PRCTICA 6 MANTENIMIENTO DE ASEPSIA EN BIORREACTORES

instituto politcnico nacionalunidad profesional interdisciplinaria de biotecnologadepartamento de bioingenieraacademia de ingeniera de bioconversioneslaboratorio de biorreactores

PRCTICA 6 MANTENIMIENTO DE ASEPSIA EN BIORREACTORESPROFESORES:M. EN I. AGUSTN ALTAMIRANO SEGOVIAM. EN C. JONS MARTNEZ LIMNING. JOS LEN RANGEL RAMREZ

EQUIPO 2

INTEGRANTESCARAVANTES CHVEZ JULIO CSARESCOBAR ROSALES MONTSERRATFIGUEROA ROMERO JORGE LUIS

GRUPO: 3BV1

FECHA DE ENTREGA: 1 DE JULIO DEL 2015

INDICE GENERAL

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OBJETIVOS4OBJETIVOS ESPECFICOS4INTRODUCCIN4DESARROLLO EXPERIMENTAL9RESULTADOS10DISCUSIN12CONCLUSIONES13REFERENCIAS CONSULTADAS13

INDICE DE ILUSTRACIONESIlustracin 1. Clasificacin de mtodos de esterilizacin.5Ilustracin 2. Saccharomyces cerevisiae.9Ilustracin 3.Biorreactor para produccin de biomasa (Vista frontal).9Ilustracin 4. Biorreactor para produccin de biomasa (Vista lateral).9Ilustracin 5. Toma de muestra para la tincin de Gram.10Ilustracin 6. Inoculacin del biorreactor para arrancar la cintica.10Ilustracin 7. Tincin de gram en cultivo en lote alimentado.11Ilustracin 8. Tincin de gram en cultivo en lote.11Ilustracin 9. Flujo difusivo.11Ilustracin 10. Intrusin de agua.12

PRCTICA 6MANTENINIENTO DE ASEPSIA EN BIORREACTORES1. OBJETIVO GENERAL

Conocer las pruebas de intrusin de agua y de mantenimiento de la presin para probar la integridad de filtros de aire con los que se garantice la operacin en biorreactores. Identificar claramente las diferencias entre condiciones aspticas, estriles, sanitarias y desinfeccin. Determinar la importancia de la asepsia en procesos biotecnolgicos.2. OBJETIVOS ESPECFICOS Verificacin de la asepsia en un cultivo en lote, lote alimentado y continuo en un biorreactor. Conocimiento de las buenas prcticas de laboratorio en la realizacin de una buena cintica en el Laboratorio de Biorreactores.3. INTRODUCCIN

Un microorganismo es un agente microscpico vivo e imperceptible alos sentidosque generalmente est agrupado en colonias, aunque bien puede estar como una unidad formadora de colonias (U.F.C.), la que se desarrolla en un medio apropiado para formar colonias perceptibles. Los microorganismos pueden ser patgenos (productores de ciertasenfermedades) o inocuos (los habitualmente hallados en losalimentos, elaire, el polvillo ambiental, que no perjudican alhombre.El hecho de que existan distintos tipos de grmenes en el medioambiente, crea grandes dificultades en los estudios bacteriolgicos, cuando es necesario obtener las especies microbianas enestadode pureza, ya que tanto el instrumental como losmedios de cultivo son invadidos con suma facilidad por los microbios delmedio ambiente.Los microorganismos pueden clasificarse en Crifilos (-5 a 14 C); Mesfilos (25 a 47 C) y Termfilos (50 hasta 113 C). Por ejemplo, muchoshongosse destruyen con la temperatura, pero sus esporas an son viables y cuando encuentran un medio apropiado, rico en nutrientes y humedad, se reproducen. Por tal motivo latecnologapara su destruccin debe considerar stasvariables.La esterilizacin y el mantener condiciones aspticas es un proceso a travs del que se logra la destruccin total de los microorganismos viables presentes en un determinado material, o se busca reducirlos lo ms posible.Este procedimiento es de gran utilidad dentro del campo biotecnolgico, ya que existen muchos procesos que requieren la utilizacin de materiales estriles. Entre stos podemos destacar: El acondicionamiento del material (pipetas, tubos, placas de Petri, pinzas, etc.) que va a ser utilizado en los laboratorios de microbiologa. La preparacin de medios de cultivo que sern empleados con diferentes propsitos (cultivo de microorganismos, control de ambiente, equipos o personal, anlisis microbiolgico de medicamentos, cosmticos, alimentos, etc.) La descontaminacin de material utilizado. Produccin de metabolito a partir de un microorganismos puro. Desinfeccin: tiene por objeto la destruccin de microorganismos mediante agentes denaturaleza qumica (desinfectantes), con el fin de disminuir el nmero de formas vegetativas a niveles mnimos. Desinfectante: es la sustancia qumica que inhibe o destruye microorganismos al aplicarla sobre material inerte sin alterarlo significativamente. Asepsia: trmino que se aplica a losprocedimientos utilizados para prevenir que los microorganismos progresen en un medio determinado (quirfano,laboratorio, etc.) Antispticos: son agentes desinfectantes que se utilizan sobre superficies corporales con el fin de reducir la cantidad de flora normal y de contaminantes microbianos decarcter patgeno. Tienen un menor grado de toxicidad que los desinfectantes y generalmente menor grado de actividad. Determinados preparados pueden utilizarse como antispticos o como desinfectantes indistintamente, pero a diferentes concentraciones en cada caso. Antimicrobianos: son sustancias qumicas producidas por microorganismos o sintetizadas qumicamente que a bajas concentraciones son capaces de inhibir e incluso de destruir microorganismos sin producir efectos txico en el husped.METODOS DE ESTERILIACIN.Hay diversos tipos de esterilizacin que pueden clasificarse segn su naturaleza u origen como se muestra en la ilustracin 1.

Ilustracin 1. Clasificacin de mtodos de esterilizacin.

*AGENTES FSICOS.Calor.El calor se puede aplicar como agente esterilizante de dos formas: el calor hmedo el cual destruye a los microorganismos por desnaturalizacin de las protenas y el calor seco que destruye a los microorganismos por oxidacin de sus componentes celulares. El calor es considerado como el mtodo de esterilizacin por excelencia siempre y cuando el material a esterilizar soporte altas temperaturas sin sufrir ningn tipo de dao.Radiacin.La radiacin permite esterilizar mediante la transmisin de ondas que generan la destruccin de los microorganismos. Existen distintos tipos de radiaciones.Radiacin ionizante:Este tipo de radiacin genera sustancias que son un veneno para el metabolismo bacteriano. Como los radicales oxhidrilo y radicales perxidos entre otros. Estos radicales atacan a las protenas y enzimas afectando su estructura de forma inmediata deteriorando definitivamente su metabolismo.Radiacin ultravioleta:Esta radiacin no es tan penetrante. Afecta en la superficie y ataca principalmente a las molculas de ADN. Estas molculas tienen mucha absorbancia justamente dentro del rango del UV por eso son tan sensibles. Es ideal para esterilizar material de quirfano.Radiacin Gama: La radiacin gamma es muy penetrante a diferencia de la anterior. Es ideal para esterilizar contenidos enlatados como alimentos o productos de farmacia que estn cerrados. En estos casos el calor los puede destruir por eso sonmsaconsejables este tipo de procedimientos.*AGENTES MECNICOS.La esterilizacin por filtracin se utiliza para eliminar bacterias de los medios lquidos que sean susceptibles al calor. Por ejemplo, las disoluciones enzimticas o de vitaminas.La esterilizacin se efecta pasando la muestra lquida a travs de un filtro con un tamao de poro de 0.42 m (o menor). Las bacterias normales quedan retenidas en el filtro y el lquido se esteriliza.Hay que tener presente que este sistema no elimina los virus ya que son de menor tamao que el poro (virus filtrables).La filtracin permite la remocin de todos los microorganismos presentes en un lquido o un gas retenindolos sobre la superficie de un material. Filtros HEPA (High Efficiency Particulate Air): Est compuesto por pliegues de acetato de celulosa que retienen las partculas (includos los microorganismos) del aire que sale de una campana de flujo laminar.Filtracin por membrana: Son discos de steres de celulosa con poros tan pequeos que previenen el paso de los microorganismos. Existen distintos tipos de filtro dependiendo del tamao de poro. Estos filtros son desechables. Adems de utilizarse en la esterilizacin de lquidos se usan en el anlisis microbiolgico de aguas ya que concentran los microorganismos existentes en grandes volmenes de agua.Es una tcnica recomendada por la mayora de las farmacopeas y envuelve la filtracin de fluidos a travs de un filtro de membrana estril, cualquier microorganismo presente es retenido en la superficie del filtro. Tambin se pueden analizar slidos solubles en agua, los cuales pueden ser disueltos en un diluyente apropiado y procesados por medio de esta tcnica.Se basa en hacer pasar la muestra a travs de una membrana porosa delgada, elaborada con plsticos de celulosa inerte, los poros son de tamao uniforme lo suficientemente pequeos para retener los microorganismos. *AGENTES QUMICOS.Algunas sustancias qumicas pueden ser usadas como agentes esterilizantes porque tienen la capacidad de promover una o ms reacciones qumicas capaces de daar los componentes celulares de los microorganismos (protenas, membranas, etc.)Todos los procesos de esterilizacin se deben controlar para poder asegurar que han sido efectivos. Para ello se pueden utilizar indicadores fsicos, qumicos y/o biolgicos, los cuales deben ser colocados en cada carga de esterilizacin.Indicadores fsicosEntre los principales indicadores fsicos se encuentran los medidores de presin y los termmetros los cuales permiten constatar las condiciones fsicas dentro de la cmara de esterilizacin. Tambin existen los termgrafos los cuales, adems de registrar la temperatura alcanzada en el proceso, permiten conocer durante cunto tiempo sta se mantuvo.Indicadores qumicosLa mayora de estos indicadores son cintas adhesivas que se adhieren al material a esterilizar. Estas cintas estn impregnadas con una sustancia qumica que cambia de color cuando el material ha sido sometido al proceso de esterilizacin. Este tipo de cintas no son completamente confiables debido a que muchas veces slo indican que se lleg a la temperatura deseada, pero no indican por cuanto tiempo sta se mantuvo. Tambin existen cintas diseadas de manera que el cambio de color es progresivo, estas cintas son un poco ms seguras porque permiten estimar si el tiempo de esterilizacin fue el adecuado.Indicadores biolgicosSon preparaciones de una poblacin especfica de esporas de microorganismos, las cuales son altamente resistentes a un proceso de esterilizacin en particular. Estos indicadores se deben colocar junto con la carga de esterilizacin, en el sitio que se considera que es ms difcil que llegue el vapor y despus del proceso, se deben incubar durante 24 horas en condiciones adecuadas. Si despus de este periodo hay evidencia de crecimiento microbiano (por ejemplo cambio de color del medio de cultivo), el proceso de esterilizacin no fue satisfactorio.Cuando se utilizan indicadores biolgicos se debe verificar: Tipo de microorganismo Tipo de proceso de esterilizacin Nmero de lote Fecha de expiracin Medio de cultivo utilizado Condiciones de incubacin del indicador despus de aplicado el proceso de esterilizacin Mtodos de descontaminacin para evitar la diseminacin de esporas en el medio ambienteCon este tipo de indicadores se controlan la esterilizacin por vapor a presin, por calor seco y la esterilizacin con xido de etileno.Una vez que un material est estril puede mantener esta condicin si est protegido en la forma apropiada. Es decir, la duracin de la esterilidad de un material no est relacionada directamente con el tiempo, sino con factores que comprometen su exposicin al medio ambiente.Los materiales estriles pierden su esterilidad cuando: Se produce cualquier ruptura, accidental o no, del material que lo recubre durante su transporte o almacenamiento. Al humedecerse el material de empaque. Es importante no manipular los materiales estriles con las manos hmedas, ni colocarlos sobre superficies mojadas.Al almacenar los materiales estriles se deben tomar una serie de precauciones, tales como: Controlar el acceso a las reas de almacenamiento de materiales estriles. Mantener el rea de almacenamiento limpia, libre de polvo, sucio e insectos. Controlar la temperatura y la humedad de las reas de almacenamiento. La temperatura ideal debe estar por debajo de los 26 C y la humedad relativa entre 30 y 60%. Los periodos prolongados de almacenamiento en lugares tibios y hmedos, pueden producir condensacin de humedad sobre el material de empaque. Utilizar, preferiblemente, estantes cerrados para colocar el material. Dejar que los materiales que salen del horno o el autoclave alcancen la temperatura ambiente antes de ser almacenados; de esta forma se evita la condensacin dentro del empaqueMorfologa de Saccharomyces cerevisiae. Las caractersticas de esta levadura son: morfologa elptica u ovoide, alta capacidad fermentativa, formadora de esporas (ascosporas con 4 esporas), no asimila nitratos ni escinde arbutina, su crecimiento puede ser en etanol, fermenta y asimila glucosa, galactosa, maltosa, sacarosa y rafinosa, no fermenta ni asimila lactosa.

Ilustracin 2. Saccharomyces cerevisiae.

4. DESARROLLO EXPERIMENTALPROCEDIMIENTOS USADOS EN EL LABORATORIO PARA MANTENER LA ASPXIA DURANTE LOS EXPERIMENTOS.

Previo a la prctica se realiz la esterilizacin por calor hmedo en el biorreactor, as como los aditamentos que fueron las mangueras, y para la jeringa se compr nueva. La esterilizacin por calor hmedo es uno de los mtodos ms simples pero igualmente efectivos, se busca la muerte microbiana mediante altas temperaturas, provocando la desnaturalizacin de las protenas, rompimiento de las estructuras de las clulas e inhibicin del crecimiento. Es ampliamente utilizado este mtodo debido a que es barato, rpido y es muy efectivo pues se da una distribucin uniforme gracias al vapor hmedo.Para los filtros se esterilizaron por calor seco, se introdujeron en los hornos elctricos por los cuales el aire caliente circula. Sabemos que para este mtodo de calor seco, se lleva un mayor tiempo y mayor temperatura en comparacin con el calor hmedo.

Ilustracin 3.Biorreactor para produccin de biomasa (Vista frontal).Ilustracin 4. Biorreactor para produccin de biomasa (Vista lateral).

La sepa a cultivar fue Saccharomyces cerevisiae la cual llevaba una incubacin de aproximadamente 18 horas, necesarias para su inoculacin al biorreactor en su fase exponencial y de esta manera reducir significativamente la fase lag o de acoplamiento, lo cual se logra inoculando en el mismo medio. La inoculacin se realiz con las lmparas de alcohol encendidas buscando reducir de manera importante la probabilidad de contaminarse el biorreactor. As como el uso de guantes de ltex con el mismo fin asptico. Del mismo medio de cultivo se tom el respectivo blanco que se preservo tapndolo con parafilm para las lecturas de absorbancia, manteniendo condiciones de asepsia con los mecheros prendidos.

Ilustracin 5. Toma de muestra para la tincin de Gram.Ilustracin 6. Inoculacin del biorreactor para arrancar la cintica.

Los microorganismos ms comnmente que se encuentran en el medio ambiente son E. Coli, estreptococos, Salmonella y estafilococos, bacterias las cuales pueden crecer de buena manera en casi cualquier medio, de modo que si nuestra rea de trabajo no es asptica, el matraz semilla se infectara y por lo tanto la produccin de biomasa se vera inhibida o alterada. En la prctica de produccin de biomasa en cultivo continuo, al final en la toma de las 8 pm, las mangueras de toma de cultivo nuevo dejaron de funcionar, el problema fue que ya no sala medio, sino ms bien se tomaba del tanque de salida, el cual ya estaba contaminado, por lo tanto, al final de la prctica se concluy que se contamin. En las absorbancias se ve claramente un estancamiento y al paso de 12 horas aproximadamente hay una drstica cada en las mediciones. Es un ejemplo claro de falta de asepsia.5. RESULTADOSTINCIONES DE MUESTRAS TOMADAS EN LOS CULTIVOS.Recordemos que una tincin de Gram nos ayuda a determinar si nuestra cepa (sea cual sea) es pura, es decir, que nicamente en el microscopio se observen Saccharomyces cerevisiae.Se toman las muestras para el frotis, siempre manteniendo condiciones de aspticas, con el uso correcto de guantes de ltex y mecheros.Se observaron claramente levaduras ovoides, Gram negativo. As se pudo confirmar que la cepa fue inoculada y aislada de excelente manera por la pureza de la muestra. Esto fue al inicio de la prctica de cultivo por lote. Posteriormente se realiz una segunda tincin para el cambio de cultivo en lote por cultivo alimentado. En ninguna de las dos tinciones se observa una posible contaminacin pues se observa claramente que son nicamente bacilos.Hizo falta una tercer tincin para cambio de alimentado a continuo. Y por ltimo una al final de todo el proceso para determinar claramente si el trabajo realizado fue asptico y correcto.

Ilustracin 7. Tincin de gram en cultivo en lote alimentado.

Ilustracin 8. Tincin de gram en cultivo en lote.

Algunas razones por las que un biorreactor debe trabajar bajo condiciones aspticas al efectuar una biorreaccin son debido a que los microorganismos contaminantes pueden competir con el microorganismo cultivado por el substrato. Poseer una velocidad de crecimiento mayor. Producir metabolitos txicos para el microorganismo cultivado. Ocasionar bajos rendimientos de substrato, ocasionando perdida productiva.

Ilustracin 9. Flujo difusivo.FUNCIONAMIENTO DE PRUEBA DE FLUJO DIFUSIVO.A presiones de gas diferenciales por debajo del punto de burbuja, las molculas migran a travs de los poros llenos de agua de una membrana humedecida siguiendo laley de difusin de Fick - la ecuacin utilizada para definir la ley de Fick establece una relacin entre flujo, coeficiente de difusin D, rea a travs de la cual difunde la sustancia A, variacin de concentracin y una longitud L, que puede ser el largo del tubo a travs del que se produce la difusin. - La tasa de flujo de difusin de gas para un filtro es proporcional a la presin diferencial y la superficie total del filtro.

A una presin de aproximadamente el 80% del punto de burbuja mnimo, el gas que se difunde a travs de la membrana se mide para determinar la integridad de un filtro. El flujo de gas es muy bajo en pequeas reas del filtro, pero es significativo en grandes reas del filtro.

Se han determinado especificaciones del flujo de difusin mximo para las membranas y dispositivos especficos y se utilizan para predecir los resultados de pruebas de retencin de bacterias.

Cuando la presin comienza a exceder el punto de burbuja, el volumen del flujo de gas es el resultado. Hay rdenes de magnitud de la diferencia entre el flujo de difusin y el flujo a granel.

En la prueba de difusin, la presin se aplica a 80% de la presin del punto de burbujeo del filtro sometido a prueba. Cuando hay lquidopordebajo del filtro, el volumen de flujo de gas se determina mediante la medicin de la velocidad de flujo de agua desplazada.

Ilustracin 10. Intrusin de agua.FUNCIONAMIENTO DE INTRUSIN DE AGUA. En WIT, la carcasa del filtro ya montado en la lnea de proceso se sumerge con agua y se somete a una presin mayor que la atmosfrica pero menor que la presin de la irrupcin de agua para el filtro dado.El filtro de membrana hidrfobo evita que el agua lquida penetre los poros.

En su lugar, el vapor de agua atraviesa el filtro a una velocidad que disminuye inicialmente en el tiempo como resultado de la compactacin de los pliegues de membrana y la eliminacin del aire atrapado en la membrana de filtro.

6. DISCUSIN

Durante la prctica no se obtuvieron los resultados esperados, en un inicio las condiciones estriles y de asepsia s fueron los adecuados, no hubo desatenciones y se monitoreo la produccin por lote de biomasa en los horarios establecidos y las muestras fueron tomadas correctamente, no se contamin nuestro medio y fueron los resultados en general los esperados de acuerdo a la literatura. Por otro lado, la produccin de biomasa por lote alimentado y continuo los resultados obtenidos no fueron los esperados de acuerdo a la literatura, pues hubo desatenciones, no se mantuvieron las condiciones aspticas del cultivo, de modo que se contamin y hubo demasiadas variaciones en las mediciones que se realizaron. Hubo fallas claras respecto al correcto uso de la jeringa para tomar muestras, al uso de guantes de ltex, usar un cubre bocas, etc. Los resultados en general fueron inadecuados, no se cumpli con ciertas caractersticas como que los materiales estriles deben tener claramente sealado a travs de un control su condicin de tal, deben estar vigentes, si hay dudas sobre la esterilizacin deben descartarse, si la envoltura no est indemne o hmedos, pierden su esterilidad.Debimos haber creado y manteniendo el campo estril durante el desarrollo de la intervencin, En el laboratorio es imprescindible trabajar con material y soluciones estriles con objeto de que los resultados que se obtengan correspondan al microorganismo o microorganismos que estn presentes en la muestra en estudio y no a contaminantes que procedentes del medio o los materiales, puedan desarrollarse y falsear las pruebas. 7. CONCLUSIONES

La conservacin asptica es vital para los variados procesos biotecnolgicos en la industria, como lo es la fermentacin, y as evitar tener riesgos de contaminacin. Para poder lograr la asepsia del biorreactor y de las tuberas asociadas a l, se deben proponer desde la etapa de diseo, una geometra interna y arreglos de tuberas, que eviten la acumulacin de substancias al llevar a cabo el vaciado de ellos. Existen microorganismos ajenos a nuestra cepa que buscan consumir la cantidad de sustrato disponible, por lo cual se produce una inhibicin del microorganismo de nuestro inters.8. REFERENCIAS CONSULTADAS Black, J. 1999. Microbiology Principles and Exploration. Fourth edition. John Wiley & Son, Inc. Murray, P. 1999. Manual of Clinical Microbiology. 7th edition. American Society for Microbiology. Washington, DC. The Pharmacopeia of the United States of America. Sterilization and Sterility Assurance of Compendial Articles. Cap 1211. 32 Edition. Rockville: USP; 2008. S. Moreno Grau,J. Bayo Bernal. Diseo de biorreactores y enzimologa. Primera edicin. Espaa, 1997. Pgina 118.