MMIICCRROOBBIIOOLLOOGGAA

SEGUNDO CURSO

GUIN DE PRCTICAS

Curso 2007-2008

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IINNDDIICCEE

Normativa de las prcticas de Microbiologa ............................................................................................................. Pag. 3

Normas y reglas en el laboratorio de Microbiologa .................................................................................................. Pag. 4

Material de laboratorio ............................................................................................................................................... Pag. 5

Objetivo de las prcticas de Microbiologa ................................................................................................................ Pag. 6

Esquema de trabajo .................................................................................................................................................... Pag. 7

Toma de muestra ........................................................................................................................................................ Pag. 8

Preparacin de medios de cultivo ............................................................................................................................... Pag. 9

Mtodos de siembra .................................................................................................................................................. Pag. 10

Mtodos de incubacin ............................................................................................................................................. Pag. 15

Observaciones macroscpicas ................................................................................................................................... Pag. 15

Observaciones microscpicas ................................................................................................................................... Pag. 17

Morfologa de las bacterias ....................................................................................................................................... Pag. 21

Identificacin bacteriana ........................................................................................................................................... Pag. 22

Tiras Multisustrato .................................................................................................................................................... Pag. 30

Antibiograma ............................................................................................................................................................ Pag. 31

Prctica de Virologa ................................................................................................................................................. Pag. 36

Prctica de Micologa ................................................................................................................................................ Pag. 41

Anlisis de alimentos ................................................................................................................................................ Pag. 56

Medios de cultivo ...................................................................................................................................................... Pag. 59

Pruebas bioqumicas ................................................................................................................................................. Pag. 62

Supuesto prctico ...................................................................................................................................................... Pag. 72

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NNOORRMMAATTIIVVAA DDEE LLAASS PPRRCCTTIICCAASS DDEE MMIICCRROOBBIIOOLLOOGGIIAA

- Las prcticas de Microbiologa e Inmunologa son obligatorias para todos los alum-nos matriculados en la asignatura y deben ser superadas para poder acceder al examen final de la misma.

- Se exceptan de esta norma aquellos alumnos que las hayan superado en el curso an-terior en esta Facultad. Los alumnos que hayan cursado prcticas de Microbiologa en otras Universidades debern presentar un certificado acreditativo que ser evaluado por el Depar-tamento para juzgar si procede o no a su convalidacin.

- Los alumnos sern convocados mediante listas que se expondrn con la debida ante-lacin en el tabln de anuncios del Departamento (Pabelln de Sanidad Animal) y debern venir provistos de bata de laboratorio y guin de prcticas, as como de dos artculos de divulgacin, extrados de la prensa diaria reciente (peridicos o revistas que se puedan com-prar en kioscos, y que no sean especficamente cientficos; tambin puede ser de Internet del mismo tipo de publicaciones on-line).

- Las practicas transcurren a lo largo de dos semanas consecutivas. De martes a vier-nes, en las que se realizarn las enseanzas prcticas de correspondientes a la asignatura de Microbiologa.

- Los horarios sern de maana para los alumnos que cursan estudios por la tarde y de tarde para los que cursan estudios por la maana. La duracin de cada una de las sesiones prcticas es variable, estimndose en unas 3 h.

- Es obligatoria la asistencia a todas las sesiones prcticas que integran cada grupo. Las faltas debern ser debidamente justificadas y la ausencia en ms de una sesin supondr el paso directo al examen final de prcticas.

- Una parte importante de las prcticas corresponder a la realizacin de una identifi-

cacin bacteriana de una muestra problema. Al finalizar la misma, el alumno deber entregar al profesor de prcticas un informe sobre el proceso seguido, en el que se incluya la biblio-grafa consultada, y otros datos que considere de inters.

- La calificacin del alumno en lo que respecta a las prcticas de esta asignatura se ba-

sar en tres criterios: actitud del alumno a lo largo de las prcticas, conocimientos adquiridos, e informe presentado.

- Los alumnos que no superen la evaluacin prctica podrn presentarse al examen fi-nal de prcticas que tendr lugar antes del examen final terico de la asignatura.

- Tendrn derecho al examen final de prcticas todos los alumnos de la asignatura que por cualquier causa no las hayan superado con anterioridad.

- Excepcionalmente podrn repetir las prcticas voluntariamente aquellos alumnos que no habiendo superado la prueba correspondiente a su grupo, as lo soliciten y sean informados favorablemente por el Profesor responsable de su grupo.

- Los cambios de grupos de prcticas slo se admiten en las siguientes circunstancias:

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* Por razn de incompatibilidad con el horario laboral debidamente justificada y siem-pre que se haga constar con claridad en la ficha de la asignatura.

* Por acuerdo con otra persona que deba tambin realizarlas pero en un turno diferente, hacindolo constar igualmente muy claramente al rellenar la correspondiente ficha por parte de ambas personas.

* Por razones de enfermedad debidamente justificadas.

NNOORRMMAASS YY RREEGGLLAASS EENN EELL LLAABBOORRAATTOORRIIOO DDEE MMIICCRROOBBIIOOLLOOGGIIAA

Por escaso que sea el nivel de conocimientos que se posea de esta asignatura, cual-

quiera puede imaginarse fcilmente que en el trabajo cotidiano en un laboratorio de Microbio-loga, uno de los problemas que hay que cuidar es el de las contaminaciones con microorga-nismos no deseables, ya que su presencia en un cultivo es origen, en el mejor de los casos, de errores en las pautas de identificacin, cuando no atentan contra la seguridad del microbilo-go y de su entorno. Por este motivo, se deben respetar y cumplir unas reglas esenciales:

A - Evitar la contaminacin del material a estudiar. B - Evitar la contaminacin por el material a estudiar.

Las normas bsicas de actuacin se concretan en:

1.- Del microbilogo:

1.1 La prenda adecuada para trabajar en un laboratorio de Microbiologa es la bata blanca, que debe estar siempre limpia y usarse slo en el interior de los laboratorios. 1.2 Normas generales de higiene:

* Limpieza de manos antes y despus del trabajo. * Si la longitud de los cabellos es notable, stos debern estar recogidos.

1.3 Normas generales de comportamiento: * El material, mobiliario y dems utensilios deben cuidarse con el mayor es-mero. * No se puede fumar, beber o comer en el laboratorio bajo ningn concepto. * Hay que evitar desplazamientos intiles y movimientos bruscos.

2.- Del lugar de trabajo:

2.1 Cada alumno dispone de un puesto de trabajo en el que podr encontrar:

* Un papel de filtro que cubre el lugar de trabajo. * Un mechero de gas emplazado en el centro. El mechero debe permanecer en-cendido durante la realizacin de los experimentos que requieran su utiliza-cin, apagndose cuando no sea necesario. * Los instrumentos y elementos especficos para la realizacin de cada prctica concreta.

3.- Del trabajo:

3.1 No se debe comenzar el trabajo hasta haber recibido las instrucciones precisas. 3.2 Se deben preguntar siempre todas las dudas que aparezcan antes de realizar el traba-

jo.

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3.3 La mayor parte de los instrumentos que se utilizan deben ser y permanecer estriles, por lo cual se manejan siempre en una zona aproximada de unos 15 cm alrededor de la llama del mechero encendido.

3.4 La esterilizacin de algunos utensilios (asas de platino, boca de los tubos, etc) se consigue mantenindolos en posicin oblicua sobre la llama. Estas operaciones se realizan siempre antes y despus de utilizar tales instrumentos.

3.5 No se debe dejar nunca el tubo o la placa abiertos ms tiempo del estrictamente ne-cesario, para evitar una posible contaminacin del cultivo. Tampoco se debe depo-sitar el tapn del tubo con el que estamos trabajando sobre la mesa, debindose mantener siempre en la mano hasta el momento de tapar el tubo.

3.6 La organizacin del trabajo vara segn la prctica que se est realizando, pero en general:

* Deben evitarse las precipitaciones. * Deben evitarse riesgos de confusin etiquetando o marcando el material. * Deben evitarse riesgos de contaminacin (evitar contacto de la boca con las

manos, evitar chupar objetos del laboratorio, etc.). * Deben tomarse todas las precauciones posibles para evitar accidentes (corta-

duras, quemaduras, etc.). 3.7 Despus del trabajo, tambin debe seguirse un plan ordenado.

* El material utilizado debe transportarse al lugar donde contine su procesa-miento.

* El material y utensilios utilizados deben ser lavados y esterilizados para su posterior uso o bien eliminarse previa esterilizacin si son de un solo uso.

* El puesto de trabajo debe quedar al final ordenado y limpio, tal como se en-contr al inicio de la sesin.

MMAATTEERRIIAALL DDEE LLAABBOORRAATTOORRIIOO

El material utilizado en un laboratorio de Microbiologa es muy variado y depende fundamentalmente de las lneas de trabajo a las que est dedicado; evidentemente, no se preci-sa el mismo equipamiento en un centro de investigacin con un alto grado de especializacin que en un laboratorio de Bacteriologa Clnica. Por tanto, aqu slo nos referiremos al material bsico que se suele encontrar en un laboratorio mnimamente dotado. A) Material de uso corriente:

* Material de vidrio o plstico que se usa para contener o medir: aqu se incluyen tubos de ensayo, vasos de precipitado, matraces, embudos, probetas, pipetas, dosificadores, etc., todo ello de distintos tamaos y capacidades. Tambin incluimos las placas de Petri, los portaobjetos y cubreobjetos, cmaras de recuento, cestillos y cubetas para efectuar tin-ciones, jarras para incubar en anaerobiosis, etc.

* Material de siembra: constituido principalmente por asas y filamentos de platino, asas de

Drigalski y pipetas estriles. * Material para toma de muestras e inoculaciones: escobillones estriles, tubos y frascos

estriles, jeringas y agujas, trcares, cnulas, catteres y material de diseccin. B) Aparatos productores de calor:

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Se utilizan con diversas finalidades:

* Para esterilizacin: autoclave (calor hmedo), horno Pasteur (calor seco) y mechero Bun-sen (esterilizacin por calentamiento directo).

* Para incubacin: estufas, baos de agua, de aceite o parafina y de arena. C) Aparatos productores de fro:

* Refrigeradores: son indispensables para conservar los medios de cultivo, productos bio-lgicos y patolgicos, as como mantener la supervivencia de algunos mo. Su tempera-tura oscila alrededor de los 4C.

* Congeladores: alcanzan temperaturas entre -20 y -70 C y son indispensables para con-servar determinados productos biolgicos (sueros, clulas, mo).

* Neveras porttiles: para trasladar muestras al laboratorio en condiciones de refrigeracin. D) Material ptico: Es de capital importancia en el laboratorio ya que permite la observacin de los mo..

* Microscopios: en su distintas versiones (campo claro, campo oscuro, contraste de fases, fluorescencia).

* Lupa estereoscpica: permite observar colonias bajo distintas condiciones de ilumina-cin.

E) Otro tipo de material y aparatos:

* Agitadores y homogeneizadores. * Centrfugas. * Balanzas. * Liofilizadores. * pHmetros. * Espectrofotmetros. * Destiladores, etc.

OOBBJJEETTIIVVOO DDEE LLAASS PPRRAACCTTIICCAASS DDEE MMIICCRROOBBIIOOLLOOGGIIAA

Las clases prcticas de Microbiologa tienen como objetivos bsicos los siguientes:

- Familiarizar al alumno con las normas generales de trabajo en el laboratorio. - Iniciarle en el uso de los elementos y medios propios de la asignatura. - Ensearle las tcnicas bsicas empleadas para el estudio de microorganismos.

Aislamiento e identificacin bacteriana. Preparacin e interpretacin de antibiogramas. Anlisis de microorganismos en alimentos. Recuento de bacterias Estudio e identificacin de hongos. Observacin de la patogenicidad celular de virus.

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EESSQQUUEEMMAA DDEE TTRRAABBAAJJOO

A) BACTERIOLOGA

1) Anlisis clnico.

- Recogida de muestras:

* Condiciones de esterilidad * Emisin de informe * Envo rpido al laboratorio

- Anlisis - Aislamiento:

* Medios de cultivo slido * Siembra por agotamiento * Incubacin:

* 37C * 24/48 h * Aerobiosis/anaerobiosis

- Identificacin: * Anlisis macroscpico de colonias * Anlisis microscpico:

- Formas y dimensiones - Tincin de Gram - Estructuras especiales

* Pruebas bioqumicas * Pruebas serolgicas * Identificacin por comparacin de datos * Identificacin por tiras multisustrato

2) Antibiograma

* Preparacin * Interpretacin

3) Anlisis de microorganismos en alimentos

B) MICOLOGIA

* Obtencin de cultivos puros * Pautas de identificacin

D) VIROLOGA

* Efecto citoptico.

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TTOOMMAA DDEE MMUUEESSTTRRAA

Bajo la denominacin de muestra se incluye cualquier elemento orgnico, natural o patolgico, procedente del animal vivo, del cadver, o de su entorno, que sea susceptible de contener microorganismos. Son muestras por tanto, lquidos fisiolgicos (sangre, orina, sali-va, heces), lquidos patolgicos (exudados, pus, esputos, vmitos) y slidos como biopsias o piezas procedentes del cadver; tambin son muestras los alimentos, camas y el propio am-biente en el que se encuentran situados los animales.

Recogida de muestras:

Las muestras deben ser recogidas con la mxima asepsia con el fin de no introducir en ellas microorganismos ajenos al proceso. Esta asepsia se refiere:

* Al proceso y condiciones de la toma de muestras, que debe evitar las contaminaciones. * A los utensilios empleados, que deben estar estriles. * A los recipientes destinados a la recogida y envo al laborato-rio, que igualmente deben estar estriles.

Una vez recogidas, las muestras se deben enviar al laboratorio con la mayor rapidez

posible.

Toda muestra debe ir acompaada de un informe en el cual, de forma ordenada y pormenorizada, se expondrn todos aquellos datos que tengan relacin con la misma y que puedan ser tiles para orientar al laboratorio en su labor analtica. Estos datos suelen ser de ti-po clnico (sintomatologa, lesiones, tratamientos efectuados) y epidemiolgicos (n de anima-les afectados, n de bajas, edad, sexo, tipo de alimentacin, sistema de explotacin, vacuna-ciones, enfermedades ms frecuentes en la zona, etc.).

En el momento de su recepcin en el laboratorio, toda muestra debe ser conveniente-mente identificada a travs de un nmero de orden y de su inclusin en el libro de anlisis.

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PPRREEPPAARRAACCIIOONN DDEE MMEEDDIIOOSS DDEE CCUULLTTIIVVOO

1. Tipos de medios: a) Por su objetivo:

- Aislamiento - Enriquecimiento - Identificacin - Conservacin - Recuento

b) Por su especificidad para los microorganismos:

- Comunes - Selectivos

c) Por su composicin:

- Naturales o empricos - Sintticos - Semisintticos

d) Por su estado fsico:

- Slidos: por el empleo de agentes solidificantes. * Agar:1,5-2 % medios slidos

0,2 % medios semislidos * Gelatina.

- Lquidos

e) Por su forma de almacenamiento y empleo: - En placa - En tubo:* lquido

* slido vertical * slido en pico de flauta

2. Material necesario:

- Preparacin: balanza, matraz, vaso de precipitados, esptula, probetas, tubos, tapones. - Esterilizacin: autoclave/filtracin.

3. Mtodo de preparacin: - Pesar las cantidades fijadas para cada medio de cultivo. - Hidratar con agua destilada hasta el volumen preciso. - Ajustar el valor del pH. - Homogeneizar por calentamiento para una buena solubilizacin de los componentes. - Esterilizacin.

* Por autoclave: material que no se altere por ** Caramelizacin: ciertos azcares. ** Precipitacin: ciertos minerales. ** Desnaturalizacin: ciertas protenas.

* Por tyndalizacin: material que se altere a temperaturas de autoclave. * Vapor fluente. * Filtracin: ** Filtros adaptables a jeringuillas.

** Sistemas de filtros Millipore.

4. Medios incompletos: Son aqullos a los que hay que aadir algn otro componente tras la esterilizacin (normal-

mente es un componente sensible al calor); p.e., yema de huevo, sangre, etc..

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MMEETTOODDOOSS DDEE SSIIEEMMBBRRAA

El primer paso a seguir en la identificacin de un microorganismo es proceder a su ob-tencin en cultivo puro, pues es obvio que las reacciones de cultivos mixtos no podrn ser usadas en la identificacin.

El mtodo ms comn de obtencin de un cultivo puro consiste en tomar una sola co-lonia del medio de aislamiento y proceder a su siembra por agotamiento.

Pauta general: 1. Coger el asa de platino como se indica en la figura 1. 2. Flamear el asa de platino hasta que tome color rojo. Flamear tambin el resto del vstago

(figura 2). 3. Toma de muestra

3.I Si se parte de una muestra lquida (o cultivo lquido): 3.I.a. Agitar el tubo (figura 3). 3.I.b. Destapar el tubo sin depositar el tapn en la mesa (figura 4). 3.I.c. Flamear los bordes del tubo ligeramente (figura 5). 3.I.d. Introducir el asa en el tubo de forma que el extremo quede justo por de-

bajo de la superficie (figura 6). 3.I.e. Esperar a que deje de burbujear y extraer el asa. La pelcula formada es-

tar cargada de microorganismos. 3.I.f. Volver a flamear el tubo. 3.I.g. Poner el tapn.

3.II. Si se parte de un cultivo slido: 3.II.a. Enfriar el extremo del asa en una zona del medio de cultivo donde no

haya crecimiento. 3.II.b. Tomar una colonia bien aislada.

4. Siembra en el medio de cultivo. 4.I. Siembra en medio lquido:

4.I.a. Destapar el tubo sin depositar el tapn en la mesa (figura 4). 4.I.b. Flamear los bordes del tubo ligeramente (figura 5). 4.I.c. Introducir el extremo del asa, previamente cargada en el tubo con medio

lquido y se agita con energa para desprender los microorganismos. 4.I.d. Volver a flamear el tubo. 4.I.e. Poner el tapn.

4.II. Siembra en medio slido: 4.II.a. Tomar una placa de medio slido no utilizada y por tanto estril. 4.II.b. Colocarla sobre la mesa de trabajo de forma invertida de tal forma que

se encuentre el medio de cultivo en la parte superior. De esta forma se puede destapar la placa con una sola mano.

4.II.c. Una vez destapada, se apoya el extremo del asa cargada con microorga-nismos sobre la superficie y se efecta la siembra.

5. Flamear el asa hasta que se ponga incandescente. 6. Rotular las placas o los tubos de forma que se puedan identificar. - Tipos de siembras:

a) Siembra por agotamiento: La finalidad de esta siembra es obtener colonias aisla-das del microorganismo o microorganismos sobre el medio de cultivo slido. Consiste en

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desplazar el asa de platino sobre la superficie del medio slido siguiendo cualquiera de los si-guientes procedimientos:

* En zig-zag: consiste en desplazar el asa por el medio haciendo un movimiento en forma de zeta desde un borde de la placa hacia el opuesto. Cuando se llega al centro de la placa, se levanta el asa y se repite el movimiento empezando por el otro extremo de la misma (figura 7). Este tipo de siembra tambin se puede hacer en tubo con medio slido en pico de flauta.

* En estras: con el asa cargada se trazan dos o tres lineas tangenciales en un

borde de la placa; se flamea el asa, se enfra en una zona no sembrada y de nuevo se trazan dos o tres estras que crucen a las anteriores; este procedimien-to se repite hasta que se completa la superficie de la placa (Figura 7).

b) Siembra en masa: primero se aade un volumen conocido de suspensin de mi-

croorganismos en una placa estril; despus se aaden 10-15 ml de medio de cultivo fundido a 45C, se mezcla el contenido de la placa con movimientos circulares y se deja solidificar.

c) Siembra en superficie: sobre una placa con medio solidificado se deposita una cantidad medida de suspensin de microorganismos y se extiende de forma uniforme con un asa de Drigalski (figura 8).

d) Siembra por picadura: se utiliza el filamento de platino que se introduce de forma vertical en un tubo con medio slido (figura 9).

e) Siembra por inundacin: sobre una placa con medio solidificado se vierte una suspensin densa de microorganismos de forma que "se inunde" toda la placa. Se espera unos 15 minutos para que se adsorban los microorganismos y se elimina el lquido restante guar-dando condiciones de esterilidad.

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TCNICAS DE AISLAMIENTO: TOMA DE MUESTRAS

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Figura 7.- Tcnicas de aislamiento: agotamiento de asa en placa

1. Estras

2. Flameado Enfriar

3. Estras

4. Flameado Enfriar

5. Estras

6. Flameado Enfriar

7. Estras

B.- OBSERVACIN DE LOS RESULTADOS TRAS LA INCUBACIN

A.- PASOS SUCESIVOS DEL AGOTAMIENTO DE ASA EN PLACA

Obtencin de colonias aisladas

OTROS SISTEMAS DIFERENTES DE AGOTAMIENTO DE ASA EN PLACA

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MMEETTOODDOOSS DDEE IINNCCUUBBAACCIIOONN 1. Temperatura:

* Bacterias patgenas: 37C; excepcionalmente otras Tas. * Hongos: ver prctica correspondiente.

2. Atmsfera de incubacin:

* Aerobiosis: trasladar las placas a la estufa e incubarlas de forma invertida (tapa aba-jo; medio inoculado arriba). Los tubos se incuban siempre en posicin vertical. * Microaerofilia:

** Mtodo de la vela: en la jarra se introduce una vela encendida que va con-sumiendo el oxgeno acumulado tras cerrar la jarra. ** Estufa de CO2: permite regular la cantidad de CO2 en la atmsfera de incu-bacin.

* Anaerobiosis (Mtodo de GasPak): en una jarra de anaerobiosis junto a las placas o tubos se introduce un preparado comercial que produce H2, el cual se combina con el O2 y produce agua.

OOBBSSEERRVVAACCIIOONNEESS MMAACCRROOSSCCOOPPIICCAASS

A) Crecimiento en medio slido: las clulas microbianas se reproducen habitualmente con tal rapidez que en 18 - 24 horas dan lugar a la aparicin de masas visibles de clulas sobre me-dios slidos que se denominan colonias. Cada colonia se considera que est formada por un nico tipo de microorganismo.

Las colonias tienen una morfologa caracterstica que se estudia a simple vista o con la ayuda de una lupa. Los caracteres ms importantes de las colonias y cuyo estudio tiene inters en la caracterizacin son los siguientes:

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1. Forma: Puede ser puntiforme, circular, irregular, filamentosa, rizoide u ovalada 2. Tamao: Se mide en mm. Se dice que es puntiforme si mide menos de 1mm. 3. Elevacin: Vistas de perfil las colonias pueden ser plana, elevada (o en relieve), convexa, pulvinada (ms elevada que convexa), mamelonada (con una protuberancia central), o umbili-cada (con una depresin central). 4. Forma del borde: Puede ser entero, ondulado, lobulado, dentado (o aserrado), filamentoso, y rizado. 5. Superficie: * Lisa * Rugosa * Mate * Brillante * Transparente * Opaca 6. Color:

Presencia de colores caractersticos y difusin de pigmentos en el medio. 7. Capacidad de emulsin en agua:

* Forma una suspensin uniforme * Forma una suspensin grumosa * No se emulsiona

B) Crecimiento en medio lquido: tiene inters los siguientes aspectos: 1. Cantidad de crecimiento:

* Ninguna * Escasa * Moderada

* Abundante. 2. Crecimiento en la superficie:

* Positivo * Negativo

* Formacin de un anillo * Pelcula superficial que se desintegra o no al agitar

3. Turbidez:

* Uniforme * Floculante * Negativa

4. Depsito en el fondo del tubo:

* Ausente * Granular * Floculante * Viscoso * Se desintegra o no al agitar

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OOBBSSEERRVVAACCIIOONNEESS MMIICCRROOSSCCOOPPIICCAASS

El ndice de refraccin de las bacterias es similar al medio que las rodea y por tanto son difciles de ver al microscopio. En cambio son qumicamente muy diferentes; estas dife-rencias son las que permiten distinguir las bacterias por medio de TINCIONES. Las tinciones son de dos tipos:

a) Tinciones simples: Son aqullas que utilizan un solo colorante. Muestran la forma, el tamao y la ordenacin de las bacterias.

b) Tinciones diferenciales: Son aqullas que utilizan dos o ms reactivos. Con ellas se pueden observar diferencias entre clulas o partes de clulas. Las ms importantes son:

1. Tincin de Gram. 2. Tincin de microorganismos cido-alcohol resistentes (Ziehl-Neelsen). 3. Tincin de estructuras.

- Tincin de esporos. - Tincin de flagelos. - Tincin de cpsulas.

Los principales pasos para realizar una tincin para su posterior examen microscpico son: 1. Extensin:

* A partir de un caldo de cultivo. Con un asa de platino se coloca una gota de caldo en el portaobjetos y se extiende con movimientos circulares (figura 10).

* A partir de una colonia en medio slido. Con el asa de platino se toma una gota de agua que se deposita en el portaobjetos; despus se toma una colonia, se mezcla y se extiende como antes (figura 11).

2. Secar: dejando la preparacin al aire hasta la evaporacin 3. Fijacin:

Tiene como objeto fijar los microorganismos al portaobjetos por la llama hasta que se seque, sin calentar demasiado (figura 12). El calor excesivo alterara la forma normal y la es-tructura de los microorganismos que se van a teir. El portaobjetos debe notarse caliente, pero no debe quemar cuando se coloca sobre el dorso de la mano. 4. Tincin: En funcin del objetivo existen distintos procedimientos de tincin.

Tincin de Gram Cuando se emplea este mtodo de tincin, debido a diferencias en la pared celular, las

bacterias se dividen por lo general en dos grandes grupos, segn retengan o no el colorante primario ("GRAMPOSITIVAS" o "GRAMNEGATIVAS" respectivamente) tras sufrir la ac-cin de un decolorante.

En esta tcnica se emplean cuatro reactivos diferentes: METODO: * Un colorante primario (violeta de genciana) durante tres minutos.

* Lavar con agua. * Un mordiente (lugol) durante dos minutos.

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* Lavar con agua. * Un agente decolorante (alcohol-acetona) durante diez segundos. * Lavar con agua. * Un colorante de contraste (safranina) durante treinta segundos. * Lavar con agua y secar sobre un papel de filtro.

(figuras 13, 14 y 15) Las clulas que retienen el colorante primario se denominan "GRAMPOSITIVAS"

(color violeta) y las que se decoloran con el alcohol-acetona y se tien posteriormente con la safranina reciben el nombre de "GRAMNEGATIVAS" (color rojizo).

* Observar al microscopio con el objetivo de inmersin (punto 4).

Tincin de esporos Las bacterias de algunos gneros forman endosporos que son estructuras muy resisten-

tes a las altas temperaturas, a la falta de humedad y a la accin de productos qumicos. Los endosporos son tambin resistentes a la penetracin de colorantes utilizados en Bacteriologa y por tanto en una extensin teida segn el mtodo de Gram se pueden distinguir como zo-nas incoloras en el interior de las formas vegetativas de las bacterias Gram positivas. Sin em-bargo, una vez teidas su decoloracin suele ser difcil. METODO (Bartolomew y Mittwer)

* Se prepara una extensin en la forma habitual y se fija intensamente al calor para lo cual se pasa unas veinte veces por la llama.

* Se cubre la extensin durante 10 minutos con solucin acuosa saturada de verde ma-laquita, calentando hasta la emisin de vapores.

* Se lava con agua y se aade safranina durante 30 segundos, se lava con agua y se seca con papel de filtro.

* Observar al microscopio con el objetivo de inmersin Segn este mtodo de tincin, los endosporos se tien en verde, pero el resto de la clula (o la clula que no posee endosporos) se tie de rojo dbil.

Tincin de cpsulas Los mtodos ordinarios de tincin no colorean la cpsula, aunque a veces se puede ob-

servar una zona clara rodeando al organismo teido. Para demostrar la presencia de cpsulas se emplea generalmente la tincin negativa con tinta china o nigrosina. METODO

* Depositar una gota de tinta china o nigrosina sobre un portaobjetos. * Mezclar con ella una colonia procedente de un medio slido, con ayuda del asa de pla-

tino. * Cubrir con un cubreobjetos, evitando la formacin de burbujas de aire. Presionar con

fuerza entre papel de filtro para eliminar los restos de tinta china que puedan enturbiar la observacin.

* Examinar al microscopio con el objetivo de inmersin

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Las bacterias con cpsula aparecen rodeadas de una zona clara destacando del fondo gris os-curo. Las bacterias no capsuladas no presentan esta zona clara. 5. Observacin al microscopio con el objetivo de inmersin METODO

* Depositar en la preparacin una pequea gota de aceite de inmersin. De esta forma se reduce la refraccin de los rayos de luz al pasar del portaobjetos al aire, consiguin-dose que un mayor nmero de ellos penetren en el objetivo (figura 16).

* Colocar el portaobjetos en la platina. * Elevar el condensador del microscopio al nivel de la platina para lograr el mximo de

luz. * Bajar el objetivo de inmersin hasta que contacte con la gota de aceite y enfocar hasta

observar la morfologa del microorganismo.

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Rayos no refractados Aceite de inmersin Rayos de luz refractados

Aire Preparacin

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MMOORRFFOOLLOOGGIIAA DDEE LLAASS BBAACCTTEERRIIAASS

Las bacterias presentan una amplia diversidad de tamaos y de forma muy general pueden aparecer bajo la luz del microscopio ptico o electrnico con morfologa esfrica (co-cos), alargada (bacilos), y espiral (espiroquetas).

Los cocos libres aparecen como clulas esfricas aisladas, en pares como DIPLOCO-COS, en cadenas como ESTREPTOCOCOS, o dependiendo de los planos de divisin, en te-tradas o en grupos arracimados.

Los bacilos pueden variar considerablemente en longitud desde los que son muy cor-tos, a veces denominados COCOBACILOS, hasta los bacilos largos que varan en longitud de dos a diez veces su dimetro. Los extremos de los bacilos pueden ser suavemente redondea-dos, o cuadrados. Las largas hileras aisladas se conocen como FILAMENTOS. Los bacilos bacterianos fusiformes, que aparecen en la cavidad bucal e intestinal, son aguzados en ambos extremos.

Los bastones curvos, o ESPIRILOS, varan desde microorganismos pequeos, en for-ma de coma, o levemente helicoidales con una sola curvatura, o en forma de espiroquetas ms largas y sinuosas.

FIGURA 17: MORFOLOGIA DE LAS BACTERIAS

a-e: cocos a: cocos arracimados b-c: diplococos d: cocos en cadena e: cocos en ttradas

f: cocobacilos g-i: bacilos g: bacilos aislados

h: bacilos en cadenas i: bacilos aislados, en empalizada y formando ngulos

j-k: espirilos

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IIDDEENNTTIIFFIICCAACCIIOONN BBAACCTTEERRIIAANNAA

Los procedimientos para llevar a cabo la identificacin bacteriana van desde los sim-plemente descriptivos (morfologa y tincin), pasando por las pruebas bioqumicas simples para deteccin de productos metablicos o de una determinada reaccin enzimtica, llegando hasta tcnicas muy sofisticadas como puede ser el clculo del porcentaje G+C en bacterias o el empleo de sondas de ADN.

Un proceso exhaustivo de identificacin bacteriana incluira los siguientes pasos: 1 Caractersticas macroscpicas. 2 Caractersticas microscpicas. 3 Condiciones de crecimiento.

4 Propiedades bioqumicas. 5 Susceptibilidad a los antibiticos.

6 Estructura antignica (serotipia) y fagotipia. 7 Composicin qumica. 8 Produccin de bacteriocinas. 9 Patogenicidad. 10 Composicin del ADN.

Las pruebas bioqumicas nos indican una serie de caractersticas metablicas que, en

conjunto, nos permitirn diferenciar unas bacterias de otras). Existe un gran nmero de estas pruebas, por lo que en un problema concreto nos decantaremos por la realizacin de una u otra prueba bioqumica basndonos en:

* Origen de la cepa: de dnde la hemos aislado. * Condiciones bajo las que ha sido aislada. * Morfologa. * Tincin, especialmente la de Gram. * Posibilidad de formacin de esporos. * Posibilidad de formacin de cpsula.

Segn los resultados obtenidos de la observacin de estos parmetros, una vez consul-

tada la bibliografa sobre taxonoma bacteriana, el amplio espectro bacteriano, va a quedar restringido a unos pocos gneros, por lo que el siguiente paso ser realizar las pruebas bio-qumicas que nos ayuden a quedarnos con uno solo de ellos, y posteriormente llegar a la de-terminacin de especie.

Es muy importante comprender que estas pruebas no han sido elegidas al azar, sino siguiendo una pauta detallada con objeto de escoger aquellas que nos van a llevar a la identificacin de especie lo ms rpidamente posible.

Son muchas las pruebas bioqumicas descritas, y es evidente que en cada caso intenta-remos realizar las menos posibles, siempre y cuando stas nos lleven a una completa y segura identificacin.

En la realizacin de pruebas bioqumicas hay que tener en cuenta que no todos los miembros de una determinada especie bacteriana reaccionarn de la misma manera: Se pro-ducen variaciones, y esto habr que recordarlo cuando se interpreten los cuadros para identifi-cacin de bacterias. Al comparar los resultados obtenidos con un grupo tabulado de resultados patrn, se debe utilizar el criterio de "aproximacin mxima": si un microorganismo se desva de lo normal en uno o dos resultados de una batera de pruebas segn la tabla patrn, ello no supone que necesariamente haya que descartarlo de esa especie.

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Los resultados definidamente positivos (+) o negativos (-) son aquellos en que como

mnimo el 90% de las cepas de esa especie reaccionan de esa manera, mientras que los Varia-bles (V) se refieren al hecho de que un 11 a 89% pueden hacerlo en uno u otro sentido, por lo que no debe confiarse en stos para los fines de identificacin.

Las tablas siguientes son un resumen de las que se pueden encontrar en cualquier ma-nual de identificacin bacteriana y que nos servirn para identificar los microorganismos uti-lizados durante la primera semana de prcticas as como los empleados en el supuesto prcti-co.

NO fermentativos, inmviles: G. Neisseria / Brahamella (Tabla VIII)

No fermentativos Fermentativos

COCOS

BACILOS

OXIDASA (CATALASA +) F. Enterobacteriaceae (Tabla XIV)

OXIDASA+ OXIDASA G. Acinetobacer (Tabla XI)

OXIDASA + Mviles/curvados: F. Vibrionaceae (Tabla XII)

CATALASA+ Inmviles/cocobacilos: G. Pasteurella / Mannheimia (Tabla XIII)

KLI

GLE

R

Ferm. Gluc. +: G. Staphylococcus (Tabla I)

Ferm. Gluc. -: G. Micrococcus (Tabla I)

COCOS BACILOS

CATALASA + CATALASA -

ClNa 6% + : G. Enterococcus (Tabla II)

ClNa 6% - : G. Streptococcus y Lactococcus (Tabla II)

CATALASA +

CATALASA -

BA

CTE

RIA

S G

RA

M +

B

AC

TER

IAS

GR

AM

-

Bacilos/cido de glucosa: G. Pseudomonas (Tabla IX) Cocobacilos/no cido de glucosa G. Bordetella (Tabla X)

G. Salmonella

G. Shigella

G. Enterobacter

G. Yersinia

G. Escherichia

G. Klebsiella

G. Enterobacter

G. Yersinia

Regulares/pequeos: G. Listeria (mvil a 22C, inmvil a 37C) (Tabla VII)

Regulares/grandes: G. Bacillus (Tabla V) MVILES

INMVILES G. Corynebacterium (Tabla III)

G. Clostridium (Tabla VI)MVILES

G. Erysipelothrix (Tabla IV) INMVILES

G. Salmonella

G. Proteus

G. Edwarsiella

G. Citerobacter

G+ L+ Gas+ SH2-

G+ L- GasV SH2+

G+ L- GasV SH2-

G+ L+ Gas+ SH2V+

24

Crecimiento MacConkey

Metabolismo Gneros BA

CTE

RIA

S G

RA

M N

EGA

TIV

AS

CO

CO

S (c

oco-

baci

los)

Negativo Oxidativo Cat+/Ox+

Neisseria spp. Branhamella spp.

Positivo Oxidativo o no reactivo Cat.+/Ox-

Acinetobacter spp. B

AC

ILO

S

Negativo Oxidativo Cat+/Ox+

Flavobacterium spp.

Fermentativo Cat+/Ox+

Pasteurella spp. (la mayora)

No reactivo Cat+/Ox+

Brucella spp. Haemophilus spp. Pasteurella anatipestifer Taylorella equigenitalis

No reactivo Cat+/-/Ox+/-

Moraxella spp. Campylobacter spp.

No reactivo Cat+/Ox-

Francisella tularensis

Positivo Oxidativo Cat+/Ox+

Pseudomonas spp. (la mayora) Burkholderia cepacia

Fermentativo Cat+/Ox+

Aeromonas spp.* Pasteurella heamolytica* Plesiomonas spp.*

Fermentativo Cat+/-/Ox+/-

Actinobacillus spp.

Fermentativo Cat+/Ox-

Enterobacteriaceae* Pasteurella caballi

No reactivo Cat+/Ox+

Bordetella spp.* Alcaligenes spp.*

BAC

TER

IAS

GR

AS

POSI

TIV

AS CO

CO

S

Oxidativo Cat+/Ox+/-

Micrococcus spp.

Fermentativo Cat+/Ox-

Staphylococcus spp.

Fermentativo Cat-/Ox-

Streptococcus spp.

No reactivo Cat+/Ox-

Rhodococcus equi

BA

CIL

OS

Oxidativo Cat+/Ox-

Nocardia asteroides (algunos) Bacillus spp.* (algunos)

Fermentativo Cat+/Ox-

Actinomyces viscosus Bacillus spp.* (algunos) Corynebacterium spp. Listeria spp.*

Fermentativo Cat-/Ox-

Actynomyces spp.** (la mayora)Actinomyces pyogenes Erysipelothrix spp. Clostridium spp.**/* Eubacterium spp.** Lactobacillus spp.

No reactivo Cat+/Ox-

Rhodococcus equi

Cat=catalasa; Ox=oxidasa; +: reaccin positiva; -: reaccin negativa; V= variable; *=mvil; **=anaerobio

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TABLA I. FAMILIA Micrococcaceae

Gnero Staphylococcus Gnero Micrococcus

S. intermedius S. aureus S. simulans S. epidermidis M. luteus M. roseus M. variansNitratos + + + V+ - + + Motilidad - - - - - V + O/F glucosa F F F F O O O

Manitol V + + - + + + Maltosa - + - + - - V Coagulasa + + - - - - - V.P. - + - V+ - - - DNAsa + + - - - - - Lecitinasa + + + dbil - - - - Ureasa + V+ + + V - +

O: Oxidativo; F: Fermentativo; V+: Mayora de cepas positivas; V: Variable. TABLA II. Gneros Streptococcus, Enterococcus y Lactococcus

Hemlisis CAMP Hidrlisis ClNa

6,5% V.P. Acidificacin

Esc. Hipur. Arg. Sal. Raf. Sorb. Lac. Man. Rib. S. agalactiae , ,no + - + + - + V+ - - V- - + S. dysgalactiae , no - - - + - - - - - + - + S. uberis , no - + + + - + + - + + + + S. suis no + - ND - - + - - + - ND S. bovis , no - + - - - + + + - V+ V - L. garvieae - + - + - + + - - V- V+ + L. piscium No - + ND - - ND + + - + + + E. faecalis ,no - + (+) + + + + - + + + + E. faecium , no - + + + + + + - - + (+) + E. hirae No - + - + + + + D - + - +

hemlisis = incompleta; hemlisis = completa; Esc: esculina; Hipur: hipurato; Arg: arginina; V.P. Voges Proskauer; Sal: salicina; Raf: rafinosa; Sorb: sorbitol; Lac: lactosa; Man: manitol; Rib: ribosa; V+: Mayora de cepas positivas; V-: Mayora de cepas negativas;V: Variable. TABLA III. GENERO Corynebacterium

Nit. Ureasa Esculina Fermentacin

Gluc. Sac. Manit. Xyl. Malt. Rib. C. pseudotuberculosis V + - + - - - + + C. renale - + - + - - - - + C. bovis - V- - V+ - - - - - C. urealyticum - + - - - - - - - Nit. = reduccin nitratos; Glu = glucosa; Sac: sacarosa; Manit: manitol; Xyl: xylosa; Malt: maltosa; Rib: ribosa; V+: Mayora de cepas positivas; V-: Mayora de cepas negativas;V: Variable.

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TABLA IV. GNERO Erysipelothrix E. inopinata E. rhusiopathiae E. tonsillarum Lactosa - + - Ribosa V+ - + Trehalosa + - - Arabinosa - + V+ V+: Mayora de cepas positivas TABLA V. GNERO Bacillus

B. a

nthr

acis

B. c

ereu

s

B. m

egat

eriu

m

B. su

btili

s B.

pum

ilus

B. li

chen

iform

is

B. p

olim

ixa

B. st

earo

ther

mop

hi-

lus

B. c

oagu

lans

B. a

lvei

B. b

revi

s Motilidad - V+ + + + + + + + V+ + Nitratos + + V + - + + V V - V

V.P. + + - + + + + - V + -

O/F F F O O O F F F F F O Lecitanasa + + - - - - - - - - - Arabinosa - - V + + + + V V - - Xilosa - - V + + + + V V - - Manitol - - V + + + + V V - V Crecimiento Anaerobiosis + + + - - + + V + + + O: Oxidativo; F: Fermentativo; V+: Mayora de cepas positivas; V: Variable. TABLA VI. GNERO Clostridium

C. tetani C. perfringens C. botulinum tipos

C. difficile C. septicum I II III

Motilidad V - V + V V+ V+ Indol V- - - - V- - - Lecitinasa - + - - V - - Nitratos - + - - - - V+ Esculina - V+ + - - + + Hemlisis + V + + + - + Morf.esporos RT OS OS OS OS OS OS RT: Redondos/Terminales; OS: Ovales/Subterminales; V+: Mayora de cepas positivas; V-: Mayora de cepas negativas; V: Variable.

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TABLA VII. GENERO Listeria -

Hemlisis Test de CAMP Reduccin

Nitratos Acidificacin de azcares

R. equi S .aureus D-Manitol L-Ramnosa D-Xilosa L. monocytogenes + + C + - - + - L. ivanovii ++ + P - - - - + L. seeligeri + + c + - - - + L. innocua - - - - - +/- - L. welshimeri - - - - - +/- + L. grayi - - - +/- + -/+ -

C: En forma de cerilla. P: En forma de pala. c: En forma de cerilla, dbil. TABLA VIII. GNEROS Moraxella, Brahamella y Neisseria

M. b

ovis

M. l

acun

ata

M. p

heny

lpru

vica

B. c

atar

rhal

is

B. o

vis

B. c

unic

uli

N. c

anis

N. f

lave

scen

s

N. l

acta

mic

a

Morfologa cb cb cb c c c c c c Hemlisis V+ - - - + - - - - MacConkey - - V+ - - - - - - Oxidasa + + + + + + + + + Catalasa V+ + + + + + + + + Red. Nitratos - + V+ + + - + - - Ureasa - - + - - - - - - C: Cocos. cb: Cocobacilos. V+: Mayora de cepas positivas. TABLA IX. GNEROS Pseudomonas y Burkholderia P. aeruginosa P. fluorescens P. putida B. cepacia

MacConkey crece crece crece crece Nitratos + - - V- Citrato + + - + Lecitinasa - + - No relevante Pigmentacin verde verde V no Acidificacin:

Maltosa - - - + Glucosa + + + + Lactosa - - - + Manitol V + - +

V-: Mayora de cepas negativas; V: Variable.

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TABLA X. GNERO Bordetella B. avium B. bronchiseptica B. parapertussis Movilidad + + - MacConkey + + + Hemlisis - + Reduccin nitratos - + - Ureasa - + + Oxidasa + + - TABLA XI. GNERO Acinetobacter A. baumanni A. calcoaceticus A. lwolffii Hemlisis - - - Citrato + + - cido de glucosa + + - Crecimiento 41-44 C + - - TABLA XII. FAMILIA Vibrionaceae

Gnero Vibrio Gnero Aeromonas Gnero Plesiomonas ClNa 6% + - - Sensibilidad O129 V+ resistente sensible V. fluvialis V. vulnificus A. hydrophila A. salmonicida P. shigelloides Motilidad + + + - + Lisina-DC - + V+ - + Ornitina-DC - V- - - + Nitratos + + + - + Indol + + + - + Arabinosa V+ - + + - Sacarosa V+ - + - -

V+: Mayora de cepas positivas; V-: Mayora de cepas negativas

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TABLA XIII. GNEROS Pasteurella y Mannheimia

P. multocida P. pneumotropica M. haemolytica

MacConkey No crece No crece Crece Indol + + - Ureasa - + - ONPG V- + + Ornitina-DC V+

- + -

V- + -hemlisis

Acidificacin: Manitol V+ - + Rafinosa - + V+ Lactosa V- V+ V+

V+: Mayora de cepas positivas; V-: Mayora de cepas negativas TABLA XIV. FAMILIA Enterobacteriaceae

Citrobacter Enterobacter Escherichia Klebsiella Salmonella Proteus Yersinia

C. d

iver

sus

C. fr

eund

ii

E. a

erog

enes

E. a

gglo

mer

ans

E. c

laoc

ae

E. sa

kaza

kii

E. c

oli

K.ox

ytoc

a

K. o

zaen

ae

K. p

neum

onia

e

S. a

rizon

ae

S. g

allin

arum

P. m

irabi

lis

P. v

ulga

ris

Y. e

nter

ocol

itica

Y. ru

cker

i

Indol + - - V - V- + + - - - - - + V - Rojo M + + - V+ - - + - + + + + + + V.P. - - V+ V + + - V - - - - - - - V- Citrato + V+ V+ + + + - + - V+ + - V - - V- Urea - - - - - - - + - V+ - - + + + - ADH V - + - V+ + - - - - + - - - - - Lisina-DC - - - - - - V + - + + + - - - + Ornitina-DC + - + - + + V- - - - + - + - + + Movilidad + + + + + + + - - - + + + + - - Lactosa + V + V- + + + + + + V- ND - - - - ONPG + + + + + + + + + + + - - - + V

V+: Mayora de cepas positivas; V-: Mayora de cepas negativas; V: Variable; ND:No determinado

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TTIIRRAASS MMUULLTTIISSUUSSTTRRAATTOO

Dentro de las tiras multisustrato, el sistema API es un mtodo rpido de identificacin microbiana mediante el empleo de pruebas bioqumicas estandarizadas y miniaturizadas.

Cada tira API consta de un nmero variable de microtubos que contienen los sustratos deshidratados. Existen varios tipos de sistemas API compuestos por diferentes combinaciones de pruebas bioqumicas, con el objeto de identificar correctamente los diversos grupos micro-bianos. Los tipos de sistemas API ms utilizados son:

* API 20 E. Identificacin de Enterobactiaceae y otros Gram negativos. * API 20 A. Identificacin de bacterias anaerobias. * API Strep. Identificacin de Streptococcus. * API Staph. Identificacin de Staphylococcus. * API 50 CH. Estudio del metabolismo de hidratos de car-bono. * API Z. Deteccin de Salmonella, Shigella y Yersinia. * API S. Deteccin de enterobacterias. * API 20 EC. Deteccin de enterobacterias coliformes. * API 20 NE. Identificacin de Gram negativos no enterobacterias. * API 20 C AUX. Identificacin de levaduras. * API 20 B. Deteccin de bacterias hetertrofas anaerobias. * API ZYM. Estudio de actividades enzimticas. * API 10 M 5 FC. Deteccin de levaduras.

Los componentes del sistema API son:

* Tira o galera con pruebas bioqumicas. * Cmara de incubacin. * Medio de suspensin. Unicamente se provee en los casos en que se requiere un medio especial, en el resto la suspensin se realiza en solucin salina est-ril. * Hoja de resultados.

Deben conservarse en refrigeracin (2-8C) y utilizarse antes de la fecha de caducidad

indicada en el envase.

Modo de empleo 1. Preparacin de la cmara de incubacin. Se aade agua (unos 5 ml) en los alveolos de

la base de la cmara, con el fin de proporcionar una atmsfera hmeda. 2. Preparacin del inculo. Tomar colonias del microorganismo a analizar y diluirlas

homogneamente en un medio de suspensin mediante agitacin. 3. Inoculacin de la tira. Se utilizarn micropipetas o puntas de pipeta estriles. Deben

llenarse los microtubos de cada prueba bioqumica, evitando la formacin de burbujas. En caso de que el nombre abreviado de la prueba aparezca rodeado por tres barras (p.ej. |CIT ), tambin debe llenarse la cpula del microtubo, y si aparece subrayado (p.ej. ADH), la cpula debe completarse con aceite de parafina o de vaselina estril.

4. Incubacin. Introducir la tira en la cmara de incubacin. La temperatura y condicio-nes de aerobiosis o anaerobiosis dependern del anlisis. El tiempo normal de incuba-cin es de 18-24 horas, en caso de que las reacciones sean dudosas debe reincubarse durante otras 24 horas.

5. Lectura de resultados. Se aadirn reactivos en las pruebas que necesiten revelado. Se anotarn en la hoja de resultados las pruebas positivas y negativas (en las hojas hay algunas pruebas que deben hacerse aparte, p.ej. catalasa, motilidad, oxidasa, creci-miento en agar McConkey, etc., que tambin deben anotarse).

6. Identificacin. Mediante el empleo del programa de ordenador Apilab Software. Tam-bin pueden utilizarse tablas y manuales especficos para sistemas API.

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AANNTTIIBBIIOOGGRRAAMMAA

Podemos definir en lneas generales como agentes antimicrobianos a aquellas sustan-cias que inhiben el crecimiento de los microorganismos o producen suinactivacin. Por lo tan-to, y dependiendo de la accin que dichos agentes ejercen sobre los microorganismos, pode-mos dividirlos en:

* Agentes microbiostticos: son aquellos en los que la inhibicin del crecimiento que producen desaparece cuando dejan de actuar sobre el microorganismo.

* Agentes microbicidas: son aquellos que producen una accin letal irreversible sobre los microorganismos.

Dependiendo de su naturaleza y procedencia, las sustancias antimicrobianas pueden ser productos qumicos de sntesis o bien productos naturales producidos por microorga-nismos u otros organismos vivos. A estos ltimos se les considera Antibiticos si bien algu-nos de ellos, que fueron primero descubiertos en la naturaleza, se obtienen en la actualidad sinttica o semisintticamente, de una forma ms sencilla y barata. Entre las sustancias anti-microbianas qumicas de sntesis se ha englobado dentro del concepto de Quimioterpico a aquellas que pueden interferir directamente en la proliferacin de los microorganismos a con-centraciones toleradas por el husped. Por lo tanto, al ser sustancias que poseen una toxicidad selectiva, pueden utilizarse teraputicamente (de ah su nombre) para inhibir a un determinado microorganismo sin ocasionar lesiones importantes en el hospedador.

Esta serie de propiedades (toxicidad selectiva, especificidad y extremada actividad) justifican la aplicacin de este tipo de sustancias en la clnica cuando las defensas corporales no bastan para que el individuo supere la enfermedad. De esta manera, el individuo puede re-cuperarse sin consecuencias graves, permitiendo la destruccin o eliminacin del agente etiolgico sin excesivos riesgos (o por lo menos menores que los producidos por la infeccin) en el hospedador.

La resistencia bacteriana a quimioterpicos y antibiticos tom su verdadera impor-tancia cuando se comprob la posibilidad de su adquisicin por mecanismos de transforma-cin, conjugacin y transduccin. De esta manera se obtiene la resistencia a gran cantidad de antibiticos y quimioterpicos al contactar cepas patgenas con cepas saprofitas que, al ser huspedes habituales del hombre y los animales, estn continuamente expuestas a gran canti-dad de estas sustancias. El suministro de estos agentes antimicrobianos a los animales y hom-bre provoca la seleccin (que no el acostumbramiento) de los mutantes resistentes a estas sus-tancias. Si esta resistencia es extracromosmica, puede ser transferida a otros microorganis-mos menos frecuentes y ms patgenos.

VALORACION DE SUSTANCIAS ANTIMICROBIANAS: ANTIBIOGRAMA

La accin de los agentes antimicrobianos debe estudiarse sobre cultivos "in vitro" del agente en cuestin. Con los datos obtenidos puede planificarse la posible utilidad teraputica del producto ensayado.

Entre estos datos puede ser interesante conocer los tipos de microorganismos sobre los que acta un antibacteriano (espectro antimicrobiano), las concentraciones necesarias para inhibir el crecimiento de un microorganismo (sensibilidad), el efecto de las condiciones am-bientales sobre la sensibilidad (pH, temperatura, etc.), si posee accin microbicida o micro-biosttica, etc.

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Uno de los datos que ms se maneja a nivel clnico y que ms trascendencia tiene es el de la sensibilidad; para calcularla se enfrentan los microorganismos problema a diversas con-centraciones de sustancias antibiticas o quimioterpicas. Mediante este sistema definimos la Concentracin Mnima Inhibitoria (CMI) que es la menor concentracin de una sustancia que es capaz de inhibir el crecimiento visible de un microorganismo.

La realizacin de esta tcnica es lo que se conoce como antibiograma, permitiendo el conocimiento de la CMI y la posible aplicacin teraputica, para cada caso clnico en particu-lar, de la sustancia adecuada a la dosis correcta.

Para la realizacin del antibiograma se pueden utilizar varias tcnicas, siendo la ms difundida y sencilla el Tcnica de Difusin en Agar, que a continuacin se detalla.

ANTIBIOGRAMA POR TECNICA DE DIFUSION EN AGAR

Esta prueba consiste en enfrentar a un microorganismo a diversas sustancias antimi-crobianas a una concentracin determinada para establecer la sensibilidad o resistencia de di-cho microorganismo a las mismas. Hay que sealar que el antibiograma se debe realizar con un solo tipo de microorganismo cada vez, es decir, con un microorganismo en cultivo puro, no debindose utilizar una poblacin mixta de microorganismos para realizar el antibiograma. Por tanto, debern realizarse tantos antibiogramas como microorganismos significativos en-contremos en la muestra clnica.

* Medio de cultivo: el medio que se utiliza es el Mueller-Hinton. Las placas se secan 30 minutos a 37C antes de su empleo.

* Inculo: la cepa que se estudia se cultiva durante 24 horas en medio de cultivo sli-do, normalmente a la temperatura de 37C; posteriormente se realiza una suspensin en solu-cin salina estril, de manera que obtengamos aproximadamente una concentracin de 106 de bacterias/ml.

* Discos de antibiticos. Tcnica:

1. Siembra: se realiza una siembra por inundacin, utilizando 3-5 ml de la dilucin preparada. Se deja reposar 5 minutos. Posteriormente se elimina el sobrenadante inclinado la placa en varias direcciones, para dejar secar la placa durante 10 minutos a 37C en posicin invertida.

2. Aplicacin de los discos antibiticos: los discos se ponen a unos 15 mm de la peri-feria de la placa con ayuda del aplicador, apretando ligeramente los discos que no hayan en-trado totalmente en contacto con el medio usando para tal fin el asa de platino esterilizada a la llama. Se pueden colocar aproximadamente 6 discos por placa, teniendo en cuenta que las zo-nas de inhibicin de los diferentes discos no deben entrecruzarse para que se puedan efectuar la lectura de los dimetros de los halos de inhibicin en varias direcciones.

3. A continuacin se dejan secar las placas de 15 a 30 minutos a temperatura ambiente para que se sequen por completo.

4. Incubacin de las placas a 37C durante 18-24 horas.

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Tras este periodo se observar el crecimiento bacteriano y los halos de inhibicin, si los hubiera.

* Lectura de la zona de inhibicin: se mide el dimetro (en milmetros) de la zona de inhibicin con una regla o comps (Figura 18). Cuando el borde no es neto, la lectura se reali-za en la zona que corresponda aproximadamente al 80% de inhibicin. Ciertos antibiticos producen a veces extensas colonias perifricas que no hay que tener en cuenta en la medicin del dimetro si stas son escasas.

* Interpretacin del antibiograma: se comparan los dimetros de los halos de inhibi-

cin producidos por cada uno de los antibiticos utilizados con los que se detallan en la Tabla 1 adjunta. En esta tabla se relacionan las zonas de inhibicin con la potencia de los discos y la sensibilidad bacteriana, por lo que debemos asegurarnos que la potencia de los discos que re-fleja la tabla coincide con la usada por nosotros.

Para el uso clnico se han clasificado las bacterias en tres grandes grupos, segn su sensibilidad antibitica:

- Cepa sensible: es aquella que puede ser afectada por un tratamiento a la do-sis habituales por va general.

- Cepa intermedia: es aquella que puede ser afectada por un tratamiento local, mediante un aumento de las dosis por va general, o por una concentracin fi-siolgica particular (orina, bilis, etc.).

- Cepa resistente: es aquella que probablemente no ser afectada con las dosis habituales, sea cual sea el tipo de tratamiento.

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CONSEJOS PARA LA REALIZACION DE UN ANTIBIOGRAMA

1. No se debe realizar el antibiograma sobre una poblacin mixta de microorga-nismos, debindose proceder previamente al aislamiento y cultivo en pureza de los distintos microorganismos encontrados en la muestra clnica, para, posteriormente, realizar un antibio-grama para cada uno de los distintos tipos de microorganismos de significacin clnica halla-dos.

2. No deben incluirse un nmero muy elevado de antibiticos.

3. Hay que realizar las siguientes consideraciones:

3.a. Se debe limitar el estudio de la sensibilidad a los antibiticos a aque-llos que presumiblemente sean activos sobre el microorganismo implicado en el proceso infeccioso. Ha de tenerse en cuenta que, a pesar de que el espectro antibacte-riano es el mismo para una misma familia de antibiticos, los fenmenos de resistencia no son siempre extrapolables a todos los miembros de dicha familia.

3.b. Se deben tener en cuenta las contraindicaciones de la especie animal a

tratar.

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TABLA 1:CRITERIOS PARA ESTABLECER CATEGORAS EN ANTIBIOGRAMAS Antimicrobiano Disco Dimetro (Interpretacin)

S I R Aplicable en: Referencia

cido Nalidxico NA 30g 19 14 18 13 Enterobacterias NCCLS 2002(V) cido Oxolinico OA 2g 11 10 Ampicilina

AM 10g 17 14 16 13 29 - 28 17 - 16 26 19 25 18

Enterobacterias Estafilococos Enterococos Estreptococos (salvo S. pneumoniae)

NCCLS 2002(V)

Amoxicilina AMX 25g 21 14 SFM 2001 Amoxicilina+cla

AMC 30g 20 19 18 14 17 13

Estafilococos Otros organismos

NCCLS 2002(V)

Amikacina AN 30g 17 15 16 14 NCCLS 2002(V) Apramicina APR 40g 14 13 VAV Aztreonam ATM 30g 22 16 21 15 Enterobacterias NCCLS 2002(H) Ceftazidima CAZ 30g 18 15 17 14 Enterobacterias NCCLS 2002(H) Ceftiofur EFT 30g 21 18 20 17 Actinobacillus pleuropneumoniae

Pasteurella multocida Salmonella enterica

NCCLS 2002(V)

Cefotaxima CTX 30g 23 15 22 14 Enterobacterias NCCLS 2002(H) Cefoxitina FOX 30g 18 15 17 14 Enterobacterias NCCLS 2002(H) Ciprofloxacina Cip 5 g 21 16 20 15 Enterobacterias NCCLS 2002(H) Cloranfenicol C 30g 18 13 17 12

21 18 20 17 Salvo Estreptococos Estreptococos (no S. pneumoniae)

NCCLS 2002(V)

Colistina CL 50g 15 < 15 SFM 2001 Doxiciclina D 30g 16 13 15 12 Estafilococos, Enterobacterias y

Pseudomonas NCCLS 2000(H)

Enrofloxacina ENR 5g 23 17 22 16 21 17 20 16

P. multocida, E. coli (Aves) Mannheimia haemolytica, P. multocida y H. somnus (bovino)

NCCLS 2002(V)

Eritromicina E 15g 23 14 22 13 21 16 20 15

Salvo Estreptococos Estreptococos

NCCLS 2002(V)

Estreptomicina S 10g 15 12 14 11 Enterobacterias NCCLS 2002(H) Espectinomicina SPC 100g 14 11 13 10 M. haemolytica, P. multocida y

H. somnus (bovino) NCCLS 2002(V)

Florfenicol FFC 30g 19 15 18 14 M. haemolytica, P. multocida y H. somnus (Bovino)

NCCLS 2002(V)

Flumequina AR 30g 19 14 18 13 Gentamicina GM 10g 15 13 14 12 NCCLS 2002(V) Imipenem IMP 10g 16 14 15 13 NCCLS 2002(V) Kanamicina K 30g 18 14 17 13 NCCLS 2002(V) Lincomicina L 15g 21 < 17 SFM 2001 Marbofloxacina MAR 5g 18 15 17 14 ROSCO Marbofloxacina MAR 5g 18 15 17 14 VTOQUINOL Neomicina N 30g 17 13 16 12 LIOFILCHEM Penicilina

P 10g 29 - 28 15 - 14 28 20 - 27 19

Estafilococos Enterococos Estreptococos (salvo S. pneumoniae)

NCCLS 1999(V)

Sulfafurazol (sul-famidas)

SF 300g 17 13 16 12 NCCLS 2002(V) Tetraciclina TE 30g 19 15 18 14

23 19 22 18 Otros salvo Estreptococos Estreptococos

NCCLS 2002(V)

Tiamulina T 30g 20 16 LIOFILCHEM Tilmicosina TIL 15g 14 11 13 10

11 10 M. haemolytica (Bovino) P. multocida, A. Pleuropneumoniae (Por-cino)

NCCLS 2002(V)

Tilosina TY 30g 20 16 LIOFILCHEM Trimetoprim TM 30g 16 11 15 10 Enterobacterias , Estafilococos NCCLS 2002(H)

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PPRRCCTTIICCAA DDEE VVIIRROOLLOOGGAA INTRODUCCIN

Los virus son agentes infecciosos extraordinariamente pequeos compuestos por pro-tena y un nico tipo de cido nucleico, ARN o ADN pero no ambos. Aquellos que tienen en-voltura, adems poseen lpidos y, en algunas ocasiones, las protenas ms superficiales poseen grupos azcares (glucoprotenas).

Dada su extrema simplicidad estructural, los virus son incapaces de llevar una vida in-dependiente y necesitan parasitar clulas que les van a aportar aquellos materiales de los que carecen y van a permitir su replicacin. Por lo tanto, en el ciclo de vida de los virus se puede hablar de dos fases: a) fase extracelular, en la que actan como partculas inertes sin actividad metablica algu-

na, simplemente para pasar de clula a clula; b) fase intracelular, en la cual desarrollan su ciclo de vida, y de la cual se deriva su efecto

patognico.

Algunos virus pueden prescindir de la fase extracelular porque son captados por otra clula no infectada segn geman o emergen, o porque aprovechan que la clula se est divi-diendo para transmitirse a las clulas hijas. Pero ningn virus puede prescindir de fase intra-celular. Por este motivo, el estudio de los virus siempre requiere el uso de clulas vivas. Afortunadamente, en la actualidad se dispone de lneas celulares continuas: clulas que se multiplican en un medio adecuado en frascos de cultivo en el laboratorio y que cuando hay muchas se prescinde de parte de ellas para que las que permanecen puedan seguirse multipli-cando, y as bsicamente de una forma indefinida.

Las clulas as mantenidas son muy susceptibles a alteraciones accidentales tales como contaminaciones, variaciones de temperatura, de pH, de presin de oxgeno, etc. Han de ser cultivadas en unos ambientes muy restringidos, manteniendo las condiciones lo ms cons-tantes posible. Por este motivo, el acceso a la sala de cultivos debe ser restringido y no es aconsejable incluir en las prcticas el manejo de las clulas, bien infectadas o bien sin infectar por virus.

Los virus son demasiado pequeos para ser observados con el microscopio ptico. Sin embargo, al desarrollar su ciclo de replicacin utilizan productos celulares y alteran la vida de la clula, y en muchas ocasiones esto s que se puede observar con el microscopio ptico. Como se indic ms arriba, ste es el llamado efecto citoptico. Los posibles efectos citop-ticos son numerosos. Entre ellos se cuentan la aparicin de sincitios, la lisis celular, el desa-rrollo de cordones, la vacuolizacin, la aparicin de clulas gigantes, etc. Al final de la des-cripcin de esta prctica hay algunas fotos demostrativas. En la WebCT de la Microbiologa, en Laboratorio Virtual de Microbiologa Veterinaria, en la parte destinada a Laboratorio de Virologa hay imgenes de efectos citopticos y cmo se van desarrollando.

OBJETIVO

El objetivo de esta prctica es hallar la cantidad de virus presente en una muestra de origen infeccioso. Para ello, realizaremos una titulacin, a fin de determinar la Dosis Infectiva en Cultivo Tisular 50 (TCID50), o cantidad de muestra que produce efecto citoptico en 50%

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de los cultivos. Los clculos son muy similares a los que se realizan para determinar cualquier otra dosis infectiva, letal, etc 50.

DESARROLLO

Todo el proceso debe realizarse en condiciones de la mxima esterilidad. Se dis-pondr de una placa de 96 pocillos en la que se van a hacer dos titulaciones. Las placas son muy parecidas a las de ELISA pero estn tratadas para que las clulas se adhieran a las mis-mas. A diferencia de las bacterias, los virus no crecen bien en cualquier clula y son muy es-pecficos. En el laboratorio generalmente hay que disponer de una veintena o ms de lneas celulares para garantizar que un virus procedente de un aislamiento concreto puede crecer en alguna de ellas. Sin embargo, en estas prcticas se va a titular un virus que sabemos que crece sobre la lnea celular CRFK, fibroblastos de rin felino. Para la titulacin, haremos dilucio-nes del virus que iremos aadiendo a los pocillos. Transcurridas 24 h veremos el efecto ci-toptico. Protocolo de la prctica En la placa, en cada uno de los 96 pocillos hay alrededor de 20.000 clulas en 100 l en un medio de cultivo especfico para cultivos titulares. Cada placa ser empleada para dos titulaciones, aadiendo 100 l de cada dilucin del virus a cuatro pocillos diferentes.

1. Realizar diluciones de la muestra de virus en base cinco. Preparar una batera de tubos Eppendorf estriles, hasta un total de 10 tubos. Aadir 800 l de medio de cultivo (RPMI con suero fetal bovino y antibiti-

cos, para evitar en la medida de lo posible el crecimiento de bacterias) a cada uno.

Tomar con una micropipeta 200 l de muestra de virus, y transferirlos al pri-mer Eppendorf. En este tubo, el virus habr quedado diluido 1:5.

Mezclar concienzudamente, y transferir 200 l del tubo 1:5 al siguiente tubo, quedando el virus diluido 1:25.

Repetir el paso 5 hasta el final, partiendo siempre del ltimo tubo en donde se ha realizado la dilucin.

2. Una vez estn todas las diluciones hechas, pasar 100 l de cada dilucin a cuatro poci-llos distintos. La dilucin final del virus en cada pocillo ser la mitad que la inicial, ya que en el volumen final, tan slo la mitad corresponde a la dilucin del virus.

3. No aadir dilucin de virus a las dos ltimas columnas, para considerarlas controles. En estos pocillos, las clulas tienen que crecer perfectamente.

4. Incubar a 37C durante 24 horas en atmsfera con 5% de CO2 y humedad. Al da siguiente se procede a observar el resultado. A partir de aqu ya no es necesario mantener las condiciones de esterilidad.

1. Eliminar el medio de cultivo por absorcin con una pipeta multicanal. 2. Fijar las clulas con metanol, aadiendo 100 l a cada pocillo con la pipeta multicanal

y dejndolo actuar durante 5-10 minutos. 3. Eliminar el metanol y lavar con el agua del grifo dejndola caer en los pocillo con mu-

cho cuidado para que no se desprendan las clulas. 4. Aadir 100 l de solucin Giemsa, y dejndolo actuar durante 30 minutos. Si el colo-

rante no est preparado, diluir 1 gota de la solucin madre en 1 ml de agua.

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5. Eliminar la solucin de Giemsa y lavar con cuidado con el agua del grifo. 6. Observar al microscopio. 7. Anotar en un papel los pocillos en los que hay efecto citoptico (aquellos en los que

las clulas pegadas al pocillo son menos de la mitad que en los controles).

RESULTADOS

Para evaluar los resultados y dar un ttulo hay que aplicar una frmula estadstica. Aqu se muestra el mtodo de Karber.

TCID50 = - -(S-0.5) = log10 de la ltima dilucin con 100% de cultivos positivos (con efecto citoptico) = log10 del factor de dilucin log10 10 = 1 log10 5 = 0,7 log10 3 = 0,5 log10 2 = 0,3 S = suma de la fraccin de pocillos con efecto citoptico en cada dilucin, desde la dilu-

cin en la que el 100% lo muestra. Este ltimo caso tiene un valor de 1 y todos los dems sern una fraccin de 1.

En el ejemplo de la pgina anterior = -2,4 (log10 de 1:250, ltima dilucin con el 100% de efecto citoptico). = 0,7 (diluciones en base 5) S = la suma de Dilucin 1:250 = 4/4 = 1 Dilucin 1:1250 = 3/4 = 0,75 Dilucin 1:6.250 = 1/4 = 0,25 Dilucin 1:16.250 =0/0= 0 Suma = 2,00 Sustituyendo los valores en la ecuacin: TCID50 = - 2,4 (0,7 x (2-0,5)) = -2,4 (0,7 x 1,5) = - 2,4 1,05 = -3,45

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Tubo-Columna

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 (11) (12)

Dilucin en el Ep-pendorf

1:5 1:25 1:125 1:625 1:3125 1:15.625 1:78.125 1:390.625 1:1.953.125 1:9.765.625 Contr Contr

RPMI 800l 800l 800l 800l 800l 800l 800l 800l 800l 800l Virus 200l 200l 200l 200l 200l 200l 200l 200l 200l 200l Dilucin final en pocillo

1:10 1:50 1:250 1:1250 1:6.250 1:16.250 1:156.250 1:781.250 1:3.906.250 1:19.531.250 0 0

Ejemplo

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Algunos ejemplos de efecto citoptico

a) Efecto citoptico inexistente b) Lisis, calvas o placas c) Efecto citoptico: leucemia d) Efecto citoptico: sincitios

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PPRRAACCTTIICCAA DDEE MMIICCOOLLOOGGIIAA Objetivos: En esta prctica el alumno debe cubrir los siguientes objetivos:

Conocimiento de las tcnicas bsicas utilizadas en el laboratorio de Micologa. Reconocimiento de las distintas estructuras que tienen los hongos cuando se des-

arrollan sobre medios de cultivo. Conocer las caractersticas morfolgicas (macro y microscpicas) de los distintos

grupos taxonmicos de inters veterinario. Aprender a utilizar las claves dicotmicas bsicas de identificacin de hongos. Teora:

1. Medios de cultivo: no difieren en principio de las normas generales expuestas al hablar de bacterias. Los aspectos diferenciales que podemos destacar son los siguientes:

Se utilizan medios selectivos con los siguientes objetivos: a) Inhibir el crecimiento de bacterias. Para ello se han empleado dos estrategias bsi-cas:

** Medios con pH cido (

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3. Mtodos de aislamiento: Obtencin de cultivos puros.

Mtodos:

- Siembra por agotamiento: utilizado para levaduras (ya descrito en las tcnicas de bacteriologa.

- Siembra en tres puntos: utilizado para hongos miceliares.

Siempre que trabajemos con un cultivo de hongos debemos tener en cuenta que estos se reproducen por medio de esporas, y que estas se dispersan muy fcilmente por el ambiente, contaminando el laboratorio. Por tanto, debemos tomar precauciones en la manipulacin de los cultivos, de tal forma que se evite, en lo posible, la contaminacin, para lo cual:

- Debemos tener las placas abiertas el menor tiempo posible. - Las placas con crecimiento fngico siempre se abren boca abajo, dejando

la tapa en la mesa y manteniendo el cultivo hacia abajo con el fin de que las esporas no se diseminen.

Mtodo de siembra en tres puntos

a. Con el asa de platino estril y fra se raspa ligeramente el centro de la colonia del hongo. b. En una placa con medio de cultivo se toca en tres puntos equidistantes con el asa de

platino cargada. c. Se lleva a incubar a temperatura y periodo ptimos dependiendo del tipo de proble-

ma en estudio. 4. Mtodo de identificacin de hongos aislados sobre medio de cultivo: La identificacin se realiza siguiendo las pautas: * Anlisis macroscpico de las colonias: por el aspecto de la colonia podemos saber si se tra-ta de una levadura o de un hongo miceliar o filamentoso.

Los caracteres macroscpicos de la colonia que presentan inters taxonmico son: Color (anverso y reverso), tonalidad y distribucin. Textura superficial, surcos y/o estras. Exudados y pigmentos. Tamao

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* Anlisis microscpico.

a.- Para levaduras: siguiendo procedimiento similares a las tcnicas bacteriolgicas ya descritas.

- En fresco, sin fijar. - Fijadas y teidas

b.- Para hongos miceliares: las preparaciones para la observacin microscpica se montan normalmente utilizando los siguientes elementos:

- Agua o azul de metileno como agente de montaje. - Agujas enmangadas o "celo" para toma del material a examinar.

Tcnica de la cinta adhesiva: 1. La placa de cultivo se abre sobre la mesa. 2. Se corta un trozo de papel celo que se pone en contacto con una colonia del hongo. 3. Sobre un porta depositamos una gota de agua o azul de metileno. 4. Se presiona el celo sobre el porta, eliminando el exceso de agua o colorante con pa-pel secante (filtro), evitando la formacin de burbujas. 5. Se observa la preparacin al microscopio a distintos aumentos.

Tcnica del cubreobjetos

1. La placa de cultivo se abre sobre la mesa. 2. Con dos agujas enmangadas se toma una porcin del centro de la colonia. 3. Sobre un porta depositamos una gota de agua o azul de metileno. 4. Se dislacera, con ayuda de las agujas, la porcin de colonia en estudio. 5. Se coloca un cubreobjetos sobre la preparacin, eliminando el resto de agua o colorante con papel secante (filtro). 6. Se observa la preparacin al microscopio a distintos aumentos.

El agua para el montaje de la preparacin, se emplea cuando queremos conocer la co-loracin que tienen las estructuras de los hongos. Caracteres que presentan valor taxonmico:

a) En la identificacin de levaduras. b) En la identificacin de hongos miceliares.

a) Criterios de identificacin para levaduras:

Caractersticas de cultivo: - Medio lquido: formacin de velo o anillo. - Medio slido: Caractersticas macroscpicas de la colonia (ya descritas)

Caractersticas microscpicas de la levadura: - Forma, tamao de las clulas. - Tipo de reproduccin asexual. - Tipo de reproduccin sexual.

Caractersticas fisiolgicas: - Utilizacin de los compuestos de carbono:

** Fermentacin ** Oxidacin ** Hidrlisis de la arbutina

- Utilizacin de los compuestos de nitrgeno.

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- Capacidad de crecimiento en medios libres de vitaminas. - Hidrlisis de la urea - Produccin de pigmentos. - Capacidad de licuar gelatina.

b) Criterios de identificacin para hongos miceliares:

Caractersticas de cultivo: a partir de las colonias desarrolladas en medios de culti-vo slidos ejem: agar extracto de Malta, agar glucosado de Sabouraud, Czapex-Dox, etc.

- Caractersticas macroscpicas: (ya descritas) - Caractersticas microscpicas:

** Caractersticas de las hifas: Dimetro. Color: (hialino, dematiceo = oscuro, marrn) Presencia o ausencia de septos.

Presencia de determinadas formaciones caractersticas: hifas en raqueta, hifas en espiral, hifas peptinadas, formacin de clamidosporas.

** Caractersticas de las estructuras reproductoras asexuales:

- Hongos cenocticos: Morfologa del esporangio Morfologa de la columela Presencia o ausencia de apfisis, rizoides... - Hongos septados

Presencia o ausencia de conidiforo. Morfologa del conidiforo. Morfologa y tipo de clula conidigena. Tipo de conidiogenesis: tlica o blstica. Estructura y caractersticas de los conidios. ** Caractersticas de las estructuras reproductoras sexuales (si las hay).

- Hongos cenociticos Morfologa de la zigospora - Hongos septados

Presencia de cuerpos fructferos sexuales (cleistotecios, apotecios, peri-tecios).

Presencia y tipos de ascas y ascosporas. En la mayor parte de los hongos miceliares la informacin obtenida del estudio de sus carac-tersticas de cultivo (anlisis macro y microscpico) es suficiente para poder identificarlos uti-lizando las claves dicotmicas. En algunos casos, para poder discernir entre dos gneros prximos o bien dentro de un gnero determinado entre dos especies, se tiene que recurrir a pruebas fisiolgicas, que nos pondrn en evidencia diferencias metablicas entre ellas (presencia o ausencia de un determinado en-zima, capacidad de asimilacin de determinados sustratos.......).

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IDENTIFICACIN DE HONGOS-CLAVES DICOTOMICAS

1.a - Crecimiento en Agar Glucosado de Sabouraud formando colonias ms o me-

nos mucosas, de color blanco, crema, rosa, rojas .......etc., sin formacin de fi-lamentos.................................................................................LEVADURAS

1.b - Crecimiento en medio Agar Glucosado de Sabouraud formando colonias de

apariencia miceliar........................................................................................... 2

2.a - Hifas no septadas (o con septos muy escasos en las proximidades de los

rganos, reproductores). Dimetro de la hifa >4. Esporas asexuales se for-man en el interior de receptculos cerrados (esporangios)

HONGOS CENOCITICOS Div. Zygomycota

2.b - Hifas septadas. Dimetro de la hifa variable normalmente

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HONGOS CENOCITICOS.

Division Zygomycota Crecimiento en medios slidos, generalmente muy expansivo, algodonoso, hifas hia-linas, los esporangios se ven como puntos oscuros en la superficie de la colonia

Caractersticas de inters taxonmico

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1.a.- Esporangiosporas formadas en el interior de merosporangios.........................

.............................................................................................. Syncephalastrum

1.b.- Esporangiosporas formadas en esporangios globosos con colume-la......................................................................................................... 2

2.a.- Micelio vegetativo con rizoides. El esporangio presenta apfisis ................. 3

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2.b.- Ausencia de rizoides y de apfisis........................................................... Mucor

3.a.- Rizoides situados en la base del esporangio. Columela de forma globosa

............................................................................................................ Rhizopus

3.b.- Rizoides presentes pero a menudo difciles de observar. Apfisis en forma de

embudo.................................................................................................. Absidia

HONGOS TABICADOS.

Divisin Ascomycota. Divisin Deuteromycota. 1.a.- Organos reproductores cerrados presentes: sexuales (cleistotecio, peritecio y apotecio) o asexuales (picnidios, acervulos)............................................................2

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1.b- Organos reproductores sexuales ausentes. Organos reproductores asexuales cerrados ausentes................................................................... Div. Deuteromycota

Clase Hyphomycetes 2.a.-Organos reproductores sexuales presentes. Espora sexual en el interior de una

clula en forma de saco (asca)...............................................Div. Ascomycota

2.b.- Organos reproductores sexuales ausentes. Organos reproductores asexuales cerrados presentes.................................................................... Div. Deuteromycota Clase Coelomycetes

Divisin Deuteromycota. Clase Hyphomycetes. 1.a.- Conidios ausentes............................................... Micelio estril. 1.b.- Conidios presentes........................................................ 2. 2.a.- Conidios mayoritarios formados por un proceso tlico . .............................. 3.

50

2.b.- Conidios mayoritarios formados por un proceso blstico. ............................ 6

3.a.- Conidio formado por fragmentacin de micelio vegetativo (sin diferenciacin

previa), formando artroconidias exclusivamente. Micelio hiali-no............................................................................................. Geotrichum

3.b.- Artroconidia ausente o poco abundante,presencia de otro tipo de conidios tli-

cos. Micelio hialino.................................................................................... 4. 4.a.- Presencia de dos tipos de conidios tlicos: unicelulares (microconidios) y

pluricelulares con tabiques transversales (macroconidios)........................... 5.

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4.b.- Presencia de un solo tipo de conidio pluricelular (tabicado con septos trans-versales)......................................................................... Epidermophyton

5.a.- Macroconidia de pared gruesa y rugosa. Relativamente ms abundantes que

las microconidias.......................................................................... Microsporum

5.b.- Macroconidia de pared delgada y lisa. Microconidia relativamente ms abun-

dante que las macroconidias............................................... Trichophyton

6.a.- Conidios generalmente unicelulares............................................................ 7. 6.b.- Conidios generalmente pluricelulares......................................................... 10. 7.a.- Conidios mayoritarios formados a partir de micelio indiferenciado por gema-

cin (blstico). Colonias viscosas, aspecto levaduriforme, color variable ini-

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cialmente (blanquecinas, rosas, marrn plido) evolucionando a marrn oscu-ro........................................................................................Aureobasidium

7.b.- Conidios formados sobre clulas conidigenas diferenciadas y agrupados

de forma caracterstica constituyendo conidioforos...................................... 8.

8.a.- Colonias en tonos blancos o marrones claros cuando envejecen. Clulas co-

nidiognas anelidicas, conidios generalmene rugosos de base truncada, agrupados formando cadenas...................................................Scopulariopsis

8.b.- Colonias en tonos blancos, amarillos, azules, verdes, generalmente de creci-

miento rpido. Clulas conidiogenas fialidicas....................................... 9.

9.a.- Las fialides insertadas sobre el pice de una hifa diferenciada, ensanchada,

que constituye la vescula. Pudiendo tener uno o dos verticilos de clulas co-nidiogenas................................................................................... Aspergillus

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9.b.- Las fialides constituyen el ltimo verticilo del conidioforo que tiene la forma

caracterstica de pincel.................................................................... Penicillium

10.a.- Colonias blancas, amarillas, rosadas.Generalmente los macroconidios tienen Forma de hoz con tabiques transversales.Tambin pude tener microconidios unicelulares........................................................................................ Fusarium

10.b.- Colonias generalmente de coloresoscuros (verde, marron). Micelios oscuros

(dematiaceos). Conidios maduros pluricelulares con tabiques de orientacin irregular, transversales, longitudinales y oblicuos (dictioconidio).... Alternaria

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Levaduras

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Glosario de los terminos micolgicos empleados en la clave de identificacin de las prcticas Anlide: tipo de clula conidiogena que produce conidios blsticos de una manera baspeta, alargandosese con la produccin de cada conidio, que deja cicatrices en forma de anillo en la superficie externa. Aplanospora: espora inmvil. Apfisis: dilatacin en el extremo del esporangiforo situado debajo del esporangio de los Zygomicota. Artrospora. Espora resultante de la fragmentacin de la hifa. Cenoctica: no septada. Clamidospora: conidio tlico de pared gruesa, que generalmente funciona como espora de resistencia. Columela: estructura estril existente dentro de un esporangio u otra fructificacin. Conidio: espora asexual no movil, que suele formarse en el pice o en el lado de la clula esporgena (clula conidigena). Conidio blstico: conidio que se forma por un proceso de gemacin a partir de una clula conidigena. Conidio tlico. Conidio formado por transformacin de la totalidad de una clula hifal preexistente. Conidiforo: hifa simple o ramificada que sale de una hifa somtica y se modifica de tal forma que en su pi-ce, o en un lado lleva una o ms clulas conidiogenas. Dictioconidio: espora con tabique transversales , longitudinales y oblicuas. Esporangio: estructura en forma de saco cuyo contenido protoplsmico completo se transforma en un nmero indefinido de esporas. Esporangiolo: esporangio pequeo que contiene pocas esporas. Esporangioforo: hifa portadora de un esporangio. Filide: tipo de clula conidiogena que produce conidios blsticos de unamanera baspeta, sin un aumento de-tectable de la longitud. Hifa hialina: hifas transparentes, incoloras. Hifa dematiacea: hifas de color oscuro. Merosporangio: esporangio cilndrico. Rizoide: ramificacin corta y delgada de las hifas semejante a la raiz de una planta. Zoospora: espora movil, producida asexualmente.

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AANNAALLIISSIISS DDEE AALLIIMMEENNTTOOSS

La existencia de microorganismos en los alimentos no significa en muchos casos un peligro para el consumidor o una calidad deficiente de los mismos. Slo en aquellos casos en los que los alimentos vehiculan grmenes potencialmente patgenos o en los que la manipula-cin y las condiciones de higiene y almacenamiento han sido deficientes pueden constituir un serio peligro para la salud del consumidor. No obstante la legislacin vigente exige la ausen-cia de determinados microorganismos, y un nmero mximo de otros, con lo que sea por la causa que sea, el anlisis de alimentos microbiolgico de alimentos es obligatorio. Como con-secuencia la determinacin en el laboratorio de ciertos grupos de microorganismos cuya pre-sencia en los alimentos en determinado nmero indica que estos alimentos estuvieron expues-tos a condiciones tales que permitieron la entrada y multiplicacin de agentes infecciosos o toxignicos. A estos grupos de microorganismos se les denomina "indicadores" y sirven para evaluar la seguridad que ofrecen los alimentos en cuanto a microorganismos y sus toxinas.

En otros casos se pueden seleccionar otros grupos de bacterias, aadiendo al agar nu-tritivo inh