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PRACTICA 4

ELECTROFORESIS EN PAPEL DE AMINOACIDOS

1.- OBJETIVO:

El objetivo fundamental de la practica es la comprobacin de la migracin electrofortica de los aminocidos sometidos a un campo elctrico en funcin de su carga y PI

2.- FUNDAMENTO:

a) PUNTO ISOELECTRICO

Los aminocidos son molculas que poseen, al menos, dos grupos ionizables, un amino y un carboxilo. A un pH adecuado (pH 7,4) toman la forma de ion dipolar. Para el aminocido ms sencillo, la glicina (Gly), la estructura ion dipolar se le denomina glicina isoelctrica, por tener igual nmero de cargas positivas y negativas:

En medio cido, la forma dipolar puede aceptar un protn (H+) en el grupo carboxilato (- COO-), y tambin puede en medio alcalino, perder un protn (H+) del grupo (- NH3+).

Al pasar de pH muy cido a pH muy alcalino, la evolucin de las cargas en la representacin de Bronsted del aminocido glicina, sera:

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El aminocido glicina es un cido diprtico, que se caracteriza por tener dos constantes de ionizacin y por consiguiente dos pKs: * El primero (pK1) corresponde a la disociacin del grupo carboxilo (- COOH). * El segundo (pK2) corresponde a la disociacin del grupo amino (-NH3+).

Entre estos dos pK se sita el punto de equivalencia de las dos disociaciones inicas: se conoce como punto isoelctrico (pHi), para el cual las cargas (+) y (-) se encuentran en equilibrio. A este pHi, la movilidad del aminocido es nula cuando se encuentra situado en un campo elctrico.

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Para la glicina:

pH < pI pH=pI pH > pI

R-CH-COOH R-CH-COO- R-CH-COO-

NH3+ NH3+ NH2

carga neta:

+1 0 -1

Para un aminocido bsico, seran:

pH pI

NH3+ NH3+ NH3+ NH2 | | | | R-CH-COOH R-CH-COO- R-CH-COO- R-CH-COO- | | | | NH3+ NH3+ NH2 NH2

carga neta:

+2 +1 0 -1

b) Electroforesis

Por electroforesis se entiende el mtodo basado en el movimiento de iones o molculas cargadas por accin de un campo elctrico. En la Bioqumica y Biologa Molecular sirve para la separacin e identificacin de biomolculas. La electroforesis se aplica en el campo de la Bioqumica a la separacin de compuestos que poseen grupos ionizables (aminocidos, pptidos, protenas, cidos nucleicos) teniendo en cuenta que la carga neta de estas sustancias depende del pH del medio en que se encuentren.

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Una partcula cargada en un campo elctrico intenso esta sometida a dos fuerzas importantes, la fuerza elctrica proporcional a la carga y al campo elctrico, y una fuerza hidrodinmica de frenado debido a la viscosidad del medio, obtenida mediante la ley de Stokes. En cambio, se puede despreciar en este anlisis otra fuerza debida a la agitacin trmica llamada fuerza browniana y que causa la difusin de las partculas.

ezEFel = ,

donde e es la carga elemental, z la carga inica, y E el campo elctrico igual a V/d, con V la diferencia de potencial aplicada y d la distancia entre electrodos.

avFStokes pi6= , donde es la viscosidad del medio, a el radio de la partcula supuesta esfrica y v

su velocidad. La fuerza de Stokes es proporcional a la velocidad, por lo que al someter la

partcula al campo elctrico, sta acelera en un lapso de tiempo muy breve hasta que las dos fuerzas queden iguales, la partcula ha alcanzado la velocidad lmite. Equiparando las dos fuerzas se obtiene la expresin para la velocidad lmite:

uEEa

ezv ==

pi6,

donde se ha introducido u, la mobilidad electrofortica. La velocidad de migracin de la partcula es proporcional al campo elctrico aplicado y a la mobilidad electrofortica:

a

ezu

pi6=

De esta ltima frmula, se deduce que la mobilidad electrofortica es proporcional a la carga de la molcula, pero es inversamente proporcional a su tamao (a) y a la viscosidad de la solucin ().

Entre los distintos mtodos de electroforesis que se utilizan, cabe destacar:

La electroforesis de zona, que se realiza en distintos soportes, tales como papel, acetato de celulosa, almidn, agar, poliacrilamida, etc., a bajos (6 V/cm) o altos campos elctricos (20 V/cm), y en presencia o ausencia de agentes desnaturalizantes.

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La inmuno-electroforesis, que combina la electroforesis en agar con la reaccin de precipitacin especfica antgeno-anticuerpo.

La electrofocalizacin o electroenfoque, que separa en base al punto isoelctrico de la biomolcula. Se emplea fundamentalmente para protenas.

La electroforesis que se va a realizar en la prctica es la zonal en papel de celulosa. Se va a aplicar a la separacin de los aminocidos glicina (Gly), leu (Leu), cido asprtico (Asp) y lisina (Lys).

En el transporte electrofortico, a la fuerza del campo se opone la resistencia viscosa del medio, producindose cuando se igualan una velocidad constante de desplazamiento de las partculas.

La fuerza inica de la solucin tampn tiene una importancia fundamental en la electroforesis, puesto que cuando es baja, permite velocidades de migracin de los solutos ms rpidas y con menor desprendimiento de calor.

La fuerza impulsora de la separacin es el campo elctrico. La fuerza retardadora es la interaccin del soporte con las molculas cargadas a separar. A igualdad de campo elctrico, tamao de las molculas y viscosidad de la solucin, el nico parmetro que afecta a la separacin es la carga, dependiente a su vez del pH del medio. La celulosa del papel hace de soporte para la emigracin de los iones y del medio conductor de la corriente entre los electrodos, a travs de una solucin tampn de pH.

Los aminocidos al situarlos en el medio tamponado de pH caracterstico, adquirirn una determinada carga de acuerdo con la naturaleza ionizable de sus grupos funcionales.

Por tanto, la separacin de una mezcla de aminocidos por electroforesis consistir en la emigracin de los aminocidos cargados positivamente hacia el electrodo denominado ctodo (polo negativo), o al electrodo opuesto llamado nodo (polo positivo) si estn cargados negativamente, o no se desplazarn si la carga neta del aminocido es nula.

Puesto que el tampn de electroforesis que se va a utilizar en la prctica est constituido por piridina/cido actico glacial/agua de pH = 6,1, se puede predecir la

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carga que tendr cada uno de los aminocidos a dicho pH y si el aminocido, por tanto, emigrar al ctodo, al nodo o permanecer en el origen o punto de aplicacin de la muestra.

Como el parmetro que define la carga de una molcula de aminocido es el punto isoelctrico (pI), si se conocen o calculan los valores de pI para cada aminocido que se va a ensayar, la carga que mostrarn al pH de la experimentacin y la emigracin que sufrirn por accin del campo elctrico, es fcil determinarlas para cada uno de los aminocidos.

Aminocido Gly Leu Asp Lys

pI 5,97 5,98 2,77 9,74

Carga a pH=6,1

0 0 (-) (+)

Emigracin Origen Origen nodo Ctodo Prediccin del comportamiento electrofortico de los aminocidos

En resumen, puede decirse que cuando una molcula cargada se coloca en un campo elctrico se mover hacia uno u otro electrodo dependiendo de: 1) su carga elctrica, 2) su tamao, 3) la intensidad del campo elctrico y 4) la temperatura del medio.

Si la molcula tiene carga positiva migrar hacia el ctodo; si tiene carga negativa, hacia el nodo.

Por tanto, a la vista de la tabla, se puede decir que al pH de 6,1 al que se realiza la electroforesis, los aminocidos neutros se quedarn en el origen, los aminocidos cidos emigrarn al nodo y los aminocidos bsicos emigrarn al ctodo.

3.- PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

3.1.- MATERIALES Y REACTIVOS

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- Aminocidos al 1% o glicina

o leucina

o cido asprtico o lisina

- papel whatman n 1

- pinzas de madera - micropipeta

- pulverizador - secador - solucin de nihidrina (1mg/ml en acetona) - Tampn piridina: tampn pH 6,1, (40 ml piridina, 3,2 ml cido actico glacial y agua hasta 1L) - tijeras - guantes

- fuente de electroforesis - cubeta para electroforesis en papel - cubeta de revelado

3.2.- DESARROLLO EXPERIMENTAL

El dispositivo experimental necesario para realizar una electroforesis zonal en papel consiste en:

- Una fuente de alimentacin que suministre un potencial constante (300 V). - Una cubeta de electroforesis en papel de celulosa. La cubeta posee dos

compartimentos separados, cada uno de los cuales contiene un electrodo de platino, que deben conectarse a la fuente de alimentacin mediante los cables con conectores adecuados, uno para el electrodo que hace de ctodo y otro para el que hace de nodo.

Las principales precauciones que hay que tener son:

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- El papel de celulosa hay que procurar no tocarlo con los dedos. El papel hay que manejarlo con las pinzas de madera.

- No contaminar las soluciones de los aminocidos patrn y de la muestra problema.

- Desde el momento en que se conecte la fuente de corriente a la cubeta de electroforesis, hasta que termine la misma, no se deben de tocar los cables, conexiones o disolucin que est en contacto con la corriente.

a.- Aplicacin de las muestras.

- Se traza con el lpiz una lnea muy dbil en el centro del papel. En la lnea se sealan dbilmente cinco puntos distribuidos equitativamente a lo ancho de la placa.

- Al mismo tiempo se seala en el margen superior derecho de la tira de papel el signo (+), para indicar el extremo del papel que se va a situar en el compartimento de la cubeta que va a actuar como nodo.

Tira papel whatman n 1

b.- Electroforesis de las muestras.

A1

A2

A4

problema

A3

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Una vez aplicadas las muestras, se roca ligeramente el papel con la solucin tampn de electroforesis mediante el pulverizador, procurando no mojar directamente las muestras.

Se quita la tapadera de la cubeta, se coge el papel con las pinzas y se coloca sobre la cubeta. Se introducen cada uno de los extremos del papel en los compartimentos de la cubeta, procurando que el extremo sealado en el papel con (+) sea el compartimento del nodo

Si los extremos no quedan bien sumergidos en la solucin tampn de electroforesis, se llenan los compartimentos con ms tampn.

Antes de comenzar la electroforesis, hay que asegurarse que el papel est bien humedecido.

Se coloca la tapadera en la cubeta, se conecta la fuente de alimentacin a la red de alimentacin y se enciende la misma. Con el mando del voltaje se ajusta el potencial a unos 300 V.

Al cabo de media hora se apaga la fuente, se desconecta de la red, se quita la tapadera, se saca el papel de la cubeta mediante las pinzas, procurando no romperlo y se coloca encima del papel de filtro de la mesa del laboratorio

c.- Secado y deteccin de los aminocidos.

- Se airea el papel para que se seque

- Con las pinzas de madera se sumerge en la cubeta que contiene la solucin de ninhidrina. Nada ms que se impregne, se saca de la solucin, dejando que escurra el exceso de la misma.

- Se espera hasta que se produce la reaccin de color - La deteccin de los aminocidos patrn y de la muestra problema se realiza por

la aparicin de las manchas de color prpura.

La reaccin que se produce entre los aminocidos y la nihidrina es la siguiente:

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d.- Identificacin electrofortica de los aminocidos de la muestra problema.

Los aminocidos contenidos en la muestra problema se identifican mediante la comparacin de los desplazamientos de las manchas con los correspondientes a los de los aminocidos patrones

A1

A2

A4

problema

A3

a

b

Catodo (-) Anodo (+)

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4.- BIBLIOGRAFA - Modern experimental biochemistry. Rodney Boyer : Boyer, Rodney F - Bioanalytical chemistry. Susan R. Mikkelsen, Eduardo Cortn.

5.- CUESTIONES

1. Seala de que factores depende el movimiento de los aminocidos en la electroforesis en papel.

2. Qu aminocidos estn presentes en la muestra problema? 3. Si el pH del tampn fuera 2 cual sera el resultado de la electroforesis? 4. Se podra identificar mediante esta tcnica una mezcla de los aminocidos

valina y triptofano utilizando las condiciones de la prctica?