Prácticas 6 a 10 Metabolismo Intermediario

PRACTICA No 6

BALANCE DE FERMENTACIÓN. PARTE 1

1. OBJETIVO

Realizará el balance óxido-reducción durante el proceso de fermentación. Discutirá y

evaluará el significado de dicho balance para la célula microbiana.

2. INTRODUCCIÓN

La palabra fermentación proviene del latín que significa hervir. Éste proceso se remonta

desde la prehistoria, además de la producción de alcohol o bebidas alcohólicas, la

palabra fermentación se aplica a cualquier proceso en el cual los microorganismos

(bacterias, hongos, mohos, levaduras) actúan sobre una gran variedad de sustancias para

conservar la carne, quesos, mantequilla, yogur, etc. Se utiliza asimismo en la

producción de antibióticos, vitaminas y muchos materiales químicos importantes para la

industria. El primer investigador que estudió este proceso fue L. J. Thenard en 1803en

donde observó que la fermentación se debía a las levaduras. Más tarde en 1878, Wilhem

Kuhne dio nombre de enzimas a los fermentos que catalizaban la reacción.

Posteriormente en 1856 Louis Pasteur estudió la pasteurización de vinos y cervezas

como medio para evitar la descomposición y en 1897 Hans y Edward Buchner

estudiaron la fermentación de los carbohidratos en extractos libres de células. En

presencia de oxígeno, aumenta la respiración y disminuye la fermentación; sucediendo

lo contrario en procesos de anaerobiosis, a éste efecto se le llama Efecto Pasteur.

Cuando las levaduras actúan para convertir los carbohidratos en etanol, usan

básicamente las mismas reacciones de la glucólisis, la principal diferencia es el modo

como metabolizan el ácido pirúvico, al cual descarboxilan formando acetaldehído y

requiriendo Mg+2

y pirofosfato de tiamina en la célula. Posteriormente el acetaldehído

es reducido por una deshidrogenasa alcohólica que utiliza NADH + H+ como coenzima

formando etanol. Los balances estequiométricos en procesos de fermentación son

esenciales para su entendimiento y/o aplicación. El cálculo de flujos metabólicos resulta

fundamental en los estudios cuantitativos en fisiología celular

3. MATERIAL Y EQUIPO

Agitador mecánico

Balanza granataria

Baño maría

Bulbos y Pipetas Pasteur

Centrífuga clínica

Centrífuga refrigerada

Gradillas

Jeringas de 1 mililitro de aguja larga

Matraces para la fermentación

Matraces volumétricos de 10 y 100 mililitros

Mecheros tipo Fisher

Pipetas de 1, 2.5 y 10 mililitros

Probetas de 25 y 100 mililitros

Parafilm

Tapones de hule

Tubos de ensayo de 16 por 150 mm

Material biológico: Levadura comercial (Saccharomyces cerevisiae)

4. REACTIVOS

Ácido tricloroacético al 10%

Agua destilada

Glucosa 2 M

Hidróxido de potasio al 10%

Cloruro de Bario al 5%

Regulador de fosfatos de 50 mM pH 6.8

Suspensión de levaduras al 30% v/v

5. DESARROLLO DE LA PRÁCTICA

OBTENCIÓN DE LA SUSPENSIÓN CELULAR.

1. Resuspender tres gramos de levadura en 10 mililitros de medio YPG e incubar 30

minutos a 28°C.

2. Las células se lavan de 6 a 8 veces con agua destilada por centrifugación y se

recupera el paquete celular que se resuspende en el regulador de fosfatos hasta

obtener una concentración final del 30% v/v.

PROCESO DE FERMENTACIÓN.

1. En un matraz de 50 ml, se colocan 24 ml de suspensión celular y 12 ml de regulador

de fosfatos (véase la tabla indicada) y se realiza una conexión como se muestra en la

figura de abajo, los matraces deben estar conectados herméticamente durante 5

minutos a 32°C.

CONDICIÓN

48 ml de suspensión celular sin glucosa

48 ml de suspensión celular con Glucosa 2

M


M con 1 mililitro de solución de cloruro de

mercurio 100 mM

Suspensión de levadura

Solución de Cloruro de Bario


M con 1 mililitro de solución de fluoruro de

sodio 100 mM

2. Después de los cinco minutos de incubación, se inyecta 12 mililitros de solución de

glucosa 2 M y se incuban a la misma temperatura.

3. Después de 30 minutos el proceso de fermentación se detiene agregando a la mezcla

se mezcla 600 microlitros de ácido tricloroacético concentrado y se continúa la

incubación 15 minutos más.

4. Checar el pH de la solución y si es necesario neutralice con KOH al 10% y se lleva

a un volumen final de 100 mililitros con agua destilada.

USE MATRACES VOLUMÉTRICOS O AFORADOS

A partir de ésta mezcla de fermentación recuperada (muestra fermentada) se determina

ETANOL Y GLUCOSA RESIDUAL de la siguiente práctica.

6. INFORME

Mencione otros tipos de fermentación

Como realizaría Usted un proceso fermentativo a nivel industrial

Cuál es la enzima ausente en el ser humano que metaboliza el ácido pirúvico a acetaldehído

7. BIBLIOGRAFÍA

J. Hicks, J. Bioquímica Editorial McGraw-Hill Interamericana. 2001. México, D. F.

Rose, A. H. 1976. Energy Yielding metabolism: Chemical Microbiology, 3a Ed.

Sutterworths. Boston. pp. 187-188 y 208-214

Sokatch, J. R. 1969. Fermentation of sugars. En: Bacterial physiology and metabolism.

Academia Press London. pp. 72-74

PRACTICA No. 7

BALANCE DE FERMENTACIÓN. PARTE 2

1. OBJETIVO

Determinará la cuantificación de etanol y bióxido de carbono producidos en el proceso

cuantitativo de la fermentación con los productos obtenidos de la sesión anterior

1. INTRODUCCIÓN

Dos productos resultantes en el proceso de la fermentación son el alcohol etílico y el

bióxido de carbono. La medición del contenido de alcohol es de capital importancia en el

proceso de elaboración de vinos debido fundamentalmente a dos motivos. Normalizar el

producto en cuanto a sus características y sus componentes indicada en la etiqueta y el

origen fiscal, ya que el vino, como toda bebida alcohólica, está sujeto a pago de impuesto y

por tanto el fabricante debe ser cuidadoso en el manejo de este componente para evitar

sufrir penalizaciones. Sin embargo, debe tenerse en consideración que en elaboraciones

artesanales y principalmente en las caseras, la determinación de alcohol resulta de menor

importancia que en las elaboraciones industriales y sólo estará en función de la legislación

establecida en cada país.

Existe un buen número de metodologías diseñadas para la medición de alcohol (etanol) en

el vino tradicional y en el vino de frutas, pero la principal y más universalmente extendida

es la técnica densimétrica. Ésta se basa en la determinación de la densidad de una solución

hidroalcohólica obtenida previamente por destilación del vino. La densidad puede ser

medida a través de diversos instrumentos que el analista seleccionará según su

conveniencia. Entre ellos están el hidrómetro, alcoholímetro, picnómetro y el ebullómetro.

Hay otras metodologías para la determinación de alcohol como la cromatografía gas

líquido, la enzimática donde el etanol se puede oxidar a acetaldehído por el NAD en

presencia de la enzima alcohol deshidrogenasa (ADH) para producir NADH. El NADH

producido se determina espectrofotométricamente a 334, 340 o 360 nm dependiendo de la

concentración de etanol. Otra metodología es utilizando bicromato de potasio donde el

etanol lo reduce a acetaldehído y posteriormente a ácido acético reduciendo el cromo VI a

cromo III determinándolo espectrofotométricamente. El bióxido de carbono se puede

determinar volumétricamente y gravimétricamente usando reacciones de precipitación a

carbonatos insolubles.


Agitador mecánico

Balanza analítica

Balanza granataria

Baño maría

Bulbos y pipetas Pasteur

Bomba de vacío

Cajas Conway y placas de vidrio

Centrífuga clínica

Centrífuga refrigerada

Desecador

Embudos Buchner

Estufa de 60°C

Espectrofotómetro y celdas para el mismo

Gradillas

Hielo picado

Matraces Erlenmeyer de 125 mililitros

Matraces kitasato de 500 mililitros

Matraces volumétricos de 10 y 100 mililitros

Mecheros tipo Fisher

Papel Whatman No. 1 Desecados

Pipetas de 1, 2.5 y 10 mililitros

Probetas de 25 y 100 mililitros

Tubos de ensayo de 16 por 150 mm

Vaselina sólida neutra

4. REACTIVOS

Ácido tricloroacético al 10%

Agua destilada

Agua destilada libre de CO2

Antrona al 0.2% en H2SO4

Solución saturada de Carbonato de potasio

Dicromato de potasio 14 mM en H2SO4 de 46-49%

Etanol absoluto

Etanol a una concentración de 1500 microgramos por mililitro

Glucosa 100 miligramos/ mililitro

5. DESARROLLO DE LA PRÁCTICA

DETERMINACIÓN DE ETANOL

El etanol producido se cuantifica por el método de Conway, como se indica a continuación:

En cajas Conway (ver esquema correspondiente), se coloca una cantidad de vaselina sólida

sobre el borde externo y 2 mililitros de solución de K2Cr2O7 en la cámara central.

En la cámara externa se colocan alícuotas de la muestra y se completa a un mililitro con

agua destilada. Se adicionan 2 mililitros de carbonato de potasio saturado y se sella

inmediatamente la tapa.

Se mezcla con ligeros movimientos de inclinación de la caja y se incuba a temperatura

ambiente durante 30 minutos.

Al término de la incubación se recupera cuantitativamente el Dicromato de potasio y se

afora a 10 mililitros con agua destilada. Se lee absorbencia a 445 nm contra agua destilada.

Se realiza una curva de calibración de 0 a 1500 microgramos de etanol.

DETERMINACIÖN DE GLUCOSA RESIDUAL

Una vez que se retiran las alícuotas para la cuantificación de etanol, parte de la muestra se

centrífuga en tubos Eppendorf de 1.5 mililitros y se rescata el sobrenadante que debe ser

transparente. Después de haber llevado a cabo la dilución conveniente de cada

sobrenadante (según la concentración inicial de glucosa), se pasan diferentes alícuotas a

tubos de ensaye de 16 x 150 mm y se lleva a 1 mililitro con agua destilada. Los tubos se

sumergen en un baño de hielo hasta que adquieran la temperatura del baño y se les adiciona

2 mililitros del reactivo de Antrona fría despacio (¡Cuidado, puede proyectar la mezcla). Se

mantienen los tubos en hielo y para el desarrollo de la reacción colorida, los tubos se

mezclas vigorosamente (Mucha precaución) hasta obtener una solución homogénea y luego

se someten a calentamiento en un baño de agua a ebullición durante 10 minutos. Se dejan

enfriar a temperatura ambiente y se lee la absorbancia a 620 nm contra un blanco de

reactivos.

Siguiendo el protocolo anterior, se efectúa una curva de calibración de 0 a 100

microgramos de glucosa, usando una solución tipo de glucosa de 100 microgramos por

mililitro.

DETERMINACIÓN DE CO2 POR GRAVIMETRÍA

La solución de cloruro de bario se filtra al vacío. Se hacen dos lavados de dicho matraz con

agua destilada libre de CO2 y se le agregan a la muestra transferida. El precipitado se lava

con acetona al 50% y luego con acetona pura. El papel con la muestra se deseca en una

estufa a 60°C durante 20 a 24 horas y posteriormente se pesa.

6. RESULTADOS

CURVA TIPO ETANOL

Microgramos de Etanol Absorbancia a 445

nm

0 (1 ml de agua)

Cámara central

(K2Cr2O7)

Vaselina Cámara externa (Muestra, agua y

carbonato saturado)

CÁMARA

CONWAY

VISTA

LATERAL

VISTA

FRONTAL

150 (100 microlitros de

Etanol de 1500 +900

microlitros de agua)

300

600

900

1200

1500

DETERMINACIÓN DE ETANOL FORMADO EN LA FERMENTACIÓN

Muestras Absorbancia a 445 nm

0.1 mililitros de muestra fermentada

0.5 mililitros de muestra fermentada

1 mililitro de muestra fermentada

Estos valores se obtienen al efectuar la lectura de absorbencia contra agua destilada.

CURVA TIPO DE GLUCOSA

Microgramos de glucosa Absorbancia a 620 nm

0

10

20

30

40

50

60

90

DETERMINACIÓN DE GLUCOSA RESIDUAL DE LA FERMENTACIÓN

Muestras Absorbancia a 620 nm

sobrenadante diluido 1:10




sobrenadante diluido 1:1000 + Inhibidor 1

sobrenadante diluido 1:1000 + Inhibidor 2

Los valores de absorbencia se obtienen al efectuar la lectura contra un blanco de reactivos.

DETERMINACIÓN DE CO2

Muestras Peso en gramos (g)

Papel filtro

Papel filtro + BaCl2

BaCl2 de fermentación

Papel filtro testigo

Papel filtro + BaCl2 testigo

BaCl2 testigo

Papel filtro + BaCl2 +

Inhibidor 1

BaCl2 Inhibidor 1

Papel filtro + BaCl2 + inhibidor

2

BaCl2 Inhibidor 2

7. CÁLCULOS

Calcule la cantidad de etanol formado en la fermentación (en mg /10 mililitros de muestra)

Calcule la cantidad de azúcar residual y de azúcar fermentado (en mg / 10 mililitros de

muestra)

Calcule la cantidad de CO2 formado a partir del peso de BaCO3 obtenido (en miligramos)

Convierta a unidades molares los miligramos de glucosa fermentada y los miligramos de

productos formados

Haga el balance de carbonos y el balance óxido-reducción

8. INFORME

Discuta y evalúe el significado del balance de fermentación que obtuvo en su equipo sobre

la base de los antecedentes

9. BIBLIOGRAFÍA

J. Hicks, J. Bioquímica Editorial McGraw-Hill Interamericana. 2001. México, D. F.

Rose, A. H. 1976. Energy Yielding metabolism: Chemical Microbiology, 3a Ed.

Sutterworths. Boston. pp. 187-188 y 208-214

Sokatch, J. R. 1969. Fermentation of sugars. En: Bacterial physiology and metabolism.

Academia Press London. pp. 72-74.

PRACTICA No. 8

MEDICION DE LA ACTIVIDAD DE GLUCOSAMINA-6-FOSFATO SINTASA

(GlcN-6-P-sintasa) EN LEVADURAS. PARTE 1

1. OBJETIVO

Determinar aminoazúcares por el método de Elson-Morgan y proteínas por el método de

Bradford para el cálculo de la actividad específica de la enzima GlcN-6-P sintasa.

2. INTRODUCCIÓN

La Glucosamina-6-fosfato sintasa (L-glutamina: D-fructosa-6-fosfato amidotransferasa; EC

2.6.1.16; GlcN-6-P sintasa) cataliza el primer paso de la biosíntesis de hexosaminas,

convirtiendo la fructosa-6-fosfato a glucosamina-6-fosfato usando glutamina como donador

de amonio. En eucariotas hay tres reacciones que convierten glucosamina-6-fosfato a

uridina-5-difosfo-N-acetil-D-glucosamina, un precursor de biomacromoléculas que

contienen aminoazúcares en hongos, bacterias y mamíferos tales como glicoproteínas y

quitina. La glucosamina-6-fosfato sintasa y la quitina sintasa catalizan el primer y último

paso de las reacciones para la síntesis de quitina. La glucosamina-6-fosfato sintasa es una

enzima que se ha propuesto como blanco en la quimioterapia antifúngica y como resultado

de éstas investigaciones, numerosos inhibidores de la glucosamina-6-fosfato sintasa han

sido descritos. La actividad de la ruta de las hexosaminas incrementada es importante en los

hongos durante los cambios morfológicos, en la síntesis de quitina y manoproteínas ambos

son esenciales como componentes en la pared celular del hongo y también involucra las

interacciones entre el hongo y su hospedero.


Perlas de vidrio

Homogenizador MSK Braun

Centrífuga

Ultracentrífuga

Tubos para centrífuga

Baño metabólico

Pipetas Pasteur

Micropipetas

Tubos de ensayo

Gradillas.

4. REACTIVOS

Regulador de fosfato de potasio 25 mM pH 6.5

Anhídrido acético al 5% (prepararse en el instante)

Solución saturada de bicarbonato de sodio

Tetraborato de potasio 0.8 M pH 9

P-Dimetilaminobenzaldehído (PDMB)

HCl 0.1 M

Ácido acético glacial

Levadura de panificación

Reactivo de Bradford

Glucosamina 1 mg/ml

BSA 100 mg/ml (albúmina sérica bovina)

5. DESARROLLO

*Las concentraciones que se indican de fructosa-6-fosfato, L-Glutamina, EDTA y DTT es

la concentración final en el regulador de fosfato

*Reactivo de Ehrlich: por cada tubo necesario para la reacción lleva 25 microlitros de ácido

clorhídrico, 3 mililitros de ácido acético glacial y 0.03 gramos de PDMB.

PREPARACIÓN DE LA FRACCIÓN ENZIMÁTICA.

Se trabajará con tres cultivos de Saccharomyces cerevisiae con dos diferentes

concentraciones de rojo congo 0.001%, 0.01% y 0.1%, además de un control (sin rojo

congo) un día antes de la práctica.

Filtrar por medio del equipo Millipore los medios de cultivo donde se encuentra el hongo y

recuperar las pastillas de cada matraz.

Colocar cada pastilla del hongo en un tubo de vidrio y agregar dos volúmenes de perlas de

vidrio y un volumen determinado de regulador todo bajo condiciones de 4°C (en hielo)

Homogenice por 20 minutos, 2 minutos homogenizando por 30 segundos de descanso.

Recupere el homogenado celular aspirando con una pipeta Pasteur y centrifugarlo a 10,000

rpm durante 10 minutos a 4°C. Recupere el sobrenadante y manténgalo en hielo.

Medir la concentración de proteína y usar esta fracción como fuente de enzima.

DETERMINACIÓN DE PROTEÍNA POR EL MÉTODO DE BRADFORD

Microlitros de

proteína Microlitros de agua

Reactivo de

Bradford 1

mililitro a todos los

tubos

Absorbencia a 595

nm

0 100

5 95

10 90

25 75

50 50

75 25

100 0

Problema 1:10

Problema 1:100

Problema 1:1000

CURVA DE CALIBRACIÓN PARA EL MÉTODO DE ELSON-MORGAN

Tomar 300 microlitros de agua y agregue 50 microlitros de anhídrido acético al 5% y 50

microlitros de solución saturada de bicarbonato de sodio e incubar 3 minutos. Calentar la

muestra durante tres minutos en agua hirviendo y posteriormente enfriar en hielo.

Mezclar las muestras acetiladas con 100 microlitros de Tetraborato de potasio 0.8 M pH 9 y

hervir durante tres minutos. Enfriar en hielo.

Agregar 3 mililitros de reactivo de Ehrlich. Incubar durante 20 minutos a 37°C. Leer la

absorbencia de las muestras a 585 nm.

Microgramos de

Glucosamina-6

fosfato

Absorbancia a 585 nm

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

6. RESULTADOS

Haga una gráfica para proteína y otra para la glucosamina de absorbencia contra

concentración para determinarla en la muestra problema.

7. INFORME

Mencione otros métodos para determinar proteína

Mencione algunos inhibidores de la enzima Glucosamina-6-fosfato sintasa y quitina

sintasa.

8. BIBLIOGRAFÍA

J. Smith, Rachel; Milewsky, Slawomir; J. P. Brown, Alistair and W. Gooday, Graham.

Isolation and Charaterization of the GFA1 Gene encoding the glutamine: Fructosa-6-fosfato

amidotransferase of Candida albicans. Journal of Bacteriology, Vol. 178, No. 8. Apr. 1996,

p 2320-2327

González-Ibarra, J; Milewsky, Slawomir; Villagómez-Castro, Julio-César; Cano-Canchola,

C; López-Romero, E. Sporothrix schenckii: Purification and partial biochemical

characterization of the glucosamine-6-phosphate synthase, a potential antifungal target.

Medical Mycology. 2009, p 1-12

PRACTICA No. 9

MEDICION DE LA ACTIVIDAD DE GLUCOSAMINA-6-FOSFATO SINTASA

(GlcN-6-P-sintasa) EN LEVADURAS. PARTE 2

1. OBJETIVO

Determinar la actividad catalítica de una enzima esencial en el metabolismo de eucariotas y

procariotas.


Perlas de vidrio

Homogenizador MSK Braun

Centrífuga

Ultracentrífuga

Tubos para centrífuga

Baño metabólico

Pipetas Pasteur

Micropipetas

Tubos de ensayo

Gradillas.

3. REACTIVOS

Regulador de fosfato de potasio 25 mM pH 6.5

Fructosa-6-fosfato 15 mM

L-Glutamina 10 mM

EDTA 1 mM

DTT 1 mM

Anhídrido acético al 5% (prepararse en el instante)

Solución saturada de bicarbonato de sodio

Tetraborato de potasio 0.8 M pH 9

P-Dimetilaminobenzaldehído

HCl 0.1 M

Ácido acético glacial

Levadura de panificación

Reactivo de Bradford

Glucosamina 1 mg/ml

BSA 100 mg/ml (albúmina sérica bovina)

4. DESARROLLO

Las concentraciones que se indican de fructosa-6-fosfato, L-Glutamina, EDTA y DTT es la

concentración final en el regulador de fosfato

Reactivo de Ehrlich (p-dimetilaminobenzaldehído al 1% en HCl 0.1 M en ácido acético

glacial).

DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD DE GLUCOSAMINA-6-FOSFATO

En un tubo coloque un mililitro de la mezcla de regulador de fosfato con las

concentraciones indicadas de fructosa-6-P, L-Glutamina, EDTA y DTT y la cantidad de

extracto que contenga una cantidad de proteína de 0.15 a 1.5 mg /ml.

Prepare una adicional que no contenga glutamina, en su lugar agregue regulador de fosfato.

Una vez que agregue el extracto celular incube a 30°C por 30 minutos y luego un minuto en

agua hirviendo para parar la reacción. Enfriar a temperatura ambiente. Medir la cantidad de

Glucosamina-6-fosfato por el método de Elson-Morgan.

MÉTODO DE ELSON-MORGAN

Tome 300 microlitros de la mezcla y agregue 50 microlitros de anhídrido acético al 5% y

50 microlitros de solución saturada de bicarbonato de sodio e incubar 3 minutos. Calentar

la muestra durante tres minutos en agua hirviendo y posteriormente enfriar en hielo.

Mezclar las muestras acetiladas con 100 microlitros de Tetraborato de potasio 0.8 M pH 9 y

hervir durante tres minutos. Enfriar en hielo.

Agregar 3 mililitros de reactivo de Ehrlich. Incubar durante 20 minutos a 37°C. Leer la

absorbancia de las muestras a 585 nm.

5. RESULTADOS

Consultar como se calcula la actividad específica de la enzima y calcúlela para las muestras

problema.

6. BIBLIOGRAFÍA

J. Smith, Rachel; Milewsky, Slawomir; J. P. Brown, Alistair and W. Gooday, Graham.

Isolation and Charaterization of the GFA1 Gene encoding the glutamine: Fructosa-6-fosfato

amidotransferase of Candida albicans. Journal of Bacteriology, Vol. 178, No. 8. Apr. 1996,

p 2320-2327

González-Ibarra, J; Milewsky, Slawomir; Villagómez-Castro, Julio-César; Cano-Canchola,

C; López-Romero, E. Sporothrix schenckii: Purification and partial biochemical

characterization of the glucosamine-6-phosphate synthase, a potential antifungal target.

Medical Mycology. 2009, p 1-12.

PRACTICA No. 10

ACTIVIDAD PARCIAL DE ORNITINA DESCARBOXILASA EN SEMILLAS

1. OBJETIVO Determinar la actividad de ornitina descarboxilasa de manera parcial en

semillas de frijol germinado.

2. INTRODUCCIÓN La Ornitina descarboxilasa (ODC, E.C. 4. 1. 1. 17) es una enzima

altamente regulada que cataliza el primer paso limitante para la producción de poliaminas, transformando la ornitina a putrescina y

posteriormente a espermidina y espermina. La ODC es una de las enzimas más reguladas en organismos eucariotas, es inducida por

diferentes activadores del crecimiento y suprimida por inhibidores específicos o por mutaciones que inhiben el crecimiento celular y la

transformación. También puede ser inducida por otros estímulos, tales como el tratamiento hipotónico o estímulos que inducen la diferenciación

celular. La ODC es una enzima de alto recambio cuya vida media

usualmente está en el orden de entre algunos minutos a una hora. Este recambio está sujeto a cambios marcados dependiendo de las

condiciones celulares, indicando que su degradación también es regulada. También está regulada la ODC bajo control negativo por las

poliaminas, ya que si son agregadas exógenamente no solo inhiben la síntesis de ODC sino que también provocan un rápido decaimiento en su

actividad. La degradación de la ODC es acelerada por las poliaminas lo cual es confirmado al seguir el decaimiento de la ODC marcada con

anticuerpos. Las poliaminas ejercen dos acciones de supresión en la ODC, una sobre la síntesis de la ODC y la otra sobre la inducción de una

proteína que posee un rápido recambio denominada antienzima, cuya síntesis es inducida por una exposición a un exceso de poliaminas y se

une a la ODC con gran afinidad inhibiendo su actividad. En forma resumida, los tres mecanismos que modulan negativamente a la ODC

por las poliaminas son:

a) Supresión traduccional de la síntesis, b) aceleración de su degradación y c) la inducción de la antienzima.


Homogenizador Potter Hielo picado

Pipetas Pasteur Micropipetas

Matraces especiales Tapas para los matraces especiales

Jeringa con aguja

Cuadros de papel filtro Baño metabólico

4. REACTIVOS Regulador de Tris-HCl 100 mM pH 7.5 adicionado con EDTA 1 mM, DTT

2 mM y PLP 0.2 mM Semillas de frijol sin germinar y germinadas

Hidróxido de potasio 5 M Ácido clorhídrico 1 M

Agua destilada libre de CO2 Inhibidores 2 mM

Cloruro de bario al 5% en agua libre de CO2

5. DESARROLLO SE USARAN SEMILLAS GERMINADAS Y SIN GERMINAR

Muela las semillas de una por una en un mortero congelado en presencia de hielo y agregue un determinado volumen de regulador

compuesto de acuerdo a la cantidad de semillas que tenga.

DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD DE ODC

La actividad de ODC de la muestra se determinó midiendo la liberación de CO2 gravimétricamente usando solución de cloruro de bario para su

cuantificación. Se coloca en matraces Erlenmeyer especiales en su compartimento exterior 200 microlitros de extracto de semilla y 100

microlitros de inhibidor (MGBG, Ornitina, Putrescina y DAB) a una concentración de 6 mM final (deje un matraz sin inhibidor como blanco)

y en el compartimiento interno se coloca un pedazo de papel filtro (1x1.5 cm) impregnado con 45 microlitros de KOH 5M. Se tapa

inmediatamente y se deja incubando a 37°C por 90 minutos. La reacción se detuvo inyectando a través del tapón de hule 100 microlitros de HCl

1 M en el compartimento exterior. PRECAUCIÓN NO TOQUE EL PAPEL FILTRO CON EL HCl. Se dejan incubando toda la noche para permitir que

el CO2 liberado reaccione con el KOH.

DETERMINACIÓN DE CO2 POR GRAVIMETRÍA

La muestra del vaso central que queda después de la fermentación se transfiere cuantitativamente sobre 20 mililitros de BaCl2 al 5%,

contenidos en un matraz Erlenmeyer de 125 mililitros. Se hacen dos lavados de dicho vaso central con agua destilada libre de CO2 y se le

agregan a la muestra transferida. El precipitado de carbonato de bario que se forma por filtración a través

de papel filtro Whatman No. 1 de peso conocido. El precipitado se lava con acetona al 50% y luego con acetona pura.

El papel con la muestra se deseca en una estufa a 60°C durante 20 a 24

horas y posteriormente se pesa.

6. RESULTADOS

Determinación de CO2

Muestras Peso en

gramos (g)

Papel filtro

Papel filtro + BaCO3 blanco

Papel filtro + BaCO3 inhibidor 1

Papel filtro + BaCO3 inhibidor

2

Papel filtro + BaCO3 inhibidor

3

Papel filtro + BaCO3 inhibidor 4

7. INFORME

A que nivel afectan a la ODC los distintos inhibidores que usó en la práctica.

8. BIBLIOGRAFIA

Arteaga-Nieto, P; López-Romero, E; Terán-Figueroa, Y; Cano-Canchola, C; Luna-Arias, J. P.; Flores-Carreón, A. Entamoeba histolytica:

Purification and characterization of Ornithine decarboxylase. Experimental Parasitology 101 (2002), pp-215-222

Macias-Segoviano, J. I. Papel de las poliaminas en el desarrollo de

Sclerotium cepivorum. Tesis de maestría. 2004.

Prácticas 6 a 10 Metabolismo Intermediario

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