19© OFICINA ESPAÑOLA DEPATENTES Y MARCAS

ESPAÑA

11© Número de publicación: 2 210 40151© Int. Cl.7: C12N 15/63, C12N 15/00

C12N 15/09, A61K 39/12A61K 39/275, A61K 39/285A61K 39/395, A61K 39/42C07K 16/08, A61K 39/215

12© TRADUCCIÓN DE PATENTE EUROPEA T3

86© Número de solicitud europea: 96943572 .686© Fecha de presentación: 02.12.199687© Número de publicación de la solicitud: 086852287© Fecha de publicación de la solicitud: 07.10.1998

54© Título: Poxvirus recombinante-virus de la peritonitis infecciosa felina, sus composiciones y métodos paraobtenerlos y usarlos.

30© Prioridad: 01.12.1995 US 566398

45© Fecha de publicación de la mención BOPI:01.07.2004

45© Fecha de la publicación del folleto de la patente:01.07.2004

73© Titular/es:CONNAUGHT TECHNOLOGY CORPORATIONNew York, US

72© Inventor/es: Paoletti, Enzo yGettig, Russell

74© Agente: Elzaburu Márquez, Alberto

Aviso: En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Boletín europeo de patentes, dela mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina Europeade Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar motivada; sólo seconsiderará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposición (art. 99.1 delConvenio sobre concesión de Patentes Europeas).E

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DESCRIPCIÓN

Poxvirus recombinante-virus de la peritonitis infecciosa felina, sus composiciones y métodos para obtenerlos yusarlos.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a poxvirus recombinantes modificados, sus composiciones y métodos para obte-nerlos y usarlos; por ejemplo, un virus Vaccinia o un virus de la viruela aviar (p.ej.: viruela de los canarios o viruela delas aves de corral). Por ejemplo, la invención se refiere a recombinantes de poxvirus modificado y virus de la peritonitisinfecciosa felina (FIPV), sus composiciones, y métodos para obtener y usar los recombinantes y composiciones. Lainvención se refiere además a los recombinantes atenuados, especialmente recombinantes NYVAC- o ALVAC-FIPV,sus composiciones y métodos para obtener y usar los recombinantes y composiciones. Por tanto, la invención se re-fiere a un recombinante de poxvirus-FIPV, recombinantes tales que expresan uno o varios productos génicos de FIPV,composiciones que contienen tales recombinantes y/o producto o productos génicos, y métodos para obtener y usarlos recombinantes o composiciones. El producto génico puede ser FIPV N, M, y tres versiones de S (S1- proyecciónsuperficial completa; S2- proyección superficial menos la secuencia señal; y S3- sección C-terminal de la proyecciónsuperficial) o sus combinaciones, como M y N. Los recombinantes o composiciones que los contienen pueden induciruna respuesta inmunológica frente a la infección de FIPV, cuando se administran a un hospedador. El hospedador espreferiblemente un felino, p.ej., un gato o gatito. La respuesta puede ser protectora. Por tanto, la composición puedeser inmunológica o antigénica, o una vacuna.

La invención se refiere adicionalmente a los productos de expresión del poxvirus que, por sí mismos, son útilespara provocar una respuesta inmunitaria, p.ej., incrementar los anticuerpos o estimular respuestas celulares. Dichosanticuerpos o respuestas son útiles frente a la infección de FIPV, o dichos productos de expresión o los anticuerposproducidos por los mismos, aislados de un medio de cultivo o de un animal, son útiles para preparar un kit diagnóstico,un ensayo o prueba para la detección del FIPV, o del virus recombinante, o de células infectadas, o de la expresiónde los antígenos o productos en otros sistemas. Los productos de expresión y anticuerpos producidos por el virusrecombinante son especialmente útiles en kits, pruebas o ensayos para la detección de anticuerpos o antígenos en unsistema, hospedador, suero o muestra; y los productos de expresión son útiles para la producción de anticuerpos.

En esta solicitud se hace referencia a varias publicaciones. La cita completa a estas referencias se encuentra al finalde la memoria descriptiva, inmediatamente antes de las reivindicaciones, o donde se menciona la publicación.

Antecedentes de la invención

El virus Vaccinia y, más recientemente, otros poxvirus se han usado para la inserción y expresión de genes extraños.La técnica básica de insertar genes extraños en poxvirus infecciosos vivos implica la recombinación entre secuenciasde DNA de pox que flanquean un elemento genético en un plásmido donador y secuencias homólogas presentes en elpoxvirus suministrador (Piccini et al., 1987).

Específicamente, los poxvirus recombinantes se construyen en dos etapas conocidas en la técnica, que son análogasa los métodos para crear recombinantes sintéticos de poxvirus, como el virus Vaccinia y el virus de la viruela aviar,descritos en las patentes de EE.UU. Nos 4.769.330, 4.722.848, 4.603.112, 5.110.587 y 5.174.993.

Primero, la secuencia génica de DNA a insertar en el virus, particularmente un marco de lectura abierto de unafuente distinta del pox, se coloca en una construcción génica de un plásmido de E. coli en la que se ha insertadoDNA homólogo a una sección de DNA del poxvirus. Por separado, la secuencia génica de DNA a insertar se une aun promotor. La conexión promotor- gen se coloca en la construcción del plásmido, de forma que está flanqueada enambos extremos por DNA homólogo a una secuencia de DNA que flanquea una región de DNA de pox que contieneun locus no esencial. La construcción de plásmido resultante se amplifica a continuación mediante crecimiento enbacterias de E. coli (Clewell, 1972) y se aísla (Clewell et al., 1969; Maniatis et al., 1982).

En segundo lugar, el plásmido aislado que contiene la secuencia génica de DNA a insertar se transfecta en uncultivo celular, p.ej. fibroblastos de embrión de pollo, junto con el poxvirus. La recombinación entre el DNA depox homólogo en el plásmido y el genoma viral, respectivamente, produce un poxvirus modificado por la presenciade secuencias de DNA extrañas en una región no esencial de su genoma. El término DNA “extraño” designa DNAexógeno, particularmente DNA de una fuente distinta del pox, que codifica para productos génicos no producidosordinariamente por el genoma en el que se coloca el DNA exógeno.

La recombinación génica es, en general, el intercambio de secciones homólogas de DNA entre dos hebras de DNA.En ciertos virus, el RNA puede reemplazar al DNA. Las secciones de ácido nucleico homólogas son secciones de ácidonucleico (DNA o RNA) que tienen la misma secuencia de bases nucleotídicas.

La recombinación génica se puede producir de forma natural durante la replicación o producción de nuevos ge-nomas virales en la célula hospedadora infectada. Por tanto, la recombinación génica entre genes virales se puedeproducir durante el ciclo de replicación viral que se produce en una célula hospedadora que se infecta conjuntamentecon dos o más virus u otras construcciones génicas diferentes. Una sección de DNA de un primer genoma se usa de

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forma intercambiable para construir la sección del genoma de un segundo virus que infecta conjuntamente, en el queel DNA es homólogo al del primer genoma viral.

Sin embargo, la recombinación se puede producir también entre secciones de DNA en diferentes genomas queno son perfectamente homólogos. Si una de tales secciones es de un primer genoma homólogo a una sección de otrogenoma, excepto por la presencia en la primera sección de, por ejemplo, un marcador genético o un gen que codificapara un determinante antigénico insertado en una porción del DNA homólogo, la recombinación aún se puede produciry los productos de dicha recombinación se pueden detectar entonces mediante la presencia de dicho marcador genéticoen el genoma viral recombinante. Se han descrito recientemente estrategias adicionales para producir virus Vacciniarecombinantes.

La expresión acertada de la secuencia genética de DNA insertada mediante el virus infeccioso modificado, requieredos condiciones. Primero, la inserción tiene que producirse en una región no esencial del virus, a fin de que el virusmodificado permanezca viable. La segunda condición para la expresión del DNA insertado es la presencia de unpromotor en relación adecuada con el DNA insertado. El promotor se tiene que colocar de forma que esté localizadoaguas arriba de la secuencia de DNA a expresar.

El virus Vaccinia se ha usado con éxito para inmunizar frente a la viruela, culminando con la erradicación mundialde la viruela en 1980. En el curso de su historia, han aparecido muchas cepas del virus Vaccinia. Estas cepas diferentesmuestran una inmunogenicidad variada y están implicados en grados variables con complicaciones potenciales, lasmás serias de los cuales son la encefalitis pos-vacunación y la viruela vacuna generalizada (Behbehani, 1983).

Con la erradicación de la viruela, adquirió importancia un nuevo papel para el virus Vaccinia, el de vector obtenidomediante ingeniería genética para la expresión de genes extraños. Se han expresado en el virus Vaccinia genes quecodifican para un vasto número de antígenos heterólogos, originando frecuentemente una inmunidad protectora frentea la estimulación mediante el patógeno correspondiente (reseñado en Tartaglia et al., 1990a, 1990b).

Se ha demostrado que los antecedentes genéticos del vector de Vaccinia afectan a la eficacia protectora del inmu-nógeno extraño expresado. Por ejemplo, la expresión del virus de Epstein Barr (EBV) gp340 en cepa Wyeth del virusVaccinia no protegió a monos del nuevo mundo frente al linfoma inducido por el virus EBV, mientras que la expresióndel mismo gen en la cepa de laboratorio WR del virus Vaccinia era protectora (Morgan et al., 1988).

Es extremadamente importante un equilibrio fino entre la eficacia y la seguridad de un candidato de vacuna re-combinante basado en el virus Vaccinia. El virus recombinante tiene que presentar el inmunógeno o inmunógenos enuna forma que provoque una respuesta inmunitaria protectora en el animal vacunado pero que carezca de propiedadespatogénicas significativas. Por tanto, la atenuación de la cepa del vector sería una ventaja altamente deseable sobre elestado actual de la tecnología.

Se han identificado diversos genes que no son esenciales para el crecimiento del virus en cultivo tisular y cuyadeleción o inactivación reduce la virulencia en diversos sistemas animales.

El gen que codifica para la timidina-quinasa (TK) del virus de la viruela vacuna, se ha cartografiado (Hruby et al.,1982) y secuenciado (Hruby et al., 1983; Weir et al., 1983). La inactivación o deleción completa del gen de la timidina-quinasa no evita el crecimiento del virus Vaccinia en una amplia variedad de células en cultivo tisular. El virus VacciniaTK− es capaz también de replicarse in vivo en el sitio de inoculación, en diversos hospedadores y administrado pordiversas rutas.

Se ha mostrado para el virus Herpes simplex de tipo 2, que la inoculación intravaginal de cobayas con virus TK−producía titulaciones de virus significativamente menores en la médula espinal, que la inoculación con virus TK+(Stanberry et al., 1985). Se ha demostrado que la actividad TK codificada por Herpesvirus in vitro no era importantepara el crecimiento de virus en células metabolizando activamente, pero se requería para el crecimiento del virus encélulas en reposo (Jamieson et al., 1974).

La atenuación del virus Vaccinia TK− se ha mostrado en ratones inoculados por las rutas intracerebral y peritoneal(Buller et al., 1985). La atenuación se observó, tanto para la cepa de laboratorio neurovirulenta WR, como para lacepa vacunal Wyeth. En ratones inoculados por la ruta intradérmica, los virus Vaccinia recombinantes TK− generaronanticuerpos neutralizantes anti-Vaccinia, comparados con el virus Vaccinia TK+ parental, indicando que en este sistemade ensayo, la pérdida de la función TK no reduce significativamente la inmunogenicidad del vector del virus Vaccinia.Tras la inoculación intranasal de ratones con virus Vaccinia recombinantes TK− y TK+ (cepa WR), se ha encontradosignificativamente menos diseminación de virus a otras localizaciones, incluyendo el cerebro (Taylor et al., 1991a).

Otra enzima implicada en el metabolismo de los nucleótidos es la ribonucleótido-reductasa. Se demostró que lapérdida de actividad ribonucleótido-reductasa codificada por virus en el virus herpes simplex (HSV) por deleción delgen que codificaba la subunidad mayor, no producía ningún efecto sobre el crecimiento viral y la síntesis de DNA encélulas en división in vitro, pero comprometía gravemente la capacidad del virus para crecer en células privadas desuero (Goldstein et al., 1988). Usando un modelo de ratón para infección de HSV aguda del ojo e infección latentereactivable en los ganglios trigeminales, se demostró una virulencia reducida para HSV del que se había delecionado la

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subunidad grande de la ribonucleótido-reductasa, comparada con la virulencia presentada por el HSV de tipo silvestre(Jacobson et al., 1989).

Se han identificado tanto las subunidades pequeña (Slabaugh et al., 1988) como grande (Schmidtt et al., 1988) de laribonucleótido-reductasa, en virus Vaccinia. La inactivación por inserción de la subunidad grande de la ribonucleótido-reductasa en la cepa WR del virus Vaccinia, conduce a la atenuación del virus, como se midió mediante inoculaciónintracraneal de ratones (Child et al., 1990).

El gen de la hemaglutinina (HA) del virus de la viruela vacuna se ha cartografiado y secuenciado (Shida, 1986). Elgen HA del virus Vaccinia no es esencial para el crecimiento en cultivo tisular (Ichihashi et al., 1971). La inactivacióndel gen HA del virus Vaccinia produce una neurovirulencia reducida en conejos inoculados por la ruta intracraneal ylesiones menores en conejos en el sitio de inoculación intradérmica (Shida et al., 1988). El locus HA se usó para lainserción de genes extraños en la cepa WR (Shida et al., 1987), derivados de la cepa Lister (Shida et al., 1988) y de lacepa Copenhagen (Guo et al., 1989) del virus Vaccinia. Se ha demostrado que virus Vaccinia recombinantes HA− soninmunogénicos (Guo et al., 1989; Itamura et al., 1990; Shida et al., 1988; Shida et al., 1987) y protectores frente a laestimulación por el patógeno relevante (Guo et al., 1989, Shida et al., 1987).

El virus Cowpox (cepa roja de Brighton) produce manchas rojas (hemorrágicas) sobre la membrana corioalantoideade los huevos de pollo. Las deleciones espontáneas en el genoma de Cowpox generan mutantes que producen manchasblancas (Pickup et al., 1984). La función hemorrágica (u) se correlaciona con una proteína de 38 kDa codificada porun gen temprano (Pickup et al., 1986). Se ha demostrado que este gen, que tiene homología con los inhibidores deserina-proteasa, inhibe la respuesta inflamatoria del hospedador frente al virus Cowpox (Palumbo et al., 1989) y es uninhibidor de la coagulación sanguínea.

El gen u está presente en la cepa WR del virus Vaccinia (Kotwal et al., 1989b). Ratones inoculados con un recom-binante de virus Vaccinia WR en el que la región u se ha inactivado mediante inserción de un gen extraño, producenniveles de anticuerpo superiores frente al producto génico extraño, comparados con ratones inoculados con un virusVaccinia recombinante similar, en los que el gen u está intacto (Zhou et al., 1990). La región u está presente en una for-ma no funcional defectiva en la cepa Copenhagen del virus Vaccinia (marcos de lectura abiertos B13 y B14 mediantela terminología descrita en Goebel et al., 1990a, b).

El virus Cowpox se localiza en células infectadas en los cuerpos de inclusión citoplásmicos de tipo A (ATI) (Katoet al., 1959). Se cree que la función de ATI es la protección de los viriones de virus Cowpox durante la diseminaciónentre animales (Bergoin et al., 1971). La región ATI del genoma de Cowpox codifica una proteína de 160 kDa queforma la matriz de los cuerpos ATI (Funahashi et al., 1988; Patel et al., 1987). El virus Vaccinia, aunque contiene unaregión homóloga en su genoma, generalmente no produce ATI. En la cepa WR de Vaccinia, la región ATI del genomase traduce en forma de una proteína de 94 kDa (Patel et al., 1988). En la cepa Copenhagen del virus Vaccinia, lamayoría de las secuencias correspondientes a la región ATI se delecionan, estando el extremo 3’ restante de la regiónfusionado con secuencias aguas arriba respecto de la región ATI, para formar el marco de lectura abierto (ORF) A26L(Goebel et al., 1990a, b).

Se han descrito diversas deleciones espontáneas (Altenburger et al., 1989; Drillien et al., 1981; Lai et al., 1989;Moss et al., 1981; Paez et al., 1985; Panicalli et al., 1981) y obtenidas mediante ingeniería genética (Perkus et al.,1991; Perkus et al., 1989; Perkus et al., 1986) cerca del extremo izquierdo del genoma del virus Vaccinia. Se demostróque una cepa WR del virus Vaccinia con una deleción espontánea de 10kb (Moss et al., 1981; Panicali et al., 1981) seatenuaba mediante inoculación intracraneal en ratones (Buller et al., 1985). Se demostró más tarde que esta deleciónincluía 17 ORFs potenciales (Kotwal et al., 1988b). Genes específicos dentro de la región delecionada incluyen la vi-roquina N1L y una proteína de 35 kDa (C3L, por la terminología descrita en Goebel et al., 1990a, b). La inactivaciónpor inserción de N1L reduce la virulencia por inoculación intracraneal, tanto para ratones normales como inmunosu-primidos (Kotwal et al., 1989a). La proteína de 35 kDa se secreta como N1L en el medio de células infectadas porvirus Vaccinia. La proteína tiene homología con la familia de las proteínas de control del complemento, particular-mente con la proteína que se une al complemento 4B (C4bp) (Kotwal et al., 1988a). Como la C4bp celular, la proteínade 35 kDa de Vaccinia se une al cuarto componente del complemento, e inhibe la clásica cascada del complemento(Kotwal et al., 1990). Por tanto, la proteína de 35 kDa de Vaccinia parece estar implicada en ayudar al virus a eludirlos mecanismos de defensa del hospedador.

El extremo izquierdo del genoma de Vaccinia incluye dos genes que se han identificado como genes del ámbito delhospedador, K1L (Gillard et al., 1986) y C7L (Perkus et al., 1990). La deleción de ambos genes reduce la capacidaddel virus Vaccinia para crecer en diversas líneas celulares humanas (Perkus et al., 1990).

Dos sistemas de vector vacunal adicionales implican el uso de poxvirus con restricciones de hospedador de formanatural, los virus de la viruela aviar. Tanto el virus de la viruela de aves de corral (fowlpoxvirus, FPV), como el virusde la viruela del canario (canarypoxvirus, CPV), se han alterado mediante ingeniería genética para expresar productosgénicos extraños. El virus de la viruela de las aves de corral (FPV) es el virus prototipo del género Avipox de lafamilia de los Poxvirus. Este virus causa una enfermedad económicamente importante en las aves de corral, que seha controlado bien desde la década de 1920, mediante el uso de vacunas vivas atenuadas. La replicación de los virusde la viruela aviar está limitada a especies aviares (Matthews, 1982) y no existen descripciones en la literatura devirus de la viruela aviar que originen una infección productiva en ninguna especie no aviar, incluyendo el hombre.

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Esta restricción de hospedador proporciona una barrera intrínsecamente segura para la transmisión del virus a otrasespecies y hace del uso de los vectores vacunales basados en virus de la viruela aviar en aplicaciones veterinarias yhumanas, una proposición atractiva.

El FPV se ha usado ventajosamente como un vector que expresa antígenos de patógenos de aves de corral. Laproteína hemaglutinina de un virus de la influenza aviar virulento se expresó en un recombinante FPV (Taylor etal., 1988a). Tras la inoculación del recombinante en pollos y pavos, se indujo una respuesta inmunológica que eraprotectora, bien frente a una estimulación con virus de la influenza virulento homólogo o heterólogo (Taylor et al.,1988a). Se han desarrollado asimismo recombinantes FPV que expresan las proteínas superficiales del virus de laenfermedad de Newcastle (Taylor et al., 1990; Edbauer et al., 1990).

A pesar de la restricción de hospedador para la replicación de FPV y CPV en sistemas aviares, se encontró querecombinantes derivados de dichos virus expresaban proteínas extrínsecas en células de origen no aviar. Adicional-mente, se demostró que tales virus recombinantes provocaban respuestas inmunológicas dirigidas hacia el productodel gen extraño y, en su caso, se demostró que proporcionaban protección a partir de la estimulación frente al patógenocorrespondiente (Tartaglia et al., 1993a,b; Taylor et al., 1992; 1991b; 1988b).

El virus de la peritonitis infecciosa felina (FIPV) produce una enfermedad crónica, progresiva, mediada inmuno-lógicamente, en felinos como los gatos domésticos y exóticos. Se cree que la ruta de la infección de FIPV se produceprimariamente a través de la cavidad oral y la faringe. La FIP clínicamente evidente se produce una vez que el virusatraviesa la barrera mucosa y una viremia primaria lleva el FIPV a sus muchos órganos diana (hígado, bazo, intestinoy pulmones). Se han descrito dos formas de la enfermedad, como efusiva (húmeda) y no efusiva (seca). La forma efu-siva produce la acumulación de fluido clásica observada en gatos infectados que se produce por una vasculitis de tipoArthus en los órganos diana, mediada por activación del complemento, y una respuesta inflamatoria intensa. La formano efusiva se caracteriza por acumulación escasa o inexistente de fluido ascítico, pero los órganos internos se puedeninfiltrar con depósitos fibrinosos granulares. Por tanto, los anticuerpos formados como respuesta a la infección porFIPV (principalmente a la proteína de la proyección superficial) tienden a favorecer la patogénesis de la enfermedady, obviamente, no son deseados en una vacuna o composición inmunológica (Olsen y Scott, 1991). (Sin embargo, laexpresión de tales proteínas por un recombinante y los propios recombinantes en sí son útiles si uno desea antígenos oanticuerpos de los mismos para un kit, prueba o ensayo o similares).

FIPV es un miembro de la familia Coronaviridae. Los coronavirus son virus de RNA de hebra positiva, grandes,con longitudes genómicas de 27-30 kb. El virión está recubierto y está lleno de estructuras peploméricas denominadasproyecciones superficiales. La mitad izquierda del genoma de FIPV codifica una poliproteína grande que se escindeen fragmentos más pequeños, algunos de los cuales están implicados en la replicación del RNA. La mitad derechadel genoma de FIPV codifica 3 proteínas estructurales principales denominadas nucleocápsida (N), matriz (M) yproyección superficial (S). El producto del gen S de FIPV media la unión del virus al receptor celular, desencadenala fusión de membranas y produce anticuerpos neutralizantes del virus. La proteína N es necesaria para encapsidar elRNA genómico y dirigir su incorporación al interior de la cápsida, y se cree que está implicado en la replicación delRNA. Parece que la glicoproteína M de FIPV es importante para la maduración viral de FIP y para la determinacióndel sitio en el que se ensamblan las partículas del virus (Spann et al., 1988).

Debido a la activación dependiente de anticuerpos de FIP (ADE) en gatos, los intentos para producir una vacuna ouna composición inmunológica seguras y eficaces frente a FIPV, han sido altamente desafortunados. Las vacunas deFIPV inactivado y las vacunas de coronavirus vivos heterólogos no produjeron ninguna protección frente a la infecciónpor FIPV y la vacunación produjo normalmente una sensibilización incrementada a la enfermedad. Una vacuna devirus vivo modificado, Primucell, es la primera vacuna para FIPV, y la única comercializada. Primucell es una cepade FIPV sensible a la temperatura que se puede replicar a las temperaturas más frías de la cavidad nasal, pero no atemperaturas corporales sistémicas (Gerber et al., 1990). Por tanto, la vacuna Primucell administrada intranasalmentese cree que produce una inmunidad localizada frente a FIPV. Sin embargo, quedan cuestiones importantes referentesa la eficacia y potencial de activación de esta vacuna (Olsen y Scott, 1991).

El virus Vaccinia se ha usado como vector para generar virus recombinantes que expresen genes estructurales deFIPV. Se demostró que un recombinante que expresaba el gen M de FIP, incrementaba el tiempo de supervivencia degatos, tras estimulación con FIPV (Vennema et al., 1990).

Vennema et al., (1991) se refiere a la estructura primaria de los genes de las proteínas de la membrana y de lanucleocápsida del virus de la peritonitis infecciosa felina, y a ciertos de sus virus recombinantes de Vaccinia introdu-cidos en gatitos. El gen de la matriz de FIPV de Vennema et al., se clonó a partir de una cepa patógena (79-1146) ysu secuencia parece ser idéntica al gen de la matriz (del que se habla en esta memoria). El recombinante de Vennemaet al., vFM, contiene la región codificadora de la matriz acoplada al promotor de Vaccinia de 7,5 K temprano/tardíoinsertado en el locus de la timidina-quinasa (tk). Hay que destacar que el promotor no estaba unido exactamente alcodón de iniciación ATG de la matriz, sino más bien a una posición 48 pb aguas arriba desde el ATC. Asimismo, nose eliminó una señal de terminación transcripcional temprana T5NT de Vaccinia (Yuen et al., 1987), localizada en laregión codificadora del gen de la matriz.

Adicionalmente, la cepa de Vaccinia en Vennema et al. es la cepa WR (Vennema et al., en página 328, columnaizquierda, 2 primeras líneas; véanse también los plásmidos donadores y virus testigos, según se mencionan en la

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misma página, en la sección “Construction of Recombinant Vaccinia Viruses expressing the FIPV M and N proteins”,que empieza en la parte central de la columna izquierda, que indican claramente a través de citas de literatura quese usa la cepa WR). La elección de cepa es importante porque la cepa WR es un virus de laboratorio -no una cepavacunal- y las características de la cepa WR no la hacen un vector actualmente aceptable para un recombinante quepueda ponerse en contacto con humanos y mucho menos un recombinante en una composición como una vacunao una composición antigénica o inmunológica direccionada a felinos, como gatitos u otros animales en contactocon humanos, especialmente niños pequeños o individuos inmunosuprimidos, debido a las recientes preocupacionesde transmisión por contacto (tales “otros animales” podrían ser cultivos celulares de laboratorio o animales para laexpresión antigénica o para producción de anticuerpos para producir kits, ensayos o pruebas).

Por tanto, en los artículos de Vennema et al., no describen o sugieren los recombinantes, composiciones y métodosde la presente invención.

Más en particular, los recombinantes de la presente invención emplean preferiblemente NYVAC o vectores (NY-VAC y ALVAC son vectores altamente atenuados que tienen un nivel de confinamiento BSL1).

Además, en construcciones de la presente invención, preferiblemente la región codificadora está acoplada al pro-motor en un acoplamiento preciso al codón ATG, sin que medie ninguna secuencia. (Cualquier secuencia T5NT sepuede inactivar mediante una sustitución de base que no cambia la secuencia aminoácida pero evitará una terminacióntranscripcional temprana en un vector de poxvirus). Además, pueden estar presentes copias múltiples, p.ej. dos, de laregión codificadora directamente acoplada al promotor, en cada genoma viral recombinante de la presente invención.

El estudio de eficacia de Venema et al. usó gatitos SPF (13-14 semanas de edad) que se vacunaron subcutáneamenteen el día 0 y en el día 21 con 1 x 108 y 5 x 108 ufp, respectivamente. En el día 35, los gatos se estimularon oralmentecon la cepa 79-1146 de FIP.

El protocolo en la presente invención fue similar, siendo la principal diferencia una dosis de vacunación inferior(1 x 107). Los resultados de protección de Vennema se basaban en la mortalidad, sobreviviendo 3 de cada 8 gatosvacunados con vFM (37,5%). Vennema et al., estimaron su estimulación suficiente, ya que 7 de cada 8 gatos novacunados sucumbieron a la exposición a la estimulación y murieron. Tras la necropsia, todos los gatos estimulados,en Vennema et al., incluyendo los tres gatos vacunados con vFM supervivientes, tenían signos patológicos de infecciónpor FIP, incluyendo efusiones peritoneales y lesiones granulomatosas sobre las vísceras.

Por contraste, los experimentos realizados en la presente invención fueron más restrictivos. En la presente inven-ción, los solicitantes contabilizaron la protección como supervivientes y exentos de patología FIP tras la necropsia.Usando este criterio, los solicitantes obtuvieron 3 gatos protegidos (60%) de cada 5 gatos vacunados con vCP262, y0% de gatos protegidos de los gatos sin vacunar. Si los resultados de Vennema et al. se contabilizaran usando los crite-rios de los solicitantes, Vennema no habría obtenido ninguna protección; y, por tanto, ningún recombinante adecuadopara uso vacunal. Además, Vennema et al. observaron fiebre y pérdida de peso en todos los gatos estimulados. En losexperimentos de los solicitantes, (véase experimento 3 en particular), se observó incluso ninguna pérdida de peso yuna respuesta febril inferior tras la estimulación.

Por tanto, los recombinantes de la presente invención emplean un vector aceptable para cualquier uso y un nivelde protección sorprendentemente superior a una dosis inferior que el recombinante de Vaccinia de Vennema et al.

Estudios recientes usando anticuerpos monoclonales dirigidos contra el gen S (Olsen et al., 1992) han mostradotambién que los mABs que neutralizan el virus pueden producir también ADE. No se observa ninguna activación conlos mABs frente a las proteínas de la matriz o la nucleocápsida.

Por tanto, previamente a la presente invención, se necesitaban recombinantes de poxvirus-FIPV, especialmenterecombinantes tales que usaran un vector aceptable y recombinantes tales que presentaran expresión a dosis bajas,las cuales producen, en efecto, protección; y se necesitaban composiciones que contuvieran tales recombinantes, asícomo métodos para producirlos y usarlos. Y, además, sería especialmente sorprendente e inesperado si este recom-binante poxvirus-FIPV se modificase para atenuarlo, p.ej, un recombinante de virus Vaccinia-FIPV atenuado o unrecombinante avipox-FIPV atenuado, como un recombinante NYVAC-FIPV o ALVAC-FIPV. Debido, por ejemplo,a la atenuación y a la replicación productiva reducida o inexistente del poxvirus en el hospedador, un experto en latécnica no habría esperado y se habría sorprendido por la utilidad del recombinante atenuado, especialmente parafelinos y otros hospedadores, y más especialmente en una composición tal que proporciona una respuesta que incluyela protección en felinos.

Los vectores de poxvirus atenuados serían también especialmente ventajosos para composiciones antigénicas ovacunales, particularmente a la vista de que los vectores atenuados proporcionan propiedades patogénicas reducidas,escasas o inexistentes con respecto al hospedador previsto o a hospedadores no previstos, posiblemente accidentales,como aquellos que trabajan con el vector, formulando o administrando el vector o antígeno, o que puedan entrar encontacto de otra forma con él. Es decir, los vectores de poxvirus atenuados proporcionan propiedades patogénicasreducidas, escasas o inexistentes frente a hospedadores previstos, como gatos, gatitos y similares, y frente a hospe-dadores no previstos, posiblemente accidentales, como seres humanos implicados en la formulación del vector en

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una composición para administración o en la administración de la composición (p.ej. veterinarios, técnicos, u otrostrabajadores), o que pueden entrar en contacto de otra forma con el vector (p.ej. propietarios de mascotas).

Se puede apreciar por tanto, que el suministro de un poxvirus recombinante de FIPV, y de sus composiciones yproductos, particularmente recombinantes de FIPV basados en NYVAC o ALVAC y sus productos y composiciones,sería un avance altamente deseable sobre el estado actual de la tecnología.

Objetos y sumario de la invención

Por tanto, un objeto de esta invención es proporcionar virus recombinantes modificados, los cuales tienen unaseguridad incrementada, y proporcionar un método para obtener tales virus recombinantes.

Objetos adicionales de esta invención incluyen: proporcionar un recombinante poxvirus-FIPV, composiciones quecontienen dicho recombinante, antígeno o antígenos procedentes del recombinante o de la composición, métodos parausar las composiciones o el recombinante, p.ej., usos in vivo e in vitro para expresión mediante administración oinfección. Preferiblemente, la composición de recombinante poxvirus-FIPV es una composición antigénica, vacunao composición inmunológica (es decir, una composición que contiene un recombinante que expresa antígeno, o elproducto procedente de expresión del antígeno).

En un aspecto, la presente invención se refiere a un virus recombinante modificado que tiene funciones genéticascodificadas por el virus inactivadas, de forma que el virus recombinante tiene una virulencia atenuada y una seguridadincrementada. Las funciones pueden ser no esenciales, o asociadas con la virulencia. El virus es ventajosamente unpoxvirus, particularmente un virus Vaccinia o un virus de la viruela aviar, como el virus de la viruela de las aves decorral y el virus de la viruela de los canarios. El virus recombinante modificado puede incluir, dentro de una región noesencial del genoma del virus, una secuencia de DNA heteróloga que codifica un antígeno o epítope derivado de FIPV.

En otro aspecto, la presente invención se refiere a una composición antigénica, inmunológica o de una vacuna o auna composición terapéutica para inducir una respuesta antigénica o inmunológica o protectora en un animal hospe-dador inoculado con la composición, incluyendo dicha composición un vehículo y un virus recombinante modificadoque tiene funciones genéticas codificadas por virus, no esenciales, inactivadas, de forma que el virus recombinantetiene una virulencia atenuada y una seguridad incrementada. El virus usado en la composición según la presente in-vención es ventajosamente un poxvirus, particularmente un virus Vaccinia o un virus de la viruela aviar, como virusde la viruela de las aves de corral o virus de la viruela de los canarios. El virus recombinante modificado puede incluir,en una región no esencial del genoma viral, una secuencia de DNA heterólogo que codifica una proteína antigénica,p.ej. derivada de FIPV. La composición puede contener un poxvirus recombinante que contiene la codificación para yexpresa el antígeno o antígenos de FIPV o el antígeno o antígenos aislados.

En otro aspecto adicional, la presente invención se refiere a métodos que emplean el recombinante o composiciónmencionados anteriormente; por ejemplo, para obtener una respuesta in vivo al antígeno o antígenos de FIPV. Elmétodo puede comprender administrar el recombinante o composición, bien a felinos, o a otros hospedadores, p.ej.,animales de laboratorio como roedores, p.ej. ratas, ratones, jerbos o similares, para producción de anticuerpos parakits, ensayos y similares.

En otro aspecto adicional, la presente invención se refiere a un virus recombinante modificado y a composicionesque lo contienen. El virus puede tener funciones genéticas codificadas por el virus, no esenciales, inactivadas, deforma que el virus tiene virulencia atenuada, y el virus recombinante modificado contiene además DNA de una fuenteheteróloga en una región no esencial del genoma del virus. El DNA puede codificar para un antígeno o antígenos deFIPV. En particular, las funciones genéticas se inactivan mediante deleción de un marco de lectura abierto que codificapara un factor de virulencia, o utilizando virus restringidos a un hospedador, existentes en la naturaleza. El virus usadosegún la presente invención es ventajosamente un poxvirus, particularmente un virus Vaccinia o un virus de la viruelaaviar, como el virus de la viruela de las aves de corral o el virus de la viruela de los canarios. Ventajosamente, elmarco de lectura abierto se selecciona del grupo formado por J2R, B13R + B14R, A26L, A56R, C7L - K1L, e I4L(mediante la terminología descrita en Goebel et al., 1990a, b); y sus combinaciones. A este respecto, el marco delectura abierto comprende regiones genómicas que comprenden un gen de timidina-quinasa, una región hemorrágica,una región de cuerpos de inclusión de tipo A, un gen de hemaglutinina, un gen de ámbito de hospedador o unaribonucleótido-reductasa de la subunidad grande; o sus combinaciones. Una cepa Copenhagen modificada adecuadadel virus Vaccinia se identifica como NYVAC (Tartaglia et al., 1992), o virus Vaccinia del cual se han eliminado pordeleción J2R, B13R+B14R, A26L, A56R, C7L-K11 e I4L o un gen de timidina-quinasa, una región hemorrágica,una región de un cuerpo de inclusión de tipo A, un gen de hemaglutinina, una región de ámbito de hospedador, y unaribonucleótido-reductasa de subunidad grande (Véase también patente de EE.UU. Nº 5.364.773). Alternativamente, unpoxvirus adecuado es ALVAC o un virus de la viruela de los canarios (cepa vacunal de Rentschler) que se ha atenuado,por ejemplo, a través de más de 200 pases en serie sobre fibroblastos de embrión de pollo, una siembra patrón delmismo se sometió a cuatro purificaciones de placa sucesivas en agar, de las cuales se amplificó un clon de placa através de cinco pases adicionales.

La invención, en otro aspecto adicional, se refiere al producto de expresión del recombinante poxvirus-FIPV de lainvención y a sus usos, como para formar composiciones antigénicas, inmunológicas o vacunales, para administracióna un hospedador, p.ej., animales, como felinos, o para administración para protección o respuesta o para tratamiento,

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prevención, diagnóstico o ensayo, y a métodos que emplean dichas tales composiciones. El antígeno o antígenos deFIPV, o el DNA que codifica dicho antígeno o antígenos de FIPV, puede codificar M, N y las tres versiones de S; S1,S2, S3 o sus combinaciones, p.ej., M+N.

La presente invención (recombinantes, composiciones y métodos y usos) se basa en los descubrimientos de que losrecombinantes NYVAC y ALVAC, particularmente los recombinantes NYVAC- y ALVAC-FIPV, sorprendentemen-te presentan expresión a pesar de la atenuación, y una expresión que puede conferir una respuesta verdaderamenteprotectora en un hospedador susceptible.

Esta y otras realizaciones de la invención se describen mediante la siguiente descripción detallada, o son obvias apartir de la misma y se encuentran incluidas.

Breve descripción de los dibujos

La siguiente descripción detallada, proporcionada a modo de ejemplo, pero no destinada a limitar la invenciónsolamente a las realizaciones especificadas descritas, se puede entender mejor conjuntamente con los dibujos adjuntos,en los que:

Figura 1 muestra la secuencia de DNA del marco de lectura abierto del gen de la matriz FIPV (cepa 79-1146);

Figura 2 muestra la secuencia de DNA del plásmido donador del gen de la matriz de FIPV (la región codificadoradel gen de la matriz modificado se inicia en 2408 y termina en 1620; el promotor de 42K entomopox comienza en2474; el brazo izquierdo de C5 va de 1 a 1549 y el brazo derecho de C5 va de 2580 a 2989);

Figura 3 muestra la secuencia de DNA del marco de lectura abierto del gen de la nucleocápsida de FIPV;

Figura 4 muestra la secuencia de DNA del plásmido donador del gen de la nucleocápsida de FIPV (la regióncodificadora del gen de la nucleocápsida empieza en 2101 y termina en 968; el promotor I3L de Vaccinia empieza en2160; el brazo izquierdo de C3 va de 1 a 939 y el brazo derecho de C3 va de 2285 a 4857);

Figura 5 muestra la secuencia de DNA del marco de lectura abierto del gen de la proyección superficial de FIPV(cepa 79-1146);

Figura 6 muestra la secuencia de DNA del plásmido donador del gen de la proyección superficial de FIPV (laregión codificadora del gen de la proyección superficial modificado se inicia en 591 y termina en 4976; el promotorH6 de Vaccinia empieza en 471; el brazo izquierdo C6 va de 1 a 387 y el brazo derecho de C6 va de 4983 a 6144);

Figura 7 muestra la secuencia de DNA del plásmido donador de la secuencia señal negativa del gen de la proyecciónsuperficial de FIPV (la región codificadora del gen de la proyección superficial modificado se inicia en 591 y terminaen 4922; el promotor H6 de Vaccinia empieza en 471; el brazo izquierdo C6 va de 1 a 387 y el brazo derecho de C6va de 4929 a 6090);

Figura 8 muestra la secuencia de DNA del plásmido donador del fragmento C-terminal del gen de la proyecciónsuperficial de FIPV (la región codificadora del gen de la proyección superficial modificado se inicia en 591 y terminaen 2369; el promotor H6 de Vaccinia empieza en 471; el brazo izquierdo C6 va de 1 a 387 y el brazo derecho de C6va de 2386 a 3537);

Figura 9 muestra la secuencia de DNA de un fragmento de 7351 pb de DNA del virus de la viruela de los canarios,que contiene el marco de lectura abierto de C3 (el ORF de C3 empieza en la posición 1458 y termina en la posición2897);

Figura 10 muestra la secuencia de DNA de un fragmento de 3208 pb de DNA del virus de la virus de la viruela delos canarios, que contiene el marco de lectura abierto de C5 (el ORF de C5 empieza en la posición 1537 y termina enla posición 1857); y,

Figura 11 muestra la secuencia de DNA de un fragmento de 3706 pb de DNA del virus de la viruela de los canarios,que contiene el marco de lectura abierto de C6 (el ORF de C6 empieza en la posición 377 y termina en la posición2254).

Descripción detallada de la invención

Para desarrollar una nueva cepa vacunal de Vaccinia, NYVAC (vP866), la cepa vacunal de Copenhagen del virusVaccinia se modificó mediante la deleción de seis regiones no esenciales del genoma, que codificaban factores devirulencia conocidos o potenciales. Las deleciones secuenciales se detallan más adelante (véase patente de EE.UU. Nº5.364.773). Todas las denominaciones de los fragmentos de restricción de Vaccinia, los marcos de lectura abiertos ylas posiciones de nucleótidos, se basan en la terminología descrita por Goebel et al., 1990a, b.

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Los loci delecionados se transformaron también mediante ingeniería genética como loci receptores para la inser-ción de genes extraños.

Las regiones delecionadas en NYVAC se enumeran debajo. Asimismo, se enumeran las abreviaturas y las denomi-naciones de los marcos de lectura abiertos para las regiones delecionadas (Goebel et al., 1990a, b) y la denominacióndel recombinante de Vaccinia (vP) que contiene todas las deleciones a través de la deleción especificada:

(1) gen de timidina-quinasa (TK; J2R) vP410;

(2) región hemorrágica (u; B13R + B14R) vP553;

(3) una región de cuerpo de inclusión de tipo A (ATI; A26L) vP618;

(4) gen de hemaglutinina (HA; A56R) vP723;

(5) región del ámbito del hospedador (C7L-K1L) vP804; y

(6) ribonucleótido-reductasa de la subunidad grande (I4L) vP866 (NYVAC).

NYVAC.

NYVAC es una cepa de virus Vaccinia modificada mediante ingeniería genética, que se generó mediante la dele-ción específica de dieciocho marcos de lectura abiertos que codifican productos génicos asociados con la virulenciay el ámbito de hospedador. NYVAC se atenúa mucho mediante varios criterios, que incluyen i) virulencia reducidatras inoculación cerebral en ratones recién nacidos, ii) inocuidad en ratones con inmunidad comprometida genética(nu*/nu*) o químicamente (ciclofosfamida), iii) incapacidad para producir infección diseminada en ratones con in-munidad comprometida, iv) carencia de induración y ulceración significativa en piel de conejo, v) eliminación rápidadesde el sitio de inoculación, y vi) competencia de replicación muy reducida sobre varias líneas celulares en cultivotisular, incluyendo las de origen humano. No obstante, los vectores basados en NYVAC inducen excelentes respuestasfrente a inmunógenos extrínsecos y proporcionan inmunidad protectora.

TROVAC se refiere a un virus de la viruela de las aves de corral atenuado, que era un aislado clonado en placa,derivado de la cepa vacunal FP-1 de un virus de la viruela de las aves de corral que está aprobada para la vacunaciónde pollos. ALVAC es un vector basado en virus de la viruela de los canarios atenuado, que era un derivado clonadoen placa de la vacuna aprobada de la viruela de los canarios, Kanapox (Tartaglia et al., 1992). ALVAC tiene algunaspropiedades generales que son las mismas que algunas propiedades de Kanapox. Se ha demostrado también que losvirus recombinantes basados en ALVAC que expresan inmunógenos extrínsecos, son eficaces como vectores vacunales(Tartaglia et al., 1993a, b). Este vector del virus de la viruela aviar está restringido a especies aviares para replicaciónproductiva. Sobre cultivos celulares humanos, la replicación del virus de la viruela de los canarios se interrumpe tem-pranamente en el ciclo de replicación viral, previamente a la síntesis de DNA viral. No obstante, cuando se transformamediante ingeniería genética para expresar inmunógenos extrínsecos, se observa auténtica expresión y tratamiento invitro en células de mamífero y la inoculación en numerosas especies de mamífero induce respuestas inmunológicasde anticuerpos y celulares frente al inmunógeno extrínseco, y proporciona protección frente a la estimulación con elpatógeno afín (Taylor et al., 1992; Taylor et al., 1991b). Experimentos clínicos recientes de fase I, tanto en Europacomo en Estados Unidos, de un recombinante de glicoproteína de la rabia/virus de la viruela de los canarios (ALVAC-RG), demostraron que la vacuna experimental se toleraba bien, e inducía niveles protectores de títulos de anticuerposneutralizantes del virus de la rabia (Cadoz et al., 1992; Fries et al., 1992). Adicionalmente, células mononucleares desangre periférica (PBMCs) derivadas de vacunados ALVAC-RG, demostraban niveles significativos de proliferaciónde linfocitos, cuando se estimulaban con FIPV purificado (Fries et al., 1992).

NIVAC, ALVAC y TROVAC se han reconocido también como únicos entre todos los poxvirus, ya que el NationalInstitute of Health (“NIH”) (servicio de salud pública de EE.UU.), el Recombinant DNA Advisory Committee, queemite normas para el confinamiento físico del material genético como virus y vectores, es decir, normas para proce-dimientos de seguridad para el uso de tales virus y vectores que están basados en la patogenicidad del virus o vectorparticular, concedieron una reducción en el nivel de confinamiento físico: de BSL2 a BSL1. Ningún otro poxvirustiene el nivel de confinamiento BSL1. Incluso la cepa Copenhagen del virus Vaccinia -la vacuna de la viruela común-tiene un nivel de confinamiento superior, es decir, BSL2. Consecuentemente, la técnica ha reconocido que NYVAC,ALVAC y TROVAC tienen una patogenicidad inferior a cualquier otro poxvirus.

Basándose claramente en los perfiles de atenuación de los vectores de NYVAC, ALVAC y TROVAC y en sucapacidad demostrada para provocar tanto respuestas inmunológicas humorales como celulares frente a inmunógenosextrínsecos (Tartaglia et al., 1993a, b; Taylor et al., 1992; Konishi et al., 1992), tales virus recombinantes ofrecen unaventaja distintiva sobre los virus recombinantes basados en Vaccinia descritos previamente.

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La invención proporciona recombinantes poxvirus-FIPV, preferiblemente recombinantes NYVAC- y ALVAC-FIPV,que contienen DNA exógeno que codifica para cualquiera o todos de FIPV, M, N, y las tres versiones de S, S1, S2, S3o N, y las tres versiones de S; S1, S2, S3 o sus combinaciones, p.ej., M+N.

El procedimiento de administración para el recombinante poxvirus-FIPV o su producto de expresión, las composi-ciones de la invención, como composiciones inmunológicas, antigénicas, vacunales o terapéuticas, puede ser vía unaruta parenteral (intradérmica, intramuscular o subcutánea). Tal administración permite una respuesta inmunológicasistémica, o respuestas humorales o celulares.

Más generalmente, los recombinantes poxvirus-FIPV, las composiciones inmunológicas, antigénicas, vacunalespoxvirus-FIPV o composiciones terapéuticas de la invención, se pueden preparar según técnicas estándar bien cono-cidas para los expertos en la técnica veterinaria o farmacéutica. Tales composiciones se pueden administrar en dosis ymediante técnicas bien conocidas para los expertos en la técnica veterinaria o farmacéutica, teniendo en cuenta factorestales como la edad, sexo, peso, especie y estado del paciente particular, y la vía de administración. Las composicionesse pueden administrar solas o se pueden administrar conjunta o secuencialmente con composiciones, p.ej., con “otras”composiciones inmunológicas, antigénicas, vacunales o terapéuticas, proporcionando así composiciones multivalenteso “cóctel” o de combinación, y métodos para emplearlas. De nuevo, los ingredientes y la manera (secuencial o admi-nistración conjunta) de administración, así como las dosis, se pueden determinar considerando factores tales como laedad, sexo, peso, especie y estado del paciente particular y la vía de administración. A este respecto, se hace referen-cia a la patente de EE.UU. Nº 5.843.456, presentada el 7 de junio de 1995, y referida a composiciones de la rabia,composiciones de combinación y sus usos.

Ejemplos de composiciones de la invención incluyen preparaciones líquidas para administración a través de orifi-cios, p.ej., oral, nasal, anal, vaginal, peroral, intragástrica, etc., tales como suspensiones, jarabes o elixires; y prepa-raciones para administración parenteral, subcutánea, intradérmica, intramuscular o intravenosa (p.ej., administracióninyectable), como suspensiones o emulsiones estériles. En tales composiciones, el poxvirus o los antígenos recombi-nantes pueden estar mezclados con un vehículo, diluyente o excipiente adecuado, como agua estéril, solución salinafisiológica, glucosa o similares. Las composiciones también pueden estar liofilizadas. Las composiciones pueden con-tener sustancias auxiliares, como agentes humectantes o emulsionantes, agentes tamponadores del pH, adyuvantes,aditivos mejoradores de gelificación o viscosidad, conservantes, agentes saborizantes, colorantes y similares, depen-diendo de la ruta de administración y de la preparación deseada. Se pueden consultar textos estándar, como “RE-MINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCE”, edición 17, 1985, para obtener preparaciones adecuadas, sin expe-rimentación excesiva. Las dosis adecuadas se pueden basar también en los ejemplos de más adelante.

Además, los productos de expresión de los poxvirus recombinantes de la invención y las composiciones que loscomprenden, se pueden usar directamente para estimular una respuesta inmunológica en individuos o en animales. Portanto, los productos de expresión se pueden usar en composiciones de la invención, en vez de, o además del poxvirusrecombinante de la invención, en las composiciones anteriormente mencionadas.

Adicionalmente, el poxvirus recombinante de la invención, sus productos de expresión y las composiciones dela invención estimulan una respuesta inmunológica o de anticuerpos en animales y, por tanto, esos productos sonantígenos. A partir de esos anticuerpos o antígenos, mediante técnicas bien conocidas en la técnica, se pueden prepararanticuerpos monoclonales, y esos anticuerpos monoclonales o los antígenos se pueden emplear en ensayos de unióna anticuerpo, kits diagnósticos o ensayos bien conocidos, para determinar la presencia o ausencia de un antígeno oantígenos de FIPV particulares; y, por tanto, la presencia o ausencia del virus o del antígeno o antígenos, o paradeterminar simplemente si se ha estimulado una respuesta inmunológica al virus o al antígeno o antígenos. Esosanticuerpos monoclonales o los antígenos se pueden emplear también en cromatografía de inmunoadsorción pararecuperar o aislar el antígeno o antígenos de FIPV o los productos de expresión del poxvirus recombinante o lascomposiciones de la invención.

Los métodos para producir anticuerpos monoclonales y para usos de anticuerpos monoclonales y para usos ymétodos para antígenos de FIPV -los productos de expresión del poxvirus y composiciones de la invención- se conocenbien por los expertos medios en la técnica y se pueden usar en métodos de diagnóstico, kits, pruebas o ensayos, asícomo para recuperar materiales mediante cromatografía de inmunoadsorción o mediante inmunoprecipitación.

Los anticuerpos monoclonales son inmunoglobulinas producidas mediante células de hibridoma. Un anticuerpomonoclonal reacciona con un único determinante antigénico y proporciona mayor especificidad que un anticuerpoconvencional, derivado del suero. Adicionalmente, la selección de un gran número de anticuerpos monoclonales per-mite seleccionar un anticuerpo individual con especificidad, avidez e isotipo deseados. Las líneas celulares de hibri-doma proporcionan una fuente constante, barata de anticuerpos químicamente idénticos y las preparaciones de talesanticuerpos se pueden estandarizar fácilmente. Los métodos para producir anticuerpos monoclonales son bien conoci-dos para los expertos medios en la técnica, p.ej., Koprowski, H. et al., patente de EE.UU. Nº 4.196.265, concedida el1 de abril de 1989.

Los usos de anticuerpos monoclonales son conocidos. Uno de tales usos son los métodos diagnósticos, p.ej., David,G. y Greene H. patente de EE.UU. Nº 4.376.110, concedida el 8 de marzo de 1983. Los anticuerpos monoclonales sehan usado también para recuperar materiales mediante cromatografía de inmunoadsorción, p.ej., Milstein, C., 1980,Scientific American 243:66, 70.

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Consecuentemente, el poxvirus recombinante y las composiciones de la invención tienen varias utilidades indicadasaquí. También existen otras utilidades para las realizaciones de la invención. A partir de los siguientes ejemplos,proporcionados a modo de ilustración, se comprenderá mejor la presente invención y sus muchas ventajas.

Ejemplos

Clonación y síntesis de DNA

Se construyeron, seleccionaron y cultivaron plásmidos mediante procedimientos estándar (Maniatis et al., 1982;Perkus et al., 1985; Piccini et al., 1987). Se obtuvieron endonucleasas de restricción de Bethesda Research Labora-tories, Gaithersburg, MD, New England Biolabs, Beverly, MA; y Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianapolis,IN. El fragmento de Klenow de la polimerasa de E. coli se obtuvo de Boehringer Mannheim Biochemicals. La exonu-cleasa BAL-31 y la ligasa de DNA del fago T4 se obtuvieron de New England Biolabs. Los reactivos se usaron comose especificaba por los distintos fabricantes.

Se prepararon oligodesoxirribonucleótidos sintéticos en un sintetizador de DNA de Biosearch 8750 o de AppliedBiosystems 380B, como se describió previamente (Perkus et al., 1989). La secuenciación de DNA se realizó medianteel método de terminación de cadena didesoxi (Sanger et al., 1977), usando Sequenase (Tabor et al., 1987) comose describió previamente (Guo et al., 1989). La amplificación de DNA mediante reacción en cadena de la polimerasa(PCR) para verificación de secuencia (Engelke et al., 1988) se realizó usando cebadores oligonucleotídicos sintetizadosal uso y un kit de reactivos de amplificación de DNA de GeneAmp (Perkin Elmer Cetus, Norwalk, CT) en un cicladortérmico de DNA de Perkin Elmer Cetus. Las secuencias de DNA en exceso se eliminaron por deleción a partir de losplásmidos mediante digestión con endonucleasa de restricción, seguida de digestión limitada mediante exonucleasaBAL-31 y mutagénesis (Mandecki, 1986), usando oligonucleótidos sintéticos.

Células, virus y transfección

Los orígenes y condiciones de cultivo de la cepa Copenhagen del virus Vaccinia se han descrito previamente(Guo et al., 1989). La generación del virus recombinante mediante recombinación, hibridación in situ de filtros denitrocelulosa y selección para actividad β-galactosidasa, son como se describieron previamente (Piccini et al., 1987).

Los orígenes y condiciones de cultivo de la cepa Copenhagen del virus Vaccinia y NYVAC se han descrito pre-viamente (Guo et al., 1989; Tartaglia et al., 1992). La generación del virus recombinante mediante recombinación,hibridación in situ de filtros de nitrocelulosa y selección para actividad β-galactosidasa, son como se describieronpreviamente (Panicali et al., 1982; Perkus et al., 1989).

NYVAC se prepara mediante referencia a la patente de EE.UU. Nº 5.364.773 y a la solicitud de patente de EE.UU.Nº de serie 105.483, admitida a trámite.

El virus parental de la viruela de los canarios (cepa de Rentschler) es una cepa vacunal para canarios. La cepavacunal se obtuvo de un aislado del tipo silvestre y atenuado mediante más de 200 pases en serie sobre fibroblastos deembrión de pollo. Una siembra viral patrón se sometió a cuatro purificaciones de placa sucesivas en agar y un clon deplaca se amplificó a través de cinco pases adicionales, tras lo cual se usó la cepa viral como virus parental en ensayosin vitro de recombinación. El aislado de virus de la viruela de los canarios purificado en placa se designa ALVAC.

La cepa del virus de la viruela de las aves de corral (FPV), denominada FP-1, se ha descrito previamente (Tayloret al., 1988a). Es una cepa vacunal atenuada, útil en la vacunación de pollos de días de edad. La cepa viral parentalDuvette se obtuvo en Francia como una costra cutánea de virus de la viruela de aves de corral, de un pollo. El virusse atenuó mediante aproximadamente 50 pases en serie en huevos de pollo embrionados, seguidos por 25 pases sobrecélulas de fibroblasto de embrión de pollo. El virus se sometió a cuatro purificaciones en placa sucesivas. Un aisladode placa se amplificó nuevamente en fibroblastos de embrión de pollo (CEF) primarios y se estableció una cepa devirus, denominada TROVAC.

Los vectores virales NYVAC, ALVAC y TROVAC y sus derivados se propagaron como se describió previamen-te (Piccini et al., 1987; Taylor et al., 1988a, b). Las células Vero y los fibroblastos de embrión de pollo (CEF) sepropagaron como se describió previamente (Taylor et al., 1988a, b).

Ejemplo 1

Generación de recombinantes de FIPV basados en ALVAC

1. Generación de un recombinante ALVAC que expresa el marco de lectura abierto del gen de la glicoproteína dela matriz del virus de la peritonitis infecciosa felina (FIPV)

(vCP262).

La cepa 79-1146 de FIPV se obtuvo del Dr. F. Scott (Cornell University, Ithaca, NY). El RNA total se aislóde células CRFK infectadas por FIPV, usando el procedimiento del isotiocianato de cuanidium-cloruro de cesio, de

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Chirgwin et al., (1979). El cDNA de la primera hebra se sintetizó usando transcriptasa inversa AMV y cebadoresoligonucleotídicos aleatorios (6-meros), mediante el procedimiento de Watson y Jackson (1985), produciendo cDNAmonocatenario complementario al mRNA de hebra positiva del FIPV.

El gen de la matriz (M) se amplificó mediante PCR a partir del cDNA de la primera hebra, usando los cebadoresoligonucleotídicos RG739 (SEQ ID NO : 1) (5’-TAAGAGCTCATGAAGTACATTTTGCT-3’) y RG740 (SEQ ID NO: 2) (5’-ATTGGTACCGTTTAGTTACACCATATG-3’). Estos cebadores se derivaron de la secuencia de Genbank CO-FIPVMN (nº de acceso X56496) (Vennema et al., 1991). Este fragmento de PCR de 800 pb se digirió con Asp718/SacI,se purificó en gel, y se unió en pBluescript SK+, digerido con Asp718/SacI, para producir pBSFIPM. El ORF del genM se secuenció y se presenta en la Figura 1 (SEQ ID NO : 3).

pBSFIPM se transformó en células GM48 (dam-), y se aisló el DNA del plásmido, que se desmetiló (pBSFIPM-desmet). Se amplificó un fragmento de PCR de 330 pb a partir de pBSFIPM, usando los oligonucleótidos RG751 (SEQID NO: 4) (5’-TCTGAGCTCTTTATTGGGAAGAATATGATAATATTTTGGGATTTCAAAATTGAAAATATATAATTACAATATAAAATGAAGTACATTTTGCT-3’) y RG752 (SEQ ID NO: 5) (5’-CACATGATCAGCATTTTAATGCCATAAACGAGCCAGCTAAATTGTGGTCTGCCATATTG TAACACTGTTATAAATACAATC-3’) y se digirió conSacI/BclI. Este fragmento se purificó en gel, se ligó en pBSFIPM (desmet), y se digirió con BclI para producirpFIPM42K. Se generó un fragmento de 85 pb como un cebador-dímero de PCR, a partir de los oligonucleóti-dos RG749 (SEQ ID NO: 6) (5’-TCCGAGCTCTAATTAATT-AACGAGCAGATAGTCTCGTTCTCGCCCTGCCTG-3’) y RG750 (SEQ ID NO: 7) (5’-TACGAGCTCAAGCTTCCCGGGTTAATTAATTAGTCATCAGGCAGGGCGAGAACG-3’). Este fragmento se digirió con SacI y se introdujo en pFIPM42K digerido con SacI para producirpFIPM42KVQ. Esta construcción del plásmido contiene una casete de expresión formada por el ORF completo dela matriz de FIPV (con una señal de parada transcripcional temprana T5NT, mutada), acoplada al promotor de 42Kde entomopox (SEQ ID NO: 8) (5’ TTTATTGGGAAGAATATGATAATATTTTGGG-ATTTCAAAATTGAAAATATATAATTACAATATAAA-3’). La secuencia T5NT está modificada de forma que ya no funciona como una señal deparada de transcripción temprana y no se cambia ningún aminoácido. Esta casete se escindió digiriendo pFIPM42KVQcon Asp718/HindIII y se aisló en forma de un fragmento de 950 pb. Los extremos de este fragmento se hicieron romosusando la polimerasa de Klenow y se introdujeron en el locus de inserción ALVAC C5 del plásmido de inserciónpNC5LSP-5, digerido con SmaI. El plásmido donador resultante, pC5FIPM42K, se confirmó mediante análisis desecuencia del DNA. Éste está formado por el promotor de 42K de entomopox, acoplado al ORF de la matriz de FIPVen el ATG, flanqueado por los brazos izquierdo y derecho del locus de inserción C5 de ALVAC (Figura 2 (SEQ IDNO: 9)).

Este plásmido donador, pC5FIPM42K, se usó en recombinación in vivo (Piccini et al., 1987) con el vector delvirus ALVAC, para generar el virus recombinante vCP262.

El análisis de inmunoprecipitación de un lisado de células Vero marcado radiactivamente, infectadas con vCP262,usando un anticuerpo monoclonal específico de la matriz de FIP, denominado 15A9.9 (Olsen et al., 1992), mostraba laexpresión de una banda polipeptídica de 30 kDa. Esto era consecuente con el tamaño esperado del producto del gen M.Además, la banda migraba conjuntamente con una banda inmunoprecipitada a partir de células infectadas con FIPV.El análisis de separación de células activadas por fluorescencia (FACS), usando el mismo anticuerpo monoclonal,mostraba que esta proteína expresada de vCP262 se localizaba en el citoplasma de la célula infectada.

2. Generación de un recombinante ALVAC que expresa el marco de lectura abierto del gen de la nucleocápsida deFIPV

(vCP261A).

El gen de la nucleocápsida de FIPV (N) se amplificó mediante PCR usando el cDNA de la primera hebra (descritoen 1, más arriba), como molde y los cebadores oligonucleotídicos RG741 (SEQ ID NO : 10) (5’-TAAGAGCTCATG-GCCACACAGGGACAA-3’) y RG742 (SEQ ID NO : 11) (5’-TATGGTACCTTA-GTTCGTAACCTCATC-3’). Estoscebadores se derivaron de la secuencia de Genbank COFIPVMN (Nº de acceso X56496) (Vennema et al., 1991). Elfragmento de 1150 pb resultante se digirió con Asp718/SacI y se ligó en pBluescript SK+, digerido con Asp718/SacI,produciendo pBSFIPN. El ORF del gen N se secuenció y se presenta en la Figura 3 (SEQ ID NO: 12).

El promotor I3L de Vaccinia (SEQ ID NO: 13) (5’-TGAGATAAAGTGAAAATATATATCATTATATTACAAAGTACAATTATTTAGGTTTAATC-3’) (Schmitt y Stunnenberg, 1988) se acopló al ATG del ORF N, de la siguienteforma: Un fragmento de 370 pb se amplificó mediante PCR, usando pBSFIPN como molde y los cebadores oligonu-cleotídicos RG747 (SEQ ID NO: 14) (5’-CATCAGCATGAGGTCCTGTACC-3’) y RG748 (SEQ ID NO: 15) (5’-TAAGAGCTCTGAGATAAAGTGAAAATATATA - TCATTATATTACAAAGTACAATTATTTAGGTTTAATCATGGCCACACAGGGACAA-3’). Este fragmento se digirió con SacI/PPuMI y se ligó en pBSFIPN digerido con SacI/PPuMI,produciendo pFIPNI3L. Se generó un fragmento de 85 pb como un cebador-dímero de PCR a partir de los oligonucleó-tidos RG749 (SEQ ID NO: 6) (5’-TCCGAGCTCTAATTAATTAACGAGCAGATAGTCTCGTTCTCGCCCTGCCTG-3’) y RG750 (SEQ ID NO:7) (5’-TACGAGCTCAAGCTTCCCGGGTTAATTAATTAGTCATCAGGCAGGGCGAGAACG-3’). Este fragmento se digirió con SacI y se ligó en pFIPNI3L digerido con SacI, para producir pFIPNI3LVQ.La casete de expresión del gen N (N bajo el promotor I3L) se escindió en forma de un fragmento de 1300 pb, mediantedigestión de pFIPNI3LVQ con Asp718/HindIII. Los extremos de este fragmento se hicieron romos con la polimerasade Klenow y se ligaron en el plásmido de inserción C3, pSPCP3LSA (véase más adelante), digerido con SmaI. El

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plásmido donador resultante, pC3FIPNI3L, se confirmó mediante análisis de secuencia de DNA. Dicho plásmido estáformado por el promotor I3L de Vaccinia, acoplado al ORF del gen N de FIPV, flanqueado por los brazos izquierdo yderecho del locus de inserción C3 de ALVAC (Figura 4 (SEQ ID NO: 16)).

Este plásmido donador, pC3FIPNI3L, se usó en recombinación in vivo (Piccini et al., 1987) con el vector del virusALVAC, para generar el virus recombinante vCP261A.

El análisis de inmunoprecipitación de un lisado de células Vero marcado radiactivamente, infectadas con vCP261A,usando un anticuerpo monoclonal específico de la nucleocápsida de FIP, denominado 17B7.1 (Olsen et al., 1992), mos-traba la expresión de una banda polipeptídica de 45 kDa. Esto era consecuente con el tamaño esperado del productodel gen N. Además, la banda migraba conjuntamente con una banda inmunoprecipitada a partir de células infecta-das con FIPV. El análisis de separación de células activadas por fluorescencia (FACS), usando el mismo anticuerpomonoclonal, mostraba que esta proteína expresada de vCP261A se localizaba en el citoplasma de la célula infectada.

3. Generación de un recombinante ALVAC que expresa los marcos de lectura abiertos, tanto de la matriz como dela nucleocápsida de FIPV

(vCP282).

El plásmido pC5FIPM42K (Figura 2, SEQ ID NO : 9), que contenía el ORF del gen de la matriz de FIPV acopladoal promotor de 42K de entomopox, se usó en recombinación in vivo (Piccini et al., 1987) con el recombinante ALVAC-FIP-N (vCP261A) (descrito en 2, más arriba), para generar el recombinante doble vCP282. Este recombinante contieneel ORF del gen M de FIPV (promotor de 42K), insertado en el locus C5 y el ORF del gen N de FIPV (promotor I3L),insertado en el locus C3.

El análisis de inmunoprecipitación a partir de un lisado marcado radiactivamente de células Vero infectadas convCP282, usando un anticuerpo monoclonal específico de la matriz, denominado 15A9.9 (Olsen et al., 1992), mostrabala expresión de una banda polipeptídica de 30 kDa, mientras que usando un anticuerpo monoclonal específico de la nu-cleocápsida, denominado 17B7.1, mostraba la expresión de una banda polipeptídica de 30 kDa, mientras que, usandoun anticuerpo monoclonal específico de la nucleocápsida, mostraba la expresión de una banda polipeptídica de 45 kDa.Esto era consecuente con el tamaño esperado de los productos de los genes M y N, respectivamente. Además, ambasbandas migraban conjuntamente con bandas inmunoprecipitadas a partir de células infectadas con FIPV. El análisisde separación de células activadas por fluorescencia (FACS), usando el mismo anticuerpo monoclonal, mostraba queestas proteínas expresadas de vCP282 se localizaban en el citoplasma de la célula infectada.

4. Generación de un recombinante ALVAC que expresa el ORF del gen de la glicoproteína de la proyecciónsuperficial de FIPV completa

(vCP281).

El gen de la proteína de la proyección superficial (S) de FIPV se obtuvo mediante amplificación PCR a partir delmolde de cDNA de la primera hebra (descrito en 1, más arriba), en tres secciones. Los cebadores de PCR se sintetizaronbasándose en la secuencia de Genbank COFIPE2 (Nº de acceso X06170) (De Groot et al., 1987). El extremo 5’ seamplificó mediante PCR, usando los cebadores oligonucleotídicos JP53 (SEQ ID NO: 17) (5’-CATCATGAGCTCATGATTGTGCTCGTAAC-3’) y JP77 (SEQ ID NO: 18) (5’-AACAGCCGCTTGTGCGC-3’). El fragmento de 1630 pbaislado se digirió con SacI/HindIII y se ligó en pBluescript SK+ digerido con SacI/HindIII, para producir pBSFIP-SA,lo cual se confirmó mediante análisis de secuencia de DNA.

La sección intermedia de S se amplificó mediante PCR, usando los cebadores oligonucleotídicos JP84 (SEQ IDNO: 19) (5’-CTTGGTATGAAGCTTAG-3’) y JP85 (SEQ ID NO: 20) (5’-GGTGACTTAAAGCTTGC-3’). El frag-mento de 1715 pb aislado se digirió con HindIII y se ligó en pBluescript SK+ digerido con HindIII. Se secuenciarondos clones, pKR5 y pKW13, y se encontró que tenían errores (basándose en la secuencia de Genbank COFIPE2), peroen diferentes localizaciones. Para corregir estos errores de PCR, se reemplazó una sección de pKW13 por un subfrag-mento de pKR5, de la siguiente forma. PKR5 se digirió con ClaI, sus extremos se hicieron romos con la polimerasade Klenow, se digirió con BstEII, se aisló un fragmento de 750 pb, y se clonó en pKR13, digerido con SmaI/BstEII.El plásmido resultante, pBSFIPS-MII, se confirmó mediante análisis de secuencia de DNA.

La sección 3’ de S se amplificó mediante PCR, usando los cebadores oligonucleotídicos JP71 (SEQ ID NO: 21)(5’-TAATGATGCTATACATC-3’) y JP90 (SEQ ID NO : 22) (5’-CATCATGGTACCTTAGTGGACATGCACTTT-3’). El fragmento de 1020 pb aislado se digirió con HindIII/Asp718 y se introdujo en pBluescript SK+ digerido conHindIII/Asp718, para producir pBSFIPS-C, el cual se confirmó mediante análisis de secuencia de DNA.

La secuencia de DNA completa del gen de la proyección superficial de FIPV, según se derivó del cDNA de la cepa79-1146, se presenta en la Figura 5 (SEQ ID NO: 23).

El ORF de la proyección superficial contiene señales de parada transcripcional temprana T5NT. Dos se eliminaronde la sección intermedia introduciendo mutaciones a través de PCR. Un fragmento de PCR de 330 pb se amplificó depBSFIPS-MII, usando los cebadores oligonucleotídicos RG757B (SEQ ID NO : 24) (5’-CATTAGACTCTGTGACGC

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CATGTGATGTAA - GCGCACAAGCGGCTGTTATCGATGGTGCCATAGTTGGAGCTATGACTTCCATTAACAGT-GAACTGTTAGGCCTAACACATTGGACAACGACACCTAATTTCTATTAC-3’) y RG758B (SEQ ID NO: 25) (5’-CATTAGACTGTAAACCTGCATGTATTCAACTTG-CACAGATATTGTAAAATTTGTAGGTATCGTGACATTACCAGTGCTAATTGGTTGCACGT-CTCCGTCAGAATGTGTGACGTTAATAAATACCAAAG-3’), se digirió con HgaI/BspMI, y se clonó en pBSFIPS-MII digerido con HgaI/BspMI, para producir pMJ5. El análisis de secuencia de pMJ5reveló una deleción de 33 pb que se corrigió reemplazando el fragmento de 250 pb StuI/BspMI con un fragmentode PCR amplificado a partir de pBSFIPS-MII usando los cebadores oligonucleotídicos RG758B (SEQ ID NO: 25) yJP162 (SEQ ID NO: 26) (5’-GTGAACTGTTAGGCCTAACACA-TTGGACAACGACACCTAATTTCTATTAC-3’).El fragmento aislado se digirió con StuI/BspMI y se ligó en pMJ5 digerido con StuI/BspMI, para producir pNR3.Este plásmido tenía un cambio de base en posición 2384, que se corrigió usando el kit de mutagénesis U.S.E. (Phar-macia), para producir pBSFIPS-MIIDII. Este plásmido contiene la región intermedia del gen S con secuencias T5NTcambiadas, y la introducción de nuevos sitios ClaI y StuI, aunque manteniendo la secuencia aminoácida correcta.

A fin de acoplar el promotor H6 de Vaccinia (SEQ ID NO: 27) (5’-TTCTTTATTCTATACTTAAAAAGTGAAAATAAATACAAAGGTTCTTGA - GGGTTGTGTTAAATTGAAAGCGAGAAAAAAAATAATCATAAATTATTTCATTATCGCG-ATATCCGTTAAGTTTGTATCGTA-3’) (Perkus et al., 1989) al ATG del gen S, se llevó a cabo lo siguien-te. El extremo 3’ del promotor H6 acoplado al gen S, se amplificó como un fragmento de PCR, a partir de pBSFIPS-A(sección 5’ del gen S), usando los cebadores oligonucleotídicos RG755 (SEQ ID NO : 28) (5’-CTTGTATGCATTCATTATTTG-3’) y RG756 (SEQ ID NO: 29) (5’-TCCGAGCTCGATATCCGTTAAGTTTGTATCGTAATGATTGTGCTCGTAAC-3’). El fragmento de 100 pb se digirió con SacI/NsiI y se ligó en pBSFIPS-A digerido con SacI/NsiI, paraproducir pBSFIPS-AH6.

Para eliminar la secuencia T5NT en la sección 5’ del gen de la proyección superficial sin alterar la secuencia ami-noácida, se amplificó un fragmento de PCR de 350 pb, a partir de pBSFIPS-AH6, usando los cebadores oligonucleo-tídicos RG753 (SEQ ID NO: 30) (5’-TCACTGCAGATGTACAATCTG-3’) y RG754 (SEQ ID NO: 31) (5’-CAGTATACGATGTGTAAGCAATTGTCCAAAAA - GCTCCACTAACACCAGTGGTTAAAT - TAAAAGATATACAACCAATAGGAAATGTGCTAAAGAAATTGTAACCATTAATATAGAAATGG-3’). El fragmento se digirió con PstI/AccIy se introdujo en pBSFIPS-AH6 digerido con PstI/AccI, para producir pNJ1.

Los extremos 5’, intermedio y 3’ del gen S se acoplaron conjuntamente para formar el ORF completo, de laforma siguiente. Primero, la sección 3’ se escindió en forma de un fragmento de 1000 pb, digiriendo pBSFIPS-Ccon Asp718/HinDIII y ligando en pNJ1 (sección 5’) digerido con Asp718/HinDIII, produciendo pBSFIPS-A/CH6.La sección intermedia se añadió, escindiendo un fragmento de 1700 pb de pBSFIPSMIIDII, digiriendo con HinDIIIy ligando en pBSFIPS-A/CH6 digerido con HinDIII, y seleccionado para orientación. El plásmido resultante, pBS-FIPSH6II, contiene el ORF completo de S acoplado al extremo 3’ del promotor H6, con todas las secuencias T5NTeliminadas.

Para insertar el ORF de S completo en un plásmido donador C6, se escindió una casete de 4,4 kb de pBSFIPSH6II,digiriendo con EcoRV/EcoRI y rellenando los extremos con polimerasa de Klenow. Esta casete se introdujo en pJ-CA070 digerido con EcoRV/EcoRI y se rellenó con polimerasa de Klenow. El plásmido resultante, pOG9, se encon-tró, mediante análisis de secuencia de DNA, que tenía un inserto de 110 pb en el promotor H6 entre los sitios NruI yEcoRV. Para eliminar estas secuencias, pOG9 se digirió con NruI/EcoRV y se volvió a ligar, para producir el plásmidodonador pC6FIPSH6II, que tiene el promotor H6 completo, menos cuatro pares de bases entre los sitios NruI y EcoRI,que no se requieren para la transcripción temprana y tardía. Este plásmido está formado por el brazo izquierdo dellocus C6, el promotor H6, el ORF del gen S completo y el brazo derecho del locus C6 (Figura 6 (SEQ ID NO : 32)).Una mutación en el codón de parada añade nueve aminoácidos adicionales al extremo C-terminal de la proyecciónsuperficial (Figura 7).

Este plásmido donador, pC6FIPSH6II, se usó en recombinación in vitro (Piccini et al., 1987) con el vector delvirus ALVAC, para generar el virus recombinante vCP281.

El análisis de inmunoprecipitación a partir de un lisado de células CRFK infectadas con vCP281, usando un anti-cuerpo monoclonal específico de la proyección superficial de FIP, denominado 23F4.5 (Olsen et al., 1992), mostrabala expresión de una banda polipeptídica de 220 kDa. Esto era consecuente con el tamaño esperado del producto delgen S. Además, la banda migraba conjuntamente con una banda inmunoprecipitada a partir de células infectadas conFIPV, consecuente con la glicosilación adecuada. El análisis FACS usando el mismo anticuerpo monoclonal, mostrabaque esta proteína expresada a partir de vCP281 estaba localizada en el citoplasma de la célula infectada. Sin embargo,la inoculación de monocapas de células CRFK con vCP281 mostraba una gran actividad fusigénica, indicando que laproteína estaba también en la superficie de estas células. No se observó ninguna actividad fusigénica en células CRFKinfectadas con el virus ALVAC parental (testigo).

5. Generación de un recombinante ALVAC que expresa el ORF del gen de la glicoproteína de la proyecciónsuperficial de FIPV, menos la secuencia señal

(vCP283B).

La secuencia señal de 57 pb se eliminó del extremo N-terminal del gen S y se reemplazó por un ATG, insertando un

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fragmento de PCR de 270 pb en pOG9, como sigue. El fragmento de PCR se amplificó a partir de pBSFIPS-A, usan-do los cebadores oligonucleotídicos RG759 (SEQ ID NO : 33) (5’-GCTATTTTCCATGGCTTCC-3’) y RG760 (SEQID NO: 34) (5’-TCCGAGCTCGATATCCGTTAAGTTTGTATCGTAATGA-CAACAAATAATGAATGC-3’). El frag-mento se digirió con EcoRV/NcoI y se ligó en pOG9 digerido con EcoRV/NcoI, para producir pOM12. pOM12 sedigirió con EcoRV/NruI y se volvió a ligar para eliminar el inserto de 110 pb en el promotor H6. El plásmido donadorresultante, pC6FIPSH6-SS, se confirmó mediante análisis de secuencia de DNA (Figura 7 (SEQ ID NO :35)).

Este plásmido donador, pC6FIPSH6-SS, se usó en recombinación in vivo (Piccini et al., 1987) con el vector delvirus ALVAC, para generar el virus recombinante vCP283B.

El análisis de inmunoprecipitación a partir de un lisado marcado radiactivamente de células CRFK infectadas convCP283B, usando un suero de gato inmune a FIP (Nº 511), mostraba la expresión de una banda polipeptídica de apro-ximadamente 145±10 kDa. Esto era consecuente con el tamaño predicho de un producto génico S no glicosilado. Elanálisis de inmunofluorescencia usando el mismo suero policlonal, mostraba que esta proteína expresada se localizabaen el citoplasma de células CEF infectadas con vCP283B. No se observaba actividad fusigénica en células CRFK.

6. Generación de un recombinante ALVAC que expresa la sección C-terminal del ORF del gen de la glicoproteína delas proyecciones superficiales (spike) de FIPV

(vCP315).

Las 1749 pb C-terminales del gen S (582 aminoácidos terminales, de 1452 aminoácidos totales) se conectaron alpromotor H6 como sigue. pOG9 se digirió con NruI/BstEII y se aisló un fragmento de 6,2 kb. Este fragmento contienela porción C-terminal de 1749 pb del gen S. Se generó un fragmento que contenía el extremo 3’ del promotor H6 unidoa un codón ATG flanqueado por un sitio BstEII, mediante anillamiento de los oligonucleótidos JP226 (SEQ ID NO:36) (5’-CATTAGCATGATATCCGTTAAGTTTGTATCGT-AATGGGTAACCCTGAGTAGCAT-3’) y JP227 (SEQ IDNO: 37) (5’-ATGCTACTCAGGGTTACCCATTACGATACAAACTTAACGGATATCATGCTAATG-3’), y digiriendocon NruI/BstEII. Este fragmento se ligó en el fragmento pOG9 de 6,2 kb (véase 4 más arriba), para producir elplásmido donador pC6FIPSH6-C, que se confirmó mediante análisis de secuencia de DNA (Figura 8 (SEQ ID NO :38)).

Este plásmido donador, pC6FIPSH6-C, se usó en recombinación in vivo (Piccini et al., 1987) con el vector delvirus ALVAC, para generar el virus recombinante vCP315.

El análisis de transferencia Western a partir de un lisado de células CRFK infectadas con vCP315 usando un suerode gato inmune a FIP (Nº 511), mostraba la expresión de una banda polipeptídica de 56 kDa. Ésta era ligeramente máspequeña que el tamaño predicho del producto del gen S no glicosilado, truncado (64 kDa). El análisis de inmunofluo-rescencia usando el mismo suero policlonal mostraba una detección débil de la proteína localizada en el citoplasma decélulas CEF infectadas por vCP315. No se observó ninguna actividad fusigénica en células CRFK.

Ejemplo 2

Generación de plásmidos de inserción de C3, C5 y C6

Generación del plásmido de inserción de C3, pSPCP3LA

Se clonó un fragmento de BglII del virus de la viruela de los canarios de 8,5 kb, en el sitio BamI de pBluescript SK+(Stratagene, La Jolla, CA), para producir pWW5. El análisis de la secuencia nucleotídica de este fragmento reveló unmarco de lectura abierto denominado C3, iniciado en la posición 1458 y terminado en la posición 2897, en la secuen-cia presentada en la Figura 9 (SEQ ID NO : 39). A fin de delecionar el marco de lectura abierto (ORF) C3 completo,se diseñaron cebadores de PCR para amplificar un fragmento 5’ y un fragmento 3’, relativos al ORF C3. Los ceba-dores oligonucleotídicos RG277 (SEQ ID NO: 40) (5’-CAGTTG-GTACCACTGGTATTTTATTTCAG-3’) y RG278(SEQ ID NO: 41) (5’-TATCTGAATTCCTGCAGCCCGGGTTTTTATAGCTAATTAGTCAAATG-TGAGTTAATATTAG-3’) se usaron para amplificar el fragmento 5’ a partir de pWW5 y los cebadores oligonucleotídicos RG279 (SEQID NO: 42) (5’-TCGCTGAATTCGATATCAAGCTTATCGATTTTTATGACTAGTTAATCAAATAAAAA-GCATACAAGC-3’) se usaron para amplificar el fragmento 3’ desde pWW5. El fragmento 5’ se digirió con Asp718/EcoRI yel fragmento 3’ se digirió con EcoRI/SacI. Los brazos 5’ y 3’ se ligaron a continuación en pBluescript SK+ digeridocon Asp718/SacI, para producir pC3I. Este plásmido contiene el sitio de inserción de C3, con el ORF de C3 eliminadopor deleción y reemplazado por un sitio de clonación múltiple, flanqueado por una señal de terminación de traduccióny traducción temprana de Vaccinia. pC3I se confirmó mediante análisis de secuencia de DNA.

Los brazos que flanquean a pC3I se alargaron como sigue. Se obtuvo un fragmento de 908 pb aguas arriba dellocus C3, mediante digestión de pWW5 con NsiI y SspI. Un fragmento de PCR de 604 pb se amplificó a partirde pWW5, usando los cebadores oligonucleotídicos CP16 (SEQ ID NO: 43) (5’-TCCGGTACCGCGGCCGCAGATATTTGTTAGCTTCTGC-3’) y CP17 (SEQ ID NO: 44) (5’-TCGCTCGAGTAGGATACCTACCTACTACCTA-CG-3’), digerido con Asp718/XhoI y se ligó en pIBI25 (International Biotechnologies, Inc., New Haven, CT), para pro-ducir pSPC3LA. pSPC3LA se digirió en pIBI25 con EcoRV y dentro del inserto (DNA del virus de la viruela de los

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canarios), con NsiI y se ligó al fragmento Nsi/SspI de 908 pb, gnerando pSPCPLAX, que contiene 1444 pb del DNAdel virus de la viruela de los canarios, aguas arriba desde el locus C3. Se aisló un fragmento BglII/StyI de 2178 pbde pXX4 (que contiene un fragmento NsiI de 6,5 kb de DNA del virus de la viruela de los canarios, clonado en elsitio PstI de pBluescript SK+). Se amplificó un fragmento de PCR de 279 pb de pXX4, usando los cebadores oligo-nucleotídicos CP19 (SEQ ID NO: 45) (5’-TCGCTCGAGCTTTCTTGACAATAACATAG-3’) y CP20 (SEQ ID NO:46) (5’-TAGGAGCTCTTTATACTACTGGGTTACAAC-3’), se digirió con XhoI/SacI, se ligó en pIBI25 digerido conSacI/XhoI, para producir pSPC3RA.

Para añadir sitios exclusivos al sitio de clonación múltiple (MCS) en pC3I, se digirió pC3I con EcoRI/ClaI (enel MCS) y se ligó a los oligonucleótidos digeridos con quinasa y anillados CP12 (SEQ ID NO: 47) (5’-AATTCCTCGAGGGATCC-3’) y (SEQ ID NO: 48) (5’-CGGGATCCCTCG-AGG-3’) (que contenían un extremo cohesivo EcoRI,un sitio XhoI, un sitio BamHI y un extremo cohesivo compatible con ClaI), para producir pSPCP3S. pSPCP3S sedigirió en las secuencias del virus de la viruela del canario, aguas abajo del locus C3, con StyI y SacI (de pBluescriptSK+) y se ligó en un fragmento BglII/SacI de 261 pb de pSPC3RA y al fragmento BglII/StyI de 2178 pb de pXX4,generando pCPRAL que contenía 2572 pb de secuencias del virus de la viruela de los canarios, aguas abajo del locusC3. pSPCP3S se digirió en las secuencias del virus de la viruela de los canarios, aguas arriba del locus C3, con Asp718(en pBluescript SK+) y AccI, y se ligó a un fragmento Asp718/AccI de 1436 pb de pSPCPLAX, generando pCPLAI,que contenía 1457 pb de DNA del virus de la viruela de los canarios, aguas arriba del locus C3. pCPLAI se digirió enlas secuencias del virus de la viruela de los canarios, aguas abajo del locus C3, con StyI y SacI (en pBluescript SK+)y se ligó a un fragmento StyI/SacI de 2438 pb de pCPRAL, generando el plásmido pSPCP3LA. El brazo izquierdode pSPCP3LA se acortó en aproximadamente 500 pb como sigue. pSPCP3LA se digirió con NotI/NsiI y se aisló unfragmento de 6433 pb. Los oligonucleótidos CP34 (SEQ ID NO: 49) (5’-GGCCGCGTCGACATGCA-3’) y CP35(SEQ ID NO: 50) (5’-TGTCGACGC-3’) se anillaron y se ligaron en este fragmento, para producir pSPCP3LSA. Estees el plásmido de inserción de C3, que está formado por 939 pb del DNA del virus de la viruela de los canarios aguasarriba del locus C3, codones de parada en seis marcos de lectura, señal de terminación transcripcional temprana, unMCS, señal de terminación transcripcional temprana, codones de parada en seis marcos de lectura y 2572 pb de DNAdel virus de la viruela de los canarios, aguas abajo del locus C3.

Generación del plásmido de inserción de C5, pNC5LSP-5

Se construyó una genoteca de DNA del virus de la viruela de los canarios en el vector cósmido pVK102 (Knaufy Nester, 1982), se sometió a análisis mediante sondas de ácidos nucleicos con pRW764.5 (un plásmido basado enpUC9 que contiene un fragmento PvuII del virus de la viruela de los canarios de 880 pb, que incluye el ORF de C5) yse identificó un clon del cósmido que contenía un inserto de 29 kb (pHCOS1). Se identificó un fragmento ClaI de 3,3kb de pHCOS1 que contenía la región C5. El ORF de C5 se inicia en la posición 1537 y termina en la posición 1857,en la secuencia mostrada en la Figura 10 (SEQ ID NO: 51).

El vector de inserción de C5 se construyó en dos etapas. La secuencia aguas arriba de 1535 pb se generó me-diante amplificación PCR a partir de DNA genómico purificado de virus de la viruela de los canarios, usando loscebadores oligonucleotídicos C5A (SEQ ID NO: 52) (5’-ATCATCGAATTCTGAATGTTAAATGTTATACTTTG-3’) y C5B (SEQ ID NO: 53) (5’-GGGGGTACCTTTGAGAGTACCACTTCAG-3’). Este fragmento se digirió conEcoRi y se ligó en pUC8 digerido con EcoRI/SmaI, para producir pC5LAB. El brazo de 404 pb se generó me-diante amplificación PCR, usando los oligonucleótidos C5C (SEQ ID NO: 54) (5’-GGGTCTAGAGCGGCCGCTTATAAAGATCTAAAATGCATAATTTC-3’) y C5DA (SEQ ID NO: 55) (5’-ATCATCCTGCAGGTATTCTAAACTAGGAATAGATG-3’). Este fragmento se digirió con PstI y se clonó en pC5LAB digerido con SmaI/PstI, para produ-cir pC5L. pC5L se digirió en el MCS con Asp718/NotI y se ligó a los oligonucleótidos CP26 (SEQ ID NO: 56) (5’-GTACGTGACTAATTAGCTATAAAAAGGATCCGGTACCCTCGAGTCTAGAATCGATCC-CGGGTTTTTATGACTAGTTAATCAC-3’) y CP27 (SEQ ID NO: 57) (5’-GGCCGTGATTAACTAGTCATAAAAACCCGGGATCGATTCTAGACTCGAGGGTACCGG-ATCCTTTTTATAGCTAATTAGTCAC-3’) digeridos con quinasa y anillados, para pro-ducir pC5LSP. Este plásmido se digirió con EcoRI, se ligó con el oligonucleótido CP29 (SEQ ID NO : 58) (5’-AATTGCGGCCGC-3’) digerido con quinasa y anillado, y se digirió con NotI. El plásmido linealizado se purificó y seligó consigo mismo, para generar pNC5LSP-5. Este plásmido de inserción de C5 contiene 1535 pb de DNA del virusde la viruela de los canarios, aguas arriba del ORF de C5, codones de parada de traducción en seis marcos de lectura,señal de terminación de la transcripción temprana de Vaccinia, un MCS con sitios de restricción BamHI, KpnI, XhoI,ClaI y SmaI, señal de terminación temprana de Vaccinia, codones de parada de traducción en seis marcos de lectura y404 pb de la secuencia del virus de la viruela de los canarios aguas abajo (31 pb de la secuencia codificadora de C5 y373 pb de la secuencia del virus de la viruela de los canarios aguas abajo).

Generación del plasmido de inserción de C6, pC6L

La Figura 11 (SEQ ID NO: 59) es la secuencia de un segmento de 3,7 kb del DNA del virus de la viruela delos canarios. El análisis de secuencia reveló un ORF denominado C6L, iniciado en la posición 377 y terminadoen la posición 2254. A continuación se describe un plásmido de inserción de C6, construido eliminando por de-leción el ORF de C6 y reemplazándolo por un MCS flanqueado por señales de terminación transcripcional y detraducción. Se amplificó un fragmento de PCR de 380 pb de DNA genómico del virus de la viruela de los cana-rios, usando los cebadores oligonucleotídicos C6A1 (SEQ ID NO: 60) (5’-ATCATCGAG-CTCGCGGCCGCCTATCAAAAGTCTTAATGAGTT-3’) y C6B1 (SEQ ID NO: 61) (5’-GAATTCCTCGAGCTGCAGCCCCGGGTTTTTATAGCTAATTAGTCATTTT-TTCGTAAGTAAGTATTTTTATTTAA-3’). Se amplificó un fragmento de PCR de 1155

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pb de DNA genómico del virus de la viruela de los canarios, usando los cebadores oligonucleotídicos C6C1 (SEQID NO: 62) (5’-CCCGGGCTGCAGCTCGAGGAATTCTT-TTTATTGATTAACTAGTCAAATGAGTATATATAATTGAAAAAGTAA-3’) y C6D1 (SEQ ID NO: 63) (5’-GATGATGGTACCTTCATAAATACAAGTTTGATTAAACTT-AAGTTG-3’). Los fragmentos de 380 pb y 1155 pb se fusionaron entre sí, añadiéndolos conjuntamente como mol-de y amplificando un fragmento de PCR de 1613 pb, usando los cebadores oligonucleotídicos C6A1 (SEQ ID NO:49) y C6D1 (SEQ ID NO: 52). Este fragmento se digirió con SacI/KpnI y se ligó en pBluescript SK+ digerido conSacI/KpnI. El plásmido resultante, pC6L, se confirmó mediante análisis de secuencia de DNA. Dicho plásmido estáformado por 370 pb de DNA del virus de la viruela de los canarios, aguas arriba de C6, señal de terminación tempranade Vaccinia, codones de parada de traducción en seis marcos de lectura, un MCS que contiene sitios SmaI, PstI, XhoIy EcoRI, señal de terminación temprana de Vaccinia, codones de parada de traducción en seis marcos de lectura y1156 pb de la secuencia aguas abajo del virus de la viruela de los canarios.

pJCA070 se derivó de pC6L ligando una casete que contenía el promotor H6 de Vaccinia acoplado a otro genextraño, en los sitios SmaI/EcoRI de pC6L. Al cortar pJCA070 con EcoRV/EcoRI, se escinde el gen extraño y elextremo 5’ del promotor H6.

Ejemplo 3

Experimentos de eficacia con recombinantes del virus de la peritonitis infecciosa felina gasados en ALVAC

Experimento 1

Experimento de seguridad, antigenicidad y eficacia con vCP261A (N), vCP262 (M) y vCP282 (M+N)

Veinticinco gatos de 10-12 semanas de edad exentos de patógeno específico (SPF) de Harlan Sprague Dawley,Inc., se dividieron aleatoriamente en cinco grupos (5 gatos/grupo). Los grupos se vacunaron subcutáneamente (áreadel cuello) dos veces (día 0 y día 21) con 107 TCID50/dosis, bien con vCP261, vCP262, vCP282 o vCP261A + vCP262.Cinco gatos en un grupo no se vacunaron y sirvieron como testigos de estimulación. En el día 35, todos los gatos seestimularon por vía oral con 103,5 TCID50 por gato con un virus de FIP virulento (cepa 1146). Los gatos se observarondiariamente durante 33 días después de la estimulación, para controlar la mortalidad y las manifestaciones visibles deinfección por virus FIP. En el día 33, a todos los gatos se les realizó la necropsia y se examinaron para patología deFIP. La forma no efusiva se detectó mediante aislamiento del virus FIP a partir del tracto intestinal e identificaciónmediante ensayos de neutralización del virus. Los gatos con la forma efusiva tenían un fluido amarillo espeso en lacavidad peritoneal, un fluido edematoso blanco en la cavidad pleural y lesiones en el intestino, bazo e hígado. Algunosgatos infectados mostraban una implicación ocular, con conjuntivitis, blefaroespasmo y retina opalescente.

Ninguno de los gatos vacunados mostraba ninguna reacción adversa local o sistémica posterior a la vacunación.Los cinco gatos no vacunados, bien murieron con señales de FIP, o cuando se les realizó la necropsia tenían señales deFIP, validando por tanto la dosis de estimulación. Los gatos muertos y moribundos presentaban señales tanto de formasefusiva, como no efusiva, de FIP. Los resultados de los gatos vacunados con el recombinante ALVAC-FIP se presentanen la Tabla 1. Ninguno de estos gatos desarrolló anticuerpos neutralizantes del previamente a la estimulación en eldía 35. Todos los gatos presentaban una respuesta febril tras la estimulación. Todos los grupos vacunados mostrabanuna protección parcial, con la mejor protección en los grupos vacunados vCP262 y vCP282, conteniendo cada uno 3/5gatos sin ninguna señal de FIP o mortalidad. Por tanto, a partir de este estudio parece que los recombinantes ALVAC-matriz de FIP proporcionan la mejor protección global.

Experimento 2

Experimento de seguridad, antigenicidad y eficacia con vCP262 (M), en comparación con PRIMUCELL

En este experimento se usaron veintitrés gatos SPF de 10-12 semanas de edad de Hill Grove, Gran Bretaña. Diezgatos se vacunaron subcutáneamente con vCP262 a una dosis de 108 ufp en los días 0 y 21. Cinco gatos recibieron unavacuna de FIP comercializada (PRIMUCELL, Smithkline Beecham), que se proporcionó como se recomendaba por elfabricante (2 dosis separadas por 21 días, intranasal, 104,8 TCID50 por dosis). Ocho gatos no se vacunaron y sirvieroncomo testigos de estimulación. En el día 35, todos los gatos se estimularon con un virus de FIP virulento (cepa 79-1146) a una dosis de 320 DECP50 proporcionada intranasalmente. Los gatos supervivientes se volvieron a estimularen el día 84 y a aquellos que sobrevivieron se les realizó la necropsia en el día 104 y se les examinó para patologíaFIP.

Ninguno de los gatos vacunados mostró ninguna reacción local o sistémica adversa tras la vacunación. Dentrodel grupo testigo, cuatro de los gatos, bien murieron, o bien tenían patología de FIP cuando se les realizaba la ne-cropsia. Los cuatro testigos restantes (alojados en una unidad separada de los otros testigos) sobrevivieron a ambasestimulaciones y parecían estar protegidos. Todos ellos mostraban un incremento significativo en los anticuerpos neu-tralizantes del suero frente a FIP tras la estimulación, indicando por tanto la exposición al virus. No se sabe si estoindica problemas técnicos con el protocolo de estimulación o una protección natural.

Los análisis serológicos mostraban titulaciones de anticuerpos neutralizantes virales frente a FIP no significativas,en gatos que recibían dos inoculaciones de vCP262. Por contraste, se observaban titulaciones significativas tras una

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inoculación de PRIMUCELL y estas titulaciones se dispararon tras la segunda inoculación. Los gatos en ambos gruposmostraban titulaciones elevadas tras la estimulación.

Los resultados de los datos de mortalidad para los gatos vacunados se presentan en la Tabla 2. En el grupo vCP262,8/10 gatos (80%) sobrevivían a la primera estimulación, mientras que 6/10 (60%) sobrevivían a ambas estimulaciones(60%). Por contraste, en el grupo de PRIMUCELL, sólo 1/5 gatos sobrevivían a la primera estimulación. El gatosuperviviente, también sobrevivía a la segunda estimulación. Es importante destacar que 3 de los 4 gatos vacunadoscon PRIMUCELL muertos, murieron en el día 11 o antes, lo cual indica un incremento de la progresión normal dela enfermedad. No se observó mejora con gatos vacunados con vCP262. Por tanto, comparado con PRIMUCELL,vCP262 proporciona una mayor protección, sin incremento de la enfermedad.

Experimento 3

Experimento de seguridad, antigenicidad y eficacia con vCP2622 (M) en combinación con los recombinantes dela proyección superficial (vCP281 (S1), vCP283B(S2) y vCP315(S3))

Se recibieron treinta y seis gatos SPF de 9 semanas de edad de Harlan Sprague Dawley, Inc. y se dividieronaleatoriamente en seis grupos (6 gatos/grupo). Los grupos recibieron dos inoculaciones subcutáneas (dosis de apro-ximadamente 107 TCID50 para cada recombinante en los días 0 y 21), con los siguientes recombinantes: 1) vCP262(matriz), 2) vCP262 más vCP281 (S1 proyección superficial completa), 3) vCP262 más vCP283B (S2 proyecciónsuperficial menos secuencia señal) y 4) vCP262 más vCP315 (S3 proyección superficial - sección C-terminal). Ungrupo se vacunó intranasalmente con una vacuna de FIP disponible comercialmente (PRIMUCELL, Pfizer AnimalHealth), como se recomendaba por el fabricante (2 dosis, día 0 y día 21). Un grupo no se vacunó y sirvió como testigode estimulación. Quince días después de la segunda vacunación (día 36), todos los gatos se estimularon oralmentecon 103,5TCID50 por gato, con un virus de FIP virulento (NVSL FIP-1146, 89-5-1). Los gatos se controlaron para elpeso, temperatura, respuesta serológica y mortalidad durante 35 días tras la estimulación. Se realizó la necropsia enla mayoría de los gatos muertos, para observar señales de FIP y el virus FIPV se aisló de dos gatos para confirmar lainfección.

Ninguno de los gatos vacunados con recombinantes ALVAC mostró ninguna reacción local o sistémica tras lavacunación. Todos los gatos vacunados con PRIMUCELL tenían titulaciones neutralizantes de virus. En los gruposrecombinantes, sólo los gatos del grupo que recibía la matriz más la proyección superficial completa tenía titulacionesneutralizantes de virus (3/6 tras la segunda vacunación).

Los datos de mortalidad se presentan en la Tabla 3. Los gatos a los que se les realizó la necropsia mostrabanseñales tanto formas efusiva (mayoría) como no efusiva de la enfermedad. Un gato tenía encefalitis inducida por FIP(grupo testigo). La mortalidad más baja (33%) se observó en el grupo vacunado con vCP262 (matriz) solo. Los gruposque recibían vCP262 más cualquiera de los recombinantes de la proyección superficial mostraban escasa protección,si la había. El grupo vacunado con PRIMUCELL mostraba una mortalidad de 66,7%. El incremento inducido poranticuerpos (muerte temprana) se observó tanto en los grupos de PRIMUCELL como en los de vCP281 (S1 proyecciónsuperficial completa). Cinco de cada seis (83,3%) de los gatos no vacunados testigo murieron de infección por FIP, locual validaba la estimulación.

La fiebre y la pérdida de peso son indicadores de enfermedad por FIP. Existía una pérdida de peso relativa tras lavacunación en todos los grupos. Sin embargo, el grupo vacunado con vCP262 mostraba sólo una ligera pérdida de peso,comparada con el de PRIMUCELL y los grupos testigo. Se observó fiebre crónica en todos los gatos, sin embargo, elgrupo que se vacunó con vCP262 presentaba consecuentemente temperaturas inferiores a los otros grupos.

A partir de este estudio, se concluyó que vCP262 proporcionaba protección (67,7%) frente a una estimulacióngrave con FIP. Además, los gatos vacunados con este recombinante mostraban una respuesta febril inferior y menospérdida de peso tras la estimulación. Los otros recombinantes de FIP (vCP281, vCP283B y vCP315), así como elgrupo de PRIMUCELL, proporcionaban escasa protección e incluso un incremento de la mortalidad (PRIMUCELL,vCP281).

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TABLA 1

Resultados del experimento de eficacia de FIP con recombinantes ALVAC de la matriz y la nucleocápsida

1. Titulaciones expresadas como el recíproco de la dilución del suero final.2. Los números entre paréntesis representan los gatos con señales de FIP en la necropsia.3. Sin mortalidad o señales de FIP.

TABLA 2

Resultados del experimento de eficacia comparando el recombinante de la matriz ALVAC con PRIMUCELL

1. Incluye gatos a los que se les realizó la necropsia, con patología de FIP en el día 104.2. Tres de estos gatos murieron en el día 11 o antes, indicando un incremento.

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TABLA 3

Datos de mortalidad comparando recombinantes de la matriz y de la proyección superficial basados en ALVAC, conPRIMUCELL

1. Muerte en el día 15 tras la estimulación, o previamente.

Ejemplo 4

Generación de recombinantes de FIPV basados en NYVAC

Se generan los recombinantes de (S1), (S2), (S3), y (M+N), usando loci de inserción y promotores como en lapatente de EE.UU. Nº 5.494.807, p.ej. mediante modificación del plásmido pRW842 para inserción del gen G de laglicoproteína de la rabia en el locus de deleción TK (usado para la generación de vP879), p.ej. eliminando por escisióna partir de pRW842 el DNA de la rabia, e insertando por tanto el DNA de FIPV aquí descrito que codifica para M,N y las tres versiones de S, S1, S2 y S3, o sus combinaciones (por ejemplo M y N), y empleando a continuación losplásmidos resultantes en recombinación con NYVAC, vP866, NYVAC-FIPV(M), (N) y las tres versiones de (S). Elanálisis confirma la expresión.

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REIVINDICACIONES

1. Un poxvirus recombinante que contiene DNA del virus de la peritonitis infecciosa felina, que comprende unasecuencia que codifica la proteína M, en una región no esencial del genoma del poxvirus, en el que el poxvirus es:

(i) un virus Vaccinia en el que J2R, B13R + B14R, A26L, A56R, C7L-K1L y 14L se delecionan del virus, o sedelecionan del virus un gen de timidina-quinasa, una región hemorrágica, una región de un cuerpo de inclusiónde tipo A, un gen de hemaglutinina, una región de ámbito de hospedador, y una ribonucleótido-reductasa de lasubunidad grande; o el poxvirus es:

(ii) un virus de la viruela de los canarios atenuado.

2. El recombinante de la reivindicación 1, en el que el virus de la viruela de los canarios se atenuó a través demás de 200 pases en serie sobre fibroblastos de embrión de pollo, una siembra patrón del mismo se sometió a cuatropurificaciones en placa sucesivas en agar, de las cuales se amplificó un clon de placa a través de cinco pases adicionales.

3. El recombinante de la reivindicación 1, en el que el virus de la viruela de los canarios atenuado es ALVAC.

4. El recombinante de la reivindicación 1, en el que el poxvirus es el virus Vaccinia.

5. El recombinante de la reivindicación 4, en el que el virus Vaccinia es NYVAC.

6. El recombinante de la reivindicación 1, en el que el DNA del virus de la peritonitis infecciosa felina codificaademás N.

7. El recombinante de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el DNA codifica además uno, dos, o los tres de S1, S2y S3.

8. Una composición inmunológica que comprende un recombinante según las reivindicaciones 1 a 7.

9. El uso de un recombinante según las reivindicaciones 1 a 7, para preparar una composición farmacéutica parainducir una respuesta inmunológica en un hospedador, siendo adecuada dicha composición farmacéutica para admi-nistrarla a un hospedador.

10. El uso de un recombinante según las reivindicaciones 1 a 7 para preparar una composición inmunológica parainducir una respuesta inmunológica, siendo adecuada dicha composición inmunológica para administrarla, conjunta-mente con un vehículo, a un hospedador.

NOTA INFORMATIVA: Conforme a la reserva del art. 167.2 del Convenio de Patentes Europeas (CPE) y a laDisposición Transitoria del RD 2424/1986, de 10 de octubre, relativo a la aplicación delConvenio de Patente Europea, las patentes europeas que designen a España y solicitadasantes del 7-10-1992, no producirán ningún efecto en España en la medida en que confieranprotección a productos químicos y farmacéuticos como tales.

Esta información no prejuzga que la patente esté o no incluida en la mencionada reserva.

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