Practica # 2 Fotosíntesis, aislamiento de cloroplastos y la reacción de Hill

Introducción

Sin ninguna duda, uno de los problemas más interesantes y complejos que desafía el esfuerzo descubridor del hombre en la actualidad consiste en aclarar los misterios de la fotosíntesis. El mecanismo vivo (bacterias fotosintetizadoras y plantas verdes) a aprendido a capturar un fotón de luz y al utilizar la energía aportada por el para desplazar un electrón perteneciente a un par de electrones hasta un nivel más elevado. Esta captura del fotón y la conversión de su energía lumínica en energía química son una propiedad privativa de las plantas, un proceso llamado fotosíntesis. Desde los antiguos griegos que pensaban que las plantas sacaban alimento directamente de la tierra, que habían convertido los restos de plantas y animales en substancias fácilmente absorbibles por las raíces, hasta la formulación de la ley de la conservación de la materia y de la energía de por Robert Mayer en 1842, se sucedieron un cúmulo de brillantes científicos, que intentando resolver la incógnita, generaron las bases científicas para que, en 1905 Blackman sorprendiera a los fisiólogos vegetales del mundo al demostrar que la fotosíntesis no es solo una reacción fotoquímica sino también una reacción bioquímica, y en 1937, Hill proporcionara pruebas de que el desprendimiento de oxigeno está relacionado con las reacciones lumínicas y que el O2 de la fotosíntesis procede del agua y no del anhídrido carbónico.

Objetivo

Conocer la técnica para aislar cloroplastos de las hojas de las plantas verdes y demostrar la reacción de Hill en cloroplastos aislados mediante el uso de un aceptor de electrones artificial el diclorofenol –indofenol.

Materiales y reactivos

-solución de sacarosa 0.4 M-solución de KCl 0.0008 M-solución 2, 6 diclorofenol –indofenol

-pipeta de 1 ml.-probeta de 25 ml-vaso de precipitado de 100 ml

-mortero con pistilo -4 tubos para centrifuga -cubo de hielo-gasa -8 tubos de ensaye de 10 ml

-hojas de espinaca (Spinacea oleácea)-vaso de precipitado de 500 ml -gradilla -embudo de vidrio-1 matraz erlenmeyer

Procedimiento I) Aislamiento de cloroplastosTome 10 ml de una solución de sacarosa 0.4 M y póngalo en cubo de hielo. Lave perfectamente las hojas de espinaca, pese 10 g y llévelas a un mortero con 50 ml de la solución de sacarosa helada; muela la muestra y filtre la suspensión pasándola a través de una gasa colocada en un embudo de cuello corto. Centrifugue a 500 rpm durante 10 minutos; tome el sobrenadante y centrifúguelo a 3000 rpm durante 10 min. Descarte el sobrenadante y lave el residuo en sacarosa 0.4 M; en esta fracción se encuentran los cloroplastos. A continuación suspenda los cloroplastos en 10 ml de sacarosa 0.4 M helada. II) Efecto de la temperatura en la fotosíntesisDivida la suspensión en dos partes, conserva una parte en hielo y la otra hiérvala y deje enfriar.Prepare una solución con 0.3 ml de solución amortiguadora fosfato a pH 6.8 + 19 ml de KCl 0.008 m (a esta se le llamará solución amortiguadora). Prepare una solución de 2,6 diclorofenol-indofenol 16mg/100 ml (a esta se le llamara solución diclorofenol).III) Demostración de la reacción de HillPrepare 6 tubos de ensaye de la manera siguiente:A) 3.5 ml de sol. Amortiguadora +1.5 ml suspensión cloroplastos; b) 3.5 ml sol amortiguadora +1.5 ml suspensión hervida de cloroplastos.C) 3.5 ml de sol. Amortiguadora + 0.5 ml sol diclorofenol + 1.5 ml suspensión cloroplastos;D) 3.0 ml de sol amortiguadora + 0.5 ml sol diclorofenol + 1.5 ml suspensión hervida de cloroplastos.E) prepara igual al tubo cF) prepara igual al tubo dLos tubos de ensaye a, b, c y d se colocan bajo la luz intensa de preferencia al sol; los tubos e, f se colocan en la obscuridad a los 10- 15 min. Observa la coloración de los tubos

Reacción de Hill

2, 6 dicloro fenol – indofenol oxidado y reducido