PRACTICA N04: DETERMINACION DE LA CROMATINA SEXUAL XI. COMPETENCIASa. desarrollar tcnicas de observacin de los corpsculos cromatina positiva en nuclolos de clulas femeninas.b. comprende la aplicacin en la determinacin del diagnostico de estados intersexuales durante la vida post natal y aun en la vida fetal.c. valoran su aplicacin como prueba de estimulacin rpida de cromosomas necesarios xII. INTRODUCCION: En 1949, Barr y Bertram realizando experimentos de neurocitologia en gatos, observando l presencia de una masa que se teia intensamente en el nucleo de clulas en interfase, reconociendo su existencia solo en animales de sexo femenino. Esta masa que observaron asociada al borde interno de la membrana nuclear fue denominada cromatina sexual o corpsculo de Barr, y en la actualidad cromatina sexual X (conferencia de Paris, 1971). La cromatina sexual X puede ser localizada cerca del nuclolo, en el nucleoplasma (celula nervios de la gata), prximo a la envoltura nuclear (celula de la mucosa bucal) y en los neutrfilos polimorfonucleares de las clulas epiteliales, tienen forma de convexa de 0,7 a q,2 micras de dimetro, se tie intensamente (heteropicnosis positiva) con colorantes nucleares (violeta de cresilo).Su estudio tiene aplicacin medica, toda vez que su deleccion temprana, nos da una idea de la presentacin de cromosomas sexuales X, dado que la cromatina X deriva de un solo cromosoma sexual X; el numero de cuerpos de bar es n= X-1; es decir significa que hay un cuerpo de barr menos que el numero de cromosomas sexuales.III. MATERIALES Y METODOS:Colorante: Solucion acuosa de violeta de cresilo 1%, orceina actica 2%, coloranrente Leislumam (polvo leishmann 1,5 gr., metafonol 1,000 mL; tincin al dia siguiente), Giemsa stock (Giemsa polvo 0,75 gr., metanol 65 ml., glicerol 35 mL. Solucin de trabajo en buffer fosfato 6,8); solucin acuosa de azul de Toluidina 0,5% fucsina (preparacin: solucin stock: 10mL de fucsina 3% de alcohol y 90 mL. De fenol al 5%. Solucin de trbajo: 45mL. De solicion stock, 6 mL de actico glacial y 6 mL de formaldehido al 37%. Colorante: 20 mL de solucin de trabajo, mas 30 mL de buffer fosfato ph 6,7.Fijador: alcohol etlico 95% - ter etlico (1:1)Acido actico glacial 50%Alcohol yodadoSolucin salina fisiolgica 0,9%Lancetas descartables MicroscopioEscapula de maderaAlgodn, mechera de alcohol, pinzas, papel de filtro, laminas, laminillas Soporte para coloracin laminarMETODO:A) ANALISIS DE LA CROMATINA SEXUALES DE LA MUCUOSA BUCALPROCEDIMIENTO 1 (Descrillesux,1984)1. obtener sus raspados de la mucosa nasal y realizar un frotis sobre una lamina limpia sea y debidamente rotulada.2. inmediaamente sumergir la laminas en un recipiente que contenga alcohol absoluto 20 minutos minimo a temperatura de ambiente.3.- sumergir las laminas en un frasco coplin que contenga HCL 1N calentando a 60 en bao maria durante 10 minutos. Lavar luego las laminas con agua de cao y secar a estufa a 37 C.4. colocar las laminas con fucsina por un tiempo de 15 minutos5. lavar laminas con agu destilada6. decolorar las laminas en un recipente que contengan alcohol al 70% por 10 minutos agitando la lamina suavemente.7. Lavar las laminas con agua destilada y secar a estuf a 37 C8.- observacion de microscopioPROCEDIMIENTO 2 (de azebedo, 1973)1. obteneter un raspado de mucuosa 1. hacer un suave raspado, con el borde de una esptula y relaizar una extnsion en un portaobjetos, el cual se ha revestido previamente de una capa fina albumina.2. fijar la extensin en el alcohol al 90% durante 10 a 20 minutos.3. Teir con oreina actica al 1% o con violencia de cresilo durante 7 minutos.4. lavar la coloracin5. observacin de microscopios.PROCEDIMIENTO 6 (Santander,1975)1. hacer un frotis en el paso anterior.2. sumergir las laminas en alcohol a 70% por 2 minutos.3. Teir con Biebrich scarlet, 2 minutos.4. lavar con alcohol al 50%5. teir con fast Green, de 1 a 4 horas (ver al microscopio cada hora hasta que desaparezca el color rojo y quede un fondo verde.6. sumergir las laminas en alcohol de 50 5 minutos7. sumergir las laminas en alcohol de 70% 2 minutos8. sumergir las laminas en alcohol de 965 2 minutos9. sumergir las laminas de alcohol de 100% 2 minutos10. sumergir lamina en xilol11. montar en bansalmo12. observacin microscpicaPROCEDIMIENTO 7 (YNIFESP EPM)1. raspar la mucuosa oral y espareir sobre la lamina2. dejar las laminas fijadas en fijador camoy II (metanol-acetico) por 30 minuts3. Hacer hidrolisis acida con HCL 5N a temperatura ambiente por 10 minutos4. lavar con agua corriente5. colorear con violeta de cresilo 15 minutos6. lavar con agua deionizada