UNIVERSIDAD ANÁHUAC MÉXICO NORTE

PRÁCTICA 1

EXTRACCIÓN DE ADN

LABORATORIO DE BIOLOGÍA MOLECULAR

DR. ERNESTO RODRÍGUEZ AYALA

PEDRO ARTURO MEJÍA ROSALES

NRC 10347 SECCIÓN 1

HUIXQUILUCAN, ESTADO DE MÉXICO A 1 DE SEPTIEMBRE 2010

2

EXTRACCIÓN DE ADN

Introducción

El Ácido Desoxirribonucleico, comúnmente referido simplemente como

ADN, es una doble cadena, cada una constituida por una secuencia de

nucleótidos y dispuestas a manera de doble hélice o helicoidal. La molécula de

ADN es considerada ampliamente como la molécula de la vida ya que es en ella

donde se almacena todo el material genético, es decir, es de alguna manera el

instructivo general para todo lo que somos y cómo funcionamos ya que es un

código específico con el cual nuestro organismo por medio de los ribosomas

construye las proteínas, responsables de la mayoría de los procesos que ocurren

en el cuerpo además de hacernos únicos ya que cada persona posee un ADN que

aunque parecido no es el mismo y esto nos otorga la variabilidad entre cada

individuo.

El código que compone al ADN es el resultado del emparejamiento de las

cuatro bases nitrogenadas de los nucleótidos: la adenina, timina, guanina y

citosina. La adenina se complementa únicamente con la timina, mientras que la

guanina sólo se pega a la citosina. La célula mediante los mecanismos de

replicación, transcripción y traducción logra expresar el ADN en proteínas con

diversas funciones cada una. Sin embargo no toda la cadena de ADN codifica a

una proteína, sólo ciertas partes, a esas zonas es a lo que se les llama genes.

Pero el ADN no se encuentra simplemente disperso dentro de la célula, sino

que se condensa con ayuda de ocho proteínas que se llaman histonas, esto hace

que se forme un nucleosoma. Eventualmente los mismos nucleosomas también se

van condensando entre ellos y forman los cromosomas, los cuales se encuentran

dentro del núcleo de la célula, rodeado de una membrana hecha de fosfolípidos y

el núcleo y los demás componentes citoplasmáticos como proteínas, enzimas,

mitocondria, ribosomas y demás a su vez están limitados por la membrana

plasmática que igual está formada por fosfolípidos, proteínas, carbohidratos y

colesterol.

3

Objetivo

Mediante el procedimiento no orgánico de proteinasa K and salting out, de una

muestra de células se extraerá y observará ADN, además de aprender y explicar

los distintos mecanismos para lograrlo.

Material

4 Microtubos transparentes con 1 ml de tampón de lisis

1 Microtubo azul rotulado como “prot”

1 Microtubo rosa rotulado como “sal”

4 Tubos transparentes de rosca sin tapa

4 Tapas de rosca de colores

8 Escobillas para citología

4Tubos de fondo redondeado de 5 ml

4 Trozos de parafilm

4 Pipetas de plástico

1 Gradilla de corcho para tubos eppendorf

1 Rotulador de tinta indeleble

1 Contenedor de residuos

Métodos

Colecta y ruptura de células

1. Coger un microtubo transparente con 1 ml de tampón de lisis para ti, y rotularlo

con las iniciales de quien donará las células, utilizando el rotulador de tinta

indeleble.

2. Tomar la primera escobilla, y con suavidad pásala a lo largo del interior la

mejilla derecha y por el espacio situado entre la mejilla y la encía durante 1

minuto. Raspar la mucosa con firmeza, pero sin dañarse.

3. Introducir la escobilla con las células de la mucosa en el tubo que contiene el

tampón de lisis. Girar la escobilla para liberar las células de la escobilla en el

4

tampón. Frotar las cerdas de la escobilla contra el borde del tubo para transferir la

mayor cantidad posible de células en el tubo. Tirar la escobilla al contenedor de

residuos.

4. Usando una segunda escobilla limpia, raspar suavemente las células del interior

de la mejilla izquierda, entre la mejilla y la encía, por el paladar, y debajo de la

lengua durante 1 minuto.

5. Introducir la escobilla en el mismo tubo de antes, y girar la escobilla para liberar

la mayor cantidad posible de células en el tubo. Después tirar la escobilla.

6. Cerrar el tubo y suavemente voltearlo 5 veces para mezclar los componentes.

Eliminación de proteínas

1. Coger el tubo rotulado como “prot” y añadir 1 gota de la solución de proteasa

(35 µl si utilizas una micropipeta) al tubo que contiene tu extracto celular. Cerrar el

tubo y voltearlo suavemente 5 veces para mezclar los componentes.

2. Poner el tubo con el extracto celular en la gradilla de corcho del puesto de

trabajo, y colocar las muestras en el baño a 50 ºC durante 10 minutos para dejar

que la proteasa actúe.

Hacer visible el ADN

1. Sacar el microtubo del baño y añadir 2 gotas (70 µl con micropipeta) del tubo

rotulado como “sal”. Cerrar el tubo y voltearlo suavemente 5 veces para mezclar

los componentes.

2. Rotula con tus iniciales un tubo de 5 ml de fondo redondeado y pasa el

contenido de tu microtubo a este tubo.

3. Coger una pipeta de plástico y llenarla con alcohol frío.

4. Inclinar el tubo de fondo redondeado 45 º y lentamente añadir el alcohol,

dejando que caiga con cuidado por la pared interna del tubo. Se forman dos capas

(superior e inferior).

5

5. Dejar el tubo de 5 ml en posición vertical en la gradilla, a temperatura ambiente

y en reposo, durante 5 minutos.

6. A los 5 minutos mirar el tubo, especialmente en la zona de unión de la capa de

alcohol y de la capa del extracto celular. Anotar las observaciones.

7. Sellar la boca del tubo con un trozo de Parafilm, tapar la boca con el pulgar e

invertir lentamente el tubo 5 veces para mezclar los componentes. Buscar la

presencia de un material fibroso, blanco o claro.

Desarrollo

Se eligieron a dos miembros de cada equipo para colectar el ADN

Primero cada persona tomó un microtubo, el cual había que rotularse con el

nombre de cada uno

Con una pipeta de plástico se vertieron 3 ml de agua semidestilada en el

microtubo

Se tenía que tomar el contenido del microtubo, pero sin tragar, sólo

haciendo buches asegurándose de pasar el agua especialmente en el área

entre las mejillas y la encía, para luego escupir el agua, ahora con la saliva,

de regreso al interior del microtubo

Ya con la saliva en el microtubo se le agregaron 2 ml de tampón de lisis con

otra pipeta

Se volteó el microtubo 5 veces para mezclar

Con pipetas diferentes se agregaron 5 gotas de solución de proteasa al

microtubo

Se volteó 5 veces

Hecho lo anterior se colocaron todos los microtubos en una gradilla y luego

se sumergieron en un baño de 50°C por 10 minutos

Pasado este tiempo se sacaron y se dejaron a temperatura ambiente por

otros 10 minutos

Se tomaron los microtubos y se colocaron en una posición de 45°C, y

posteriormente con la última pipeta se vertieron cuidadosamente 2 ml de

6

alcohol, evitando que la pipeta tuviera contacto con las paredes del

recipiente y que el alcohol cayera por la pared lentamente.

Después de esto se observaron dos fases en el microtubo y se volteó 1 vez,

se observó el cambio ocurrido y luego se volteó 4 veces más para que

finalmente se hiciera visible el ADN

Diagrama de flujo

7

Resultados

En primer lugar se observó la saliva normal, con su consistencia viscosa

Después de agregar el tampón de lisis se notó la presencia de burbujas,

algo de espuma y se notaba un tanto espesa y turbia

Al agregar las gotas de proteasa y después de meterla al baño caliente y

posteriormente enfriarla, ocurrió un cambio: la saliva se hizo un poco más

transparente, y se hicieron presentes pequeñas partículas por todo el tubo

Cuando se agregó el alcohol se pudo observar la presencia de dos fases: la

superior y más transparente que correspondía al alcohol y la inferior que

era la saliva ya tratada con el tampón de lisis y la proteasa

Al voltear el tubo la primera vez se veía claramente la primera reacción del

alcohol con la saliva, se veían como delgados hilos transparentes flotar en

el centro

Para acabar se volteó de nuevo 4 veces y fibras de ADN se hicieron

visibles, eran muchas, estaban por todo el tubo y tenían burbujas pegadas

a ellas

8

Discusión

El experimento como ya se ha mencionado, consistió en separar a las

moléculas de ADN de los demás componentes celulares, pero para esto se usaron

las propiedades de los mismos componentes para poder degradarlos y así

obtenerlo.

Lo primero que se hizo fue obtener las células, y esto se hizo durante los

buches de agua semidestilada ya que el epitelio de la cavidad oral siempre está en

constante renovación, por lo que hay descamaciones frecuentes. Lo siguiente fue

agregar el tampón de lisis cuyo componente principal era detergente, el cual tiene

la particular propiedad de hacer que los lípidos se micelicen. Para esto hay que

recordar que tanto la membrana plasmática como la nuclear están compuestas

más que nada de fosfolípidos, por ende el detergente ayudó a remover las

membranas vertiendo todo su contenido al medio.

En ese momento se puede decir que el ADN está libre, pero también lo

están todas las demás proteínas de la célula, incluidas las DNAsas, que degradan

el ADN. Es aquí donde participa la proteasa, para degradar éstas enzimas dañinas

a la molécula, librarnos de cualquier otros elementos proteicos que no conciernen

a esta práctica y otra cosa muy importante, desenrollar al ADN ya que lo que la

mantiene tan condensada son las proteínas conocidas como histonas. La razón

por la cual se metieron los microtubos al baño de agua caliente es simplemente

porque la proteasa sólo se activa en un ambiente de 50°C. Es importante señalar

aquí que la sal iba ya incluida junto con la proteasa y lo que hizo fue que la carga

positiva del sodio se pegó a la carga negativa del grupo fosfato del ADN, con lo

que se neutralizó y ayudó a que se separara de las demás moléculas

replegándose en ella misma.

Hasta aquí entonces se puede explicar el cambio en la consistencia, la

saliva era ya más transparente porque habíamos separado a los componentes de

las células, tanto lípidos como proteínas, y las pequeñas partículas que se podían

ver flotando eran los restos de membranas. Finalmente lo que se pasó con el

9

alcohol fue que deshidrató a la molécula de ADN, y por ello precipitó, es lo que se

pudo observar al voltear la primera vez. Ya después de agitar bien se pudieron ver

bien las delgadas fibras de ADN.

Cuestionario

1. Imagina que estás intentando explicar la diferencia entre cromosomas, genes y

ADN a tu hermano o hermana que es un par de años más pequeño que tu.

ADN: Es como el instructivo de lo que somos y cómo somos. Pero no hay que

confundirse, sólo son los pasos a seguir, con éste instructivo haces tú un molde

(de ARN) y posteriormente y con ayuda de utensilios (ARNt, ribosomas, etc.) ya

tienes como el producto (proteínas)

Genes: Tu instructivo tiene como muchas cosas que sólo son de relleno, no las

necesitas para “cocinar” tus proteínas, pero las partes esenciales, las que a

fuerzas necesitas, ésos son los genes, partes del ADN que codifican una proteína

Cromosomas: El ADN es tan grande que la célula necesita compactarlo

muchísimo para que se pueda guardar más fácilmente, a la condensación del ADN

se le llama cromosoma.

2. ¿Contiene una célula hepática los mismos cromosomas que una célula de la

mucosa bucal? Sí, la diferencia está en cuáles cromosomas son los que se

expresan en cada una

3. Si quisieras aislar una copia del gen que codifica una proteína encontrada en el

estómago, ¿podría estar ese gen en las células de la mucosa bucal? Razona tu

respuesta. Sí estaría pero como se mencionó en la respuesta anterior no se

expresa, está la instrucción pero si esa proteína no la necesito, entonces no la

produzco, aún cuando ambas son mucosas tienen requerimientos distintos.

4. Indica los compartimentos celulares, incluyendo la membrana celular, el

citoplasma y el núcleo.

10

5. ¿En qué compartimento celular esperas encontrar tu ADN? En el núcleo

6. ¿Por qué es necesario un intermediario como el ARNm para pasar de la

información del ADN a la síntesis de las proteínas? Porque no se puede usar

directamente el ADN, volviendo a la metáfora de la receta no se puede entregar la

receta original de un platillo maestro, si lo hiciera ya no podría hacer más, así

también el ADN, no puede estar saliendo y entrando al núcleo cada que se ofrezca

7. ¿Cuál crees que será el siguiente paso en el aislamiento del ADN de tus

células? (ésta pregunta estaba en la sección de colecta de células): El siguiente

paso sería romper la membrana plasmática para así estar más cerca del ADN.

8. Una vez que las membranas se han roto, el ADN queda libre en la solución, al

igual que otras moléculas celulares. Haz un listado de las moléculas que junto con

el ADN esperas encontrar en la célula.: Glucosa, lípidos, sales, proteínas y

enzimas.

Núcleo

Mitocondria

Plasmalema

Citoplasma

Aparato de

Golgi

Retículo endoplásmico

rugoso

11

9. ¿Qué método o agente crees que se puede usar para eliminar esas moléculas

que no nos interesan? El detergente para los lípidos y la proteasa para las

proteínas principalmente.

10. ¿Qué proteínas podrían estar asociadas al ADN en la célula? Principalmente

las histonas y proteínas escafoides (responsables de la compactación), y también

DNAsas

11. La proteasa utilizada en este protocolo tiene un funcionamiento óptimo a 50

ºC. ¿Crees que esta enzima se ha aislado de E. coli? Razona tu respuesta. Una

pista: ¿Dónde vive E. coli? La E. Coli es una enterobacteria, entonces mi

conclusión es que no pudo haberse aislado de e. coli, porque el intestino nunca

está a 50°C

12. A menudo para ablandar la carne (de un filete, por ejemplo) ésta se golpea.

Sabiendo que ese filete es tejido muscular rico en proteínas procedente de una

vaca, ¿puedes pensar en una explicación de por qué esto funciona? Porque lo

único que esto haciendo al darle de golpes es cambiando su morfología pero su

estructura molecular sigue siendo la misma, ya que se rompen las fibras de la

carne pero las proteínas siguen estando presentes con la misma estructura.

13. Relaciona los resultados de la izquierda con los pasos de laboratorio de la

derecha:

Recoger las células A. Pasar un cepillo por el interior de

la mejilla A

Disolver las membranas B. Añadir proteasa, incubar a 50

ºC D

Precipitar el ADN C. Añadir una solución de

detergente B

Romper proteínas D. Añadir alcohol frío sobre el extracto

celular C

12

Hacer al ADN menos soluble en agua E. Añadir sal E

Conclusiones

Se cumplió en objetivo de la práctica lo que ayudó a una mejor comprensión

de la estructura y propiedades tanto de la célula como del ADN. Éste aunque está

presente en todas las células eucariontes no es tan fácil de accesar, por ser una

molécula con tanta importancia, ya que el funcionamiento tanto del organismo

como la continuidad de la especie, depende de éstos pequeños hilos en doble

hélice. Se encuentra tan bien protegida y regulada que está separada de todos los

organelos celulares por medio de los fosfolípidos y proteínas de la membrana

nuclear.

El ADN es definitivamente uno de los descubrimientos más importantes de

toda la historia, sino es que el más importante, es la razón por la cual los avances

en la medicina se están enfocando hoy en día a tratar los padecimientos pero

desde un punto de vista molecular, ya no sólo se van contra los signos y síntomas

sino que quieren ir más allá aún.

Es por esto es que el estudio del ADN durante la carrera de medicina es

crucial, para entender muchas de las enfermedades que se ponen frente a los

médicos hay que entender su composición a niveles que hace unos años hubieran

sido imposibles de imaginar y así dar tratamientos más adecuados y eficaces a los

pacientes.

Bibliografía

Fauci, A; Braunwald, E; Kasper, D; Hauser, S; Longo, D y Jameson, J.

(2008) Harrison: Principios de Medicina Interna. China: McGraw-Hill