ESTUDIO CINÉTICO DE LA FOSFATASA ÁCIDA: DETERMINACIÓN DE Km Y Vmax. IHIBICIÓN POR FOSFATO. DETERMINACIÓN DE Ki

ESTUDIO CINÉTICO DE LA FOSFATASA ÁCIDA: DETERMINACIÓN DE KM Y VMÁX

INHIBICIÓN POR FOSFATO. DETERMINACIÓN DE KI

OBJETIVO

Realizar un estudio cinético de la fosfatasa ácida, determinando los valores de KM y VMÄX utilizando como sustrato el pNFP; asi como estudiar el efecto del inhibidor del fosfato inorgánico (Pi) sobre la enzima.

INTRODUCCIÓN

En el estudio cinético de la enzima se puede examinar la estructura de la enzima y su actividad catalítica. Un mecanismo de reacción catalizada por una enzima determina la velocidad de reacción y como se altera en función de parámetros experimentales, esto se conoce como cinética enzimática (Lehninger, 2000).

La actividad enzimática está influenciada por factores experimentales como: la concentración de enzima, el pH de la solución de reacción y la temperatura. Es fácil predecir el efecto que tendría añadir más enzima, ya que al ser esta el catalizador, la velocidad inicial de reacción deberá ser mayor cuanto mayor sea la concentración de enzima, pero siempre y cuando haya suficiente sustrato (Boyer, 2000).

Dos principales factores que van a afectar la velocidad de una reaccion es la S y E.

Los inhibidos de las enzimas son agentes moleculares que interfiefen en la catalisis, disminuyendo o interrumpiendo las reacciones enzimaticas. Las enzimas catalizan vitualmente todos los procesos celulares de la enzimas ya que semejan entre los mas importantes agentes farmacéuticos conocidos (Lehninger, 2000).

PROCEDIMIENTO

ESTUDIO CINÉTICO DE LA FOSFATASA ÁCIDA: DETERMINACIÓN DE Km Y Vmax. IHIBICIÓN POR FOSFATO. DETERMINACIÓN DE Ki

Tabla 1.

Tubo No. BSin Inhibidor Con Inhibidor

1a 2a 3a 4a 5a 6a 1b 2b 3b 4b 5b 6bPnfp (sustrato) (mL) - 0.1 0.2 0.3 0.

40.5 0.6 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6

H2O o tampón citrato (mL) 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4

0.3 0.2 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 -

Fosfato (pi) (mL) - - - - - - - 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2Extrato hepático enzima (mL) 0.2 0.2 0.2 0.2 0.

20.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2

Se adicionaron los componentes de la mezcla de reacción según las cantidades y en el orden indicado en la tabla 1.

Se preparo una serie de tubos en una gradilla.1 2

Se agitaron todos los tubos.Se incubo la mezcla de reacción durante 20 min a 30°C en un baño maría. 3

Transcurridos los 20 min se paró la reacción enzimática mediante la adición de 5 mL de NaOH 0.2 N.

Se leyó la absorbancia de cada tubo a 420nm, se ajusto el espectrofotómetro a cero con el blanco (tubo B).

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RESULTADOS Y DISCUSIONES

Se prepararon los siguientes tubos:

Tabla1.Sistemas.

Tubo No.B

Sin inhibidor Con inhibidor

1a 2a 3a 4a 5a 6a 1b 2b 3b 4b 5b 6b

pNFP (sustrato) (mL) - 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6

H2O o tampón citrato (mL)

0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 -

Fosfato (pi) (mL) - - - - - - - 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2

Extracto hepático enzima (mL)

0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2

Se utilizaron los datos del calibrado de la práctica anterior para obtener los resultados (Tabla 2):

Tabla 2. Datos del calibrado.

Muestra Xi n = 8

1 0Xm = 0,2

2 0,05 Ym = 0,29625

3 0,1 a = 0,087355263

4 0,15 b = 1,044473684

5 0,2 r = 0,971831951

6 0,25 Sy/x = 0,045073454

7 0,35 Sa = 0,026108633

8 0,5 Sb = 0,103405595

Gráfica 1. Curva del calibrado contra los datos experimentales.

ESTUDIO CINÉTICO DE LA FOSFATASA ÁCIDA: DETERMINACIÓN DE Km Y Vmax. IHIBICIÓN POR FOSFATO. DETERMINACIÓN DE Ki

0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.60

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

Datos experimen-tales

Línea de calibrado

Para lo que se utilizo la ecuación de la recta: Y= aX + b

Y= (0.0873555263X+1.04473684

Tabla 3. Concentración de la muestra.

Absorbancia Concentración Sxo lim conf (+/-) m=0,589 0,480284706 0,0535264 0,1375628404116 10,824 0,705278408 0,06780458 0,1742577610308 20,993 0,867082389 0,08035381 0,2065092992440 31,23 1,09399093 0,09964254 0,2560813214918 41,64 1,486533132 0,13534481 0,3478361555449 51,758 1,599508692 0,14591969 0,3750135960683 6

Tabla 4. Ausencia de inhibidor (Pi).

ESTUDIO CINÉTICO DE LA FOSFATASA ÁCIDA: DETERMINACIÓN DE Km Y Vmax. IHIBICIÓN POR FOSFATO. DETERMINACIÓN DE Ki

Tubo No.

[p-NFP](mM)

Absorbancia (unidades)

Cant. p-NF (µmoles)

Vo (µmoles p-NF/min)

1/[p-NFP] (mM-1)

1/Vo

(min/µmoles p-NF)

1a0,480284706 0,589 0,1 0,02401424 2,082098363 41,1967

2a0,705278408 0,824 0,2 0,03526392 1,417879789 28,3575958

3a0,867082389 0,993 0,3 0,04335412 1,153292943 23,0658589

4a1,09399093 1,23 0,4 0,05469955 0,914084361 18,2816872

5a1,486533132 1,64 0,5 0,07432666 0,672706163 13,4541233

6a1,599508692 1,758 0,6 0,07997543 0,625191976 12,5038395

En la tabla 4. Se puede observar que la velocidad de cada muestra aumenta cuando se aumenta la cantidad de sustrato. Esto ocurre porque solamente una porción de la enzima presente está combinada con el sustrato, aun cuando haya muchas más moléculas de sustrato que de enzima. Esto se debe a que la constante de equilibrio para la reacción 1, no es infinitamente grande. Al aumentar o disminuir [S], aumenta o disminuye la cantidad de enzima ligada con el sustrato como ES; de aquí que Vo dependa de [S], (Murray, 1997).

Reacción 1: E + S ES

Tabla 5. Concentración de la muestra.

Yo Xo Sxo lim conf (+/-) m=

1,907 1,742164273 0,15939172 0,4096367249954 11,1 0,969526329 0,08887768 0,2284156369670 20,79 0,672726127 0,0654631 0,1682401562253 3

0,622 0,638259007 0,05521282 0,1418969375813 40,666 0,554006047 0,05764895 0,1481577999556 50,754 0,511879567 0,06306868 0,1620865180291 6

Tabla 5. Presencia de inhibidor (fosfato 20 mM).

Tubo No.

[p-NFP](mM)

Absorbancia (unidades)

Cant. p-NF (µmoles)

Vo (µmoles p-NF/min)

1/[p-NFP] (mM-1)

1/Vo

(min/µmoles

ESTUDIO CINÉTICO DE LA FOSFATASA ÁCIDA: DETERMINACIÓN DE Km Y Vmax. IHIBICIÓN POR FOSFATO. DETERMINACIÓN DE Ki

p-NF)1b 1,74216427

3 1,907 0,1 0,087108210,57399868

4 11,47997372b 0,96952632

9 1,1 0,2 0,048476321,03143150

4 20,62863013b 0,67272612

7 0,79 0,3 0,033636311,48648901

8 29,72978044b 0,63825900

7 0,754 0,4 0,031912951,56676206

5 31,33524135b 0,55400604

7 0,666 0,5 0,02770031,80503444

9 36,1006896b 0,51187956

7 0,622 0,6 0,025593981,95358452

4 39,0716905

En la tabla 5. Se puede observar que la velocidad de cada muestra disminuye cuando se aumenta la cantidad del inhibidor. La acción de un inhibidor implica la fijación de éste a alguna forma de la enzima, lo que da por resultado una pérdida total o parcial de la actividad enzimática para transformar sustratos en productos, (Bohinski, 1998).

CONCLUSIONES

BIBLIOGRAFÍA

1. Boyer R. 2000. Conceptos de Bioquímica. International Thomson Editores. México, D.F.

2. Lehninger A. 2000. Principios de Bioquímica. Ediciones Omega, S.A. Barcelona, España. Pp. 199, 202, 204, 205.

3. Bohinsky, R. 1998. Bioquímica. Quinta edición. Ed. Pearson. México. Pp. 195.

4. Murray, R. 1997. Bioquímica de Harper. Editorial El Manual Moderno. México, D.F. Pp. 101.