas que son
esenciales en los lisosomas:
- Hidrolasas ácidas, entre las que se incluyen proteasas, lipasas, nucleasas,
glicosidasas, fosfolipasas, fosfatasas y sulfatasas, las cuales presentan su
máxima actividad a pH bajos, que son controlados por bombas ATPasas que
19
atraviesan la membrana lisosomal. Las enzimas lisosomales se unen en
complejos multi-enzimáticos que degradan coordinadamente
glicoesfingolípidos, glicosaminoglicanos, oligosacáridos y glicoproteínas.
Los complejos multi-enzimáticos son un conjunto de enzimas en el que cada
producto generado por una enzima es sustrato de las otras. Un ejemplo es
neuraminidasa 1 (NEU1) y β-galactosidasa (β-Gal)36.
- Proteínas integrales de membrana lisosomal (PIM)37, los cuales residen
principalmente en el límite de la membrana lisosomal y tienen diversas
funciones, incluyendo acidificación del lumen lisosomal, importación de
proteínas desde el citosol, protección de la membrana por acción de las
hidrolasas acidas, fusión de membrana y transporte de productos de
degradación al citosol. Las PIM más abundantes son las proteínas de
membrana asociada al lisosoma (LAMP1, LAMP2, lysosome-associated
membrane protein 1), proteína integral de membrana lisosomal 2 (LIMP,
lysosome integral membrane protein 2; también conocida como SCARB2) y
la tetraspanina CD6337,38.
La función lisosomal esta complementada por organelos similares a los
lisosomas (OSL), tales como melanosomas, gránulos líticos, compartimentos del
complejo mayor de histocompatibilidad clase II y gránulos de plaquetas 38. Los
lisosomas y los OSL están involucrados en varios procesos fisiológicos, tales
como homeostasis de colesterol, reparación de la membrana plasmática,
remodelamiento de tejidos y hueso, defensa contra patógenos, señalización y
muerte celular. Estas funciones hacen que el lisosoma se convierta en un
organelo dinámico y fundamental37. A partir de sus múltiples componentes
estructurales y funcionales los lisosomas cumplen múltiples funciones dentro de
los mecanismos normales para la viabilidad celular: autofagia (macroautofagia y
autofagia mediada por chaperonas), heterofagia, endocitosis/fagocitosis,
exocitosis y muerte celular, ver Tabla 137,39.
Tabla 1. Funciones lisosomales. Principales funciones del lisosoma en las células eucariotas. Tomado y modificado de Boya., 2012.
Función lisosomal Actividades lisosomales
Autofagia
Control de calidad de organelos
Degradación de macromoléculas
Eliminación de agregados
Homeostasis de colesterol
Procesamiento de proteínas
20
Supervivencia celular
Activación de mTOR
Endocitosis/fagocitosis
Reciclaje de receptores de superficie
Presentación de antígenos
Degradación de matriz extracelular
Remoción de patógenos
Exocitosis
Reparación de la membrana plasmática
Erosión ósea
Remodelamiento tisular
Metástasis
Muerte celular Permeabilización de la membrana lisosomal
En general, la ruta de degradación endocítica comienza en la membrana
plasmática y termina en el lisosoma donde se hace la captura de algún
componente que es internalizado y movilizado a través de diferentes
mecanismos. Durante este proceso el cargamento pasa a través de diferentes
compartimentos que generan la clasificación del material a ser procesado, se
han distinguido endosomas tempranos o también llamados endosomas de
clasificación tubular que pueden dirigir el cargamento al aparato de Golgi,
también reciben proteínas endógenas provenientes del aparato de Golgi, tales
como hidrolasas lisosomales marcadas con manosa-6-fosfato37,39. La carga
puede dirigirse a endosomas tardíos o secundarios que distribuirán diferentes
vesículas de degradación al lisosoma. Por lo que la principal función de estos
endosomas es la de distribuir estas cargas de degradación o reciclaje39.
A diferencia de los procesos de degradación externos, durante la
macroautofagia de componentes citoplasmáticos, proteínas deterioradas y
organelos completos son degradados y reciclados para generar los bloques de
construcción para procesos anabólicos, este proceso ocurre en diferentes
estadios metabólicos como la inanición o para la degradación de organelos
alterados40. La autofagia mediada por chaperonas (AMC) es un proceso por el
cual las proteínas citosólicas, proteínas de membrana, o nucleares que albergan
un motivo con secuencias de aminoácidos específicas se incorporan en los
lisosomas a través de la acción combinada de una chaperona (usualmente
Hcs70) y el receptor lisosomal Lamp-2A39,41.
Cuando las funciones normales del lisosoma son interrumpidas se inicia una
cascada patológicas incluyendo homeostasis del calcio, estrés oxidativo,
21
inflamación, autofagia, estrés en el retículo endoplasmático, y respuestas
autoinmunes37,42,43. Estas deficiencias pueden ocurrir por múltiples mecanismos,
el más común es un efecto genético que altere proteínas involucradas en el
correcto funcionamiento del lisosoma, estas proteínas pueden ser proteínas de
transporte de endosomas, biogénesis del lisosoma, hidrolasas lisosomales,
proteínas de membrana lisosomal, o también pueden ser inducidas por fármacos
como amiodarodona o cloroquina44. Mayoritariamente estas enfermedades son
producto de la deficiencia de las enzimas lisosomales, por lo tanto se han
clasificado por la macromolécula que no ha puede ser degradada. Actualmente
se conocen 58 enfermedades de depósito entre las que se encuentran las
mucopolisacaridosis, la deficiencia múltiple de sulfatasas; las esfingolipidosis
(Fabry, Farber lipogranulomatosis, Gaucher, Krabbe, leucodistrofia
metacromatica, Nieman-Pick A y B, ganglidiosis GM1 y GM2); las
oligosacaridosis y -glucoproteinosis (aspartiglucosaminuria, fucosidosis, alfa-
manosidosis, beta-manosidosis, sialidosis); y la glucogenosis tipo II
(Enfermedad de Pompe)45.
Figura 1. Esquema de las diferentes enfermedades de depósito lisosomal. La enfermedad de Griscelli (GS), Hermansky-Pudlak (HPS) y Chdiak-Higashi (CHS) presentan alteraciones en el tráfico vesicular observándose grandes inclusiones en organelos similares a
22
lisosomas (OSL-LRO). Pompe es una patología donde esta alterada la hidrólisis de glicógeno, en Mucopolisacaridosis (MPS) esta alterada la ruta de degradación de glucosaminoglicanos mediada por hidrolasas. Entrelas lipidosis están: Gaucher está asociada con alteraciones en la ruta de degradación de lípidos, Fabry está relacionada con la hidrólisis de glicoesfingolípidos alteración de la función de las balsas lipídicas, Nieman-Pick, relacionada con el metabolismo de colesterol, Tay-Sachs está relacionada con la hidrólisis de esfingolípidos. I-cell es una patología asociada con la deficiencia en el marcaje de las enzimas lisosomales, luego son dirigidas al exterior celular. La deficiencia múltiple de sulfatasas (MSD) es una deficiencia en la activación de sulfatasas luego se acumulan glucosaminoglicanos, sulfátidos y gangliosidos. Tomado y modificado de Parkinson-Lawrence et al., 2010.
4.1.3 Glucosaminoglicanos y Proteoglicanos
La matriz extracelular (MEC) es un componente dinámico extracelular que forma
una compleja y organizada red tridimensional entre las células de diferentes
tejidos en un órgano46. La MEC provee un entorno físico para los componentes
extracelulares y también está involucrada en el inicio de señales bioquímicas y
biomecánicas requeridas para la homeostasis47, diferenciación48 y morfogénesis
tisular49. Está compuesta principalmente por dos clases de macromoléculas:
proteoglicanos y proteínas fibrosas49, y unas moléculas de funciones específicas
conocidas como proteínas matricelulares50, que no tienen un rol estructural pero
en cambio estas modulan la función celular por interacciones con los receptores
de membrana, proteasas, hormonas y otras moléculas bioefectoras, así como
también con proteínas estructurales de la MEC50,51.
Los proteoglicanos (PG) son proteínas glicosiladas las cuales están unidos
covalentemente a glucosaminoglicanos (GAG) (tabla 2), la unión puede ser por
la interacción de sus grupos carboxilo o sulfuro con residuos de aminoácidos
básicos (arginina o lisina)52. Los PG se han clasificado de acuerdo al núcleo
proteico, la localización y la composición de GAG53. Las tres principales familias
son proteoglicanos pequeños ricos en leucina, proteoglicanos modulares y
proteoglicanos de superficie celular53. Los GAG con los que pueden interactuar
se han denominado como heparan sulfato (HS), condroitin sulfato (CS),
dermatan sulfato (DS), queratan sulfato (QS) y ácido hialurónico (HA), este
último es el único que se une a proteínas por medio de enlaces covalentes. Los
GAG son polisacáridos lineales formados por repeticiones de disacáridos,
normalmente entre un amino azúcar, que puede ser N-acetil-D-glucosamina
(GlcNAc) o N-acetil-D-galactosamina (GalNAc), y un ácido idurónico que puede
ser ácido glucurónico (GlcA) o ácido idurónico (IdoA) (tabla 2), el queratan sulfato
está constituido por galactosa en vez del ácido urónico54. Los GAG están
implicados en diferentes procesos biológicos como inflamación, señalización,
organización estructural de otras proteínas de la MEC, acoplamiento con
receptores de membrana, eliminación de radicales libres, formación de geles
23
entre las articulaciones para la absorción de presiones, cascada de coagulación,
entre otras más. Muchas de las funciones se presentan dadas las circunstancias,
por ejemplo, cuando existe una herida en piel, el heparan sulfato que se
encuentra unido a diferentes núcleos proteicos es liberado por endoglicosidasas
al medio para cumplir funciones como la presentación de factores de crecimiento
como FGF-2, regulación de los gradientes de citoquinas y quimiocinas,
reclutamiento de leucocitos55. Los GAG tienen diferentes grados de sulfatación
que los vuelve una amplia gama de diferentes núcleos y se ha observado que
estas sulfataciones son los que ejercen las diferentes funciones56.
La biosíntesis de estos compuestos comienza por la síntesis de los núcleos
proteicos, a los cuales se les realiza adiciones sucesivas de los diferentes tipos
de azucares; inicialmente todos los núcleos proteicos se les adiciona una cadena
de cuatro residuos de azucares (GlcA β(1->3) Gal β(1->3) Gal β(1->4) Xil), de
este iniciador y dependiendo de la necesidad del tejido se realiza la adición de
los siguientes azucares con enzimas específicas, para CS/DS la GalNAc-
transferasa I adiciona una GalNAc β(1->4) mientras que el complejo de enzimas
GlcNAc-transferasa y GlcA-transferasa adicionan sucesivamente sus
respectivos sustratos, finalmente ocurren pasos sucesivos de sulfatación de
diferentes sustituyentes de los azucares. Para la síntesis de queratan sulfato se
inicia con la adición N- u O- de los respectivos oligosacáridos, GlcNAc y Gal57.
La degradación de GAG ocurre en los lisosomas, los cuales contienen las
enzimas hidrolíticas que se activan a pH menor de 5. Se conoce que la vida
media de los GAG son de 120 días para QS, 3 días para HA y 10 días para
CS/DS. Estos son internalizados por endocitosis, inicialmente se degradan los
núcleos proteicos por proteasas y luego se acortan las secuencias de GAG por
endoglicosidasas. Los fragmentos cortados son degradados por una serie de
exoglicosidasas y sulfatasas 57,58.
- Ácido hialurónico: este GAG requiere de cuatro hidrolasas.
- HS: inicialmente es degradado por una endoglucuronidasa, la degradación
consta de tres sulfatas, cuatro hidrolasas y una transferasa.
- CS/DS: estas cadenas comparten similitudes estructurales ya que entre los
azucares que pueden estar presente en dermatan sulfato se encuentra el ácido
idurónico o glucurónico. Condroitin sulfato tiene varias modificaciones en la
unión de los monosacáridos, de los cuales se han derivado otras clasificaciones
de este GAG, por ejemplo, la repetición del disacárido GlcA β (1->3) GalNAc4S
corresponde a un GAG que se encuentra mayoritariamente en cartílago,
24
mientras que la repetición del disacárido IdoA α (1->3) GalNAc4S que
corresponde al GAG dermatan se encuentra en piel y tendones. Sin embargo la
degradación de estos GAG se realiza por las mismas enzimas entre las que
están tres sulfatasas, y dos hidrolasas.
- QS: este N- u O-glicano está altamente sulfatado, por lo que requiere de
pasos sucesivos de la acción de tres exoglicosidasas y tres sulfatasas.
Cuando alguna de las enzimas es inactiva o deficiente, entonces estos procesos
sucesivos de degradación se ven interrumpidos entonces se genera lo que
comúnmente se conoce como mucopolisacaridosis24. En la Figura 2 se presenta
las diferentes rutas de degradación de los GAG.
Figura 2. Diferentes rutas de degradación de GAG. Tomado y modificado de Lawrence et al., 2014.
25
Tabla 2. Tipos de GAG. Existen 4 tipos de GAG que están unidos a diferentes tipos de proteínas extracelulares y de membrana: Heparan, condroitin, dermatan y queratan sulfato. El GAG que no se encuentra unido a proteínas es el ácido hialurónico. Tomada y modificada de Prydz et al., 2000.
4.1.4 Mucopolisacaridosis
Las MPS son una familia de enfermedades hereditarias clasificadas dentro de
los desórdenes de depósito lisosomal, producidas por la acumulación de GAG
parcialmente degradados en el lisosoma. Esta acumulación es generada por la
pérdida, total o parcial, de la actividad de una de las enzimas involucradas en la
degradación de estos compuestos45. Hasta el momento se han identificado 11
subtipos de MPS que se diferencian por los GAG acumulados y la enzima
defectuosa, en el apartado 1.1.5 se describe con más detalle los tipos de MPS.
La caracterización de las bases bioquímicas y genéticas de las MPS ha permitido
el desarrollo de herramientas diagnósticas así como de tratamientos
específicos3. El diagnóstico y seguimiento terapéutico, tradicionalmente se ha
realizado mediante la identificación y cuantificación de los GAG en muestras de
orina o sangre, así como también mediante la determinación de la actividad
enzimática de la enzima deficiente en cada MPS59. Pero estas metodologías
tienen muchas desventajas que se abordan en la sección 4.2.
26
Las MPS presentan una incidencia mundial de 1:22000 nacimientos vivos
(n.v)60,61. En Colombia se cuentan con pocos datos sobre la incidencia de esta
enfermedad, aunque recientemente se reportó una incidencia de 1.98:100.000
n.v34. Adicionalmente, en Colombia se han adelantado un número importante de
investigaciones en diferentes temas relacionados con este grupo de
enfermedades tales como: análisis del impacto socio-cultural de la
enfermedad34,62,63, la identificación de casos de MPS62,63, identificación de
mutaciones64, modelamiento de proteínas defectuosas65, producción de enzimas
recombinantes66,67, y terapia génica68–70.
4.1.5 Tipos de mucopolisacaridosis
A continuación se describen las características bioquímicas, clínicas,
fisiopatológicas, diagnóstico, tratamiento e incidencia, en la tabla 3 se presenta
el consolidado de las características de cada MPS:
Mucopolisacaridosis tipo I: La MPS I, es producida por la deficiencia en la
actividad hidrolasa de la enzima α-L-iduronidasa (IDUA - E.C. 3.2.1.76), lo cual
puede generar tres fenotipos diferentes Hurler (OMIM #607014), Hurler-Scheie
(OMIM #607015) y Scheie (OMIM #607016), esta deficiencia produce la
acumulación de heparan y dermatan sulfato en el lisosoma. El gen IDUA,
codificante para esta enzima, se encuentra ubicado en 4p16.3, y contiene 14
exones que codifican una enzima de 563 aminoacidos71. Las mutaciones que
sufre este gen principalmente han sido asociados a splicing alternativos y
deleciones/inserciones de nucleótidos72. Las mutaciones más comunes
encontradas en caucásicos con W402X y Q70X73, L578Q y P533R se detectaron
en pacientes tunecíes74. A pesar que no se logra relacionar plenamente el
genotipo fenotipo de la enfermedad se conoce que las mutaciones sin sentido,
inserciones/deleciones en ambos alelos desarrollan en su mayoría el síndrome
de Hurler75. MPS I se ha subclasificado según su grado de severidad: el
síndrome de Hurler es el fenotipo más frecuente y severo que se caracteriza por
un deterioro progresivo del sistema nervioso central, además de severas
manifestaciones músculo-esqueléticas, pulmonares y cardiacas, hernias
umbilicales y opacidad corneal76. Los síntomas comienzan a desarrollarse desde
los 6 a 24 meses de vida, observándose una alteración en el desarrollo,
macrocefalia, faces gruesas, hernias, disostosis múltiple, rigidez y contracción
de articulaciones, hepatoesplenomegalia, opacidad corneal sordera e inicia el
deterioro mental77. El síndrome de Hurler/Scheie se ha clasificado como una
forma moderada de la enfermedad, se diferencian de la forma severa porque
tienen inteligencia normal o casi normal, de manera similar presentan algunas
de las alteraciones que se observan en la forma severa pero más atenuada, a lo
27
que se le ha asimilado la deficiencia parcial de la enzima. Esta enfermedad
puede limitar la vida hasta la segunda o tercera década de vida si no se ha
realizado algún tipo de tratamiento78. Finalmente, el síndrome de Scheie es la
forma leve de la enfermedad los síntomas suelen aparecer a partir de los cinco
años, pero son tan leves que con frecuencia el diagnostico no se considera hasta
la edad adulta24.
Mucopolisacaridosis II: El síndrome de Hunter (OMIM #309900) es la única de
las MPS que su transmisión se encuentra ligada al cromosoma X. La MPS II está
es producida por la deficiencia de la enzima iduronato-2- sulfatasa (I2S - EC
3.1.6.13), favoreciendo la acumulación de dermatan y heparan sulfato24. El gen
responsable de la enfermedad se localiza en I2S Xq28, el cual contiene 9
exones. Existe un seudogen I2S2 que contiene secuencias que son homologas
a los exones 2 y 3, aunque en secuencia reversa, y de los intrones 2, 3 y 7 del
gen I2S79. Hasta la fecha se conocen cerca de 300 mutaciones entre las que se
presentan deleciones/inserciones, rearreglos gen/seudogen, las cuales se han
relacionado con la forma severa de la enfermedad80. La enfermedad se ha
clasificado en fenotipo severo y moderado, los cuales se diferencian por el grado
de afectación del sistema nerviosos central y el tiempo de vida. Los síntomas
comienzan a aparecer entre los dos y cuatro años de edad, con afectaciones
respiratorias, hernias inguinales y umbilicales, corta estatura, macroglosia,
hiperplasia gingival; apnea del sueño, disostosis múltiple, macrocefalia, primera
o segunda vertebra anormales, y síndrome del túnel carpiano. La muerte es
ocasionada normalmente por obstrucción respiratoria o falla cardiaca81,82.
Mucopolisacaridosis III: La MPS III, o síndrome de Sanfilippo, es causado por
la alteración en la degradación del heparan sulfato. Se han caracterizado 4
subtipos para esta enfermedad:
1. MPS IIIA (OMIM #252900): heparan N-sulfatasa (SGSH - E.C. 3.10.1.1).
2. MPS IIIB (OMIM #251920): α-Nacetilglucosaminidasa (NAGLU - E.C.
3.2.1.50).
3. MPS IIIC (OMIM #252930): Acetil-CoA: α-glucosaminida acetiltransferasa
(HGSNAT -E.C. 2.3.1.78).
4. MPS IIID (OMIM #252940): N-acetilglucosamina-6-sulfatasa (GNS - E.C.
3.1.6.14).
Este síndrome se caracteriza por una degeneración del sistema nervioso central
severo con una alteración somática leve. Algunas características fenotípicas son
hiperactividad, crecimiento lento, cabello grueso, hirsutismo, desordenes del
28
sueño, y hepatosplenomegalia leve. Las anormalidades esqueléticas, son
mínimas con una leve disostosis múltiple, usualmente tienen una estatura
promedio, y una rigidez articular leve83. Las MPS IIIA y IIIB son las más comunes.
Esta patología afecta principalmente las neuronas de sistema nervioso central.
Los pacientes mueren en la segunda década o al comienzo de la tercera década.
Es por esto que los incentivos de abordaje clínico se centran en el conocimiento
de la alteración de la barrera hemtoencefalica, ya que se han observado cambios
morfológicos como dilatación del espacio perivascular en los capilares de la
materia blanca, atrofia cortical e hinchazón neuronal. Adicional, se ha observado
la acumulación de gangliosidos GM3. Por lo que entender la fisiopatología de
esta MPS en particular ya que se intenta la administración de las terapias para
las otras MPS84.
Mucopolisacaridosis IV: La MPS IV, o enfermedad de Morquio, se clasifica en
los subtipos A y B, diferenciadas por la enzima que esta deficiente y que afecta
la degradación de queratan sulfato y condroitin-6-sulfato. En MPS IVA (OMIM
#253000) la enzima deficiente es la N-acetilgalactosamina-6-sulfatasa (GALNS
- E.C.3.1.6.4)85, y se caracteriza por anormalidades esqueléticas, opacidad
corneal, daño cardiaco y en articulaciones, baja estatura, con cuello y tronco
cortos, displasia de cadera, alteraciones de la columna y tórax en quilla11,86. La
enfermedad de Morquio B (OMIM #253010), es causada por la deficiencia de la
enzima β-galactosidasa (GLB1 - EC 3.2.1.23) la cual es esencial para el
catabolismo de glicoconjugados con residuos terminales de β-galactosil. Esta
enzima también está involucrada en otra enfermedad de depósito lisosomal,
conocida como gangliosidosis GM1, donde se acumulan gangliosidos,
lactosilceramida87. Morquio B es característica por las deformidades óseas, la
opacidad corneal y la alteración de la función cardiaca88. Estudios funcionales
indicaron que la mutación de la proteína de Morquio B está asociada con la
secreción alterada de tropoelastina y su incapacidad para ensamblarse en fibras
elástica, lo que resulta en elastogenesis deficiente89.
Mucopolisacaridosis VI: conocida como síndrome de Maroteaux-Lamy (OMIM
# 253200), es causada por la deficiencia en la actividad de la enzima N-
acetilgalactosamina-4-sulfatasa (ARSB - E.C.3.1.6.12) la cual degrada el GAG
dermatan sulfato90. La acumulación de este GAG resulta en problemas a nivel
del tejido conectivo de la piel, válvulas cardiacas, respiratorias, y alteraciones
óseas2. Se han reportado dos modos de avance de la enfermedad, uno rápido
que se liga con un fenotipo severo y uno de avance lento que se asocia con el
fenotipo moderado o leve24. Aunque en estos últimos tipos se puede llegar a
presentar síntomas severos en un solo órgano, que a futuro requerirá de alguna
29
cirugía91. Se ha descrito formas rápidamente progresivas de la enfermedad, en
el que la vía respiratoria se ve altamente afectada por la gran cantidad de GAG
acumulado, produciendo otros síntomas como enfermedad pulmonar
obstructiva, apnea del sueño entre otras. Diferentes análisis genéticos se han
desarrollado en esta enfermedad caracterizando que la mayoría de mutaciones
están relacionadas con mutaciones sin sentido y contrasentido92.
Mucopolisacaridosis VII: también conocida como síndrome de Sly (OMIM #
253220) en la cual la enzima deficiente es la β-glucuronidasa (GUSB - EC
3.2.1.31), que conlleva a la acumulación de dermatan, heparan y condroitin
sulfato en el lisosoma. Los acontecimientos fenotípicos que se presentan en este
síndrome incluyen hepatosplenomegalia, opacidad corneal, retardo mental,
disostosis múltiple, e hidrops fetalis93. En su mayoría las mutaciones son sin
sentido o contrasentido, se han encontrado mutaciones por splicing94. Algunos
estudios han mostrado como el efecto de la acumulación de estos GAG pueden
alterar la actividad de proteínas como STAT3 o el factor inhibitorio de leucemia
(LIF) que disminuyen la proliferación en condrocitos y por lo tanto en el desarrollo
de huesos cortos95.
Mucopolisacaridosis IX: es causada por la deficiencia en la hialuronidasa.
Descrita en 1996 por Natowitcz en el que describió un paciente varón con baja
estatura y múltiples masas de tejidos blandos periarticulares comprobando que
correspondía a un almacenamiento de ácido hialurónico 24. Triggs-Raine et al,
1999 determinó que la mutación se encontraba sobre el gen HYAL1 que
presentaba una mutación sin sentido para este paciente. Los síntomas descritos
para estos pacientes han sido formación de masas modulares en las coyunturas,
relacionándose con procesos inflamatorios, cambios faciales leves, inteligencia
normal96.
Tabla 3. Resumen de las características bioquímicas y genéticas de las MPS.
Enfermedad Subtipo Deficiencia enzimática Gen
(localización) GAG
acumulado
MPS I Hurler – Hurler/Scheie –
Scheie
α-L-iduronidasa IDUA 4p16.3 DS + HS
MPS II Hunter Iduronato-2-sulfatasa IDS Xq28 DS + HS
MPS IIIA Sanfilippo A Hepara-N-sulfatasa SGSH 17q25.3
HS
MPS IIIB Sanfilippo B α-N-Acetilglucosaminidasa
NAGLU 17q21
HS
30
MPS IIIC Sanfilippo C Heparan acetil-CoA:α-glucosamina N-acetiltransferasa
HGSNAT 8p11.1
HS
MPS IIID Sanfilippo D N-acetilglucosamina 6-sulfatasa
GNS 12q14 HS
MPS IVA Morquio A Galactosa 6-sulfatasa GALNS 16q24.3
CS + QS
MPS IVB Morquio B Β-galactosidasa GLB1 3p21.33
QS
MPS VI Maroteaux-Lamy Arlsulfatasa B ARSB 5q11-q13
DS
MPS VII Sly Β-glucuronidasa GUSB 7q21.11
DS + CS + QS
MPS IX - Hialuronidasa I HYAL 3p21.3 AH
4.2 DIAGNÓSTICO Y TRATAMIENTO DE MUCOPOLISACARIDOSIS
El diagnóstico de las mucopolisacaridosis es uno de los pasos más importantes en
el abordaje clínico de la enfermedad, ya que la realización de un correcto
diagnóstico permite iniciar de forma oportuna el tratamiento paliativo o específico97.
El diagnóstico diferencial de MPS se realiza con las primeras observaciones del
médico pediatra o neonatologo, quien reconoce algunos signos y síntomas98,
aunque la mayoría de los neonatos son asintomáticos a medida que el paciente va
creciendo se van presentando signos y síntomas clínicos como hernias inguinales
y umbilicales, faces toscas, hepatosplenomegalia, deformidades óseas y en
articulaciones, también puede existir anormalidades en sistema nervioso central97.
Otros análisis que acompañan el diagnostico en MPS examinación oftalmológica,
cardiaca para detectar opacidad corneal, glaucoma, enfermedad valvular,
cardiomiopatía, y falla cardiaca99,100. La severidad de los síntomas varía según cada
subtipo de la enfermedad dejando una esperanza de vida que no supera la primera
o segunda década de vida101.
Diferentes características fenotípicas, moleculares y bioquímicas pueden confirmar
el diagnóstico de MPS, las cuales confirman la presencia de MPS y diferencian el
tipo que presenta el paciente102; algunos algoritmos se han creado para
correlacionar el tipo de mutación junto otras características clínicas para predecir el
fenotipo en MPS I, con el cual se pretendió mejorar el proceso de diagnóstico para
optar por el tratamiento adecuado así como también para ser empleado en el
tamizaje neonatal78. El análisis fenotípico se realiza por varias características
mencionadas anteriormente. El análisis molecular busca específicamente la
mutación que pudo generar la deficiencia enzimática, puede ser útil en el pronóstico
cuando la mutación está asociada a la severidad de la MPS. En los análisis
31
bioquímicos se empleó inicialmente la detección de GAG en orina, sin embargo la
medición de la actividad enzimática que se realiza en tejidos (sangre y fibroblastos)
permite confirmar realmente el tipo de MPS103.
Los ensayos para cuantificación de GAG son: azul de 1,9-dimetilmetileno (DMB),
cromatografías (TLC, HPLC, LC), pruebas de ELISA (Enzyme Linked
Inmunoabsorvent Assay), espectrometría masa en tándem (MS/MS). Estas técnicas
se han refinado con el fin de confirmar y determinar otros tipos de biomarcadores
como oligosacáridos específicos de cada MPS3,97,104. A partir de estos
oligosacáridos otras técnicas se han desarrollado para detectar disacáridos
característicos de cada MPS, mediante el procesamiento enzimático, marcaje con
anilina y posterior identificación por glicanos marcados por isotopos-cromatografía
liquida/espectrometría de masas (GRIL-LC/MS)59.
Al igual que para otros errores innatos del metabolismo, para las MPS se ha
comenzado a trabajar en pruebas de tamizaje neonatal que permita la detección
temprana de los pacientes104. Algunos de estos métodos incluyen análisis
moleculares de ADN, métodos de inmuno-captura de enzimas deficientes para MPS
tipo I, II, IIIA y VI, métodos de análisis de actividad enzimática y detección en
conjunto de dermatan, heparan y queratan sulfato por medio de cromatografía
liquida acoplada a espectrometría de masas en tándem104. Sin embargo, estos
métodos tienen sus desventajas y ventajas respecto a costos, sensibilidad y
detección de falsos positivos59. Lin et al., 2013 realizaron una prueba piloto en treinta
y cinco mil recién nacidos aproximadamente empleando una prueba fluoremétrica
para detectar mucopolisacaridosis tipo I, encontrándose 2 recién nacidos positivos
con deficiencia enzimática que fueron corroborados con análisis moleculares de
ADN.
El tratamiento de MPS principalmente se dirige a reducir los cúmulos de GAG en
los lisosomas mediante la administración de enzimas activas producidas de forma
recombinante para ser internalizadas por la célula y direccionadas al lisosoma1.
Un diagnóstico temprano permite dar un inicio oportuno de la terapia para reducir el
avance deletéreo de la enfermedad. Sin embargo, diferentes sucesos pueden
alterar un correcto diagnóstico, algunos de estos son:
- Se han reportado casos donde los padres detectan la enfermedad antes que
los médicos especialistas, ya que realizan búsquedas de los síntomas de su
hijo en internet106.
- Algunos países, como Colombia, que se encuentran en etapas de inicio de
los programas de tamizaje neonatal no contemplan aun estas
32
enfermedades, además no se disponen de los datos epidemiológicos
adecuados y por lo tanto no se puede lograr una detección temprana107.
- En fenotipos leves los síntomas se llegan a detectar en edad adulta.
- Respecto a los GAG como biomarcadores existe poca evidencia de la
relación con la severidad somática de la enfermedad, los GAG varían entre
individuos, tejidos, edad, función renal, masa corporal3. También se ha
observado la excreción de GAG diferentes a los implicados, en MPS I se han
examinado los niveles de excreción de QS, que disminuyeron una vez se
inició la terapia de reemplazo enzimático108.
- Las pruebas analíticas de GAG son insensibles, inespecíficas, costosas, y
demandantes para el análisis101.
Cuando se ha diagnosticado se puede plantear algún tratamiento para esta
enfermedad. Los tratamientos se han obtenido por métodos experimentales y
clínicos. Actualmente se encuentran aprobados el trasplante de células madre
hematopoyéticas y la terapia de reemplazo enzimático para MPS I (Larodinasa),
MPS II (Idursulfasa), y MPS VI (Galsulfasa)1,109–111. Para MPS III A a D, IV B y VII
las enzimas recombinantes se encuentran en desarrollo o en estudio1.
Recientemente, para MPS IV A se aprobó el tratamiento por ERT con
elosulfasa112,113. Otras alternativas terapia génica, análogos a gentamicina, y
moléculas chaperonas, las cuales se encuentran en etapas de estudio in vivo1.
4.2.1 Biomarcadores para el diagnóstico de mucopolisacaridosis
Los biomarcadores son moléculas producto de alteraciones biológicas en un
individuo, que pueden ser asociadas con alguna condición patológica9 y son
esenciales para el diagnóstico, pronóstico y monitoreo de la severidad de una
enfermedad. Cuando ocurren alteraciones patológicas ocurren es necesario
identificar y medir cambios significativos que identifiquen la patología con precisión,
con el fin de que el abordaje clínico sea el adecuado, por lo que es importante contar
con moléculas biológicas (biomarcadores) que sean únicas para cada patología13.
En MPS se han identificado dos tipos de biomarcadores, primarios y secundarios al
proceso bioquímico. Los biomarcadores primarios metabolitos que se acumulan por
la deficiencia de las proteínas que las metabolizan o transportan. En el caso de las
MPS los GAG son los biomarcadores primarios, como se mencionó anteriormente3.
Los biomarcadores secundarios son producto del proceso patológico primario y se
debe a la alteración de los procesos biológicos normales., Para las MPS se han
descrito alteraciones en respuesta a proteínas no plegadas, autofagia, disfunción
mitocondrial, estrés oxidativo, homeostasis del calcio, inflamación, alteración del
33
trafico vesicular, fusión lisosoma-endosoma24,114–119. De los cuales se han obtenido
biomarcadores secundarios como:
- Complejo trombina-heparina II (MPS I, II y VI): el cofactor de heparina II,
pertenece al grupo de proteasas llamadas serpinas (serina proteasa
inhibitoria), estas cumplen funciones importantes en el control de la
coagulación y la fibrinólisis120. Inicialmente se caracterizó este biomarcador
por análisis proteómicos usando modelos murinos de MPS I121. La heparina
y el heparan sulfato aumentan la tasa de inhibición de trombina por esta
serpina. En pacientes con MPS este nivel se mide mediante ELISA y se
encuentra aumentado debido a los altos niveles de GAG en sangre122.
Langford-Smith et al., 2011 demostraron que este biomarcador puede ser
empleado para el seguimiento a corto plazo de pacientes recibiendo terapia
de reemplazo enzimático, ya que las serpinas tienen alteraciones rápidas en
su actividad por la presencia de HS y heparina.
- Relación condroitin/dermatan sulfato (MPS I, II, II y VI): se emplea para la
evaluación a largo plazo de tratamientos de reemplazo enzimático4.
Normalmente tiende a disminuir esta razón una vez los niveles de DS o CS
bajan debido a la terapia por reemplazo enzimático.
- Dipeptidil peptidasa IV (MPS I y III): este biomarcador fue determinado en
plasma de pacientes con MPS. Esta enzima está encargada de remover
dipéptidos treonina-prolina del N-terminal de la apoliproteina CI, ubicada en
las lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL). Sin embargo, esta enzima
tiene otros 36 sustratos más entre el que se encuentran la hormona
liberadora de la hormona del crecimiento, por lo que podría ser uno de los
causantes de la corta estatura en pacientes con MPS123.
- Gangliósidos GM2 y GM3 (MPS III): así como en Niemann-pick y las
gangliosidosis GM1 y GM2 se acumulan gangliosidos, como procesos
patológicos secundarios y primarios, respectivamente, se ha visto alterados
en MPS III donde el GAG involucrado es heparan sulfato84. Existe también
un aumento de GM1 y GM2 en células neuronales de GM1 y GM2, con el
posterior secuestro de colesterol en los lisosomas5. Estas alteraciones
inducen procesos inflamatorios como activación de la microglia y astrocitos
reactivos.
- Inflamación: los GAG están involucrados en mecanismos de inicio y control
de eventos asociados con inflamación. Entre los que se incluyen producción
de citoquinas/quimiocinas, reclutamiento de leucocitos y maduración de
células inflamatorias55. Uno de las cascadas más conocidas en las que
intervienen los GAG es la activación del receptor Toll-like 4124. Se han
34
encontrado en modelos animales la producción de factor de necrosis tumoral-
α, ceramida e interlququina-1β125. Estos procesos se activan por el exceso
de GAG en plasma y liquido senovial activando macrófagos que liberan
diferentes moléculas inflamatorias55.
- Autofagia: a pesar de ser un proceso normal en la célula que ocurre en
momentos de inanición, para la formación de autofagosomas se requiere de
los lisosomas para que exista el ambiente adecuado para el procesamiento
de organelos126. En MPS VI se ha observado como estos procesos normales
de degradación como la autofagia o la poliubiquitinación de proteínas y otros
organelos importantes para la viabilidad celular como las mitocondrias son
alterados en los que se destaca la elevada producción de especies reactivas
de oxigeno127, desencadenando patrones patológicos relacionados a
inflamación y muerte celular. Se ha propuesto que MPS sean consideradas
como una enfermedad de autofagia, ya que este proceso es altamente
afectado, evitando que se degraden los organelos117.
Las aproximaciones por las cuales se han obtenido estos biomarcadores se han
enfocado en la observación clínica, experimentación en modelos animales,
experimentación en líneas celulares3,24,119. Sin embargo acercamientos
computacionales y bioinformáticos han tenido éxito en la predicción de nuevos
biomarcadores para diferentes patologías, ya que muchas aproximaciones como las
‘omicas’ permiten obtener perfiles de genes, RNA, proteínas y metabolitos alterados
que pueden ser estudiados de manera sistémica, sin embargo ninguna
aproximación existe para mucopolisacaridosis, algunos investigaciones se han
centrado en datos de expresión genómica en modelos animales con MPS, pero el
análisis se ha centrado en que genes se apagan o se encienden 13. Como se ha
observado los múltiples caminos o rutas metabólicas de señalización que están
alteradas en MPS permiten ver que el estudio global de la enfermedad permitirá
entender y conectar los procesos que allí ocurren25.
4.3 APROXIMACIONES COMPUTACIONALES PARA LA PREDICCIÓN DE
BIOMARCADORES.
La bioinformática se ha convertido en un área que ha permitido el análisis e
interpretación de la gran cantidad de datos de los que actualmente se disponen. La
disponibilidad del genoma completo ha permitido que áreas como la genómica, la
proteómica y la metabolómica se dirijan hacia la identificación de nuevas moléculas
que sean únicas y características de patologías como cáncer o enfermedades
neurodegenerativas. La implementación de estas herramientas bioinformáticas en
los datos de expresión como minería de datos, visualización de datos o la
integración de esta con bases de datos facilita la interpretación y la adaptación de
35
los resultados a campos de aplicación como el uso clínico. Chiassereni et al., 2014
realizaron una análisis proteómico en conjunto con técnicas bioinformáticas para
determinar la composición de proteínas de las vesículas extracelulares presentes
en el fluido cerebroespinal humano, entre los que lograron identificar 230 nuevas
proteínas, de esta manera se propuso que conocer la composición de estas
vesículas son importantes para la detección de nuevos biomarcadores en las
enfermedades neurodegenerativas o desórdenes neurológicos128. Algunas
revisiones de literatura ya abordan como la proteómica ha permitido encontrar varios
biomarcadores para ciertas patologías, como por ejemplo, Liu et al., 2014
mencionan como SAA (serum amyloid A), plasminogeno y proteína C9 han sido
biomarcadores para cáncer gástrico y que se han estudiado a partir de estas
técnicas experimentales y bioinformáticas129.
A partir de la información proporcionada por estas omicas durante los últimos 20
años, ahora se abordan de diferente manera el análisis de los datos genómicos,
proteómicos o metabólicos, es decir, cada dato se maneja como un componente de
un sistema, luego se estudian las propiedades emergentes que se observan por la
interacción de componentes y no por sus estudio independiente130.
4.4 BIOLOGÍA DE SISTEMAS
4.4.1 Redes biológicas
El modelo de estudio lineal o cartesiano ha sido parte de la investigación en las
ciencias. Normalmente, se ha estudiado un problema mediante la separación de sus
partes, para el estudio general de las mismas y la aproximación matemática sencilla
que generalice un suceso para describirlo131. Esta forma de abordar las ciencias,
como la biología, ha permitido comprender y entender cuáles son los componentes
y cómo funcionan dentro de un sistema o célula. Sin embargo, debido a esta
aproximación generalizada e individual comprender el funcionamiento celular total
se convierte en un problema que requeriría de muchos años de investigación y
recursos132. El dogma central de la biología es un ejemplo de esta visión, donde
solo tres componentes son los principales del comportamiento del sistema, sin
embargo es la interacción de estas con otras moléculas las que permiten realizar
una función, llevar un mensaje, o mediar una catálisis133.
En los últimos 10 años se ha fortalecido un nuevo enfoque que ha estudiado las
asociaciones e interacciones entre estos componentes concibiéndolos como
sistemas complejos, formando redes y conectados en múltiples niveles131. La
biología de sistemas ha sido la denominación que se le ha dado al estudio de redes
complejas biológicas por medio del análisis de las interacciones y/o asociaciones
36
de componentes entre componentes de esta red15. De esta forma, la biología de
sistemas estudia y reconstruye sistemas complejos los cuales describen el
comportamiento biológico. Estos sistemas son abiertos, con jerarquías y finalidades
comunes, autorganizados, alejados del equilibrio, y que se adaptan a equilibrios
externos134.
La integración de componentes cumple con el principio fundamental de sinergia, es
decir, la interacción y/o asociación de algún componente con muchos más implica
la aparición de propiedades emergentes, que muy difícilmente se podrían observar
por estudiar componente por componente15. Su organización y jerarquía interna
permite conocer de manera detallada que funciones y localizaciones cumplen
ciertos componentes134. Una de las primeras redes en aparecer, en la cual se
estudió la interacción entre proteínas fue para la levadura Saccharomyces
cerevisiae, que permitió identificar que las redes biológicas no están organizadas
de forma aleatoria, sino que algunas proteínas están conectadas con muchas otras
proteínas, y que la eliminación o silenciamiento de algunas de estas proteínas se
asocia con muerte del organismo135. De igual forma, otras proteínas no son letales,
esto es debido a otra propiedad de las redes y es la robustez, ante el cambio y el
colapso, mediado por mecanismos de sistemas de control (retroalimentación),
redundancia (redundancia), y degeneración de sus componentes (asimilación
facultativa de roles perdidos), desacoplamiento (tampones), y modularidad
(creación de subsistemas)133,134.
Las redes biológicas tienen unas características topológicas o estructurales que las
hacen diferentes a cualquier otro tipo de red. Se han definido tres tipos de redes
para cualquier sistema: aleatorias, libre de escala y jerárquicas. Las aleatorias son
redes cuyas interacciones internan no tienen algún orden y por lo tanto es fácil
desarmar estas redes131. Las redes biológicas se clasifican como de libre de escala
debido a que no todos sus componentes están conectados igualmente entre ellos,
sino que existen, unos pocos componentes que interactúan con muchos otros
componentes más de la red136. Estos componentes se conocen como Hubs (Figura
3), son de alta importancia y normalmente son componentes que median procesos
vitales para la célula131,136. Una característica común de todas estas redes
biológicas es que dos componentes pueden estar conectados por un camino de muy
pocos pasos a través de la red137. En las redes biológicas se ha observado un
camino que esta entre 3 y 4 pasos, esta característica también es conocida como
efecto del mundo pequeño, luego la información pasa rápidamente entre dos
componentes en el momento de alguna perturbación exterior137,138. Otra propiedad
de las redes biológicas está definida por un coeficiente de agrupamiento alto, es
37
decir, regiones de la red donde los componentes están altamente conectados entre
ellos, lo que se ve en redes metabólicas o de interacción entre proteínas.
Figura 3. Esquema de una red metabólica. Donde se señala un nodo altamente conectado (Hub). La acetil-coenzima A es un metabolito empleado en diferentes rutas sintéticas. Tomado y modificado de http://bigg.ucsd.edu/
4.4.2 Tipos de redes biológicas
Los componentes de la red se han definido como nodos y aristas. Los nodos pueden
ser genes, factores de transcripción, mRNA, proteínas, macromoléculas, fármacos,
entre otros. Las aristas son relaciones entre nodos y pueden ser interacciones
físicas o asociaciones funcionales136. Estas aristas pueden ser directas o indirectas,
las primeras especifican un nodo fuente y un nodo final, las segundas simplemente
relacionan interacciones como proteína-proteína (Figura 4).
Figura 4. Diferentes representaciones de una red. (a) representación metabólica de la síntesis de urinilmonofosfato a citosiltrifosfato con los cofactores y productos correspondientes. (b) representación de asociación entre los componentes de la figura
38
(a). (c) asociación de metabolitos de la reacción (a). Los nodos son metabolitos, cofactores y/o productos. Tomado de Barabasi et al., 2004.
Las redes que relacionan genes, proteínas y mRNA, son producto de la generación
de datos a través de las nuevas tecnologías como microarreglos, CHIPs,
secuenciación, Y2H-espectometria de masas, que son tecnologías aplicadas a las
omicas139. Estas herramientas han facilitado la recolección de gran cantidad de
datos para diferentes sucesos biológicos o patológicos140.
Las redes biológicas se pueden clasificar de diferentes maneras, sin embargo una
de las clasificaciones útiles para este estudio se describen a continuación: redes
proteína-proteína, genes, genes-factores de transcripción, metabólicas y de
señalización.
4.4.3 Redes metabólicas y su análisis
El conocimiento bioquímico del que se dispone de las transformaciones metabólicas
ha hecho posible la reconstrucción, a una escala genómica, de redes metabólicas
para diferentes individuos. Estas redes pueden convertirse en formatos
matemáticos, permitiendo la formulación de modelos a escala genómica (GEMs).
Los GEMs permiten el cálculo de rasgos fenotípicos basados en la composición
genética del organismo. Los GEMs se componen de metabolitos y enzimas, donde
los primeros son los nodos y los segundos las aristas134,141.
Los modelos metabólicos o GEMs siguen unas reglas generales que permiten que
las redes sigan un comportamiento fisiológico15:
1. Todas las funciones celulares se basan en reacciones químicas.
2. Toda la información debe ceñirse a los datos biológicos de los que se
disponga para la especie.
3. Los datos experimentales pueden ser mapeados en los modelos para
generar restricciones.
4. Las células funcionan bajo restricciones de tipo: fisicoquímico, ambiental,
topológico y regulatorio. Estas restricciones no pueden ser violadas y
permiten la estimación de todos los estados funcionales que el modelo o red
puede alcanzar. Matemáticamente tales declaraciones son trasladadas
dentro de subespacios asociados con la matriz estequiométrica (S). En esta
matriz, las filas corresponden a metabolitos y las columnas a reacciones de
la red. El coeficiente de los sustratos y productos de cada reacción se colocan
en la celda de la matriz.
39
5. La masa y la energía se conservan. Como todas las reacciones se describen
en la matriz estequiométrica junto con sus coeficientes y como un conjunto
de ecuaciones pueden ser descritas por la matriz estequiométrica, esto
significa que todos los estados de equilibrio (estados de homeostasis) de una
red pueden ser descritos por la ecuación S*v=0, donde v es el vector de los
flujos a través de una reacción.
6. Las células evolucionan bajo una presión dada por el ambiente. Esta presión
es conocida como el cumplimiento de una función objetivo y determina el
estado óptimo dedo por una red y gobernada por las restricciones.
Para realizar un modelo metabólico adecuado se requieren de varios pasos
sucesivos que lleven a un modelo que se comporte de manera similar a los procesos
biológicos estudiados. Para reconstruir un modelo se requiere de varias
herramientas bioinformáticas y bases de datos que se complementan, en
general134,142,143:
1. Plantilla del modelo. Básicamente es disponer de todos la información
bibliográfica y experimental del tipo de célula que se quiera modelar.
2. Reconstrucción detallada del modelo. En este se puede
compartimentalizar entre organelos, generar la reacciones de
intercambio entre organelos, reacciones de intercambio y demanda
celular.
3. Representación matemática del modelo en ecuaciones diferenciales
parciales u ordinarias. Los modelos son representados en matrices
estequiométricas donde se relacionan los metabolitos y las
reacciones, es decir:
Para la reacción A -> B, el valor estequiométrico para A es -1
porque se consume y B es 1 porque se produce. Para un
metabolito diferente que no participe en la reacción será cero.
a. Relleno de gaps del modelo. Cuando se han introducido todas las
reacciones en el modelo, existe la posibilidad que alguna de ellas sea
huérfana o sea una reacción bloqueada, esto conlleva a metabolitos
que no tienen una fuente de producción o se producen pero no se
consumen.
b. Simulación y visualización. Esto permite la manipulación del modelo
para fines propuestos. Los análisis se pueden realizar por varios
métodos de análisis como: análisis de balance de flujos (FBA), análisis
de variabilidad de flujos (FVA), regulación para análisis de balance de
40
flujos (rFBA), minimización del ajuste metabólico (MOMA, por sus
siglas en ingles de minimization of metabolic adjusment), minimización
de regulación on-off (ROOM, por sus siglas en ingles de regulatory on-
off minimization).
Para los dos primeros pasos se emplean múltiples bases de datos que facilitan la
información de diferentes organismos, y permiten realizar análisis metabólicos.
Algunos estas bases de datos son KEGG, BioCyc, ENZYME, Biochemical Genetic
and Genomic (BIGG), BRaunschweigENzymeDAtabase (BRENDA) y Reactome.
Para los pasos 3 a 5, se requieren herramientas bioinformáticas que permitan la
manipulación de la información. Entre estas se encuentran herramientas que
pueden ser integradas a otros programas o que desde la web pueden generar
diferentes tipos de manipulaciones y análisis como MetaFluxNet, FluxExplorer,
OptFlux, SurreyFBA y Flux-balance Analysis based SIMUlations (FASIMU),
COnstraint-based Reconstruction and Analysis Toolbox (COBRA), OpenFlux, FBA
SimVis, Flux Analysis and Modeling Environment (FAME) estos análisis se
encuentran referenciados y disponibles en web en
http://cobramethods.wikidot.com/start.
Los análisis que se pueden realizar a un modelo metabólico comprenden la solución
de ecuaciones diferenciales las cuales deben cumplir un objetivo biológico fijado144.
Las soluciones se obtienen por medio del análisis de balance de flujos (FBA),
método que se basa en programación lineal144,145 (Figura 5). Estos resultados
representan la distribución de flujos de las reacciones que aportan al cumplimiento
de la función objetivo y que alcanzan un estado estacionario o de conservación de
masa144. La producción de masa y consumo son restricciones que también son
fijadas en el modelo, inclusive se pueden adicionar más restricciones de tipo
fisicoquímicas, espaciales o topológicas, ambientales y/o regulatorias146. Las
restricciones son fijadas por el investigador y tienen fines de adaptar el modelo para
inicialmente simular el comportamiento del organismo que se esté estudiando
(Figura 6)147.
El análisis de variabilidad de flujos o FVA consiste en la optimización del valor vi
mediante dos problemas de optimización separados. El primero consiste en la
optimización de vi maximizando la función objetivo, y la segunda minimizando la
función objetivo. Dado que FBA puede generar multiplicidad de cálculos, FVA
permite conocer los limites dentro de los cuales están permitidos los flujos para una
reacción146.
41
Figura 5. Esquema del procedimiento de análisis para un modelo metabólico. (1) Se definen las reacciones en el modelo metabólico, las cuales son descritas en un matriz estequiométrica que cumpla con los principios de conservación de masa. (2) Las reacciones tienen unas restricciones, inicialmente son flujos de masa, que definen un rango de producción y consumo. Se fija una reacción como función objetivo, la cual será optimizada. Y por programación lineal se obtienen los flujos que aportan para el cumplimiento de la función objetivo. Tomado y modificado de Raman et al., 2009.
Figura 6. Solución de la matriz estequiométrica. La red metabólica se representa en una matriz estequiométrica a la cual se le asignan valores
negativos o positivos o cero, dependiendo si es consumido, producido o no interviene en la reacción,
respectivamente. Las restricciones de masa que se aplican a cada reacción, es decir, los límites
entre los cuales puede ser producido o consumido los metabolitos de una reacción, en conjunto
forman un espacio convexo que entre el cual se va a optimizar la función objetivo. Tomado y
modificado de Bordbar et al., 2014.
42
Algunas aplicaciones de los modelos metabólicos se han extendido logrando
avances como: predicción de reacciones en rutas metabólicas, obtención de
sistemas condicionados para la producción de ciertos metabolitos para uso
biotecnológico, búsqueda de blancos terapéuticos para cáncer e infecciones. A
continuación se describen algunos estudios empleando modelos metabólicos:
- García et al., 2012, emplearon la reconstrucción metabólica de Sacaromices
cerevisiae para comparar los flujos obtenidos por FBA bajo una función
objetivo compuesta y resultados experimentales obtenidos de datos
bibliográficos 148. Ellos determinaron que la función objetivo que mejor se
acopla a los resultados experimentales viene siendo la optimización de la
reacción de biomasa, ya que esta reacción describe los requerimientos de
una célula en crecimiento y ha sido descrita por otros autores para su
correcta formulación149.
- Algunas modificaciones de FBA han permitido simular con más precisión
modelos experimentales como por ejemplo modelos de levadura mediante el
análisis de viabilidad para determinar la pertinencia de diferentes funciones
objetivo o sus combinaciones150. Covert et al. 2003, empleando una
reconstrucción de 20 reacciones que comprendían el metabolismo de
glicolisis, pentosas fosfato, ciclo de Krebs, rutas de fermentación, biosíntesis
de aminoácidos y crecimiento celular151. A parte de las restricciones de masa,
se adicionaron restricciones de regulación génica mediante operadores
booleanos, esto permitió que el espacio de soluciones se redujera con lo cual
se logró adaptar el modelo a unas condiciones ambientales impuestas151.
- Thiele et al en 2013, reconstruye la red de metabolismo humano a escala
genómica que comprende todas las rutas conocidas en humano, esta fue una
versión mejorada de recon 1 que había sido generada por Duarte et al en
2007. Ambas reconstrucciones comprenden una modelo bottom-up,
determinístico, definido por ecuaciones diferenciales ordinarias,
compartimentalizados, genes asociados para cada reacción, identificadores
de reacciones, identificadores de metabolitos, confidencia de la reacción,
escritos en formato SBML (System Biology Markup Lenguage). En la Tabla
4 se muestran las diferencias entre los dos modelos.
Tabla 4. Diferencias entre recon 1 y recon 2.
Propiedad Recon 1 Recon 2
Total de reacciones 3744 7440
Total de metabolitos 2766 5063
43
Número de metabolitos en:
Espacio extracelular 404 642
Citoplasma 995 1878
Mitocondria 393 754
Núcleo 95 165
Retículo endoplasmático 235 570
Peroxisoma 143 435
Lisosoma 217 302
Aparato de Golgi 284 317
Número de transcritos 1905 2194
Número de genes 1496 1789
Número de subsistemas 90 99
Número de reacciones bloqueadas
1270 1603
Número de metabolitos muertos
339 1176
Tamaño de la matriz estequiométrica
2766:3744 5063:7440
EIMs mapeados 233 248
Número de genes para EIMs
255 272
44
5 OBJETIVOS E HIPÓTESIS
5.1 OBJETIVO GENERAL
Analizar las alteraciones metabólicas para la predicción de biomarcadores a partir
de la variación de flujos de reacción en modelos metabólicos humanos para los
diferentes tipos de mucopolisacaridosis.
5.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
1. Describir las reacciones metabólicas alteradas en los diferentes tipos de
mucopolisacaridosis.
2. Determinar biomarcadores potenciales para el diagnóstico o seguimiento de
mucopolisacaridosis.
5.3 HIPÓTESIS
El empleo de redes metabólicas humanas permite predecir cambios metabólicos en
los diferentes tipos de mucopolisacaridosis.
45
6 MÉTODOS
La metodología se realizó teniendo en cuenta el siguiente Figura:
Figura 7. Diagrama de flujo de la metodología seguida para la obtención y
análisis de los modelos.
Recon 2
Depuración de modelo
Reacción inútil
¿Está el modelo
depurado?
Generación de modelos MPS
Revisión de
enzimas asociadas
a MPS ¿Se encuentra
la enzima?
Se introduce una reacción
Silenciar las enzimas
Comprobar
silenciamiento
Fijar una función objetivo (FO)
Comprobar
FO
Análisis de balance de flujo Análisis de variabilidad de flujo
Análisis de enriquecimiento de genes
Comparación de rangos de flujos Comparación de flujos
46
6.1 RECONOCIMIENTO DEL MODELO RECON 2.
En el presente trabajo se empleó la reconstrucción metabólica humana recon 221, y
disponible en http://humanmetabolism.org/. Esta red es una actualización de su
antecesora recon1. Estas redes se desarrollaron a partir de toda la información
proveniente de otras redes metabólicas como EHMN (Edinburgh Human Metabolic
Network), HepatoNet1, y de otras reconstrucciones tejido-específicos como de
macrófagos, hepatocitos y células renales. El modelo de recon 2 consta de 7440
reacciones correspondientes a 100 rutas, entre las que se encuentran desde
metabolismo básico (glicolisis, ciclo de Krebs, pentosas fosfato, síntesis y
degradación de nucleótidos, metabolismo de lípidos entre otras más), cuenta con
rutas especiales como reacciones de detoxificación de fármacos, reacción de
biomasa. El modelo consta de 642 metabolitos extracelulares los cuales se
encuentran en biofluidos tales como plasma y orina, estos metabolitos cuentan con
sus identificadores en bases de datos específicas como Human Metabolic Database
(HMDB).
Para la depuración del modelo, se descargó de los archivos suplementarios del
articulo oficial de Thiele et al., 2013, en formato xls, el cual contiene toda la
información del modelo. Los campos con los que se contaban fueron: abreviación
de la reacción, nombre de la reacción, formula estequiométrica, ruta metabólica,
límite inferior, límite superior, genes asociados a la reacción, grado de confidencia,
termino SBO (system biology ontology), EC number, notas del creador del modelo
y referencias. La depuración se realizó teniendo en cuenta reacciones que no
enriquecieran el modelo y que pudieran generar reacciones de bloqueo, es decir,
producir metabolitos (fármacos y xenobióticos) que no son parte del metabolismo
basal. Cuando las reacciones son reversibles se tiene un flujo tanto hacia la derecha
(valores positivos) como hacia la izquierda (valores negativos), los cuales tienen
unidades de milimol/gramos de peso seco/hora.
Los análisis sobre el modelo se realizaron empleando las herramientas Constraints
Based Reconstruction and Analysis (COBRA)142 y SBML en MATLAB The
MathWorks, Inc., Natick, Massachusetts, United States.
6.2 IDENTIFICACIÓN ENZIMÁTICA Y GENERACIÓN DE MODELOS.
La identificación de las enzimas de degradación de MPS se realizó mediante una
búsqueda bibliográfica; las diferentes reacciones se mapearon en el modelo
teniendo en cuenta: a) los diferentes nombres que puede recibir una enzima, b) los
identificadores de las enzimas como el número EC, y c) la ruta involucrada de la
enzima. Para generar los modelos knock-out, los límites de flujo superior e inferior
47
para las enzimas asociadas con las diferentes MPS fueron fijados a cero,
independientemente.
6.3 DEFINICIÓN DE LA FUNCIÓN OBJETIVO Y ANÁLISIS DE BALANCE DE
FLUJOS.
Recon 2 proporciona la información necesaria para el desarrollo de un modelo
estequiométrico, el cual toma la forma S.v = 0, donde S es la matriz estequiométrica
y v los valores de los flujos (Figura 5). Para cada reacción se tiene establecido unos
límites permitidos de flujo, que están definidos para fijar la reversibilidad o
irreversibilidad de una reacción. Cuando el flujo es positivo la reacción planteada se
dirige hacia la derecha, mientras que un flujo negativo se interpreta como una
reacción reversible cuya dirección es hacia la izquierda. Estos límites son las
restricciones que se usaron para la optimización de los modelos144. Al fijar estas
restricciones el modelo puede ser optimizado linealmente para cumplir cierta función
objetivo. La función objetivo evaluada fue síntesis de ATP, la cual se escogió por
una búsqueda exhaustiva en bases de datos. Cada modelo de MPS fue optimizado
empleando COBRA toolbox y con Gurobi5 (Gurobi Optimization, Inc.) como
solucionador del problema de optimización. Los flujos de reacción obtenidos para
los diferentes modelos de MPS se compararon contra los obtenidos por recon 2 bajo
las mismas condiciones.
Para una comprobación que los flujos obtenidos de los modelos MPS eran propios
de estos modelos, se realizó el mismo procedimiento de silenciamiento y
optimización para otras enfermedades de depósito lisosomal, estas fueron la
enfermedad de Pompe, Gaucher y Fabry, cuyas enzimas silenciadas fueron
Glucosiltransferasa α(1->4), glucosilcerebrosidasa y α-galactosidasa,
respectivamente.
6.4 ANÁLISIS DE ENRIQUECIMIENTO GÉNICO
Se realizó un análisis de enriquecimiento para los genes asociados a las reacciones
que se vieron alteradas al comparar los flujos entre recon 2 y los diferentes modelos
MPS. Para esto se empleó la base de datos para anotación, visualización y
descubrimiento integrado DAVID v6.7152 con el cual se formaron grupos de genes
alterados. Cada grupo tiene un coeficiente de enriquecimiento que hace referencia
a la relación según su clasificación funcional.
6.5 ANÁLISIS DE VARIABILIDAD DE FLUJOS Y DETERMINACIÓN DE
BIOMARCADORES.
Bajo la evaluación de la función objetivo (síntesis de ATP) se obtuvieron los nuevos
límites para cada reacción de acuerdo al análisis de variabilidad de flujo. Los limites
48
o restricciones de masa para cada reacción se compararon contra el estándar de
recon 2 de la siguiente manera:
Para dos reacciones de diferentes modelos (A y A’) A ϵ MPSx, donde x puede ser
cualquier subtipo de MPS y A’ ϵ recon 2. Teniendo que A=[a1,a2] y A’=[a’1,a’2], 1
es el límite superior de la reacción y 2 es el límite inferior de la reacción, si (a1≤a’1
o a1≥a’1) y (a2≤a’2 o a2≥a’2), entonces los limites o restricciones de masa de la
reacción A no se superpone sobre el rango de la reacción A’, y esta
reacción/metabolito podrá ser considerado como un biomarcador23. Dos tipos de
biomarcadores que pueden ser distinguidos bajo esta definición: 1) en los que los
límites que no se solapan, y 2) en los que existe algún solapamiento al compararlos
contra los límites de cada reacción de recon 2 (Figura 8). El diagrama de la
metodología se presenta en la Figura 7.
Figura 8. Definición de rangos para determinación de biomarcadores. Parte superior: se muestra el límite superior e inferior para una reacción cualquiera, cuando se ha
modificado o alterado la red como en el caso de MPS entonces se pueden presentar diferentes casos
de comportamiento de los limites, cuando se eleva o disminuyen, a tal punto que no se pueden
sobrelapar entonces se habla de biomarcadores de alta confidencia. En la parte inferior: se
ejemplifican cuatro sucesos para los límites de los modelos de MPS, donde los límites se siguen
sobrelapando con los de recon 2.
6.6 ANÁLISIS ESTADÍSTICO.
Los modelos se sometieron a análisis de componentes principales (PCA)
empleando los resultados de FBA. El PCA fue realizado con las herramientas
estadísticas incluidas en el software matemático de MATLAB.
49
6.7 VALIDACIÓN DE RESULTADOS.
Los cambios metabólicos observados en los modelos fueron comparados contra
reportes de literatura mediante una revisión bibliográfica extensa en bases de datos
como OMIN, HMDB, literatura en NCBI y GoPubmed.
50
7 RESULTADOS Y DISCUSIÓN
7.1 CONSIDERACIONES INICIALES.
La mucopolisacaridosis son patologías que comprometen múltiples vías
bioquímicas, de señalización y metabolismo, se ha reportado que la acumulación
de GAG afecta múltiples procesos normales de la célula, entre ellos: alteraciones
en respuesta a proteínas no plegadas, autofagia, disfunción mitocondrial, estrés
oxidativo, homeostasis del calcio, inflamación, alteración del trafico vesicular, fusión
lisosoma-endosoma24,34,115–118,153. Estos cambios se han descrito como eventos que
ocurren progresiva y consecutivamente, siendo denominados como secundarios y
terciarios, y que se han considerado para MPS y otras EDL, en general algunos de
estos eventos son:
1. Acumulación de otros sustratos como gangliósidos GM1 y GM2,
colesterol, esfingolípidos, lo que lleva a alteración de la concentración de
la membrana lisosomal153,154.
2. Alteración en el tráfico vesicular que pueden contener macromoléculas y
receptores de membrana unidos a sus ligandos155.
3. Alteración de la permeabilidad de la membrana lisosomal liberando
proteasas al citosol, por ejemplo captepsina D156.
4. Alteración en la fusión de lisosomas con otras vesículas156.
5. Incapacidad de fusionar lisosomas con autofagosomas117.
6. Requerimientos metabólicos altos, debido a la deficiencia de los
metabolitos de reciclaje provenientes del lisosoma157.
7. Mitocondrias que deben ser degradadas en autofagosomas, aumentan
debido al deficiente acople entre lisosomas y organelos117.
8. Aumento de especies de oxigeno reactivas por mitocondrias.
9. Alteraciones en señalización, incremento de procesos inflamatorios y
muerte celular25.
Estas modificaciones han sido estudiadas en diferentes modelos animales,
celulares y datos clínicos3,25. Sin embargo un estudio que estudie los procesos
patológicos en conjunto de MPS no se ha realizado, ya que se han estudiado
mecanismos independientemente tanto para MPS como para las EDL, por lo que
los mecanismos patológicos se han obtenido por asociación de estos
estudios5,6,25,37. Por lo tanto dentro de los varios procesos celulares, moleculares y
bioquímicos que están desbalanceados en MPS se escogió el estudio del
metabolismo por varias razones: 1) el lisosoma tiene un rol importante en el
metabolismo, luego su alteración induce cambios en todos los niveles158, 2) la
51
alteración metabólica de MPS no se ha estudiado completamente por lo que una
aproximación computacional puede generar hipótesis para evaluar
experimentalmente159, 3) las alteraciones metabólicas en MPS desencadenan
diferentes cambio en diferentes vías de señalización, luego predicciones
computacionales pueden generar nuevas hipótesis25, 3) existen diferentes
aproximaciones computacionales que permiten predecir el comportamiento
metabólico de un organismo, 4) el estudio en conjunto del metabolismo puede
generar propiedades emergentes y 5) los metabolitos obtenidos como posibles
biomarcadores podrían ser empleados por métodos analíticos ya existentes160.
En este trabajo se empleó la reconstrucción a escala genómica del metabolismo
humano (recon 2) desarrollada por Thiele y colaboradores21. Esta se modificó y
analizó mediante las herramientas bioinformáticas COBRA Toolbox142, SBML
Toolbox161, Libsbml Toolbox161, con el propósito de modelar los cambios
metabólicos que ocurren tras el silenciamiento de las reacciones involucradas en la
degradación de GAG y asociadas con la generación de MPS. Estos cambios
metabólicos fueron empleados para predecir biomarcadores potenciales para el
diagnóstico y seguimiento de este grupo de enfermedades. Además como se
mencionó, el análisis se basó teniendo en cuenta la deficiencia total de la actividad
enzimática, y que el modelo simulado no se encuentra bajo ningún tipo de
tratamiento farmacológico.
7.2 DEPURACIÓN DEL MODELO
Durante el proceso de reconstrucción y validación de recon 2 realizado por Thiele
et al 2013, el modelo se evaluó para determinar la capacidad de que cumpliera
ciertas tareas metabólicas, con el fin de determinar si el modelo podía sintetizar
ciertos metabolitos o de degradar otros, como por ejemplo sintetizar ATP bajo
condiciones aeróbicas y anaeróbicas, y empleando sustratos como alcohol, glicina,
lactato, y prolina, entre otros21. Bajo estas características del modelo, el modelo es
útil para la búsqueda de nuevas moléculas biológicas como potenciales
biomarcadores.
A partir de esta información se quiso evaluar el comportamiento metabólico de recon
2 una vez existía una alteración en la ruta de degradación de GAG y así determinar
cambios propios de cada MPS. Los modelos simulados se depuraron con el fin de
cumplir con ciertos criterios metabólicos, estos fueron: 1) los modelos no estaban
bajo ningún tratamiento farmacológico, 2) los modelos no estaba en proceso de
crecimiento y 3) los procesos catabólicos y anabólicos no se limitaron, es decir, los
modelos simularon un escenario de supervivencia162. La modificación del modelo
constó de un proceso de filtro y depuración de las reacciones que pudieran causar
52
alteraciones por la producción de metabolitos que contribuyeran a resultados
erróneos (cofactores, fármacos y xenobióticos, iones), ya que la presencia de estos
pueden activar reacciones que empleen como sustratos los productos de
degradación de estas reacciones de xenobióticos, por ejemplo iones hidronio, agua
o radicales libres. En este sentido, se eliminaron reacciones que: 1) interrumpieran
el balance metabólico celular, por ejemplo la reacción de biomasa, 2) no fueran
propias del estudio; por ejemplo reacciones de degradación de fármacos por
citocromos y 3) reacciones que puedan causar una cascada de bloqueo. Esta
depuración llevo a la eliminación de 57 reacciones, que correspondían a reacciones
involucradas en metabolismo de xenobióticos (25 reacciones), transporte de
fármacos (31 reacciones) y producción de biomasa (1 reacción) (Tabla 5).
Finalmente, se obtuvo un modelo de 7383 reacciones que adicional estaban
agrupadas a 98 rutas metabólicas clasificadas dentro del mismo modelo.
Tabla 5. Reacciones eliminadas durante la depuración de recon 2. Las reacciones corresponden a procesos de transporte y metabolismo de xenobióticos y reacción de
biomasa.
Abreviación de formula
Nombre de reacción
Formula de la reacción
'EBASTINEOHtr'
Tra
nspore
de X
enobió
ticos
'ebastineoh[r] <=> ebastineoh[c] '
'EBASTINEtr' 'ebastine[r] <=> ebastine[c] '
'24NPHte' '24nph[e] <=> 24nph[c] '
'4HDEBRISOQUINEte' '4hdebrisoquine[e] <=> 4hdebrisoquine[c] '
'4MTOLBUTAMIDEte' '4mtolbutamide[e] <=> 4mtolbutamide[c] '
'4NPHSFte' '4nphsf[e] <=> 4nphsf[c] '
'4NPHte' '4nph[e] <=> 4nph[c] '
'5HOMEPRAZOLEte' '5homeprazole[e] <=> 5homeprazole[c] '
'AFLATOXINte' 'aflatoxin[e] <=> aflatoxin[c] '
'ANTIPYRENEte' 'antipyrene[e] <=> antipyrene[c] '
'APNNOXte' 'apnnox[e] <=> apnnox[c] '
'APPNNte' 'appnn[e] <=> appnn[c] '
'CARVEOLte' 'carveol[e] <=> carveol[c] '
'COUMARINte' 'coumarin[e] <=> coumarin[c] '
'DMANTIPYRINEte' 'dmantipyrine[e] <=> dmantipyrine[c] '
'EAFLATOXINte' 'eaflatoxin[e] <=> eaflatoxin[c] '
'EBASTINEOHte' 'ebastineoh[e] <=> ebastineoh[c] '
'EBASTINEte' 'ebastine[e] <=> ebastine[c] '
'HCOUMARINte' 'hcoumarin[e] <=> hcoumarin[c] '
'HTAXOLte' 'htaxol[e] <=> htaxol[c] '
'LIMNENte' 'limnen[e] <=> limnen[c] '
'NIFEDIPINEte' 'nifedipine[e] <=> nifedipine[c] '
'NPTHLte' 'npthl[e] <=> npthl[c] '
'OMEPRAZOLEte' 'omeprazole[e] <=> omeprazole[c] '
53
'ONPTHLte' 'onpthl[e] <=> onpthl[c] '
'PERILLYLte' 'perillyl[e] <=> perillyl[c] '
'TAXOLte' 'taxol[e] <=> taxol[c] '
'TOLBUTAMIDEte' 'tolbutamide[e] <=> tolbutamide[c] '
'WHDDCAte' 'whddca[e] <=> whddca[c] '
'WHHDCAte' 'whhdca[e] <=> whhdca[c] '
'whttdca[e] <=> whttdca[c] '
'RN0020R'
Me
tabolis
mo d
e x
enobió
ticos
'o2[r] + h[r] + nadph[r] + C07535[r]
'RN0021C' 'h2o[c] + CN0012[c] <=> CN0009[c] '
'RN0021R' 'h2o[r] + CN0012[r] <=> 2 h[r] + CN0009[r] '
'RN0021X' 'h2o[x] + CN0012[x] <=> 2 h[x] + CN0009[x] '
'RN0022C' 'h2o[c] + C14851[c] <=> CN0010[c] '
'RN0022R' 'h2o[r] + C14851[r] <=> 2 h[r] + CN0010[r] '
'RN0022X' 'h2o[x] + C14851[x] <=> 2 h[x] + CN0010[x] '
'RN0023C' 'h2o[c] + C14849[c] <=> CN0011[c] '
'RN0023R' 'h2o[r] + C14849[r] <=> 2 h[r] + CN0011[r] '
'RN0023X' 'h2o[x] + C14849[x] <=> 2 h[x] + CN0011[x] '
'RN0027C' 'o2[c] + 3 h[c] + nadph[c] + CN0020[c] => h2o[c] + nadp[c] + CN0021[c] '
'RN0027R' 'o2[r] + 3 h[r] + nadph[r] + CN0020[r] => h2o[r] + nadp[r] + CN0021[r] '
'RN0028C' 'h2o[c] + CN0021[c] <=> CN0022[c] '
'RN0028R' 'h2o[r] + CN0021[r] <=> CN0022[r] '
'RN0028X' 'h2o[x] + CN0021[x] <=> CN0022[x] '
'RN0029C' 'o2[c] + nadph[c] + CN0022[c] => h2o[c] + h[c] + nadp[c] + CN0023[c] '
'RN0029R' 'o2[r] + nadph[r] + CN0022[r] => h2o[r] + h[r] + nadp[r] + CN0023[r] '
'RN0030C' 'o2[c] + 3 h[c] + nadph[c] + CN0016[c] => h2o[c] + nadp[c] + CN0017[c] '
'RN0030R' 'o2[r] + 3 h[r] + nadph[r] + CN0016[r] => h2o[r] + nadp[r] + CN0017[r] '
'RN0031C' 'h2o[c] + CN0017[c] <=> CN0018[c] '
'RN0031R' 'h2o[r] + CN0017[r] <=> CN0018[r] '
'RN0031X' 'h2o[x] + CN0017[x] <=> CN0018[x] '
'RN0032C' 'o2[c] + nadph[c] + CN0018[c] => h2o[c] + h[c] + nadp[c] + CN0019[c] '
'RN0032R' 'o2[r] + nadph[r] + CN0018[r] => h2o[r] + h[r] + nadp[r] + CN0019[r] '
54
'biomass_reaction' Reacció
n g
enérica d
e b
iom
asa
20.650823 h2o[c] + 20.704451 atp[c] + 0.385872 glu_L[c] + 0.352607 asp_L[c] + 0.036117 gtp[c] + 0.279425 asn_L[c] + 0.505626 ala_L[c] + 0.046571 cys_L[c] + 0.325996 gln_L[c] + 0.538891 gly[c] + 0.392525 ser_L[c] + 0.312690 thr_L[c] + 0.592114 lys_L[c] + 0.359260 arg_L[c] + 0.153018 met_L[c] + 0.023315 pail_hs[c] + 0.039036 ctp[c] + 0.154463 pchol_hs[c] + 0.055374 pe_hs[c] + 0.020401 chsterol[c] + 0.002914 pglyc_hs[c] + 0.011658 clpn_hs[c] + 0.053446 utp[c] + 0.009898 dgtp[n] + 0.009442 dctp[n] + 0.013183 datp[n] + 0.013091 dttp[n] + 0.275194 g6p[c] + 0.126406 his_L[c] + 0.159671 tyr_L[c] + 0.286078 ile_L[c] + 0.545544 leu_L[c] + 0.013306 trp_L[c] + 0.259466 phe_L[c] + 0.412484 pro_L[c] + 0.005829 ps_hs[c] + 0.017486 sphmyln_hs[c] + 0.352607 val_L[c] => 20.650823 adp[c] + 20.650823 h[c] + 20.650823 pi[c] '
7.3 IDENTIFICACIÓN DE REACCIONES ASOCIADAS CON MPS Y
GENERACIÓN DE MODELOS.
Una vez depurado el modelo se fijó una función objetivo, se tuvo en cuenta que en
las MPS existen diferentes alteraciones metabólicas producto de la deficiencia
lisosomal que afecta en el reciclaje de macromoléculas y procesos celulares, tales
como la alteración de canales de calcio, interacción ligando receptor, y alteración
de fusión de endosomas procesos que requieren de energía y metabolitos para su
funcionamiento 25,157,162. En este sentido, se definió como función objetivo la síntesis
de adenosin trifosfato (ATP), la cual correspondía a la síntesis de ATP por la ATP
sintasa localizada en la membrana interna mitocondrial y cuya reacción catalizada
es:
4 h[c] + adp[m] + pi[m] => 3 h[m] + h2o[m] + atp[m]
donde [c]: metabolito ubicado en citosol, [m]: metabolito ubicado en mitocondria,
adp: adenosian de difosfato, pi: pirofosfato, h: ion hidronio, h2o: agua y atp:
adenosin trifosfato
Con el modelo recon 2 depurado y con la función objetivo fijada, se identificaron las
enzimas que se encuentran deficientes en cada una de las diferentes MPS. En total
se identificaron 10 enzimas 24, que se encuentran en diferentes multi-complejos en
el lisosoma degradando consecutivamente los polisacaridos, por lo que estas
enzimas se encontraban relacionadas a varias reacciones de los prototipos de GAG
que se encuentran en recon 2 (Tabla 6). El prototipo de HS consta de 24 moléculas
de aminoazúcares y un núcleo proteico, existen 5 ejemplos de CS (entre las cuales
se encuentra DS) cada uno de 5 moléculas de aminoazúcares y para QS consta de
40 moléculas entre aminoazúcares y galactosa con un núcleo proteico. Identificadas
estas reacciones se continuó con la generación de cada modelo de MPS.
55
Como se ha mencionado el modelo tiene dos restricciones, una estequiometrica y
otra de límites (máximo y mínimo) permitidos de flujo o masa que pasa a través de
cada reacción, entonces el silenciamiento se realizó ajustando a cero los límites
máximos y mínimos de flujo para las reacciones asociadas con las enzimas
deficientes en MPS. Este silenciamiento total de la enzima correspondió a un
fenotipo severo de la enfermedad, donde la mutación genética lleva a una pérdida
total de la actividad enzimática de la enzima 163. En este sentido, para MPS I se
simuló el fenotipo Hurler, y no los de Hurler-Scheie y Scheie, los cuales
corresponden a las formas intermedias y atenuadas, respectivamente, de la MPS
tipo I75.
Tabla 6. Número de reacciones asociadas a cada enzima de MPS y presentes en el modelo recon 2.
Enfermedad Enzima deficiente Número de reacciones
asociadas con la enzima
MPS I alfa-L-Iduronidasa 4
MPS II Iduronato sulfatsa 3
MPS III A Heparan N-sulfatasa 4
MPS III B alfa-N-Acetil-glucosaminidasa 5
MPS III C Acetil-CoA:alfa-glucosaminida acetiltransferasa
4
MPS III D N-Acetilglucosamina 6-Sulfatasa 17
MPS IV A Galactosa 6-sulfatasa 9
MPS IV B beta-Galactosidasa 18
MPS VI N-Acetilgalactosamina 4-sulfatasa 5
MPS VII beta-Glucoronidasa 7
De acuerdo a esto, la degradación de QS requiere de 75 reacciones entre las que
interviene las enzimas α-fucosidasa, β-galactosidasa, β-N-acetilhexosaminidasa, β-
N-acetilglucosaminidasa, glicosilasparaginasa, iduronidasa, N-
acetilgalactosaminidasa, N-acetilglucosamina-6-sulfatasa, N-acetilglucosaminidasa
y sialidasa (Figura 9, no se muestra toda la ruta). La degradación de CS/DS de 44
reacciones, interviene las enzimas α-L-iduronidasa, la iduronato-2-sulfatasa, β-
glucuronidasa, β-N-acetilhexosaminidasa, glucurunato-2-sulfatasa y la N-
acetilgalactosamina -4 y -6-sulfatasa. La degradación de HS requiere de 27
reacciones en las que interviene α-L-iduronidasa, iduronato-2-sulfatasa, heparan-N-
sulfatasa, α-N-acetilglucosaminidasa, heparan-glucosaminida N-acetiltransferasa,
N-acetilglucosamina-6-sulfatasa y beta-glucuronidasa. De esta manera se explica
porque para modelar las diferentes MPS, fue necesario silenciar más de una
reacción en el modelo depurado de recon 2. En el Anexo 1 se relacionan las
reacciones que fueron silenciadas para modelar los diferentes tipos de MPS.
56
Figura 9. Degradación de queratan sulfato. Recon 2 presenta la formación de un esqueleto de GAG, luego en la parte superior se observa el producto de biosíntesis de QS que por pasos sucesivos se degrada hasta el núcleo proteico serina/treonina. Los nodos representan los metabolitos y las aristas representan las enzimas que catalizan dicha reacción. Tomado de BIGG Database (http://bigg.ucsd.edu/).
57
7.4 VERIFICACIÓN SILENCIAMIENTO DE REACCIONES EN MODELOS MPS.
Para cada uno de los 11 modelos generados se verificó que las reacciones se
hubiesen silenciado mediante la optimización por análisis de balance de flujos. En
este caso se definió como función objetivo la maximización de la reacción
silenciada, como esta se encontraba apagada se esperaba no encontrar flujo final
para estas reacciones.
A pesar que se encontraron soluciones factibles a la optimización, ningún modelo
logro maximizar las reacciones, ya que estas estaban silenciadas. A continuación
se presenta la solución de optimización obtenida para todos de MPS analizados:
Sol = x: [7383x1 double] f: 0 y: [5063x1 double] stat: 1 solver: ‘gurobi5’ time: 0.3870 >>
donde ‘f’ corresponde al flujo resultado de la función objetivo, en este caso, es cero;,
x: valores para cada reacción, y: metabolitos, stat: indicador de si la respuesta es
factible (1) o no (0) y time: tiempo requerido para el cálculo.
La solución factible de flujos se debió a que existe un espacio definido por las
restricciones de las reacciones no silenciadas (estequiométricas y de flujo), por
donde pasaban los diferentes flujos, esto quiere decir que existen algunas
reacciones que se emplearon para cumplir la función objetivo, pero no era posible
obtener flujo en la función objetivo, igualmente esto valida el modelo porque a pesar
que se dirija el flujo hacia estas reacciones silenciadas no es posible la degradación
del GAG correspondiente y por lo tanto los modelos simulaban correctamente el
fenotipo severo de MPS.
7.5 OPTIMIZACIÓN POR ANÁLISIS DE BALANCE DE FLUJOS PARA LOS
MODELOS RECON 2 Y TIPOS DE MPS.
Con el fin de determinar los cambios en los flujos metabólicos para diferenciarlos
con respecto a los observados en un modelo no alterado (recon 2), se sometieron
a un análisis de balance de flujos (FBA, se optimizaron) los 11 modelos (recon 2 y
10 de MPS), empleando la reacción de síntesis de ATP como función objetivo. De
esta forma se obtuvieron los valores de flujo para cada una de las reacciones que
componen el modelo (Anexo 2).
58
Tres tipos de valores de flujo se pueden obtener para una determinada reacción:
negativos, positivos o nulos. Los primeros hacen referencia a reacciones que se
desplazan hacia la izquierda, los segundos pertenecen a reacciones que se
desplazan hacia la derecha, y los últimos corresponden a las reacciones que no se
requirieron para el cumplimiento de la función objetivo. Cada modelo empleó una
serie de reacciones para cumplir la función objetivo teniendo en cuenta las
restricciones estequiométricas y de masa que son propias del modelo. Estas
restricciones se presentan como límites entre -1000 y 1000 mmol/gdw/h, (gdw
=gramos de peso seco de célula). Cada modelo logró optimizar la función objetivo
de maximizar la reacción correspondiente a síntesis de ATP, lo que indica que a
pesar de presentar la alteración en una de sus rutas metabólicas, se encontró una
solución viable al problema, sugiriendo que la deficiencia en las enzimas
encargadas del metabolismo lisosomal de los GAG en estos modelos no es letal
para estos ya que existen otros metabolitos que son fuentes energéticas (lípidos,
aminoácidos y azucares) que provienen del medio extracelular como de la
degradación de otras macromoléculas (glicógeno o núcleos proteicos). A pesar de
ser un modelo estático, es decir, no se estudia el progreso en el tiempo de la
enfermedad sino que se detalla un momento especifico de la enfermedad, se
observa que el silenciamiento que simula un fenotipo severo concuerda con lo
evidenciado para MPS donde a pesar de existir una insuficiencia enzimática total,
el organismo sobrevive por un tiempo que estos casos severos es menor de la
primera década de vida2. Sin embargo es por los diferentes mecanismos patológicos
secundarios y terciarios, que la célula finalmente muere, es decir, mecanismos de
señalización apaptóticos, es por esto que es importante resaltar que este modelo
no comprende otros actores de la patología como mRNA, señalización, factores de
transcripción, proteínas estructurales entre otras moléculas2,164, sin embargo los
modelos metabólicos que se basan en métodos de optimización se fundamentan en
que los sistemas vivos se organizan para optimizar tareas vitales o basales165.
Para el análisis de estos datos se compararon los flujos metabólicos obtenidos para
las MPS con los observados en el modelo depurado de recon 2. Este análisis
permitió identificar las reacciones que cambiaron tras el silenciamiento de las
reacciones lisosomales. Las comparaciones se realizaron tomando a recon 2 como
el metabolismo de un individuo sano mientras que el proceso de enfermedad
correspondía a los modelos MPS.
7.6 VALIDACIÓN DE LOS FLUJOS PARA LOS MODELOS MPS Y EDL.
Para determinar que los flujos obtenidos previamente en los modelos MPS eran
propios de la simulación del silenciamiento de rutas de degradación de GAG. Se
sometieron a optimización o a FBA bajo la misma función objetivo (síntesis de ATP)
59
los modelos de otras enfermedades lisosomales, estas fueron Fabry
(Globotriaosilceramida/α-galactosidasa), Pompe (Glucógeno/glucosil transferasa
α(1->4)) y Gaucher (Glucosilceramida /Glucocerebrosidasa). Las cuales se
escogieron por su alteración en el metabolismo de gangliósidos y esfingolípidos los
cuales corresponden a moléculas que pueden llegar a acumularse en MPS. Pompe
se escogió porque al existir una depleción en el uso del glucógeno, se esperaba
encontrar una similitud de la alteración energética que se presenta en todas las EDL
incluyendo MPS5,157.
La comparación se realizó entre los flujos obtenidos entre cada modelo. Se encontró
que la similitud entre modelos era bastante baja, para 20 de las 100 rutas
metabólicas definidas por Thiele et al para recon 2, menos del 6% total de las
reacciones en cada ruta metabólica era igual para todos los modelos, sin embargo
para el metabolismo de tetrahidrobiopterina se encontró un 37% de similitud entre
los flujos obtenidos. En detalle estas reacciones corresponden a reacciones gap, es
decir, sus metabolitos no se producen por alguna otra reacción, es decir, estas
reacciones no estaban conectadas dentro del modelo (Tabla 7).
Por esta comparación y análisis, se concluyó que los flujos obtenidos son propios
de cada modelo debido a cada deficiencia enzimática que desencadena flujos
diferentes en el metabolismo, además los cambios no se presentan en conjunto, es
decir los flujos no existen cambios propios de EDL.
Tabla 7. Comparación de flujos entre los 14 modelos (recon2, MPS y EDL).
Reacciones
en recon 2
No. rxns
con igual
flujo
% Rxnigual/
Rxn total
'Transport, lysosomal' 107 1 1%
'Transport, mitochondrial' 310 6 2%
'Transport, endoplasmic reticular' 161 5 3%
'Transport, extracellular' 1550 30 2%
'Glycine, serine, alanine and threonine metabolism' 37 1 3%
'Tryptophan metabolism' 70 3 4%
'Arginine and Proline Metabolism' 41 1 2%
'Transport, peroxisomal' 126 4 3%
'Phosphatidylinositol phosphate metabolism' 63 4 6%
'Pyruvate metabolism' 32 1 3%
'Bile acid synthesis' 128 2 2%
'Nucleotide interconversion' 177 2 1%
'Eicosanoid metabolism' 257 3 1%
'Glutathione metabolism' 16 1 6%
'Starch and sucrose metabolism' 33 1 3%
'Unassigned' 173 2 1%
'Fatty acid synthesis' 126 1 1%
'Tetrahydrobiopterin metabolism' 27 10 37%
'Exchange/demand reaction' 742 13 2%
'NAD metabolism' 23 2 9%
60
7.7 COMPARACIÓN POR GRUPOS Y RUTAS METABÓLICAS DE LOS
MODELOS MPS CONTRA RECON2.
Con el fin de determinar diferencias entre los modelos que se relacionan con los
mismos GAG se realizó un análisis comparativo entre los flujo obtenidos, por
ejemplo, MPS III tiene tres subtipos que están relacionados con la degradación
heparan sulfato, luego se esperaba que los modelos metabólicos presentaran
diferencias entre estos subtipos, para generar hipótesis independientes de cada
modelo.
El primer análisis realizado fue un análisis de componentes principales (PCA), con
el que se obtuvieron 4 grupos de modelos: Grupo 1 recon 2, MPS IIID y MPS VII;
Grupo 2 MPS IIIA, IIIB y IIIC; Grupo 3 MPS IVA, IVB y MPS VI; y Grupo 4 MPS I y
MPS II (Figura 10). Estos resultados muestran que exceptuando los modelos del
Grupo 1, los modelos se encuentran agrupados de acuerdo con la ruta metabólica
afectada, lo cual sugiere que dependiendo del GAG acumulado el modelo presenta
una alteración característica en su metabolismo. Por ejemplo, en las MPS I y II
(Grupo 4) se encuentra alterado el catabolismo del DS y HS; mientras que las MPS
IIIA, B y C (Grupo 2) tienen en común la alteración exclusiva del metabolismo del
HS. Sin embargo, el análisis de FBA no permitió diferenciar entre las MPS que
comparten el mismo GAG alterado, y adicionalmente las MPS VII y IIID, quedaron
agrupadas con el modelo recon 2 (Grupo 1), en las siguientes secciones se discute
de las posibles causas de este agrupamiento. Los valores de flujo de los modelos
del grupo 2 eran iguales, de manera similar paso con los modelos del grupo 4. Estos
aspectos indican que es necesario continuar trabajando en la construcción de estos
modelos empleando un modelo dinámico o regulado por descriptores booleano o
probabilístico que permita reducir más el espacio de optimización y por lo tanto tener
resultados diferenciales. A partir de estos agrupamientos se realizaron los análisis
posteriores de los resultados.
7.8 DESCRIPCIÓN METABÓLICA DE LOS FLUJOS.
Todos los modelos fueron capaces de sintetizar ATP, las reacciones y sus
respectivos flujos en los modelos de MPS variaron respecto a los empleados y
obtenidos en recon 2. Este cambio en los flujos metabólicos puede ser debido a que
los metabolitos de la degradación de GAG [D_glucuronato (glcur), ion sulfato (SO4),
galactosa (gal), xilosa (xyl), N-acetilgalactosamina (acgal), N-acetilglucosamina
(acgam), coenzima A (coa), iduronato (iduor), L_fucosa (fuc_L), y N-
acetilneuraminato (acnam)] no pueden ser empleados en otros procesos
metabólicos en los modelos, por lo que el sistema cambia el flujo de otras reacciones
para poder lograr la maximización de la función objetivo (síntesis de ATP).
61
Figura 10. Análisis de componentes principales de los modelos de MPS y recon 2. Se observa la conformación de cuatro grupos entre MPS y recon 2.
De las 7383 reacciones de recon 2 depurado, un total de 1942 reacciones fueron
empleadas para cumplir la función objetivo, mientras que en los modelos de MPS
se emplearon en promedio 2286 ± 249 reacciones para cumplir dicha función
(Figura 11, barras azules). Los modelos de los Grupos 2 (MPS III A, B y C, 2468
reacciones) y los del Grupo 1 (MPS IIID y VII con, 1929 y 1923 reacciones,
respectivamente) fueron los que mayor y menor número de reacciones requirieron,
respectivamente. A pesar que se emplearon una igual cantidad de reacciones en el
Grupo 1, en promedio los flujos obtenidos para 1272 reacciones de los modelos
MPS (IIID y VII) eran diferentes a los obtenidos para recon 2, por lo que las demás
reacciones con flujo igual los asociaron dentro de este grupo en el PCA, esto
significa que el silenciamiento de las enzimas en estas MPS también tuvieron un
impacto sobre el metabolismo del modelo.
De las 98 rutas metabólicas descritas en recon 2, se encontró flujo en 87 de ellas
para los 11 modelos. Las rutas que no presentaron flujo en alguno de los modelos
MPS fueron: lipoato, linoleato, acido araquidónico, vitamina E, vitamina B12,
Recon 2
MPS_I MPS_II
MPS_IIIA
MPS_IIIB
MPS_IIIC
MPS_IIID
MPS_IVA
MPS_IVB
MPS_VI
MPS_VII
62
selenoaminoácidos, síntesis de CS, estilbeno y alcaloides, y degradación de
limoneno. Como consecuencia a esto último, en estas rutas no se iba a encontrar
biomarcadores o cambios metabólicos. Esto implico que las rutas inflamatorias en
la que están relacionada el ácido araquidónico no se pudieran evaluar166. Así como
lo efectos protectores o antioxidantes de la vitamina E167 y los efectos sobre el ADN
de la vitamina B12168. Exactamente estas rutas presentaban reacciones que no
estaban conectadas con la red, también se denomina reacciones gap.
La comparación de los flujos metabólicos de cada modelo MPS contra los de recon
2 permitió observar que en promedio 1983 ± 475 reacciones se alteraron en MPS
(Figura 11, barras rojas). Estas alteraciones representaban reacciones que
presentaban cambios en los flujos, así como también reacciones que no se
emplearon en recon 2 y que se activaron en los modelos MPS o viceversa.
Para tener un panorama global de grupos metabólicos alterados, se realizó un
agrupamiento de las 100 rutas metabólicas descritas en recon 2 con base a la
caracterización por grupos que se tiene establecida en la base de datos de Kyoto
Encyclopedia of Genes and Genomes KEGG pathway (Anexo 3). Esta clasificación
permitió ver la relación de la alteración de los modelos en los diferentes grupos
metabólicos (Tabla 8). De acuerdo a este agrupamiento, las reacciones de
transporte (21.8% del total de reacciones), carbohidratos (19.3% del total de
reacciones), glicanos (16.5% del total de reacciones), aminoácidos (13.2% del total
de reacciones) y nucleótidos (26.5% del total de reacciones) tuvieron una mayor
cantidad de reacciones que aumentaron su flujo comparadas contra recon 2; la
cantidad de reacciones que disminuyeron su flujo correspondían a metabolismo de
grupos sanguíneo (12.3% del total de reacciones), metabolismo de otros
aminoácidos (14.6% del total de reacciones), reacciones de intercambio (16.5% del
total de reacciones) y metabolismo de nucleótidos (18.3% del total de reacciones).
Esto significó un cambio importante por el hecho que en recon 2 no se presentó un
cambio tan marcado en el metabolismo teniendo en cuenta que también debía
cumplir con la función objetivo de síntesis de ATP. Esto también quiso decir que con
estas restricciones adicionales (silenciamiento) a los modelos se logró alterar
completamente todo el sistema de reacciones metabólicas. Los cambios detallados
por ruta metabólica se presentan en el Anexo 4. De los cambios detallados en el
Anexo 4 y para los metabolismos que presentaron reacciones con aumento de flujo
fueron:
- En metabolismo de carbohidratos, las rutas de pentosa fosfato, glicolisis,
ciclo de Krebs, aminoazúcares, piruvato y dicarboxilato.
63
Figura 11. Número de reacciones empleadas y alteradas por modelos MPS y recon 2. Número de reacciones empleadas para el cumplimiento de la función objetivo (barras azules).Número de reacciones de las utilizadas para cumplir la función objetivo que cambiaron respecto a los flujos obtenidos en recon 2 (barras rojas). En esta última, se incluyen reacciones que se apagaron y se prendieron, reacciones que aumentaron y disminuyeron en los modelos de MPS.
- En el metabolismo de aminoácidos, el metabolismo de valina, leucina,
isoleucina, glicina, serina, alanina, arginina, prolina, glutamato.
- En el metabolismo de glicanos, síntesis y degradación de N-glicanos, síntesis
y degradación de QS.
- En el metabolismo de nucleótidos, catabolismo de purinas e interconversión
de nucleótidos.
- En las reacciones de transporte, transporte extracelular y mitocondrial.
Adicional, en el metabolismo de lípidos se observó que a pesar que no contaba con
una alteración importante dentro de este grupo, se encontró que en su mayoría las
reacciones que aumentaron su flujo fueron las de β-oxidación. En este sentido los
resultados mostraban una activación metabólica, donde la falta de los metabolitos
de degradación de GAG y la síntesis de ATP, aumentaba reacciones sintéticas y de
obtención de energía, así como el intercambio de metabolitos, los que mayor
intercambio presentaron fue con el espacio extracelular, mitocondria y retículo
endoplasmático (Tabla 8), con lo cual se incito al modelo a utilizar nuevas
reacciones como por ejemplo sintetizar nuevas estructuras (glucógeno, QS,
19422356 2468
19292455 2465 2409
1923
22012278
1330
2276 2301 2248
1250
0
1000
2000
3000
4000
5000
recon 2 MPSI -II MPSIII A toB
MPSIIID MPSIVA MPSIVB MPSVI MPSVII
Nú
me
ro d
e r
eac
cio
ne
s
64
productos finales e intermediarios de N-glicanos), que correspondía al aumento de
consumo de ATP.
Evidencia experimental se ha realizado para estudiar las alteraciones metabólicas
cuando la función lisosomal se ha visto afectada, estos estudios se han centrado
tanto por la acumulación de GAG como de otros metabolitos. En un estudio
realizado por Woloszynek et al., 2009 empleando ratones MPS I, se estudiaron las
anormalidades metabólicas y bioquímicas con respecto a lo observado en ratones
silvestres. Los resultados de dicho estudio mostraron que existe una disminución en
la concentración de algunos carbohidratos y ácidos grasos, así como también un
aumento en la degradación de proteínas169. Según los resultados de Woloszynek et
al., 2009 debido a la deficiencia de reciclaje de metabolitos por parte del lisosoma,
se activan mecanismos de biogénesis de autofagia, mecanismo regulados por un
complejo de cinasas presente en la membrana del lisosoma, conocido como blanco
de la rapamicina en mamíferos (mTOR) que es activado por factores de crecimiento,
hormonas, aminoácidos, glucosa oxígeno y estrés162. La activación de este factor
permite la translocación de TFEB al nucleó (factor de transcripción que activa genes
ligados a biogénesis de autofagosomas, oxidación lipídica entre otros), esto es
debido a procesos relativos a periodos de inanición donde las células deben obtener
fuentes de energías alternas38,170.
En general los modelos MPS concordaron con algunos de estos sucesos, la
activación de nuevas fuentes de energía como β-oxidación, o el empleo de
aminoácidos, así como la síntesis de GAG (QS) y glicanos (intermediario y
moléculas finales de N-glicanos), también el uso de moléculas que se emplearían
para la síntesis de estos GAG y glicanos como 3’-fosfoadenosina5’-fosfosulfato
(PAPS) y de UDP-glucosa que se internalizó al retículo endoplasmático57, y la salida
de algunos intermediarios del ciclo de Krebs como citrato, α-cetoglutarato y
oxalacetato, entre los metabolitos que se transportaron de mitocondria a citosol y
viceversa estaban carnitina, panteteina, dTMP, 2-oxobutanoato, lisina, arginina
entre los más importantes. El citrato puede iniciar la síntesis de ácidos grasos, que
también presenció un aumento de las reacciones de esta ruta en los modelos MPS
en comparación a recon 2. La β-oxidación aumentada en los modelos corresponde
a algunas observaciones realizadas en diferentes EDL donde el tejido adiposo se
reduce en varios tejidos169. La síntesis de glicanos en MPS igualmente se ha
observado que aumenta debido a que muchos de los GAG degradados en
lisosomas se reutilizan nuevamente en la síntesis de nuevos GAG, debido a que le
permite a las células reservar energía y recursos171. También, debido a su
importancia funcional y estructural 46, la deficiencia de estos GAG en la MEC induce
a que la célula deba sintetizar y normalizar las cantidades normales en el medio
65
extracelular, lo que consume mayor cantidad de energía para internalizar y sintetizar
nuevas estructuras de novo157,169,171. En este orden de ideas, los modelos MPS
lograron diferenciarse de recon 2 y mostraron un posible momento metabólico
donde se buscaban nuevas formas de obtención de energía, degradación y síntesis
de GAG que simulaban el proceso metabólico donde los lisosomas ya no pueden
fusionarse o no reciclan los diferentes sustratos, mientras que la célula en un intento
por preservar las funciones y comunicación con el medio extracelular sintetiza
diferentes macromoléculas.
De igual forma, Woloszynek et al, reportaron una elevación en la concentración de
aminoácidos, lo cual se puede explicar por la necesidad de obtener precursores de
energía, como los aminoácidos, para suplir las necesidades celulares por la
inanición inducida por la deficiencia lisosomal. En los modelos MPS, se activó el
metabolismo y la biosíntesis, no hubo diferencia de si el metabolismo catabólico o
anabólico, las reacciones se emplearon por los diferentes metabolitos disponibles
en citosol, siendo el compartimento de mayor cantidad reacciones (Anexo 4).
Por otro lado, el aumento de la síntesis de lípidos fue consecuente con la ruta de
pentosas fosfato, esta última ruta sintetizaba NADPH a partir de la xilulosa
reductasa y fosfogluconato reductasa. Estas enzimas permitieron entonces la
síntesis de moléculas como acetoacetilo, oxodecanoilo, oxooctanoilo,
oxotetradecanoilo, entre otras más. Estas estructuras fueron empleadas
posteriormente empleadas en -oxidación. Los modelos MPS pasaron por un ciclo
de síntesis y degradación por la activación de rutas metabólicas. Estudios han
demostrado que en EDL y MPS el aumento del consumo de energía es mayor que
en individuos sanos además que el tejido adiposo marrón y blanco se ve
disminuido172,173.
Aunque no se observaron para todas las MPS la activación de los mismos procesos,
en promedio las restricciones aplicadas eran adecuadas para la simulación de los
procesos metabólicos en MPS. Sin embargo, se requieren de restricciones
adicionales que permitan simular características propias de cada MPS.
Tabla 8. Tendencia de las reacciones en los dif erentes g rupos metabó licos para los modelos MPS comparados contra los obt enidos en recon2.
Las barras en col umnas corresponden a l a compar ación entre los val ores tomando como r ango el mayor y el menor val or.
7.9 REACCIONES ENCENDIDAS Y APAGADAS.
A partir de las reacciones que variaron en los modelos MPS con respecto al modelo
depurado de recon 2, se indagó las reacciones que se activaron o inactivaron en el
cumplimiento de la función objetivo tras el silenciamiento de las respectivas
reacciones de degradación de GAG. En general 608 ± 243 reacciones activaron
(Figura 12, barras amarillas) y 136 ± 32 reacciones se inactivaron (Figura 12, barras
66
verdes) en los modelos MPS. En el Anexo 5 se presenta en forma detallada el
comportamiento de las diferentes rutas metabólicas que presentaron estas
reacciones que se encendieron o se apagaron.
Igualmente se indagó cuales habían sido los metabolismos alterados en estas
reacciones, donde se encontró que en su mayoría se activaron reacciones que en
recon 2 no habían sido empleadas, estas fueron: transporte de metabolitos,
metabolismo de lípidos, carbohidratos, aminoácidos y glicanos También es de
resaltar que de las 10 reacciones de fosforilación oxidativa se aumentaron dos que
correspondían a NADH deshidrogenasa y el complejo citocromo c oxidasa, ambos
relacionados con el aumento de especies reactivas de oxígeno174.
A pesar que en recon 2 no se empleó toda la cadena respiratoria, posiblemente
porque algunos metabolitos que entran a la mitocondria son sustratos (por ejemplo
adenosin difosfato o adp) a los diferentes complejos de la cadena respiratoria, por
lo que se saltan pasos. Pero en los modelos MPS a pesar que también cumplen con
la misma función objetivo se emplearon otras reacciones que aportaron ubiquinol
que se empleó tanto en la reacción mediada por la enzima glicerol-3-fosfato
deshidrogenasa para obtener ubiquinona, el cual se emplearía por la NADH
deshidrogenasa; mientras que el aumento en consumo de oxigeno desplazo la
reacción de la citocromo c oxidasa hacia la derecha, que dentro del modelo uno de
sus productos son los iones superóxido. A pesar que se conocen otros eventos que
ocasionan el estrés oxidativo en MPS, como permeabilización de membrana
lisosomal 156, deficiente fusión lisosoma-autofagosoma 117, liberación de calcio
citoplasmático156, o citoquinas proinflamatorias 118, los modelos MPS aquí
estudiados presentan un evento metabólico que contribuye al estrés oxidativo que
es ocasionado por la activación metabólica debido a la deficiencia en una de las
rutas de degradación lisosomal y a la carga energética por la síntesis de ATP.
Para el análisis de las rutas alteradas de la Tabla 9, y teniendo en cuenta que recon
2 es una red tri-partita que relaciona genes-enzimas-metabolitos, se extrajeron los
genes asociados a las reacciones que se apagaron y las que se encendieron en
común para los modelos MPS. Empleando las herramientas bioinformáticas de la
base de datos para anotación, visualización y descubrimiento integrado (DAVID
v6.7) se realizó una clasificación funcional empleando los genes que se encuentran
asociados a cada reacción dentro de los modelos MPS (Anexo 6).
67
No.
Rxn
* Pa
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ism
inuy
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ism
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Met
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tore
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83
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7343
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Met
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140
143
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spor
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etab
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660
732
862
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525
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Met
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MPS
I-II
MPS
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r.
68
Figura 12. Numero de reacciones que se silenciaron y se activaron en los modelos de MPS comparando los flujos contra los obtenidos en recon 2. Las barras verdes corresponden a las reacciones que se activaron. Las barras naranjas corresponden a las reacciones que se silenciaron.
Se obtuvieron diferentes grupos de relaciones funcionales, por lo que para el
análisis se consideraron los primeros 20 grupos (con valores mayores a 1,5)
realizados por DAVID, los cuales principalmente se encontraban asociados con
procesos y componentes estructurales asociados a mitocondria. Para los genes que
se activaron se encontró actividad sobre la cadena respiratoria, transporte de
electrones, metabolismo de ácidos grasos, biosíntesis de cofactores, biosíntesis de
lípidos de membrana, procesos de glicosilación, biosíntesis de nucleótidos (Figura
13).
Con respecto a los genes de reacciones silenciadas se observó que estos se
encuentran asociados con el metabolismo de fármacos y xenobióticos por
citocromos, β-oxidación, degradación de aminoácidos (lisina, arginina, prolina,
fenilalanina y tirosina), transporte de aminoácidos, elongación de ácidos grasos
(Figura 13). De esta manera se confirmó una vez más que estos procesos
metabólicos se encontraban alterados y que se presentaron en conjunto para los
modelos de MPS. La alteración metabólica estaba favoreciendo diferentes procesos
relacionados a mitocondria, es decir, existía una mitocondria activada en
comparación con recon 2.
709770
259
762 773 737
250
140
155
93
161 161153
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0
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
MPSI - II MPSIII A - C MPSIIID MPSIVA MPSIVB MPSVI MPSVII
Nú
me
ro d
e r
eac
cio
ne
s
69
Tabla 9. Reacciones que se silenciaron o activaron en los modelos MPS. Las barras en columnas corresponden a la comparación entre los valores tomando como rango el
mayor y el menor valor.
Ruta
met
aból
ica
No.
Rxn
* Ru
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FFO
NO
FFO
NO
FFO
NO
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NO
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NO
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NO
FFO
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407
478
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428
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Met
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758
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oxi
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22
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bio
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Met
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ores
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am
inoá
cido
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11
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2333
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276
5027
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Otr
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911
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12
MPS
IVA
MPS
IVB
MPS
VIM
PSVI
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PSI-I
IM
PSIII
A-C
MPS
IIID
70
Esta activación se ha observado en MPS VI donde la alteración de otros procesos
secundarios como la acumulación de proteínas marcadas con ubiquitina,
inflamación, deterioro de la autofagia están asociados con la disminución del
potencial de membrana de la mitocondria, la fragmentación de esta, el gasto
energético y la producción de radicales libres117.
Para probar la relación de estos genes con la hipótesis de las alteraciones en
mitocondria, se estudiaron los genes que estaban en el grupo relacionados con la
mitocondria.
Figura 13. Análisis de enriquecimiento génico para los genes que se encendieron en los diferentes modelos de MPS. El valor de enriquecimiento significa el valor de importancia que tiene este grupo de acuerdo a diferentes características como ruta metabólica, términos ontológicos o funcionalidad.
Los genes que se encontraron alterados y que se obtuvieron a partir de las
reacciones que se apagaron o encendieron en los modelos MPS, se relacionaron
con diferentes acontecimientos celulares después de la acumulación de los GAG en
el lisosoma. En un estudio realizado por Jegga et al 2011, se empleó una
metodología por biología de sistemas para la integración de los genes y factores de
transcripción asociados en las rutas lisosomales y de autofagia. Ellos identificaron
36,2130,1
28,6727,27
26,3425,31
24,0723,3623,18
22,121,76
20,5719,58
17,1614,3914,14
13,8113,47
12,7612,72
10 15 20 25 30 35 40
Mitocondria - OxFos
Metabolismo de ácidos grasos
Transito de péptidos - lumen mitocondrial
Biosíntesis y metabolismo de cofactores
Catabolismo y modificación de lípidos
Biosíntesis de ácidos orgánicos
Microsomas - fracción vesicular
Transporte aa neutros
Biosíntesis de GPI
Señalización de Fosfatidil inositol
Membrana retico endoplasmático
Biosíntesis de N-glicanos
Glicolisis/gluconeogénesis
Componentes aparato de golgi
Componentes del peroxisoma
Biosíntesis de ácidos grasos
Unión a aminoácidos
Glicoproteínas y proteínas transmembranales
Metabolismo de purinas
Transporte iónico
Valor de enriquecimiento
71
que para autofagia las rutas de señalización de mTOR y de insulina regulan
altamente la autofagia. Mientras que la regulación de genes lisosomales están
regulados por las rutas de GAG y glicosfingolípidos, es decir, la biogénesis y
funcionamiento lisosomal se encontraba altamente regulado por estas
macromoléculas.
Los genes aquí encontrados correspondían a enzimas lisosomales de degradación
de GAG, de tal manera que en los modelos MPS se había encendido las reacciones
de degradación simulando exactamente la activación lisosomal.
Figura 14. Análisis de enriquecimiento génico para los genes que se apagaron en los diferentes modelos de MPS.
Otro grupo de genes encendidos estaban relacionados con mitocondria y
fosforilación oxidativa, algunos de estos se relacionaban con procesos patológicos
de muerte celular presentes en otras enfermedades como Parkinson, Huntington y
Alzheimer, exactamente en rutas de señalización como fosfolipasa C (PLC) que está
relacionada con la liberación de calcio del retículo endoplasmático 175, en este
mismo proceso por la alteración de calcio se observó que también la elevación de
la óxido nítrico sintasa 1 se encontraba activada que en exceso de óxido nítrico se
pueden formar especies reactivas derivadas de este como el peroxinitrito que como
14,4712,21
10,598,15
7,867,72
7,316,296,126,075,98
5,185,13
4,834,8
4,033,873,73,69
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
Metabolismo de xenobióticos por CYP450
Catabolismo de ácidos grasos y lípidos
Componentes membrana mitocondrial
Componentes peroxisoma
Metabolismo de propanoato, valina, isoleucina, leucina,…
Glicolisis/gluconeogenesis
Metabolismo de piruvato
Transporte de aminoácidos neutro
Glucosa/ribitol deshidrogenasa
Proteína de desacoplamiento tejido adiposo pardo
Transporte aa catatónicos
Unión a magnesio
Metabolismo de cofactores
Metabolismo de fármacos
Unión a nucleótidos
Actividad esteroide deshidrogenasa
Unión a flavo proteínas
Transporte de nucleósidos
Elongación de ácidos grasos en mitocondria
Actividad simporte
Valor de enriquecimiento
72
los otros radicales libres pueden causar daño celular causado por estrés nitrosativo,
en MPS se ha evidenciado la alteración de calcio y la alteración de la membrana
plasmática, así como procesos inflamatorios124, sin embargo la medición de estrés
nitrosativo no se ha asociado, siendo este un factor importante asociado con
enfermedades como hipertensión, artritis colitis, y diversas complicaciones
cardiacas y renales 176; otro proceso alterado es la disfunción mitocondrial que
involucra la enzima Abeta vinculante de la alcohol deshidrogenasa (ABAD) que está
relacionada con toxicidad neuronal por inducción de radicales libres que facilitan la
apoptosis 177. A pesar que algunos autores han observado la relación entre las
enfermedades neurodegenerativas con las EDL porque en ambas el lisosoma se ve
afectado, no se ha realizado una relación exhaustiva178, por ejemplo, ABAD no se
ha estudiado en MPS. Este tipo de análisis permite extender los usos de las redes
metabólicas ya que facilitan la identificación de rutas de señalización alteradas.
Además, es importante la identificación de estas similitudes con otras enfermedades
como son las neurodegenerativas ya que se comparten bastantes procesos
alterados como la autofagia o la acumulación de proteínas, de esta manera se
pueden correlacionar diferentes sucesos que aún no se conocen entre estas
patologías179. Por lo que otras rutas alteradas que serían de interés estudiar serian
señalización por p53, proteasoma y adhesión celular, ya que estas rutas se
encontraron alteradas.
Los genes que se apagaron correspondieron a metabolismo de xenobióticos (Figura
14), en la actualidad no se dispone de estudios de farmacocinética o
farmacodinamia que relacionen el metabolismo alterado de la depuración de
fármacos, sin embargo algunos reportes de efectos adversos con medicamentos se
han evidenciado en estos pacientes180, estos resultados requerirían nuevas
restricciones que simularan los efectos metabólicos de algún fármaco en específico
para estudiar los posibles efectos tóxicos146.
7.10 DIFERENCIACIÓN ENTRE MODELOS MPS.
Los flujos obtenidos entre los diferentes modelos de MPS fueron comparados entre
sí con el objetivo de identificar reacciones características de cada MPS. Para
realizar esta comparación, se consideró como flujo diferente cualquier valor inferior
o superior al 95 o 105%, respectivamente, del flujo observado en el modelo de
referencia. Por ejemplo, si en un MPS I una reacción determinada tenía un valor de
flujo de 100 mmol/gdw/h, un valor de 90 0 110 mmol/gdw/h en otro de los modelos
de MPS sería considerado como elevado o disminuido, respectivamente. La
selección de este rango se estableció teniendo en cuenta que hay cambios de los
flujos entre los modelos bastante pequeños luego cualquier comparación podría
llevar a falsos positivos.
73
Según lo anterior, se compararon los modelos MPS entre ellos para diferenciar los
cambios únicos de cada enfermedad. En el Anexo 7 se presenta la totalidad de los
cambios observados entre los diferentes modelos. En la Tabla 10 se presentan los
cambios por grupos metabólicos. Los resultados mostraron una vez más
alteraciones en los flujos de reacciones involucradas en el metabolismo de
aminoácidos, lípidos y carbohidratos y transporte de metabolitos. Sin embargo, los
flujos de ciertas reacciones dentro de cada modelo son diferentes para cada una de
las MPS.
Estas reacciones siguen características de alteración en todas las MPS, tanto para
flujos elevados como para aquellos que presentan disminución (Tabla 10 a y b).Por
ejemplo, para las reacciones que presentaron aumento en sus valores de flujo
(Anexo 7) se observa que para las MPS III A-C se presentó un mayor número de
reacciones en la degradación de QS, mientras que en MPS I y II se presentó un
mayor número de reacciones en la síntesis de QS. Por su parte, en la MPS IVA se
presentó un aumento en la síntesis de ubiquinona y en la MPS VII se observó
alteración en toda la ruta de degradación del HS. Es importante destacar que para
la MPS VII no se observaron aumentos de los flujos frente a las demás MPS.
Con respecto a las reacciones que se disminuyeron (Anexo 8), no se encontró
diferencia entre los diferentes modelos de MPS, pero se observaron algunas
características en MPS IIID que presentaba 30 reacciones en el metabolismo de
lípidos menores en comparación que todas las demás MPS, así como también en
el metabolismo de nucleótidos. Otras rutas alteradas en las demás MPS estaban
relacionadas con transporte de metabolitos entre organelos (mitocondria,
extracelular, lisosoma, peroxisoma) y reacciones de intercambio o demanda.
7.11 ANÁLISIS DE VARIABILIDAD DE FLUJOS.
La identificación de posibles biomarcadores para las MPS se realizó empleando el
análisis de variabilidad de flujos bajo la función objetivo de síntesis de ATP. Como
se describió este tipo de análisis permite encontrar los límites de flujo inferior y
superior para cada reacción, para que puedan cumplir con la función objetivo.
Cuando existe una alteración dentro de la red metabólica, como el silenciamiento
de una o más reacciones esto conlleva a la modificación de estos límites de flujo
dentro de reacciones alteradas directamente. Los flujos se presentan en el Anexo
2.
A partir del análisis de variabilidad de flujos se obtuvieron los valores de consumo
y/o producción para cada reacción en cada uno de los modelos. En general se
encontraron 4 biomarcadores para MPS IVA, 111 para MPS IVB, 15 para MPS VI
74
y 130 para MPS VII (Anexo 9). Que correspondían a diferentes sucesos descritos
en la Figura 8 (ver sección de métodos), estos se presentan en la Tabla 11.
Tabla 10. Comparación metabólica entre los modelos de MPS. En las tablas se presenta la cantidad de reacciones que presentaron un flujo único respecto a las otras MPS, es decir, alguna reacción de uno de los modelos MPS con flujo mayor (a) o menor (b) respecto al flujo de reacción en los demás modelos MPS.
Tabla 11. Tipos de rangos obtenidos para los diferentes modelos MPS. Los biomarcadores de alta confidencia corresponden a los rangos tipo 3 y 6. Los intermedios corresponden al tipo 2 y 4. Los demás son de baja confidencia.
(a) MPSI-II MPSIIIA-C MPSIIID MPSIVA MPSIVB MPSVI MPSVII
Metabolismo de aminoácidos 31 32 20 16 17 25 2
Metab grupo sanguineo 8 4
Metab carbohidratos 25 26 12 18 19 11 2
Fosforilación oxidativa 1 1 1 1
Intercambio 41 26 26 27 21 18 2
Metab glicanos 79 61 7 10 3 68
Metab lipidos 86 82 41 87 96 44 1
Metab cofactores y vitaminas 12 9 11 22 6 2
Metab otros aminoácidos 4 2 2
Metab nucleotidos 27 16 9 10 13 13
Otros 22 22 20 12 17 10
Transporte de mtabolitos 145 106 70 100 82 76 1
(b) MPSI-II MPSIIIA-C MPSIIID MPSIVA MPSIVB MPSVI MPSVII
Metabolismo de aminoácidos 3 7 2 5 3 3
Metab grupo sanguineo 1
Metab carbohidratos 5 1 3 2 2 4
Fosforilación oxidativa 1
Intercambio 15 10 17 17 15 21 14
Metab glicanos 2
Metab lipidos 4 1 30 10 9 5 5
Metab cofactores y vitaminas 2 4 2 2 1 2
Metab otros aminoácidos 2
Metab nucleotidos 2 13 8 11 3 6
Otros 5 1 4 1 1 5
Transporte de mtabolitos 15 14 35 21 38 40 34
MAX MIN TIPO DE RANGO
- AUMENTO 1
AUMENTO - 2
AUMENTO AUMENTO 3
- DISMINUYO 4
DISMINUYO - 5
DISMINUYO DISMINUYO 6
DISMINUYO AUMENTO 7
RANGOS
75
Las reacciones que se presentan como biomarcadores de alta confidencia
corresponden a las rutas de esfingolípidos, esteroides y degradación de GAG, que
corresponden a rutas altamente alteradas en MPS, donde se ha observado
precisamente cambios importantes en las MPS que tienen asociado heparan sulfato
como GAG acumulado5 (Figura 15).
Figura 15. Número de reacciones que se identificaron como biomarcadores por ruta metabólica para los modelos MPS tipo IVA, IVB, VI y VII. Rxn: reacción. QS: queratan sulfato. CS: condroitin sulfato.
De los modelos de MPS IVB y VII se identificaron biomarcadores de alta confidencia,
mientras que los MPS de tipo IVA y VI presentaron de baja confidencia (Tabla 12).
Moléculas como aminoácidos o aminoazúcares se encontraron como posibles
biomarcadores de MPS VII, a pesar que no existe evidencia de las concentraciones
de estos con las MPS, podrían considerarse como aminoácidos consecuencia de la
degradación de proteínas debido a la búsqueda de otras fuentes energéticas40,169.
Tabla 12. Biomarcadores de alta y baja confidencia predichos por FVA. En la parte superior se encuentran los biomarcadores de alta confidencia, en la parte inferior los de
baja confidencia. A: aumento, D: disminuyo, QS: queratan sulfato, UDP: uridildifosfato, AcGal:
acetilgalactosamina.
0 5 10 15 20 25 30 35
Metab aminoazucares
Degradación de CS
Rxn de intercambio
Metabolismo de galactosa
Degradacion de grupo heme
Metabolismo de Inositol
Degradación de QS
Ruta pentosa fosfato
Metabolismo esfingolipidos
Metabolismo de sucrosa y almidón
Metabolismo de esteroides
Transporte, reticulo endoplasmico
Transporte, extracelular
Transporte, aparato de golgi
Transporte, lisosoma
Número de reacciones como biomarcador
MPS_VII
MPS_VI
MPS_IVA
MPS_IVB
76
La observación detallada de estos biomarcadores (enzimas y metabolitos) permitió determinar que la ruta principal que se alteró en estas cuatro MPS fue el metabolismo de esfingolípidos, los metabolitos principalmente fueron ceramida y un derivado de este, globósido. Dos enzimas relacionadas a la obtención de este ultimó fueron lactosilceramida 4-α-galactosiltransferasa y la β-N-acetilgalactosaminidasa.
Otra enzima fue la β-1,3-galactosiltransferasa, la cual transfiere galactosa a
residuos terminados en β-N-acetilglucosamina, está involucrado con la biosíntesis
de motivos de carbohidratos de glicolípidos y glicoproteínas181.
Varios reportes de la acumulación secundaria de lípidos en MPS se han estudiado,
en específico se han reportado glicolípidos (GM3 y GM2), colesterol, fosfolípidos y
esfingolípidos182, estos tienen diferentes mecanismos propuestos y desconocidos
del porque la acumulación, algunos son la inactivación de otras enzimas lisosomales
por los GAG acumulados25, así como también la acumulación de colesterol en la
membrana del lisosoma lo cual imposibilita la fusión vesicular6. Similitudes en las
alteraciones del metabolismo de esfingolípidos en enfermedades
neurodegenerativas como el Alzheimer, en la cual estas favorecen las alteraciones
neuropatológicas de esta enfermedad. Diferentes asociaciones se han realizado
entre la acumulación de proteínas β-amiloide con las ceramidas. Luego así como
en Alzheimer se podría emplear este biomarcador en diagnóstico de deterioro
cognitivo, en MPS podría usarse como biomarcador en la progresión de la
Ruta metabólica Nombre de reacción MPSIVB MPSVII
Intercambio de xilosa D
Intercambio de iduronato A
Intercambio de globósido A
Degradación de QS Sialidasa, Lisosoma A
β-1,3-glactosiltransferasa III A
Lactosilceramida 4-α-galactosiltransferasa A
β-N-acetilgalactosaminidasa A
Transporte de ceramida A
Transporte intracelular N-acetil-galactosamina D
Transporte de glutamate, lisosoma A
Transporte de glicina (simporte), lisosoma A
Transporte de iduronato al lisosoma D
Transporte de alanina (simporte), lisosoma A
Transporte de prolina (simporte), lisosoma A
Transporte de N-acetilneuraminato al lisosoma D
Transporte de histidina por
peptidos trasnp. hPT3 o hPT4A
Transporte de UDP A
Trasnporte de UDP-AcGal D
Ruta metabólica Nombre de reacción MPSIVA MPSIVB MPSVI MPSVII
β-N-acetilhexosaminidasa, lisosoma D A D
β-glucuronidasa, lisosoma A D DMetabolismo de GAG
Transporte aparato de Golgi
Transporte lisosomal
Intercambio/demanda
Metabolismo de esfingolípidos
77
enfermedad en los estadios pre-sintomáticos del deterioro cognitivo. En la
gangliósidosis donde se encuentra alterada la -galactosidasa, se acumulan
diferentes esfingolípidos, luego en MPS IVB que también implica esta enzima estos
biomarcadores podrían ser de uso en la enfermedad, a pesar que en este tipo de
MPS han sido pocos los casos en que se presenta el retardo o deterioro mental183,
es posible que se pueda estudiar estos biomarcadores en otras MPS ya que en
conjunto los modelos MPS siguieron un patrón en el comportamiento metabólico.
En asociación con los resultados obtenidos en la identificación de reacciones que
se encendieron y apagaron, otro gen que se encendió estaba asociado con
lipoproteína lipasa que hidroliza triglicéridos de los quilomicrones y las lipoproteínas
de baja densidad (VLDL), además que participa en la unión de varias estructuras
como GAG en las partículas de lipoproteínas184, por lo que recientemente se ha
asociado esta lipasa con la unión de la proteína -amiloide que es internalizada y
degradada vía lisosoma, también se ha observado que esta unión es mediada por
los GAG, luego si en MPS se encuentra alterada el lisosoma es posible que la
acumulación de la proteína -amiloide también se encuentre elevada185. LPL está
distribuido en corazón, musculo esquelético tejido adiposo marrón y blanco, así
como en cerebro, y a pesar que no se conoce que función cumple allí se ha
relacionado con la acumulación de ovillos neurofibrilares y placas seniles. Luego la
alteración de esta enzima en cerebro podría alterar la regulación del balance
energético, en estudios en ratones se ha observado que existe una disminución en
los niveles de ácidos grasos esenciales186. Luego es posible que en MPS se
encuentre alterada esta enzima acumulada en placas seniles conllevando a la
alteración metabólica de ácidos grasos que se han observado reducidos en algunos
animales con MPS I169.
La activación metabólica posiblemente favorece la activación de otras rutas, entre
las que esta estrés oxidativo, y alteraciones en metabolismo de esfingolípidos en
los cuales se alteró ceramidas que se encuentra relacionado con las reacciones que
se activaron y que están involucradas en muerte celular con otras patologías como
enfermedades neurodegenerativas, esto lleva a pensar qué podría existir una
relación más profunda entre el daño neuronal que ocurre en MPS y Alzheimer, esto
por los mecanismos relacionados aquí; también, cabe preguntarse si se podrían
emplear biomarcadores de Alzheimer en MPS y viceversa. Adicional, el
comportamiento metabólico en los modelos MPS puede ser comparado con futuros
aproximaciones experimentales para la validación.
78
8 CONCLUSIONES
Los modelos de MPS obtenidos por silenciamiento selectivo de las enzimas de
degradación de GAG y debido al cumplimiento de la función objetivo (síntesis de
ATP) cuando son optimizados los modelos, generaron importantes cambios
metabólicos, algunos evidenciados en MPS, tanto experimental como en clínica.
Los cambios metabólicos más sobresalientes fueron la activación de fuentes
energéticas alternas como β-oxidación, la síntesis de macromoléculas y la
alteración mitocondrial relacionada con especies reactivas de oxígeno. A su vez, la
obtención de biomarcadores una vez validado los modelos, logró identificar 14
metabolitos y 4 enzimas las cuales correspondían a metabolismo de esfingolípidos
y a transporte de aminoácidos (histidina, glutamato, alanina, prolina) y de
aminoazúcares. A pesar que los resultados obtenidos por los modelos deben ser
validados experimentalmente, este primer acercamiento hecho para 10 subtipos de
mucopolisacaridosis por biología de sistemas permite iniciar un campo de acción
para el entendimiento de lo complejo que son estas enfermedades, sin embargo
esta primera aproximación queda como un nuevo recurso para futuras
investigaciones en el área.
79
9 PERSPECTIVAS Y APLICACIONES
Los resultados aquí obtenidos deben ser validados experimentalmente, luego se propone
acercamientos que permitan cuantificar las variaciones de varios metabolitos.
El trabajo desarrollado permitió realizar nuevas preguntas de las bases que se deben tener
para enfocar futuras aproximaciones computacionales para esta enfermedad, estas son:
Acoplamiento del modelo con nuevos organelos, por ejemplo autofagosoma, lo cual
permitirá entender otros procesos que ocurren allí.
Relleno de huecos metabólicos presentes en la red, inserción de constantes cinéticas y
reguladores booleanos, lo cual permitirá reducir el espacio de optimización para soluciones
más certeras.
Empalme con datos ‘omicos’ de literatura y experimentales. Esto permitirá hacer más
robustez los análisis. Debido a que se puede estudiar diferentes redes (genes, proteínas,
metabolitos) en diferentes momentos de la enfermedad.
Diferenciación entre los diferentes modelos celulares en los cuales se ha estudiado MPS y
que presentan una amplia variedad en resultados, por lo que emplear estos modelos
permitirán realizar una aproximación para encontrar diferencias. Por ejemplo, diferenciar
metabólicamente los sucesos que pasan en células gliales y neuronales.
Análisis diferenciales de flujos de redes para redes metabólicas, y descripción topológica
para encontrar nodos importantes alterados en las distintas MPS.
Análisis de diferentes sustratos para una aproximación dietaría en pacientes con MPS.
Las aplicaciones de este proyecto es útil para la predicción in silico de no solo cambios
metabólicos, sino génicos y de regulación génica. Por lo que alimentar más el modelo
permitirá realizar aproximaciones más certeras y facilitara la validación in vivo. La detección
de estos vacíos en el conocimiento por esta vía es importante para la disminución de
recursos como animales de experimentación y materiales de laboratorio.
Actualmente se discute de la interacción entre farmacogenética y biología de sistemas
como terapia individualizada, por lo que el desarrollo de estos sistemas abre las puertas a
nuevos campos de la investigación.
80
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11 ANEXOS
Anexo 1. Reacciones específicas para recon 2 que estaban asociadas a las
enzimas lisosomales deficientes en MPS.
MPS I
Abreviación de la reacción Nombre de la reacción Formula de la reacción
'IDOAASE1ly'
α-L-iduronidasa
'h2o[l] + hs_deg4[l] => hs_deg5[l] + idour[l] '
'IDOAASE2ly' h2o[l] + hs_deg16[l] => idour[l] + hs_deg17[l] '
'IDOAASE3ly' h2o[l] + hs_deg22[l] => idour[l] + hs_deg23[l] '
'IDOAASE4ly' 'h2o[l] + cs_b_deg3[l] => cs_a_deg3[l] + idour[l] '
MPS II
Abreviación de la reacción Nombre de la reacción Formula de la reacción
'S2TASE1ly'
Iduronato-2-sulfatasa
'h2o[l] + hs_deg15[l] => h[l] + so4[l] + hs_deg16[l] '
'S2TASE2ly' 'h2o[l] + hs_deg21[l] => h[l] + so4[l] + hs_deg22[l] '
'S2TASE3ly' 'h2o[l] + cs_b_deg2[l] => h[l] + so4[l] + cs_b_deg3[l] '
MPS IIIA
Abreviación de la reacción Nombre de la reacción Formula de la reacción
'HS1ly'
Heparan-N-sulfatasa
'h2o[l] + hs_deg1[l] => h[l] + so4[l] + hs_deg2[l] '
'HS2ly' 'h2o[l] + hs_deg6[l] => h[l] + so4[l] + hs_deg7[l] '
'HS3ly' 'h2o[l] + hs_deg12[l] => h[l] + so4[l] + hs_deg13[l] '
'HS4ly' 'h2o[l] + hs_deg18[l] => h[l] + so4[l] + hs_deg19[l] '
MPS IIIB
Abreviación de la reacción Nombre de la reacción Formula de la reacción
'GLCNACASE1ly'
α-N-acetilglucosaminidasa
'h2o[l] + hs_deg3[l] => acgam[l] + hs_deg4[l] '
'GLCNACASE2ly' 'h2o[l] + hs_deg8[l] => acgam[l] + hs_deg9[l] '
'GLCNACASE3ly' 'h2o[l] + hs_deg14[l] => acgam[l] + hs_deg15[l] '
'GLCNACASE4ly' 'h2o[l] + hs_deg20[l] => acgam[l] + hs_deg21[l] '
'GLCNACASE5ly' 'h2o[l] + hs_deg24[l] => acgam[l] + hs_deg25[l] '
MPS IIIC
Abreviación de la reacción Nombre de la reacción Formula de la reacción
'HSAT1ly'
Heparan-glucosaminida N-acetiltransferasa
'accoa[c] + hs_deg2[l] => coa[c] + h[l] + hs_deg3[l] '
'HSAT2ly' 'accoa[c] + hs_deg7[l] => coa[c] + h[l] + hs_deg8[l] '
'HSAT3ly' 'accoa[c] + hs_deg13[l] => coa[c] + h[l] + hs_deg14[l] '
'HSAT4ly' 'accoa[c] + hs_deg19[l] => coa[c] + h[l] + hs_deg20[l] '
MPS IIID
Abreviación de la reacción Nombre de la reacción Formula de la reacción
97
'S6TASE11ly'
N-acetylglucosamina-6-sulfatasa
'h2o[l] + ksi_deg6[l] <=> h[l] + so4[l] + ksi_deg7[l] '
'S6TASE12ly' 'h2o[l] + ksi_deg9[l] <=> h[l] + so4[l] + ksi_deg10[l] '
'S6TASE13ly' 'h2o[l] + ksi_deg12[l] <=> h[l] + so4[l] + ksi_deg13[l] '
'S6TASE14ly' 'h2o[l] + ksi_deg15[l] <=> h[l] + so4[l] + ksi_deg16[l] '
'S6TASE15ly' 'h2o[l] + ksi_deg18[l] <=> h[l] + so4[l] + ksi_deg19[l] '
'S6TASE16ly' 'h2o[l] + ksi_deg21[l] <=> h[l] + so4[l] + ksi_deg22[l] '
'S6TASE17ly' 'h2o[l] + ksi_deg24[l] <=> h[l] + so4[l] + ksi_deg25[l] '
'S6TASE18ly' 'h2o[l] + ksi_deg27[l] <=> h[l] + so4[l] + ksi_deg28[l] '
'S6TASE19ly' 'h2o[l] + ksi_deg30[l] <=> h[l] + so4[l] + ksi_deg31[l] '
'S6TASE1ly' 'h2o[l] + hs[l] <=> h[l] + so4[l] + hs_deg1[l] '
'S6TASE20ly' 'h2o[l] + ksi_deg33[l] <=> h[l] + so4[l] + ksi_deg34[l] '
'S6TASE21ly' 'h2o[l] + ksi_deg36[l] <=> h[l] + so4[l] + ksi_deg37[l] '
'S6TASE23ly' 'h2o[l] + ksii_core2_deg3[l] <=> h[l] + so4[l] + ksii_core2_deg4[l] '
'S6TASE24ly' 'h2o[l] + ksii_core2_deg6[l] <=> h[l] + so4[l] + ksii_core2_deg7[l] '
'S6TASE26ly' 'h2o[l] + ksii_core4_deg3[l] <=> h[l] + so4[l] + ksii_core4_deg4[l] '
'S6TASE2ly' 'h2o[l] + hs_deg5[l] <=> h[l] + so4[l] + hs_deg6[l] '
'S6TASE3ly' 'h2o[l] + hs_deg11[l] <=> h[l] + so4[l] + hs_deg12[l] '
MPS IVA
Abreviación de la reacción Nombre de la reacción Formula de la reacción
'S6TASE10ly'
Galactosa-6-sulfato sulfatasa
'h2o[l] + ksi_deg4[l] <=> h[l] + so4[l] + ksi_deg5[l] '
'S6TASE22ly' 'h2o[l] + ksii_core2_deg1[l] <=> h[l] + so4[l] + ksii_core2_deg2[l] '
'S6TASE25ly' 'h2o[l] + ksii_core4_deg1[l] <=> h[l] + so4[l] + ksii_core4_deg2[l] '
'S6TASE4ly' 'h2o[l] + cs_c[l] <=> h[l] + so4[l] + cs_c_deg1[l] '
'S6TASE5ly' 'h2o[l] + cs_c_deg3[l] <=> h[l] + so4[l] + cs_c_deg4[l] '
'S6TASE6ly' 'h2o[l] + cs_d[l] <=> h[l] + so4[l] + cs_d_deg1[l] '
'S6TASE7ly' 'h2o[l] + cs_d_deg4[l] <=> h[l] + so4[l] + cs_d_deg5[l] '
'S6TASE8ly' 'h2o[l] + cs_e_deg1[l] <=> h[l] + so4[l] + cs_e_deg2[l] '
'S6TASE9ly' 'h2o[l] + cs_e_deg5[l] <=> h[l] + so4[l] + cs_e_deg6[l] '
MPS IVB
Abreviación de la reacción Nombre de la reacción Formula de la reacción
'GALASE11ly'
β-galactosidasa
'h2o[l] + ksi_deg29[l] => gal[l] + ksi_deg30[l] '
'GALASE12ly' 'h2o[l] + ksi_deg32[l] => gal[l] + ksi_deg33[l] '
'GALASE13ly' 'h2o[l] + ksi_deg35[l] => gal[l] + ksi_deg36[l] '
'GALASE14ly' 'h2o[l] + ksi_deg38[l] => gal[l] + ksi_deg39[l] '
'GALASE15ly' 'h2o[l] + ksi_deg40[l] => gal[l] + ksi_deg41[l] '
'GALASE16ly' '2 h2o[l] + ksii_core2_deg2[l] => 2 gal[l] + ksii_core2_deg3[l] '
'GALASE17ly' 'h2o[l] + ksii_core2_deg5[l] => gal[l] + ksii_core2_deg6[l] '
'GALASE18ly' 'h2o[l] + ksii_core2_deg8[l] => gal[l] + ksii_core2_deg9[l] '
98
'GALASE19ly' 'h2o[l] + f1a[l] => gal[l] + core6[l] '
'GALASE1ly' '2 h2o[l] + l2n2m2mn[l] => n2m2mn[l] + 2 gal[l] '
'GALASE20ly' '2 h2o[l] + ksii_core4_deg2[l] => 2 gal[l] + ksii_core4_deg3[l] '
'GALASE3ly' '2 h2o[l] + ksi_deg5[l] => 2 gal[l] + ksi_deg6[l] '
'GALASE4ly' 'h2o[l] + ksi_deg8[l] => gal[l] + ksi_deg9[l] '
'GALASE5ly' 'h2o[l] + ksi_deg11[l] => gal[l] + ksi_deg12[l] '
'GALASE6ly' 'h2o[l] + ksi_deg14[l] => gal[l] + ksi_deg15[l] '
'GALASE7ly' 'h2o[l] + ksi_deg17[l] => gal[l] + ksi_deg18[l] '
'GALASE8ly' 'h2o[l] + ksi_deg20[l] => gal[l] + ksi_deg21[l] '
'GALASE9ly' 'h2o[l] + ksi_deg23[l] => gal[l] + ksi_deg24[l] '
MPS VI
Abreviación de la reacción Nombre de la reacción Formula de la reacción
'S4TASE1ly'
N-acetilgalactosamina-4-sulfatasa
'h2o[l] + cs_a[l] <=> h[l] + so4[l] + cs_a_deg1[l] '
'S4TASE2ly' 'h2o[l] + cs_a_deg3[l] <=> h[l] + so4[l] + cs_a_deg4[l] '
'S4TASE3ly' 'h2o[l] + cs_b[l] <=> h[l] + so4[l] + cs_b_deg1[l] '
'S4TASE4ly' 'h2o[l] + cs_e[l] <=> h[l] + so4[l] + cs_e_deg1[l] '
'S4TASE5ly' 'h2o[l] + cs_e_deg4[l] <=> h[l] + so4[l] + cs_e_deg5[l] '
MPS VII
Abreviación de la reacción Nombre de la reacción Formula de la reacción
'GLCAASE4ly'
β-glucuronidasa
'h2o[l] + cs_a_deg2[l] => glcur[l] + cs_a_deg3[l] '
'GLCAASE5ly' 'h2o[l] + cs_c_deg2[l] => glcur[l] + cs_c_deg3[l] '
'GLCAASE6ly' 'h2o[l] + cs_d_deg3[l] => glcur[l] + cs_d_deg4[l] '
'GLCAASE7ly' 'h2o[l] + cs_e_deg3[l] => glcur[l] + cs_e_deg4[l] '
'GLCAASE1ly' 'h2o[l] + hs_deg9[l] => glcur[l] + hs_deg10[l] '
'GLCAASE8ly' 'h2o[l] + ha[l] => glcur[l] + ha_deg1[l] '
'GLCAASE9ly' '2 h2o[l] + ha_pre1[l] => acgam[l] + glcur[l] '
Anexo 2. Valores de flujos (FBA Y FVA) de cada modelo MPS y recon 2.
Resultados de optimización de cada modelo MPS y recon 2 cumpliendo la función objetivo de síntesis de ATP. En el siguiente link e encuentra compartido: https://www.dropbox.com/s/oqw1za5vhsptder/ANEXO%202.xlsx?dl=0
Anexo 3. Categorización de rutas metabólicas detalladas en recon 2 en base a la clasificación realizada en la base de datos KEGG pathway (http://www.kegg.jp/kegg/pathway.html).
METABOLISMO DE CARBOHIDRATOS
Glicolisis/gluconeogénesis
99
Ciclo del ácido cítrico
Ruta de las pentosas fosfato
Metabolismo de fructosa y manosa
Metabolismo de galactosa
Metabolismo de sacarosa y almidon
Metabolismo de aminoazúcares
Metabolismo de piruvato
Metabolismo de carboxilato y dicarboxilato
Metabolismo de propanoato
Metabolismo de butanoato
Metabolismo de nucleósidos
Metabolismo de ácidos dibásicos C5
Metabolismo de inositol fosfato
METABOLISMO ENERGETICO
Fosforilación oxidativa
METABOLISMO DE LIPIDOS
Oxidación de ácidos grasos
Síntesis de ácidos grasos
Metabolismo de esteroides
Síntesis de ácidos biliares
Metabolismo de glicerofosfolípidos
Metabolismo de glicoesfingolípidos
Metabolismo de lipoato
Metabolismo de linoleato
Síntesis de triacilglicerol
Metabolismo de esfingolípidos
Metabolismo de ácido araquidónico
Metabolismo de ecosanoides
Síntesis y metabolismo de andrógenos y estrógenos
Metabolismo de colesterol
Síntesis de colesterol y escualeno
Metabolismo de fosfatidilinositol fosfato
METABOLISMO DE NUCLEOTIDOS
Síntesis de pirimidinas
Catabolismo de pirimidinas
Síntesis de purinas
Catabolismo de purinas
Interconversión de nucleótidos
Ruta de salvamento de nucleótidos
METABOLISMO DE AMINOACIDOS
100
Metabolismo de valina, leucina e isoleucina
Ciclo de la urea
Metabolismo de triptofano
Metabolismo de tirosina
Metabolismo de fenilalanina
Metabolismo de metionina y cisteína
Metabolismo de lisina
Metabolismo de glicina, serina, alanina y treonina
Metabolismo de glutamato
Metabolismo de D-alanina
Metabolismo de histidina
Metabolismo de cisteína
Metabolismo de alanina y aspartato
Metabolismo de prolina y arginina
METABOLSIMO DE3 OTROS AMINOACIDOS
Metabolismo de beta-alanina
Metabolismo de glutatión
Metabolismo de taurina e hipotaurina
Metabolismo de seleno-aminoácidos
METABOLISMO Y SINTESIS DE GLICANOS
Degradación de N-glicanos
Síntesis de N-glicanos
Síntesis de O-glicanos
Síntesis de queratan sulfato
Síntesis de condroitin sulfato
Degradación de heparan sulfato
Metabolismo de hiualuronato
Degradación de queratan sulfato
Degradación de condroitin sulfato
METABOLISMO DE COFACTORES Y VITAMINAS
Metabolismo de vitamina A
Metabolismo de vitamina B2
Metabolismo de vitamina B6
Metabolismo de vitamina B12
Metabolismo de vitamina E
Síntesis de ubiquinona
Metabolismo de tiamina
Metabolismo de vitamina C
Metabolismo de vitamina D
Metabolismo de folato
101
Metabolismo de biotina
Catabolismo de acetilcoA
Síntesis de acetilcoA
Metabolismo de tetrahidrobiopterina
TRANSPORTE DE METABOLITOS
Trans. Reticulo endoplasmatico
Trans. Extracelular
Trans. Aparato de Golgi
Trans. Lisosomal
Trans. Mitocondrial
Trans. Nuclear
Trans. Peroxisomal
INTERCAMBIO
Reacción de intercambio/demanda
MMETABOLISMO DE GRUPO SANGUINEO
Síntesis de grupo sanguíneo
Degradación de heme
Síntesis de heme
OTROS
Síntesis de alcaloides
Unión a fibra dietaría
Degradación de pineno y limoneno
Reacciones Misceláneas
Metabolismo de NAD
Síntesis grupo R
Detoxificación de ROS
No asignadas
102
Anexo 4. Comportamiento de los flujos de reacción para los diferentes modelos MPS comparados contra los obtenidos en recon 2. MAA: metabolismo de aminoácidos, MGS: metabolismo de grupo sanguíneo, MC: metabolismo de carbohidratos, Ox: fosforilación oxidativa, Ex: reacciones de intercambio y demanda, MBG: metabolismo y biosíntesis de glicanos, ML: metabolismo de lípidos, MCV: metabolismo de cofactores y vitaminas, MOA: metabolismo de otros aminoácidos, MN: metabolismo de nucleótidos, TM: transporte de metabolitos.
Ruta metabolicaGrupo
MetabNo. Rxn
* Ruta disminuyo AUMENTO disminuyo AUMENTO disminuyo AUMENTO disminuyo AUMENTO disminuyo AUMENTO disminuyo AUMENTO disminuyo AUMENTO
'Valine, leucine, and isoleucine metabolism' 43 2 16 4 14 5 5 4 10 5 15 4 15 5 5
'Urea cycle' 69 5 3 5 5 5 3 5 7 7 9 7 3 5 4
'Tyrosine metabolism' 121 5 9 5 12 2 3 5 6 5 4 5 6 2 4
'Tryptophan metabolism' 70 2 4 4 5 1 1 2 5 3 6 4 11 2 4
'Phenylalanine metabolism' 12 1 2 1 1 1 1 1 1 1 1 5
'Methionine and cysteine metabolism' 54 4 2 4 5 7 3 5 12 5 6 4 6 5 4
'Lysine metabolism' 24 2 2 3 9 1 1 2 5 3 4 3 5
'Histidine metabolism' 16 3 1 3 3 2 3 3 3
'Glycine, serine, alanine and threonine metabolism' 37 2 15 1 10 5 2 12 1 12 2 16 7
'Glutamate metabolism' 15 3 6 3 6 3 5 3 5 2 8 3 7 2 7
'D-alanine metabolism' 3 1 1 1 1 1 3
'Cysteine Metabolism' 3 1 1 1 1 1 1 2 1 1
'Arginine and Proline Metabolism' 41 10 9 9 12 5 9 10 9 11 9 10 10 9 6
'Alanine and aspartate metabolism' 16 4 1 5 1 3 4 3 1 3 3 3 2 3 2
'Heme degradation' 3
'Heme synthesis' 14 8 2 8 2 8 1 8 2 8 2 8 1 8 1
'Blood group synthesis' 48 7 5 1
'Starch and sucrose metabolism' 33 6 6 2 8 3 5 7 5 2 12 2 10 6 1
'Pyruvate metabolism' 60 9 18 9 17 5 7 9 10 7 17 9 10 4 4
'Propanoate metabolism' 13 3 2 3 1 1 2 2 2 1 2 3 1 2
'Pentose phosphate pathway' 39 3 14 2 17 6 4 2 19 2 15 3 16 5 5
'Inositol phosphate metabolism' 64 3 1 8 1 6 1 10 1 5 1 3
'Glyoxylate and dicarboxylate metabolism' 14 5 3 3 1 1
'Glycolysis/gluconeogenesis' 47 9 14 7 12 9 8 10 14 7 11 7 11 8 4
'Galactose metabolism' 12 3 2 3 2 3 1 2 2 2 3 3 3 2 1
'Fructose and mannose metabolism' 24 4 3 5 5 4 1 6 4 6 4 6 5 5 2
'Citric acid cycle' 20 5 4 5 6 5 3 5 6 5 8 4 5 4 5
'C5-branched dibasic acid metabolism' 8 2 2 1 1 1 1 1 1 2 2 2 2 1 1
'Butanoate metabolism' 3 1 2 1 1 1 1 1 1 1 1
'Aminosugar metabolism' 28 2 8 1 9 1 4 2 12 1 10 1 5 4
'Oxidative phosphorylation' Ox 10 3 4 3 3 3 1 1 5 3 4 3 4 4
'Exchange/demand reaction' Ex 741 140 143 135 150 89 86 138 150 132 138 140 149 82 88
'O-glycan synthesis' 15 3 1
'N-glycan synthesis' 108 38 9 37 43 38
'N-glycan degradation' 41 7 14 5 5 5 5
'Keratan sulfate synthesis' 66 37 11 39 11
'Keratan sulfate degradation' 70 11 38 2 3 6
'Hyaluronan metabolism' 2 1
'Heparan sulfate degradation' 35 2 24
'Chondroitin sulfate degradation' 18 1
'Triacylglycerol synthesis' 13 2 6 2 2 2 2 2 5 1 3 1 3 2 1
'Steroid metabolism' 77 2 6 2 4 2 3 2 6 3 8 3 9 1 3
'Squalene and cholesterol synthesis' 5 1 1 1 1 3 1
'Sphingolipid metabolism' 75 8 6 8 9 8 1 7 6 6 10 6 7 6 2
'Phosphatidylinositol phosphate metabolism' 63 3 13 3 13 2 4 16 4 13 3 13 3 7
'Glycosphingolipid metabolism' 14 1 1 1 1 1 1 1 1 2 1 1 1 1
'Glycerophospholipid metabolism' 74 8 10 8 13 7 4 9 10 9 10 7 8 8 7
'Fatty acid synthesis' 126 18 22 18 27 17 21 17 34 17 30 18 31 4 4
'Fatty acid oxidation' 866 54 65 60 97 43 63 61 115 61 101 55 71 48 48
'Eicosanoid metabolism' 258 5 10 4 8 4 8 5 9 4 9 5 10 3 7
'Cholesterol metabolism' 62 4 11 4 7 3 3 12 5 17 2 15 1 3
'Bile acid synthesis' 127 18 19 15 19 6 8 12 16 17 27 18 20 11 7
'Androgen and estrogen synthesis and metabolism' 57 1 1 1 1 1 1
'Vitamin D metabolism' 29 1 2 1 2
'Vitamin C metabolism' 16 4 3 1 2 4 1 1 2 1 2 2 1 1 2
'Vitamin B6 metabolism' 11 2 3 1 2 2 3 3 3 1 2 2
'Vitamin B2 metabolism' 7 1 3 1 3 1 1 4 5 5 1
'Vitamin A metabolism' 80 5 9 7 9 8 11 12 14 11 10 11 11 9 9
'Ubiquinone synthesis' 14 13
'Thiamine metabolism' 6 1 2 2 2 2 4 2 2
'Tetrahydrobiopterin metabolism' 27 1 2 1 1 1 1 1 1 1 1 1 3
'Folate metabolism' 59 2 15 3 16 3 12 4 11 3 10 4 15 4 7
'CoA synthesis' 22 5 3 5 4 5 4 5 6 4 4 5 3 8 6
'CoA catabolism' 4 2 2 2 2 1 2 1 2 2
'Biotin metabolism' 12 10 5 10 10 1 10 5 1 5
'Taurine and hypotaurine metabolism' 8 3 3 3 3 3 3 3 3 3
'Glutathione metabolism' 16 5 3 5 3 2 2 5 8 6 4 5 2 3 1
'beta-Alanine metabolism' 12 1 1 2
'Pyrimidine synthesis' 19 4 4 4 5 1 2 4 4 4 5 4 5 2 1
'Pyrimidine catabolism' 34 7 10 6 7 5 2 6 3 7 9 5 9 4 3
'Purine synthesis' 10 1 1 1 2 1 1 1 2 1 2 1
'Purine catabolism' 77 7 34 12 31 10 13 11 32 13 27 8 36 10 20
'Nucleotide salvage pathway' 3 1 1 1 1
'Nucleotide interconversion' 182 44 56 38 52 36 33 44 46 35 53 42 51 38 36
'Unassigned' 158 37 26 26 40 17 30 26 33 28 40 30 34 22 21
'ROS detoxification' 7 3 4 2 4 3 3 1
'R group synthesis' 50 5 11 3 13 5 5 4 14 4 17 2 14 4 4
'NAD metabolism' 23 3 2 3 6 4 1 4 7 4 1 5 5 5 3
'Miscellaneous' 86 6 14 6 14 6 7 5 13 5 10 6 16 3 5
'Dietary fiber binding' 12 2 2 2 2 2
'Transport, peroxisomal' 105 12 21 17 20 12 11 19 22 13 21 14 20 13 10
'Transport, nuclear' 64 10 10 6 14 4 7 7 16 12 10 7 10 7 8
'Transport, mitochondrial' 276 37 69 46 75 40 36 36 81 43 81 45 78 33 34
'Transport, lysosomal' 67 6 15 6 15 6 5 5 16 4 10 7 14 4
'Transport, golgi apparatus' 65 3 14 4 14 1 2 3 13 6 16 2 11 1 1
'Transport, extracellular' 1626 221 437 233 448 183 184 227 433 220 452 233 427 183 169
'Transport, endoplasmic reticular' 130 17 41 16 39 11 14 16 39 21 31 24 35 10 12
MPSIIIDMPSI-II MPSIIIA-C MPSIVA MPSIVB MPSVI MPSVII
MAA
MGS
TM
Otros
MN
MOA
MCV
ML
MBG
103
Anexo 5. Comportamiento de los flujos en los modelos MPS comparados contra recon 2. MAA: metab de aminoácidos, MGS: metab de grupo sanguíneo, MC: metab de
carbohidratos, Ox: fosforilación oxidativa, Ex: reacciones de intercambio y demanda, MBG: metab y biosíntesis de glicanos, ML: metab de lípidos, MCV: metabolismo de cofactores y vitaminas, MOA: metab de otros aminoácidos, MN: metab de nucleótidos, TM: transporte de metabolitos.
Ruta Metabólica
Grupo
Metab
No. Rxn
* rutaOFF ON OFF ON OFF ON OFF ON OFF ON OFF ON OFF ON
'Alanine and aspartate metabolism' 16 1 3 2 1 1
'Arginine and Proline Metabolism' 41 4 7 2 4 1 4 5 2
'Cysteine Metabolism' 3 1
'D-alanine metabolism' 3 1 1 1 1 1 3
'Glutamate metabolism' 15 1 2 1 2 1 2 1 2 3 1 2 1 2
'Glycine, serine, alanine and threonine metabolism' 37 13 7 4 10 9 14 6
'Histidine metabolism' 16 1
'Lysine metabolism' 24 1 1 1 6 1 3 1 1 1 2
'Methionine and cysteine metabolism' 54 3 2 3 2 9 1 4 4 2 3
'Phenylalanine metabolism' 12 1 4
'Tryptophan metabolism' 70 1 2 2 3 1 1 1 3 2 4 4 9 1 2
'Tyrosine metabolism' 121 6 9 1 2 3 1 1 2 4
'Urea cycle' 69 2 4 8 2 1
'Valine, leucine, and isoleucine metabolism' 43 1 9 3 6 2 2 1 3 3 7 3 8 2 4
'Blood group synthesis' 48 5 1
'Heme synthesis' 14 1 1 1 1
'Aminosugar metabolism' 28 2 8 1 9 1 4 2 12 1 10 1 5 4
'Butanoate metabolism' 3 1
'Citric acid cycle' 20 1 2 2 1 1 2
'Fructose and mannose metabolism' 24 1 2 1 4 1 2 3 3 3 2 4 2
'Galactose metabolism' 12 1 2 1 2 1 1 1 2 1 3 1 3 1 1
'Glycolysis/gluconeogenesis' 47 1 8 2 5 1 5 1 9 1 5 1 5 1
'Glyoxylate and dicarboxylate metabolism' 14 5 3 3 1 1
'Inositol phosphate metabolism' 64 2 7 5 9 4 2
'Pentose phosphate pathway' 39 1 4 6 1 3 1 8 1 3 8 3
'Propanoate metabolism' 13 2 2 2 1 1 2 1 2 1 2 2 1 1
'Pyruvate metabolism' 60 1 15 14 4 1 8 14 1 8 1 3
'Starch and sucrose metabolism' 33 5 3 1 1 1 2 6 4 1 1
'Oxidative phosphorylation' Ox 10 2 2 2 2 3
'Exchange/demand reaction' Ex 741 47 49 47 62 21 20 46 60 43 56 47 54 19 25
'Chondroitin sulfate degradation' 18 1
'Chondroitin synthesis' 45
'Heparan sulfate degradation' 35 2 24
'Hyaluronan metabolism' 2 1
'Keratan sulfate degradation' 70 11 38 2 3 6
'Keratan sulfate synthesis' 66 37 11 39 11
'N-glycan degradation' 41 7 14 5 5 5 5
'N-glycan synthesis' 108 38 9 37 42 38
'O-glycan synthesis' 15 3 1
'Bile acid synthesis' 127 5 9 3 7 1 3 6 4 16 5 8 2
'Cholesterol metabolism' 62 7 3 1 8 1 13 10 2
'Eicosanoid metabolism' 258 7 5 1 4 6 6 6 3
'Fatty acid oxidation' 866 2 46 9 77 4 27 9 74 9 65 4 53 3 36
'Fatty acid synthesis' 126 1 2 1 8 1 7 1 15 10 1 12 1 4
'Glycerophospholipid metabolism' 74 2 3 9 1 2 1 5 1 5 3 1 2
'Glycosphingolipid metabolism' 14 1 1 1 2 1 1
'Phosphatidylinositol phosphate metabolism' 63 10 10 1 15 1 12 10 2 3
'Sphingolipid metabolism' 75 6 8 1 5 8 5
'Squalene and cholesterol synthesis' 5 3
'Steroid metabolism' 77 4 2 1 4 5 5 1
'Triacylglycerol synthesis' 13 6 2 2 5 3 3 1
'Biotin metabolism' 12 1 1
'CoA catabolism' 4 1 1
'CoA synthesis' 22 1 1 2 2
'Folate metabolism' 59 1 12 1 12 2 9 2 8 1 6 2 11 2 5
'Tetrahydrobiopterin metabolism' 27 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 2
'Thiamine metabolism' 6 1 2
'Ubiquinone synthesis' 14 13
'Vitamin A metabolism' 80 2 6 2 6 3 7 5 9 5 7 5 7 4 6
'Vitamin B2 metabolism' 7 3 3 4 4 4
'Vitamin B6 metabolism' 11 1 2 1 2 1
'Vitamin C metabolism' 16 2 2 2 1
'Vitamin D metabolism' 29 1 2 1 2
'beta-Alanine metabolism' 12 1 1 2
'Glutathione metabolism' 16 1 1 1 1 1 5 1 1 1 1
'Taurine and hypotaurine metabolism' 8 3 3
'Nucleotide interconversion' 182 8 23 6 20 2 13 8 16 6 19 5 16 4 12
'Nucleotide salvage pathway' 3 1 1 1 1
'Purine catabolism' 77 1 14 3 14 2 5 4 10 3 10 2 14 2 8
'Purine synthesis' 10 1 1 1 1
'Pyrimidine catabolism' 34 1 6 1 4 1 1 2 5 5 1 1
'Pyrimidine synthesis' 19 2 1 2 1 2 1 1 1 1 1
'Dietary fiber binding' 12 2 2 2 2 2
'Miscellaneous' 86 1 4 1 4 1 1 5 2 1 5 2
'NAD metabolism' 23 2 1 3 2
'R group synthesis' 50 10 1 10 5 12 15 11 3
'ROS detoxification' 7 3 4 2 4 3 3 1
'Unassigned' 158 10 9 6 21 5 10 7 14 5 19 9 13 5 6
'Transport, endoplasmic reticular' 130 7 26 5 21 3 6 5 22 9 15 9 18 2 5
'Transport, extracellular' 1626 16 178 25 188 21 52 28 184 20 189 25 184 25 48
'Transport, golgi apparatus' 65 2 12 3 12 1 2 12 5 14 1 10
'Transport, lysosomal' 67 3 15 3 15 2 5 2 16 1 10 4 14
'Transport, mitochondrial' 276 9 27 11 33 4 17 7 38 11 39 6 43 2 15
'Transport, nuclear' 64 3 2 1 5 1 8 5 2 2 3 3 2
'Transport, peroxisomal' 105 2 9 7 10 2 4 5 11 6 7 3 7 2
OTHERS
TM
MC
MBG
ML
MCV
MOA
MN
MPSIVA MPSIVB MPSVI MPSVII
MAA
MGS
MPSI-II MPSIIIA-C MPSIIID
104
Anexo 6. Conjunto de genes obtenidos del silenciamiento o activación de
reacciones en los modelos MPS.
Conjunto de genes ON/OFF (ENTREZ GENE ID)
ON 26; 30; 31; 32; 34; 35; 36; 37; 38; 48; 50; 51; 52; 53; 54; 55; 100; 107; 108; 109; 111; 112; 113; 114; 115; 124; 125; 126; 127; 128; 130; 131; 158; 159; 175; 189; 215; 216; 217; 218; 219; 220; 221; 222; 223; 224; 225; 226; 229; 230; 231; 240; 248; 249; 250; 251; 270; 271; 272; 275; 276; 277; 278; 279; 280; 290; 291; 292; 293; 353; 366; 383; 411; 412; 427; 440; 443; 495; 496; 501; 523; 523,1; 525; 526; 527; 528; 529; 533; 534; 535; 570; 586; 593; 594; 622; 669; 686; 763; 788; 790; 847; 873; 875; 952; 953; 954; 955; 956; 957; 1103; 1109; 1118; 1119; 1152; 1158; 1374; 1375; 1376; 1384; 1431; 1468; 1491; 1503; 1548; 1553; 1565; 1571; 1576; 1577; 1579; 1582; 1586; 1589; 1593; 1603; 1606; 1607; 1608; 1609; 1621; 1622; 1629; 1632; 1644; 1645; 1650; 1666; 1717; 1718; 1719; 1738; 1743; 1757; 1798; 1806; 1811; 1836; 1891; 1892; 1962; 2030; 2108; 2109; 2168; 2180; 2181; 2182; 2194; 2222; 2224; 2235; 2356; 2517; 2519; 2544; 2548; 2571; 2582; 2584; 2585; 2588; 2593; 2595; 2618; 2628; 2632; 2643; 2645; 2650; 2653; 2678; 2683; 2686; 2687; 2694; 2720; 2731; 2752; 2799; 2805; 2806; 2819; 2936; 2937; 2974; 2977; 2982; 2983; 2984; 2986; 2990; 3000; 3028; 3030; 3032; 3033; 3034; 3073; 3074; 3081; 3098; 3099; 3101; 3155; 3156; 3157; 3158; 3162; 3163; 3177; 3251; 3284; 3293; 3295; 3340; 3417; 3418; 3419; 3420; 3421; 3423; 3425; 3612; 3613; 3620; 3632; 3633; 3635; 3636; 3712; 3795; 3939; 3945; 3948; 3990; 4023; 4051; 4121; 4122; 4124; 4125; 4128; 4129; 4166; 4249; 4329; 4522; 4535; 4536; 4537; 4538; 4539; 4540; 4541; 4548; 4597; 4598; 4645; 4668; 4669; 4694; 4695; 4696; 4697; 4698; 4700; 4701; 4702; 4704; 4705; 4706; 4707; 4708; 4709; 4710; 4711; 4712; 4713; 4714; 4715; 4716; 4717; 4718; 4719; 4720; 4722; 4723; 4724; 4725; 4726; 4728; 4729; 4731; 4758; 4759; 4830; 4831; 4833; 4837; 4842; 4843; 4846; 4860; 4881; 4882; 4891; 4942; 4967; 5009; 5019; 5033; 5034; 5048; 5049; 5050; 5051; 5053; 5092; 5105; 5130; 5167; 5168; 5169; 5172; 5184; 5207; 5208; 5209; 5210; 5223; 5224; 5226; 5238; 5244; 5281; 5286; 5287; 5288; 5290; 5291; 5293; 5294; 5295; 5296; 5297; 5298; 5305; 5313; 5315; 5330; 5331; 5332; 5333; 5334; 5335; 5336; 5337; 5351; 5352; 5372; 5373; 5406; 5407; 5408; 5464; 5476; 5538; 5728; 5742; 5743; 5825; 5831; 5832; 5860; 5959; 5973; 6184; 6185; 6240; 6241; 6303; 6307; 6309; 6319; 6342; 6448; 6470; 6476; 6482; 6483; 6484; 6487; 6489; 6505; 6506; 6507; 6509; 6510; 6511; 6512; 6513; 6514; 6515; 6517; 6519; 6520; 6523; 6524; 6526; 6528; 6533; 6534; 6539; 6541; 6542; 6543; 6546; 6547; 6554; 6555; 6566; 6567; 6572; 6573; 6576; 6578; 6579; 6581; 6582; 6583; 6584; 6646; 6647; 6648; 6649; 6652; 6697; 6715; 6716; 6718; 6723; 6783; 6785; 6817; 6822; 6839; 7083; 7084; 7167; 7173; 7264; 7296; 7299; 7306; 7350; 7351; 7352; 7355; 7357; 7359; 7360; 7363; 7364; 7365; 7366; 7367; 7372; 7389; 7498; 7841; 7915; 7941; 7991; 8029; 8034; 8050; 8140; 8288; 8309; 8310; 8394; 8395; 8396; 8402; 8424; 8435; 8501; 8503; 8509; 8513; 8525; 8526; 8527; 8529; 8534; 8560; 8574; 8639; 8647; 8659; 8703; 8704; 8714; 8733; 8760; 8790; 8801; 8802; 8803; 8813; 8818; 8824; 8833; 8836; 8854; 8867; 8871; 8875; 8876; 8879; 8884; 8897; 8974; 8985; 8992; 9016; 9056; 9057; 9060; 9061; 9114; 9153; 9154; 9162; 9187; 9197; 9227; 9245; 9296; 9334; 9348; 9365; 9374; 9388; 9394; 9415; 9435; 9453; 9468; 9469; 9481; 9487; 9488; 9517; 9550; 9563; 9583; 9615; 9651; 9653; 9843; 9869; 9951; 9953; 9955; 9962; 9963; 10005; 10020; 10026; 10057; 10087; 10157; 10164; 10195; 10229; 10257; 10312; 10327; 10331; 10390; 10396; 10400; 10449; 10455; 10554; 10555; 10558; 10560; 10588; 10599; 10637; 10654; 10678; 10682; 10690; 10720; 10797; 10841; 10861; 10870; 10901; 10905; 10919; 10965; 10993; 10999; 11001; 11041; 11046; 11136; 11164; 11238; 11253; 11254; 11282; 11283; 11320; 11332; 11343; 22305; 22856; 22978; 23007; 23169; 23236; 23305; 23396; 23417; 23428; 23475; 23483; 23498; 23533; 23545; 23556; 23563; 23657; 23761; 25769; 25796; 25841; 25902; 26002; 26061; 26062; 26063; 26229; 26266; 27034; 27068; 27087; 27124; 27159; 27349; 28234; 28976; 29880; 29920; 29929; 29958; 30061; 30833; 50484; 50617; 50814; 51004; 51005; 51079; 51102; 51109; 51179; 51196; 51205; 51251; 51301; 51382; 51557; 51604; 51606; 51703; 51727; 51733; 51805; 54187; 54344; 54363; 54407; 54490; 54511; 54575; 54576; 54577; 54578; 54579; 54600; 54657; 54658; 54659; 54675; 54677; 54682; 54716; 54872; 54965; 54995; 55089; 55163; 55191; 55224; 55268; 55276; 55293; 55315; 55326; 55350; 55361; 55454; 55500; 55512; 55577; 55650; 55748; 55753; 55790; 55811; 55825; 55902; 55967; 56052; 56301; 56474; 56548; 56623; 56848; 56894; 56895; 56922; 56953; 56954; 56994; 57026; 57030; 57084; 57134; 57171; 57194; 57379; 57393; 57665; 58508; 58510; 60386; 64064; 64077; 64078; 64080; 64087; 64131; 64132; 64579; 64711; 64772; 64834; 64841; 64850; 64870; 64871; 64902; 65010; 65263; 65985; 79053; 79087; 79369; 79586; 79717; 79723; 79813; 79837; 79896; 79901; 79966; 80025; 80055; 80150; 80201; 80235; 80270; 80308; 80704; 80724; 80854; 80864; 81539; 81693; 83715; 83852; 84002; 84129; 84444; 84532; 84720; 84735; 84812; 84889; 84920; 85365; 89869; 90161; 90423; 91703; 92483; 92745; 93010; 93034; 93183; 94005; 112483; 112724; 113026; 113235; 115019; 115111; 116285; 116369; 117247; 122622; 122970; 124583; 124935; 125206; 126129; 126328; 126410; 127124; 128869; 129807; 132158; 135152; 137872; 137964; 140679; 145226; 146712; 159963; 160287; 160851; 162466; 192134; 195814; 196883; 196951; 197257; 200010; 200576; 201288; 206358; 245972; 245973; 246213; 253430; 257068; 259230; 266722; 284129; 284273; 286016; 337876; 347734; 349565; 374291; 374907; 387893; 400410; 441024; 645740; 728226; 728441; 728637; 100287639; AA081045.1; AA177072.1; AA278423.1; AA502753.1; AA526438.1; AA664770.1; AA676725.1; AA788780.1; AA977580.1; AF116616.1; AI090874.1; AI191472.1; AI222095.1; AI435857.1; AI493054.1; AI539321.1; AI620219.1; AI684467.1; AI694761.1; AI697028.1; AI915649.1; AI926493.1; AI934540.1; AI971036.1; AI990637.1; AL048840.1; AL525798.1; AU149534.1; AV727634.1; BE966236.1; BG035985.1;
105
D87002.1; H17063.1; H77542.1; HG2846-HT2983.1; LOC728997.1; NM_013421.1; PRO1933.1; R33828.1; R39999.1; T83654.1; U37519.1; U52111.1; W74642.1
OFF 19; 30; 33; 51; 217; 218; 219; 220; 221; 222; 223; 224; 501; 570; 586; 755; 788; 1103; 1374; 1375; 1468; 1543; 1544; 1545; 1548; 1549; 1551; 1553; 1555; 1558; 1559; 1562; 1565; 1571; 1572; 1573; 1576; 1577; 1580; 1588; 1593; 1594; 1666; 1717; 1719; 1723; 1892; 1962; 2030; 2180; 2181; 2194; 2222; 2643; 2687; 2879; 2936; 3028; 3030; 3032; 3033; 3156; 3177; 3283; 3284; 3295; 3425; 3628; 3939; 3945; 3948; 4139; 4522; 4830; 4831; 4832; 4860; 5211; 5213; 5214; 5286; 5287; 5288; 5313; 5315; 5831; 5833; 5834; 5836; 5837; 5959; 5973; 6240; 6241; 6510; 6520; 6524; 6526; 6541; 6542; 6561; 6566; 6573; 6576; 6675; 6783; 6822; 7350; 7351; 7352; 7371; 8034; 8140; 8310; 8394; 8395; 8501; 8525; 8659; 8879; 9016; 9154; 9162; 9365; 9380; 9481; 9789; 9791; 9942; 10005; 10020; 10087; 10201; 10249; 10257; 10449; 10455; 10588; 10935; 11046; 11136; 11254; 11283; 22305; 23396; 23464; 23478; 23600; 26503; 28972; 29785; 29922; 50484; 51109; 51179; 51703; 51727; 51733; 54363; 55089; 55163; 55293; 55315; 55343; 57194; 57379; 57665; 57834; 60490; 60559; 64078; 64080; 64802; 64816; 64834; 66002; 81539; 83549; 84889; 90701; 91373; 92483; 112724; 122970; 124935; 125206; 126129; 145226; 159963; 160287; 195814; 199974; 200010; 206358; 260293; 400410; 441024; 100287639; AA081045.1; AA532636.1; AI620219.1; AI824319.1; AI934540.1; AU149534.1; BE966236.1; H77542.1; LOC374569.1; T83654.1; W74642.1
106
Anexo 7. Número de reacciones cuyo flujo aumento en un modelo MPS especifico comparado contra los flujos de las demás MPS.
No Rxn
* ruta MPSI-II MPSIIIA-C MPSIIID MPSIVA MPSIVB MPSVI MPSVII
'Alanine and aspartate metabolism' 16 1 1 4 1 1 1
'Aminosugar metabolism' 31 6 1 5 3
'Arginine and Proline Metabolism' 41 6 3 6 2
'Bile acid synthesis' 128 2 4 1 2 9 8
'Cholesterol metabolism' 62 7 3 2 3 11 2
'Citric acid cycle' 20 1 1 1 1 3 1
'Cytochrome metabolism' 15 1 1
'Eicosanoid metabolism' 257 1 1
'Exchange/demand reaction' 742 41 26 26 27 21 18 2
'Fatty acid oxidation' 869 40 55 27 46 52 21 1
'Fatty acid synthesis' 126 16 6 3 20 1 4
'Folate metabolism' 59 7 6 5 4
'Galactose metabolism' 12 2 1
'Glutamate metabolism' 15 2 3 1 2
'Glycerophospholipid metabolism' 74 5 5 3 3 1 1
'Glycine, serine, alanine and threonine metabolism' 37 5 5 3 1 5
'Glycolysis/gluconeogenesis' 40 4 2 6 3 2 2
'Glyoxylate and dicarboxylate metabolism' 15 3 3 3
'Histidine metabolism' 16 1 5
'Inositol phosphate metabolism' 64 1 4 2 4 2
'Keratan sulfate degradation' 75 12 43
'Keratan sulfate synthesis' 59 37 11 11
'Methionine and cysteine metabolism' 37 1 1 5 2
'Miscellaneous' 88 5 2 2 2 1 4
'N-glycan synthesis' 108 30 3 1 3 29
'Nucleotide interconversion' 177 20 12 9 7 10 6
'Nucleotide salvage pathway' 3 1 1
'Oxidative phosphorylation' 10 1 1 1 1
'Pentose phosphate pathway' 39 4 2 1 2 3
'Phenylalanine metabolism' 10 1 1 4
'Phosphatidylinositol phosphate metabolism' 63 10 5 3 4 7 3
'Propanoate metabolism' 13 1 1 1
'Purine catabolism' 38 2 3 2 1 4
'Pyrimidine catabolism' 35 3 1 2 1
'Pyrimidine synthesis' 19 1 1
'Pyruvate metabolism' 32 2 3 3 1
'R group synthesis' 50 5 6 2 7 6 3
'ROS detoxification' 7 1 1 1
'Sphingolipid metabolism' 83 2 4 8 8 2
'Starch and sucrose metabolism' 33 1 4 1 3 3
'Steroid metabolism' 76 1 1 1 3 3
'Transport, endoplasmic reticular' 161 17 13 6 3 5 3
'Transport, extracellular' 1550 70 59 38 65 54 50
'Transport, golgi apparatus' 78 5 1 4 1 1
'Transport, lysosomal' 107 22 4 2 6 3 1
'Transport, mitochondrial' 309 20 17 20 12 9 18 1
'Transport, nuclear' 65 2 2 1 3 2 1
'Transport, peroxisomal' 126 9 10 3 7 8 2
'Triacylglycerol synthesis' 13 2
'Tryptophan metabolism' 70 2 1 2 6
'Tyrosine metabolism' 121 4 8 1 2 2
'Unassigned' 173 11 14 16 10
'Urea cycle' 69 2 2 1 1 7 1
'Valine, leucine, and isoleucine metabolism' 42 6 2 1 4
'Vitamin A metabolism' 81 3 2 3 1
'Vitamin B2 metabolism' 7 1 1
'Vitamin C metabolism' 16 1 1
'Butanoate metabolism' 3 2 1
'Fructose and mannose metabolism' 27 3 1 2
'Lysine metabolism' 25 7 3
'N-glycan degradation' 16 1 7 3
'O-glycan synthesis' 15 3 1
'Vitamin D metabolism' 29 1
'Androgen and estrogen synthesis and metabolism' 57
'D-alanine metabolism' 3 2
'Glycosphingolipid metabolism' 14 1
'Heme synthesis' 14 8
'Tetrahydrobiopterin metabolism' 27 1
'Vitamin B6 metabolism' 11 2 2
'Biotin metabolism' 12 1
'Blood group synthesis' 46 4
'C5-branched dibasic acid metabolism' 8 1
'Chondroitin sulfate degradation' 44 5
'CoA catabolism' 6 1 2
'Cysteine Metabolism' 3 1 1
'Dietary fiber binding' 12 1 2
'Glutathione metabolism' 16 4 1 1
'Hyaluronan metabolism' 5 1
'NAD metabolism' 23 1
'Ubiquinone synthesis' 14 13
'beta-Alanine metabolism' 12 1 1
'CoA synthesis' 20 2
'Squalene and cholesterol synthesis' 6 3
'Thiamine metabolism' 6 2
'Heparan sulfate degradation' 27 27
'Purine synthesis' 13 1
107
Anexo 8. Número de reacciones cuyo flujo disminuyó en un modelo MPS especifico comparado contra los flujos de las demás MPS.
No Rxn
* ruta MPSI-II MPSIIIA-C MPSIIID MPSIVA MPSIVB MPSVI MPSVII
'Alanine and aspartate metabolism' 16 2
'Aminosugar metabolism' 31 1 1
'Arginine and Proline Metabolism' 41 3 1 1
'Bile acid synthesis' 128 1 2 1
'Cholesterol metabolism' 62 2 1
'Citric acid cycle' 20 1
'Eicosanoid metabolism' 257 2 1
'Exchange/demand reaction' 742 15 10 17 17 15 21 14
'Fatty acid oxidation' 869 3 15 6 7 2
'Fatty acid synthesis' 126 10 4
'Folate metabolism' 59 1
'Galactose metabolism' 12 1 1
'Glutamate metabolism' 15 1
'Glycerophospholipid metabolism' 74 1
'Glycine, serine, alanine and threonine metabolism' 37 1
'Glycolysis/gluconeogenesis' 40 1 1
'Methionine and cysteine metabolism' 37 1 1
'Miscellaneous' 88 1 1 1
'Nucleotide interconversion' 177 1 7 4 8 1 5
'Oxidative phosphorylation' 10 1
'Pentose phosphate pathway' 39 2 2
'Phenylalanine metabolism' 10 1
'Purine catabolism' 38 4 2 1 1
'Pyrimidine catabolism' 35 1 1
'Pyrimidine synthesis' 19 1 1 1 2 1
'Pyruvate metabolism' 32 1
'R group synthesis' 50 1 1 1 1
'ROS detoxification' 7 1
'Starch and sucrose metabolism' 33 4
'Steroid metabolism' 76 1 1
'Transport, endoplasmic reticular' 161 2 9 6 6 3
'Transport, extracellular' 1550 12 2 16 11 16 21 23
'Transport, golgi apparatus' 78 1 1 2
'Transport, lysosomal' 107 2 1 3 1 4
'Transport, mitochondrial' 309 2 5 5 4 4 6 3
'Transport, nuclear' 65 1 1 1 4 2
'Transport, peroxisomal' 126 1 3 2 3 3 4 1
'Triacylglycerol synthesis' 13 2
'Tryptophan metabolism' 70 1 1 2
'Unassigned' 173 3 3 2
'Urea cycle' 69 3
'Valine, leucine, and isoleucine metabolism' 42 1 1 1
'Vitamin A metabolism' 81 2 1 1 1 1
'Vitamin C metabolism' 16 2
'Fructose and mannose metabolism' 27 1
'N-glycan degradation' 16 2
'Androgen and estrogen synthesis and metabolism' 57 1
'D-alanine metabolism' 3 1
'Glycosphingolipid metabolism' 14 1
'Heme synthesis' 14 1
'Tetrahydrobiopterin metabolism' 27 1
'Vitamin B6 metabolism' 11 1
'CoA catabolism' 6 1
'Glutathione metabolism' 16 2
'NAD metabolism' 23 1
'CoA synthesis' 20 1
'Purine synthesis' 13 1
108
Anexo 9. Reacciones que presentaron un cambio de límites de flujo en los modelos de MPS IVA, IVB, VI y VII. Los tipos de rango fueron para los flujos obtenidos en los modelos de MPS que comparados contra los de recon 2 se obtenía alguno de los siguientes sucesos: 1- el mínimo aumentaba, 2- el máximo aumentaba, 3- mínimo y máximo aumentaban, 4- mínimo disminuía, 5- máximo disminuía, 6- mínimo y máximo disminuían y 7- máximo disminuía y mínimo aumentaba.
Nombre de reacción MPS IVA MPS IVB MPS VI MPS VII
'1,4-alpha-glucan branching enzyme (glygn1 -> glygn2)' 5
'amylo-1,6-glucosidase, 4-alpha-glucanotransferase EC:2.4.1.25' 5
'amylo-1,6-glucosidase, 4-alpha-glucanotransferase EC:3.2.1.33' 5 MAX MIN TIPO DE RANGO
'Antichymotrypsin exchange' 1 - AUMENTO 1
'Antitrypsin exchange' 1 AUMENTO - 2
'ApoA1 exchange' 1 AUMENTO AUMENTO 3
Apo-CIB Protein assembly' 2 5 - DISMINUYO 4
'Apo-CII Protein assembly' 2 5 DISMINUYO - 5
'Apo-CIII Protein assembly' 2 5 DISMINUYO DISMINUYO 6
'ApoTransferin exchange' 7 DISMINUYO AUMENTO 7
'Beta-1,3-galactosyltransferase 3' 3
'beta-glucuronidase, lysosomal' 2 5 5
'beta-N-acetylhexosaminidase, lysosomal' 5 2 5
'Bilirubin beta-diglucuronide exchange' 5
'bilirubin di-glucuronide production' 5
'Bilirubin exchange' 1
'Ceramide 1-phosphate exchange' 5
'Ceramide glucosyltransferase' 1
'Ceramide kinase' 5
'ceramide transport protein' 3
'dehydro-L-gulonate decarboxylase' 1 4
'dihydrosphingosine N-acyltransferase' 1
'D-Xylose exchange' 6
'D-xylose reversible transport' 6 3
'Exchange of L-iduronate' 3
'exchange reaction for blirubin mono-glucuronide' 5
'galactose efflux from lysosome' 6 3
'galactose-1-phosphate uridylyltransferase' 1
'globoside (homo sapiens) exchange' 3
'globoside intracellular transport' 6
'globoside transport' 3
'Glucosylceramidase' 5
'Glucuronate 1-phosphate phosphatase' 5 2
'glucuronate transport into lysososme' 6 3
'glucuronidated compound transport' 1
'glucuronidated compound transport' 1
Glutamate transport, lysosomal' 3
'glycine reversible transport via proton symport (lysosome)' 3
'glycogen debranching enzyme' 5
'glycogen phosphorylase (amyls -> glc-D)' 5
'glycogen phosphorylase (glygn2 -> dxtrn)' 5
'glycogen synthase (ggn -> glygn1)' 5
'glycogenin self-glucosylation' 5
'Haptoglobin exchange' 1
'hyaluronan exchange' 6 3
'hyaluronan transport, extracellular to lysosome' 3 6
'iduronate transport into lysososme' 6
'inositol oxygenase' 5 2
'Lactosylceramide 4-alpha-galactosyltransferase' 3
'L-alanine reversible transport via proton symport (lysosome)' 3
'L-gulonate 3-dehydrogenase' 1 4
'L-iduronate transport, extracellular' 6
'L-proline reversible transport via proton symport (lysosome)' 3
'L-Tryptophan exchange' 2 5
'myo-Inositol exchange' 1 4
RANGOS
109
'N-acetyl-D-mannosamine kinase' 5
'N-acetyl-galactosamine intracellular transport' 6
'N-acetylgalactosamine kinase' 5 5
'N-acetylgalactosamine kinase (ITP)' 5 5
'N-acetylgalactosaminidase, alpha-' 6 3
'N-acetylgalactosaminidase, beta-' 3
'N-acetylglucosamine 2-epimerase' 4 7
N-acetylglucosamine kinase' 4 1
'N-acetylglucosaminidase, lysosomal' 6 3
'N-Acetylneuraminate 9-phosphate phosphohydrolase' 5
N-Acetylneuraminate 9-phosphate pyruvate-lyase' 5
'N-Acetylneuraminate lyase (reversible)' 1
'N-acetylneuraminate transport into lysososme' 6
'NADH dehydrogenase (ubiquinone) 1, alpha/beta subcomplex' 2 5
'Plasminogen exchange' 4 5
'Protein degradation' 2 5
'Protein degradation' 2 5
'Protein degradation' 2 5
'Protein degradation' 2
'Protein degradation' 2 5
'Protein degradation' 5
'Protein degradation' 5
'Protein degradation' 5
'Protein degradation' 5
'Protein degradation' 5
'Prothrombin exchange' 4
'RE0383' 5 2
'RE2404' 5 2
'RE2405' 5 2
'RE2541' 5 2
'RE3381' 5 2
'sialidase, lysosomal' 3
'sphingomyelin deacylase' 5
'Sphingomyelin synthase (homo sapiens)' 5
'sphingosylphosphorylcholine (homo sapiens) exchange' 5
'sphingosylphosphorylcholine transport (diffusion)' 5
'Sulfate transport (lysosome)' 3 6
'Transport of L-Histidine by hPT3 or hPT4 peptide transporters' 3
'udp intracellular transport' 3
'udpacgal intracellular transport' 6
'UDPglucose 4-epimerase' 2
'UDPglucuronate uridine-diphosphohydrolase' 5 2
'UDPglucuronate uridine-monophosphohydrolase' 5 2
'UDP-glucuronosyltransferase 1-10 precursor, microsomal' 5
'UDP-glucuronosyltransferase 1-10 precursor, microsomal' 5
'UDP-N-acetyl-D-glucosamine 2-epimerase (Hydrolysis)' 2 5
'UDP-N-acetylgalactosamine diphosphorylase' 6 6
'UDP-N-acetylglucosamine 4-epimerase' 3 3
'UTP-glucose-1-phosphate uridylyltransferase' 1
'Xylose efflux from lysosome' 3 6
