POTENCIAL DEL TRATAMIENTO DE ESTACAS DE...
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1 POTENCIAL DEL TRATAMIENTO DE ESTACAS DE YUCA (Manihot esculenta) CON LOS HONGOS ENTOMOPATÓGENOS Beauveria bassiana y Metarhizium anisopliae PARA EL MANEJO DE PIOJO HARINOSO (Phenacoccus herreni). LEIDY ESTHER SÁNCHEZ REY Trabajo de grado como requisito parcial para optar al de título de pregrado en Biología. Director SOROUSH PARSA Ph. D. en Entomología UNIVERSIDAD DEL TOLIMA FACULTAD DE CIENCIAS BÁSICAS PROGRAMA DE BIOLOGÍA IBAGUÉ-TOLIMA 2013
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POTENCIAL DEL TRATAMIENTO DE ESTACAS DE YUCA (Manihot esculenta) CON LOS HONGOS ENTOMOPATÓGENOS Beauveria bassiana y Metarhizium anisopliae PARA EL MANEJO DE PIOJO HARINOSO (Phenacoccus herreni).
LEIDY ESTHER SÁNCHEZ REY
Trabajo de grado como requisito parcial para optar al de título de pregrado en Biología.
Director SOROUSH PARSA
Ph. D. en Entomología
UNIVERSIDAD DEL TOLIMA FACULTAD DE CIENCIAS BÁSICAS
PROGRAMA DE BIOLOGÍA IBAGUÉ-TOLIMA
2013
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DEDICATORIA
Gloria Consuelo Rey,madre usted ha sido y siempre será el motor de toda mi
existencia. Su amor y apoyo incondicional me han dado la motivación para tomar
fuerzas en los momentos de debilidad. Sin la bendición más grande que me ha dado
Dios, usted madre, nada de esto hubiese sido posible.
A mi padre Pablo María Sánchez, y a cada uno de mis hermanos Alexander,Edwar y
Carol, porque nunca han dejado de respaldarme y siempre han creído en mí.
4
AGRADECIMIENTOS
A SorouhsParsa, por brindarme esta oportunidad, la orientación y toda la paciencia
durante este proceso.
A Viviana Ortiz por compartir su conocimiento, bondad y compañía en las largas
labores de trabajo.
A GerardinoPerez y Adriano Muñoz por su apoyo en las labores de campo e
invernadero.
A Reynaldo Pareja por su buen humor y sus sabios consejos, por su amistad.
A María Isabel Gómez por su asesoría y la atención brindada para este trabajo.
A todo el equipo de trabajo por abrirme sus puertas y brindarme su cariño.
A todas las personas, compañeros y amigos del CIAT que directa o indirectamente
influenciaron para que este trabajo se pudiera realizar.
A todos los profesores de la Universidad del Tolima que influenciaron con su
conocimiento en mi formación como futura bióloga. En especial al Ingeniero Nelson Canal que amable y desinteresadamente apoyó este proceso como codirector.
A mis amigos y compañeros de la Universidad del Tolima que siempre estuvieron
atentos y apoyando este proceso. Marisol Campuzano, Elizabeth Téllez, Carolina Cárdenas y Luz Geidy Yanez por su respaldo y voces de aliento desde la distancia.
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CONTENIDO
INTRODUCCIÓN .......................................................................................................... 11
1. OBJETIVOS ............................................................................................................ 14
1.2 OBJETIVO GENERAL ............................................................................................ 14
1.3 OBEJTIVOS ESPECÍFICOS .................................................................................... 14
2. MATERIALES Y MÉTODOS ..................................................................................................... 15
2.1 SITIO Y DISEÑO EXPERIMENTAL ........................................................................ 15
2.2 HONGOS ................................................................................................................ 15
2.3 PLANTAS ................................................................................................................ 16
2.4 INSECTOS .............................................................................................................. 16
2.5 INOCULACIÓN ....................................................................................................... 18
2.6 COLONIZACIÓN ENDOFÍTICA .............................................................................. 19
2.7 INFESTACIÓN ......................................................................................................... 20
2.8 ANÁLISIS ESTADÍSTICO ....................................................................................... 21
3 MARCO TEORICO Y ANTECEDENTES ............................................................................... 22
3.1 LA YUCA ................................................................................................................. 22
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3.1.1 Generalidades y propiedades de propagación ..................................................... 22
3.1.2 Enfermedades y plagas trasmitidas por estacas de yuca .................................... 23
3.1.3 Reporte de hongos endófitos en yuca .................................................................. 24
3.2 PIOJO HARINOSO ................................................................................................. 25
3.2.1 Generalidades ...................................................................................................... 25
3.2.2 Morfología ............................................................................................................ 26
3.2.3 Ciclo biológico ...................................................................................................... 26
3.2.4 Ecología y comportamiento .................................................................................. 27
3.3 HONGOS ENTOMOPATÓGENOS ......................................................................... 28
3.3.1 Proceso de infección ............................................................................................ 28
3.3.2 Beauveria bassiana ............................................................................................ 29
3.3.3 Metarhizium anisopliae ....................................................................................... 30
4 RESULTADOS ............................................................................................................................... 32
4.2 COLONIZACIÓN ENDOFÍTICA ............................................................................... 32
4.2 INFESTACIÓN ......................................................................................................... 33
5 DISCUSIÓN DE RESULTADOS ............................................................................. 36
6 CONCLUSIONES .......................................................................................................................... 40
7
7 RECOMENDACIONES ............................................................................................ 41
REFERENCIAS ....................................................................................................... 42
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LISTA DE FIGURAS
Pág.
Figura 1. Ciclo biológico de P. herreni .................................................................... 27
Figura 2. Ciclo de desarrollo de un hongo entomopatógeno .................................. 29
Figura 3. Porcentaje de la colonización endofítica de M. anisopliae, B. bassiana y
Control en tejido de yuca ....................................................................................... 33
Figura 4. Efecto de los tratamientos B. bassiana, M. anisopliae y control sobre el
estado de P. herreni ................................................................................................ 34
Figura 5. Efecto de los tratamientos M. anisopliae, B. bassiana y control sobre el
estado de plantas de yuca atacadas por P. herreni ................................................ 35
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RESUMEN
La yuca es el cuarto cultivo más importante de las zonas tropicales y subtropicales del
mundo. Su rendimiento es afectado por insectos plaga como el piojo harinoso
(Phenacoccus herreni). Este estudio evaluó si Beauveria bassiana y Metarhizium
anisopliae pueden colonizar endofíticamente la yuca, y si la inoculación de estos
entomopatógenos en la planta puede conferir resistencia al ataque del insecto. Estacas
de yuca fueron sumergidas en suspensiones conidiales (1 x 108 conidios/ml) de B.
bassiana y M. anisopliae. El establecimiento endofítico se determinó 20 días después
de la siembra. Las plantas se separaron en raíces, hojas y tallo. Cada tejido fue
desinfectado y cortado en segmentos que se sembraron en PDA con antibióticos e
incubados. El porcentaje de colonización fue determinado contando el número de
fragmentos que exhibían crecimiento del hongo del tratamiento. El efecto de los
tratamientos sobre P. herreni se determinó después de infestar cada planta con un
ovisaco de este insecto. Se evaluó el daño causado en las plantas y el desarrollo de los
insectos, tomado como número y peso de las hembras entre tratamientos. El
porcentaje de colonización endofítica fue bajo, y resultó significativamente diferente
entre los tratamientos. No se evidenció ningún efecto sobre el desarrollo de P. herreni.
Las evidencias sugieren que la metodología de inoculación y la selección de cepas
deben ser mejoradas para hacer más eficiente el establecimiento de los hongos
entomopatógenos como endófitos en yuca, antes de estimar su potencial en el manejo
de piojo harinoso.
Palabras clave: Manihot esculenta, Beauveria bassiana, Metarhizium, anisopliae, piojo
harinoso, endófitos entomopatógenos.
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ABSTRACT
Cassava is the fourth most important food crop in tropical and subtropical areas of the
world. Performance can be severely affected by insect pests such as mealybugs
(Phenacoccus herreni). This study evaluated if Beauveria bassiana and Metarhizium
anisopliae can endophytically colonize cassava, and if inoculation of plants with these
entomopathogenics confers resistance to insect attack. Cassava cuttings were dipped
in conidial suspensions (1 x 108conidios/ml) of B. bassiana and M. anisopliae.
Endophytic establishment was determined 20 days after planting. Roots, leaves and
stems of plants were separated and each tissue was disinfected and cut into segments
which were placed onto PDA with antibiotics and incubated. Percentage colonization of
each plant part was determined by counting the number of segments which exhibited
fungal growth treatment. The effect of the treatments on P. herreni was determined after
infest each plant with one ovisac from this insect. The plant damage and the insect
development were evaluated, recording the number and weight of females in the
inoculated plants. The percentage of colonization was low, and was significantly
different between treatments. No effect on the development of P. herreni was observed.
Evidences suggest that the inoculation method and the strain selection need to be
improved to achieve an efficient establishment of entomopathogenic fungi as
endophytes in cassava, before to estimate their potential in the management of
mealybugs.
Keywords: Manihot esculenta, Beauveria bassiana, Metarhizium, anisopliae,
mealybug, entomopathogenic endophytes.
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INTRODUCCIÓN
La yuca, mandioca o casabe es un arbusto leñoso perenne cultivadoextensamente por
su raíz almidonosa de alto valor nutricional. Su nombre deriva de la palabra “Casabi”,
nombre dado por la comunidad Arahuaca a las raíces de la planta. Es uno de los
cultivos tropicales más importantes del mundo y su mayor producción está en manos
de pequeños agricultores que la utilizan como fuente alimenticia (Cock, 1985 citado por
Burbano, Carabalí, Montoya & Bellotti, 2007). Una de sus importantes ventajas
respecto a otros cultivos es su capacidad dedesarrollarse en suelos de escasa
fertilidad y zonas con largos períodos de sequía (Aristizábal, Sánchez & Mejía-Lorío,
2007). Además, la yuca es uno de los cultivos con mayor adaptabilidad, ya que se
puede sembrar desde el nivel del mar hasta los 1800 msnm , con temperaturas que
oscilan entre 20 y 30°C, con humedad relativa entre 50 y 90%, y precipitaciones
anuales entre los 600 y 3000 mm (Aristizábal et al., 2007).
Según Aristizábal et al. (2007) su centro de origen genético se encuentra en la Cuenca
Amazónica, y las evidencias de su uso como cultivo datan desde hace 2500 años. En
el siglo XVI fue introducida a África y dos siglos más tarde se diseminó hacia el interior
donde se estableció rápidamente y llegó a ser una fuente importante de alimentación.
La introducción a Asia no está bien documentada, pero se cree que en 1740 ya era
cultivada en Indonesia y en el siglo XlX se diseminó en Asia Tropical y Oceanía. Para el
siglo XX el cultivo de la yuca continúo su proceso de expansión en las zonas bajas
tropicales con suelos de menos calidad e inexplotados como Tailandia y dónde la
población se fue incrementando rápidamente como en la India. Ya en el siglo XXl la
producción se ha intensificado y además de su importancia como fuente alimentaria, la
yuca también ha tenido una serie de usos industriales que la han promovido como un
gran potencial para el desarrollo industrial y para aumentar los ingresos rurales de
poblaciones marginadas.
A raíz de la considerable expansión de este cultivo se ha visto un consecuente
aumento de enfermedades y plagas, las cuales han resultado en disminución de la
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calidad de los productos y en pérdidas económicas significativas. Actualmente los
insectos que más afectan este cultivo son: el ácaro verde (Mononychellus tanajoa), la
mosca blanca (Aleurotrachellus sociales) y el piojo harinoso (Phenacoccus herreni),
que pueden causar pérdidas en el rendimiento hasta del 80% (Burbano et al., 2007).
Uno de los factores de infestación en plantaciones de yuca proviene de insectos plaga
que se trasmiten por medio del material de siembra y atacan las plantas en los
primeros meses de desarrollo. Este es el caso de P. herreni, plaga importante de la
yuca endémica de Sur América (Bellotti, Reyes, Varela & Castillo, 1983).
Programas nacionales e internacionales de investigación están dirigiendo sus
esfuerzos hacia la búsqueda de tecnologías sencillas, a bajo costo y de fácil aplicación
que permitan optimizar la protección de cultivos de manera sostenible. El manejo
integrado de plagas (MIP) es una estrategia que utiliza diferentes métodos
ecológicamente orientados, implementando diferentes técnicas de control para el
manejo de plagas. Tiene como objetivo final producir los máximos beneficios
manteniendo la conservación del ambiente a largo plazo. Una de las alternativas dentro
del MIP es el uso de hongos entomopatógenos. Los hongos entomopatógenos son
organismoscapaces de causar enfermedad en un insecto huésped, usualmente
provocando la muerte.Diversas especies se han estudiado y se ha identificado que
tienen la capacidad decontrolar plagas de cultivos de importancia económica.
Actualmente, algunos de estos entomopatógenos son producidos semi-industrialmente
y utilizados exitosamente en programas de control biológico (Monzón, 2001). Se
conocen alrededor de 100 géneros y 700 especies de hongos entomopatógenos
(García et al., 2008), entre las especies más estudiadas están Metarhizium anisopliae y
Beauveria bassiana. Dos especies cosmopolitas, que además han mostrado tener la
capacidad de establecerse endofíticamente en diversas especies de plantas agrícolas
como maíz, tomate, banano, trigo, soya y canola.
Por tales razones se evalúo si estacas de yuca tratadas por inmersión en suspensiones
conidiales de B. bassiana y M. anisopliae pueden ser colonizadas endofíticamente, y si
este potencial endofitismopuede conferir resistencia alataque del piojo harinoso
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(P.herreni).
Si el uso de una nueva técnica resultara eficiente en el control de plagas en
plantaciones de yuca, los resultados se verían reflejados en la disminución de la
contaminación del medio ambiente por el uso excesivo de productos químicos y el alto
costo económico. Además se obtendrían cultivos con mayores rendimientos.
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1. OBJETIVOS
1.1 OBJETIVO GENERAL
Evaluar el potencial de tratamiento de estacas de yuca con los hongos
entomopatógenos Beauveria bassiana y Metarhizium anisopliae para el manejo
integrado de piojo harinoso (Phenacoccus herreni) en yuca.
1.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Evaluar el potencial de tratamiento de estacas de yuca en suspensión conidial para
establecer B. bassiana y M. anisopliae endofíticamente.
Determinar si el endofitismo de B. bassiana y M. anisopliae le confiere resistencia a
plantas de yuca frente a P. herreni.
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2. MATERIALES Y MÉTODOS
2.1 SITIO Y DISEÑO EXPERIMENTAL
El estudio fue conducido en un invernadero del Centro Internacional de Agricultura
Tropical (CIAT), Palmira, Valle del Cauca, con una temperatura de 26 ± 4 °C y una
humedad relativa de 71 ± 15 %. Se realizó bajo un diseño de bloques completos al
azar con 6 repeticiones. Los tratamientos consistieron en: (1) estacas sumergidas en
una suspensión conidial (1 x 108 conidios/ml) de B. bassiana, (2) estacas sumergidas
en una suspensión conidial (1 x 108 conidios/ml) de M. anisopliae, (3) estacas control
sumergidas en 0.1% Tritón X-100 estéril, para evaluaciones de colonización endofítica.
(4) Estacas sumergidas en una suspensión conidial (1 x 108 conidios/ml) de B.
bassiana seguido por una infestación con P. herreni, (5) estacas sumergidas en una
suspensión conidial (1 x 108 conidios/ml) de M. anisopliae seguido por una infestación
con P. herreni, (6) estacas control sumergidas en 0.1% Tritón X-100 estéril seguido por
una infestación con P. herreni, para evaluaciones de resistencia.
2.2 HONGOS
Se utilizó una cepa de GHA de B. bassiana obtenida del formulado comercial Mycotrol
(Mycotech Corporation, Butte, MT) y la cepa 9236 de M. anisopliae obtenida del
formulado comercial Metatrópico (Soluciones microbianas del Trópico, Caldas). Estas
cepas se cultivaron durante 15 días en agar papa dextrosa (PDA) (Difco, Sparks, MD) a
25°C en la oscuridad, hasta cubrir la superficie de la caja de Petri y esporular.
Lassuspensionesde conidios fueron preparadas mediante un raspado de conidios de
las cajas de Petri, suspendiendo el cultivo en una solución acuosa de 10 mililitros de
agua con 0.1% Tritón X-100 (Sigma Chemical Co., St Louis, Missouri). La suspensión
se agitó manualmente durante 20 segundos y posteriormente en un vortex por 1
minuto. Las suspensiones conidiales se filtraron a través de dos capas de gasa
esterilizada para eliminar los micelios. Se tomó cada una de las
suspensiones(suspensión madre) y se calculó su volumen. Después se hicieron
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diluciones seriadas (10-1 hasta 10-4) utilizando 0.1% Triton X-100. Una vez obtenida la
dilución 10-4 se estimó la concentración de la solución madre por conteo de conidios en
un hemacitómetro. Se calculó el volumen de la suspensión final para ajustar la
suspensión madre a una concentración final de 1 x 108 conidios/ml. Posteriormente, se
sembró 100 µl de la suspensión final en una caja Petri con 2.5% agar noble (Noble
Agar, Difco, Sparks, MD), y se incubó a 25°C por 24 horas para evaluar el número de
conidios viables para cada una de las cepas. La viabilidad de conidios de las cepas
utilizadas se determinómediante una prueba de germinación. El porcentaje de
germinación se realizó a partir del conteo de tres grupos de 100 conidios por caja Petri.
Las suspensiones se utilizaron el mismo día de su preparación.
2.3 PLANTAS
Estacas de yuca de la variedad CMC 40, fueron obtenidas de plantas de 6 meses de
edad, de siembras bimestrales hechas en campo (Lote No. 2) del CIAT (3°50’340’’N y -
76°35’78’’O), que se encuentran a una altura de 1001 m.s.n.m., con una precipitación
media anual de 1200mm y una temperatura promedio de 25°C, provenientes de suelos
arcilloso con un pH entre 5 y 5.5, un contenido de materia orgánica del 6.8%, fósforo
disponible entre 45-55 mg/kg, y contenido de potasio intercambiable de 0.44 cmol
(K+)/kg de suelo.
De la parte basal del tallo principal se cortaron estacas de 20 cm de largo, con un
diámetro de 2.8 cm y 5 yemas aproximadamente. La semilla recolectada se trasladó a
un invernadero donde se lavó con agua corriente, se esterilizó superficialmente con
etanol al 70% por 2 minutos, hipoclorito de sodio al 2% por 2 minutos, se enjuagaron
con agua destilada estéril tres veces y se pusieron a secar sobre papel absorbente
estéril. El proceso de desinfección se hizo para eliminar microorganismos epifitos.
2.4 INSECTOS
Se emplearon ovisacos de P. herreni de la colonia establecida en el CIAT.
La adecuación para la cría en masa de P. herreni en el CIAT está hecha bajo
condiciones de invernadero con una temperatura de 26 ± 4 °C y una humedad relativa
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de 71 ± 15 %. A una altura de 1,50m se ponen sobre mesones jaulas cerradas (1m x
2m x 80cm) hechas con tamiz de nailon fino, que permita aislar los insectos de
patógenos y predadores. Cada jaula tiene una capacidad de almacenar 6 plántulas
sembradas en recipientes de 11 y 16cm de diámetro en la base y parte superior
respectivamente, por 15cm de altura.
Para efectuar la cría de P. herreni se utilizan plántulas de yuca de la variedad CMC 40
con 30 días de desarrollo. De siembras bimestrales hechas en el Lote No. 2 del CIAT
(3°50’34”N y -76°35’0.78”O), se escogen estacas de yuca con 25 cm de largo y 6
yemas aproximadamente para la cría. Se hace una mezcla de suelo y arena cernida en
proporción 3:1 (suelo-arena). El suelo es esterilizado con vapor de agua a presión
(80°C y 120PSI) y se deja enfriar durante 24 horas. En potes plásticos con 15cm de
altura, se depositan 1.5kg del suelo tratado. En cada pote con suelo se siembra una
estaca de CMC 40 a 7cm de profundidad en forma vertical, cerciorándose que la estaca
quede firme y con las yemas hacia arriba. Cada pote es regado con 150ml de agua de
la llave. Cada dos días se hace una revisión y dependiendo de la necesidad de riego se
aplican 200ml de agua en cada pote. Quince días después de la siembra, cuando la
primera hoja este bien abierta y se esté abriendo la segunda, se fertiliza con 45ml por
pote de una solución que contiene 5g/lde 15-15-15 (N-P-K) y 2.5g/lde urea. Veinte días
después de la siembra se hace una fertilización foliar con una solución de microcoljap
(elementos menores) en una concentración de 1ml/lde agua. Esta aplicación se repite
tres veces con frecuencia semanal. Después de 30 días las plántulas se ofrecen como
alimento fresco, para que los insectos encuentren una condición similar al campo.
Seis plántulas de yuca son infestadas cada una con un grupo de 3 ovisacos (~600
huevos) de P. herreni. Los ovisacos se colocan en la axila de la base del tallo principal,
~600 huevos permiten que cuando emerjan los insectos de primer instar migren a la
parte apical de los puntos de crecimiento de la planta, se establezcan
homogéneamente, y alrededor de estos puntos se incrementa la población inicial del
piojo harinoso.
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Las plántulas infestadas se distribuyen en las jaulas separándolas por instares. Se
pueden colocar huevos y larvas de I instar juntas pero las de II – IV instar y adultos pre-
ovoposición en jaulas separadas.
Cuando los insectos llegan al estado adulto de pre-ovoposición se sacan de la jaula de
cría y se colocan en otra igual por un período de ~6 días, hasta adultos ovoposición.
Tres días después de la copulación las hembras forman ovisacos donde ponen sus
huevos. Los ovisacos son recolectados al azar en grupos de tres, cada grupo se utiliza
para infestar una nueva planta hasta tener 6 nuevas estacas de yuca infestadas para
empezar con el ciclo de cría nuevamente. Este proceso tiene un período de duración
de 30 días.
Ya obtenidos los ovisacos las plantas son descartadas y llevadas a un horno donde se
incinera los restos de material vegetal y animal para evitar contaminar los cultivos de
los invernaderos aledaños y del campo.
2.5 INOCULACIÓN
La inoculación se realizó por bloque y las estacas fueron asignadas a los tratamientos
al azar. En un recipiente plástico (38,2 x 33,6 x 14 cm), una a una las estacas fueron
sumergidas por 5 min en 1lde suspensión conidial (1 x 108 conidios/ml) de B. bassiana
y M. anisopliae, con agitación constante para evitar la sedimentación del hongo en la
base del recipiente durante el tratamiento. El control se sumergió en 1lde 0.1% Tritón
X-100 estéril por el mismo período de tiempo.
Cada estaca se sembró a 7cm de profundidad en forma vertical en un pote plástico de
11 y 16cm de diámetro en la base y parte superior respectivamente, por 15cm de
altura, con 1,5kg de una mezcla de suelo y arena (3:1) estéril. En el momento de la
siembra, el pote se regó con 150ml con agua de la llave. Se revisó cada dos días en las
horas de la mañana la necesidad de riego tocando el suelo del pote y se aplicaban
100ml por pote.
Diez días después de la siembra, se hizo una fertilización con 45ml por pote de una
solución que contiene 5g/l de 15-15-15 (N-P-K).
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2.6 COLONIZACIÓN ENDOFÍTICA
La determinación del establecimiento de B. bassiana y M. anisopliae en los tejidos de
las estacas de yuca se hizo 21 días después de la siembra, cuando habían germinado
los primeros brotes en las estacas: tallo primario, hojas y raíces adventicias en
crecimiento de donde se podía obtener el material de muestra. En la estaca se
mantuvo un solo brote y se eliminaron los restantes.
Se procesó un bloque a la vez, el bloque se escogió al alzar. Dentro del bloque las
muestras se procesaron por parte de planta, por tratamiento al azar.
Evitando dañar la estructura radical, se removió del suelo la estaca y se lavó con agua
de la llave los rizomas y las raíces para retirar el sustrato adherido.
Cada estaca fue separada en raíces, hojas y tallo. Por cada estaca se comparaban los
rizomas y se seleccionaban 3 raíces sanas aleatoriamente, provenientes de la parte
cicatrizada de la estaca y 3 provenientes de yema, se cortaron en fragmentos de 3cm.
Se muestrearon las tres hojas más cercanas a la base del tallo y se tomaron
aleatoriamente 2 lóbulos de cada hoja, y del tallo principal se cortó un fragmento de
4cm de corte transversal desde la base del tallo y otro de la misma longitud de la parte
media del tallo, cada parte muestreada se guardó en bolsas de papel (13,5 x 7,5cm),
rotuladas y se almacenaron a 4°C para evitar el crecimiento de agentes contaminantes
y la deshidratación del tejido.
Después de obtener las muestras se comenzó por procesar la raíz, luego las hojas y
finalmente el tallo. Cada tejido se esterilizó en hipoclorito de sodio al0.5% por 2
minutos, seguido de etanol al 70% por 2 minutos y tres lavados con agua destilada
estéril y se colocaron sobre papel toalla estéril.
Después, se tomó el tejido esterilizado y se cortó en fragmentos de 3mm2, se tomaron
6 de estos fragmentos aleatoriamente y se sembraron en una caja Petri (60 x 15), que
contenía medio PDA con una concentración de 2mg/l de estreptomicina, tetraciclina y
penicilina para eliminar bacterias endofíticas, se incubó a 25°C.
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Para evaluar la eficiencia de la esterilización, al finalizar, procesando cada bloque, se
tomó una muestra de 100 µl de agua del último lavado y se sembró en agar noble
(Noble Agar, Difco, Sparks, MD) se incubó a 25°C por 10 días. Si la desinfección
resulta ser ineficiente para algún bloque, se debe descartar y tomar los datos de los
bloques restantes.
La presencia o ausencia de B. bassiana y M. anisopliae de los fragmentos de hojas,
tallo y raíz por estaca, se registró después de 10 días de incubación a 25°C, todo
agente contaminante que colonizó el medio en la caja Petri se retiró con un bisturí
estéril y se sembró en otra caja Petri.
Se usó la morfología para la identificación de colonias de B. bassiana y M. anisopliae.
Las colonias de hongos de B. bassiana se caracterizan por tener una base de micelio
blanco denso, que se convierte en color crema a amarillo pálido en el borde (Humber,
1997 citado por Akello, Dubois, Coyne, Gold, & Kyamanywa, 2007). M. anisopliae se
caracteriza por tener una colonia algodonosa, inicialmente blanca y cambiante a
oliváceo oscuro en la mayoría de las cepas (Romero, Estrada, Castañeda, & Luján,
1997).
2.7 INFESTACIÓN
Veinte días después del tratamiento por inmersión conidial, se puso con un pincel un
ovisaco de P. herreni por planta en la axila del tallo principal emergente. Treinta días
después de la infestación se tomaron los primeros 5 cm de la parte apical de la planta y
se contó el número de peciolos, el peso fresco de las hojas y el peso fresco del tallo,
para determinar cuál era el estado de las plantas. Además, se determinó el estado de
los insectos categorizado en número y peso de las hembras de los tratamientos versus
el control.
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2.8 ANÁLISIS ESTADÍSTICO
El porcentaje de colonización para cada uno de los hongos evaluados fue calculado
como:
Para determinar el efecto de los tratamientos sobre el estado de las plantas y de los
insectos, los datos fueron analizados mediante un ANOVA. Se estableció la correlación
de variables a través del test de Pearson, y las correlaciones encontradas se analizaron
utilizando una regresión simple. Se usó el test de Shapiro-Wilk para contrastar si los
datos evaluados presentan una distribución normal. Todos los análisis fueron
ejecutados en el programa estadístico JPM 8.
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3. MARCO TEÓRICO Y ANTECEDENTES
3.1 LA YUCA
3.1.1 Generalidades y propiedades de propagación. La yuca (Manihot esculenta
Crantz), planta originaria de América tropical, es un arbusto leñoso perenne, que
pertenece a la familia Euphorbiaceae (Mejia deTafur, 2002). Es considerada una de las
principales fuentes de energía para millones de personas que viven en zonas tropicales
y subtropicales del mundo (Bellotti, Arias, Vargas, Reyes, & Guerrero, 2002). En estas
zonas, la yuca ocupa el cuarto lugar en importancia después del arroz, el maíz y la
caña de azúcar (Cock, 1984 citado por Mejía, 2002). Es un cultivo de propagación
vegetativa con una gran tolerancia a la sequía, cuyo desarrollo comercial tiene un ciclo
largo, de 1 a 2 años. Su reproducción alógama y su constitución genética altamente
heterocigótica constituyen la principal razón para propagarla por estacas y no por
semilla sexual (Ceballos y De la Cruz, 2002 citado por Aristizábal, et. al.,2007). La
calidad del material de siembra en yuca depende de la variedad y el tipo de planta, la
madurez y el grosor del tallo, el número de nudos, el tamaño de la estaca, la resistencia
a plagas y enfermedades, la calidad fisiológica y los daños mecánicos que presente a
causa de su manipulación (Aristizábal, et. al., 2007).
La calidad es un conjunto de cualidades genéticas, fisiológicas y sanitarias que dan a
las estacas su capacidad para dar origen a plantas productivas (López, 2012). Una
estaca apropiada debe provenir de cultivos maduros, con edad de 10-12 meses, donde
no haya mezclas varietales y que provenga de suelos preferiblemente fértiles. La
estaca debe presentar desarrollo avanzado en el grosor y estado de lignificación del
23
xilema, que no presente lesiones mecánicas y esté libre de plagas o enfermedades
causadas por patógenos (hongos, bacterias, micoplasma y virus) que influyan en su
rendimiento (López, 2012 y Aristizábal, et. al., 2007).
Las partes más apropiadas de la planta para obtener las estacas, son la basal y la
media del tallo primario, por su mayor acumulación de sustancias de reserva y mejor
madurez fisiológica. Para seleccionar la semilla, se acostumbra realizar una prueba de
viabilidad que consiste en efectuar un corte superficial en la corteza del tallo y
comprobar si de este fluye inmediatamente y en alta proporción látex, lo que significa
que la rama tiene humedad y capacidad de brotación, o de lo contrario, si el látex no
sale o se demora en salir se considera el material como no viable (Aristizábal, et. al.,
2007).
Debido a la baja tasa de multiplicación de plantas de yuca; un método para garantizar
el uso de semilla asexual sana es utilizar plantas obtenidas por propagación rápida, se
puede realizar mediante el método de inducción de retoños, el cual consiste en la
inducción de brotes y posterior enraizamiento, a partir de estacas de dos o más nudos
(Aristizábal, et. al., 2007).
3.1.2 Enfermedades y plagas trasmitidas por estacas de yuca. Varias de las causas
que ocasionan bajo rendimiento en el desarrollo de los cultivos de yuca provienen de
agentes patógenos e insectos plaga que se trasmiten por medio del material de
siembra. Los patógenos pueden ser sistémicos o localizados. Los patógenos
sistémicos son capaces de invadir toda la planta y no se pueden detectar fácilmente en
la obtención de estacas porque no producen síntomas en los tejidos lignificados y
maduros. Dentro de estos organismos nocivos reportados se encuentran los hongos
como Diplodia manihotis, Fusarium solani, F. xoysporum, y Sphaceloma manihoticola.
Bacterias como Xanthomonas axonopodis p.v. manihotis que puede producir pérdidas
de germinación superiores al 25% y económicas de más del 50% (López, 2002). Virus
como el mosaico africano, el mosaico común americano, el mosaico de las nervaduras
y el mosaico caribeño, que pueden producir en las plantas síntomas foliares o
síntomas radicales (López, 2002).
24
Los patógenos localizados cuya capacidad invasora no es sistémica, sólo penetran
zonas de estacas heridas o averiadas por medios mecánicos o por insectos.
Pertenecen a este grupo Erwinia cartovora pv carotovora (pudrición bacterial del tallo),
Agrobacterium tumefaciens (agalla bacterial del tallo), Colletotrichum spp. (antracnosis)
y Phoma spp (mancha de anillos circulares) (Lozano y Jayasinghe, 1982 citado por
López, 2002).
Los insectos y ácaros también pueden diseminarse fácilmente vía material de
propagación (Lozano, 1982 citado por López, 2002). Los huevos y las larvas son los
estadios más comunes de infección que se pueden encontrar en las yemas de los tallos
y dentro del tejido de los tallos. Los ácaros como Mononychellus tanajoa, Tetranychus
urticae y Oligonychus peruvianus, y las escamas (Aonidomitilus albus, Saissetia
miranda) se consideran entre las plagas más graves que tiene la yuca (López, 2002).
Los trips, siendo la especie más importante Frankliniella williamsi pueden reducir el
rendimiento y la reducción en la producción de material de siembra en Colombia para
ocho variedades susceptibles (Bellotti & Schoonhoven, 1978 y Lozano et. al., 1986
citado por López, 2002). Las larvas de insectos como Anastrepha pickeli, A. manihoti
hacen túneles en los tallos de la planta de yuca. Otros, como los piojos harinosos
(Phenacoccus manihoti y P. herreni) ovipositan en las partes inferiores de las plantas
que sirven como material de siembra y se trasmiten al nuevo cultivar, completando su
ciclo biológico al estimularse nuevamente el desarrollo de la planta.
3.1.3 Reporte de hongos endófitos en yuca. En la mayoría de las plantas vasculares
investigadas se ha encontrado que albergan hongos endófitos (Saikkonenet. al, 1998;
Arnold y Lewis, 2005 citado por Meyling & Eilenberg, 2007). Estudios en M. esculenta
han mostrado que es una planta hospedera de varias especies de hongos endófitos de
la epidermis, colénquima y parénquima del tallo de varios clones, sin síntomas visibles
de enfermedad alguna (Hernández, 1995). Según estudios de Riviera (1992) de seis
variedades de yuca estudiados, se aislaron 91 cepas de hongos y reportes de la
literatura en Hernández (1995) registran algunas de las especies aisladas de tejidos
internos de plantas aparentemente sanas. Además, dentro de los mismos estudios,
utilizando plantas inoculadas artificialmente, concluyen que el efecto de colonización-
25
resistencia parece variar de acuerdo al clon inoculado y al sistema de inoculación
implementado. Parece que existen diferencias en susceptibilidad a estos endófitos y
que algunos pueden ser detrimentes o benéficos en determinadas circunstancias
(Riviera, 1992).
Por otra parte, la yuca es capaz de formar asociaciones con una amplia diversidad de
hongos micorrízicos arbusculares (HMA), los cuales actúan como un complemento de
la raíz de la planta en la toma de nutrientes (Barrer, 2009 y Straker, Hilditch, & Rey,
2010). En suelos tropicales de Suramérica se encontró que Glomus manihotis es el
HMA más fuertemente invasivo, eficaz y competitivo con la capacidad de mejorar las
condiciones de la planta (Sieverding y Toro, 1989 citado por Straker, et al, 2010), y en
África se han reportado recientemente especies como: Glomus etunicatum, G.
rubiforme, Gigaspora sp., Acaulospora scrobiculata y Scutellospora sp. como hongos
endófitos de la raíz (Straker, et al, 2010).
3.2 PIOJO HARINOSO
3.2.1 Generalidades. Los piojos harinosos son parte de un extensivo complejo de
insectos y ácaros que atacan la yuca (Bellotti y Schoonhoven, 1978 citado por Bellotti,
2000) constituyendo uno de los principales problemas de producción. Pertenecen a la
familia Pseudococcidae y las dos especies más importantes son Phenacoccus herreni y
P. manihoti. Estas dos especies son similares taxonómicamente y causan síntomas
similares de daño, pero difieren notablemente en su ecología (Cox y Williams,
1981citado por Bellotti, Reyes, & Varela, 1983). P. manihoti y P. herreni son insectos
oligófagos que principalmente colonizan especies de Manihot. Según Calatayud y Rü
(2006), en Suramérica se ha reportado P. manihoti para Citrus spp. (Rutaceae) y en
soya, Glycinemax (L.) Merr. (Fabaceae), mientras que P. herreni sólo se ha reportado
en M. esculenta (Williams y Granara de Willink, 1992citado por Calatayud y Rü, 2006).
Los focos más importantes de P. herreni se han registrado en el Norte de Suramérica y
al Noreste de Brasil, donde altas poblaciones pueden causar pérdidas considerables
(Bento, et. al., 2000 citado por Bellotti, 2000). El daño es ocasionado por la
alimentación de ninfas y adultos, los cuales causan amarillamiento, encrespamiento de
las hojas y formación de roseta en los puntos de crecimiento. En altas poblaciones
26
generan necrosis, defoliación, distorsión del tallo y muerte del cogollo. Los mayores
picos de población de P. herreni se presentan con el incremento de la temperatura
acompañado de un período largo de sequía, lo que hace que se intensifique la
actividad de la plaga y el daño del cultivo (Bellotti, 2000).
3.2.2 Morfología. P. herreni tiene un marcado dimorfismo sexual después del segundo
instar (Calatayud &Rü, 2006). La hembra es áptera, de forma oval, cuerpo blanco y
segmentado, con antenas cortas y tres pares de patas. Después de la emergencia y de
cada muda el cuerpo es traslucido, cubriéndose posteriormente con unas pequeñas
secreciones cerosas que le dan un aspecto algodonoso. El macho adulto es alado,
frágil, con las partes bucales reducidas, el cuerpo es de color rosado con un par de alas
y dos apéndices caudales cerosas de color blanco; largos como el cuerpo, patas bien
desarrolladas y la longitud de las antenas es igual a las dos terceras partes de su
cuerpo (Varela &Bellotti, 1981 citado por Vargas &Bellotti, 1984), y pueden copular con
varias hembras, la relación de sexos es de tres hembras por un macho (Burbano,
2003).
3.2.3 Ciclo Biológico. Bajo condiciones de invernadero, el desarrollo del ciclo de vida
entre el huevo y el adulto es de 20 días (Burbano, 2003; Calatayud & Rü, 2006). Antes
de iniciar la oviposición la hembra forma en la parte superior de su cuerpo un saco
algodonoso donde son colocados los huevos (Burbano, 2003). La oviposición ocurre 3
días después de la copulación y cada hembra oviposita un promedio de 200 huevos por
ovisaco (Burbano, 2003; Vargas &Bellotti, 1984). Bajo condiciones de invernadero, con
una temperatura promedio de 28°C, el desarrollo de los huevos dura ~8 días; el primer
instar femenino ~6 días; segundo instar ~6 días; tercer instar ~6 días; adulto pre-
oviposición ~6 días y adulto-oviposición ~18 días (Varela &Bellotti, 1981 citado por
Calatayud & Rü, 2006). En los machos, el desarrollo del primer instar dura ~6 días;
segundo instar ~3 días; tercer instar ~3días; y entre el cuarto instar y el adulto ~3 días
(Varela &Bellotti, 1981 citado por Calatayud & Rü, 2006) (Fig. 1). Durante el tercer y
cuarto instar, los machos completan su desarrollo a adultos alados dentro de un capullo
o “cocoon” (Calatayud & Rü, 2006), cuando emergen su promedio de vida es de ~2
días en los cuales copula y muere.
27
Fig. 1. Ciclo biológico de P. herreni de acuerdo a Varela & Bellotti( 1981) adaptado de
Calatayud & Rü, (2006).
P. herreni es un insecto floemófago, caracterizado por presentar un aparato bucal
picador-chupador durante todo el ciclo biológico de las hembras. Los machos
presentan el aparato bucal hasta el segundo instar; posteriormente se atrofia y dejan de
alimentarse. Por eso, las hembras al conservar su aparato bucal y alimentarse del
floema durante todo su ciclo de vida, son las que causan el mayor deterioro a los
cultivos (Polania, Calatayud &Bellotti, 1999).
3.2.4 Ecología y Comportamiento. La infestación de la planta es iniciada por los
primeros instares ninfales los cuales migran a la parte apical de los puntos de
crecimiento de la planta y alrededor de estos puntos se incrementa la población inicial
de piojo harinoso (Burbano, 2003). A medida que la población aumenta los piojos
migran del brote y se diseminan por toda la planta. Esta dispersión activa inicia en los
tallos y luego llega a las hojas. En sus primeros estadios P. herreni se puede también
dispersar pasivamente por corrientes de viento. Las infestaciones se hacen más fuertes
en los períodos secos y disminuyen durante los períodos de lluvia, donde los rebrotes
28
de las yemas basales pueden estar considerablemente contaminados (Burbano, 2003),
y de este punto empezar una nueva infestación en una próximo período de sequía o en
cultivares nuevos por la transmisión en material de siembra.
3.3 HONGOS ENTOMOPATÓGENOS
3.3.1 Proceso de Infección. En general los hongos entomopatógenos invaden a los
insectos directamente a través del exoesqueleto o cutícula (Charnley & Collins, 2007).
El ataque tiene diferentes etapas: adherencia, germinación, diferenciación y
penetración (Kouassi, 2001 citado por Echeverría, 2006). En la primera etapa, el
conidio se adhiere a la cutícula del insecto y penetra a través del integumento. Para
esto es necesario el reconocimiento y la compatibilidad entre el conidio y las células del
tegumento del insecto (Echeverría, 2006). Las esporas hidrofóbicas se unen a la
cutícula del insecto por dos interacciones específicas (Charnley & Collins, 2007): una
pasiva en la cual ejercen fuerzas electrostáticas e hidrofóbicas, y otra activa, en la cual
se secretan mucílagos, que interactúan químicamente con las lecitinas de la membrana
y generan un ambiente favorable para la secreción de enzimas (Kouassi, 2001; Wong,
2003; Duperchy, 2003 citado por Echeverría, 2006). El proceso seguido a la adhesión
de la espora en la cutícula, es la germinación, que depende de la influencia de
condiciones como temperatura, humedad (Gottlieb, 1978 citado por Vega, Meyling,
Luangsa-ard & Blackwell, 2012), factores nutricionales, químicos y físicos (Vega, et. al.,
2012). La diferenciación del hongo inicia con la formación de un tubo germinativo,
seguido de la formación de un apresorio (Echeverría, 2006; Vega, et. al., 2012), el cual
ayuda a la penetración de la cutícula por actividad enzimática extracelular y presión
mecánica (Kouassi, 2001; Wong, 2003; Duperchy, 2003 citado por Echeverría, 2006),
lo cual toma unas 12 horas (Cenicafé, 2002). Una vez que el hongo rompe a través de
la cutícula y subyace a la epidermis, se prolifera en la hemolinfa, donde la muerte del
insecto es el probable resultado de inanición o alteración fisiológica/bioquímica
provocada por el hongo (Charnley & Collins, 2007), donde después de 72 horas de la
inoculación el insecto está totalmente colonizado (Cenicafé, 2002).
29
El ciclo de vida se completa cuando el hongo esporula sobre el cadáver del huésped
(Charnley & Collins, 2007). En condiciones de humedad relativa alta, el hongo saldrá a
través del cuerpo del insecto produciendo esporas aéreas, que permiten la trasmisión
horizontal o vertical de la enfermedad dentro de la población de insectos (Charnley &
Collins, 2007). La duración de las diferentes fases de este ciclo depende de la especie
atacada y las condiciones ambientales presentes durante la infección (Cenicafé, 2002).
Fig. 2. Ciclo de desarrollo de un hongo entomopatógeno (a). Cepa de Metarhizium
anisopliae esporulando en un cadáver recolectado en campo (b). Tomado y adaptado
de Thomas &Read, (2007).
3.3.2 Beauveria bassiana. Es un hongo entomopatógeno anamórfico del orden
Hypocreales (Ascomycota) es enemigo natural de una amplia gama de insectos y
arácnidos, presenta un distribución cosmopolita (Roberts & St. Leger, 2004; Rehner,
2005 citados por Meyling & Eilenberg, 2007). Se ha documentado que se encuentra
naturalmente en más de 700 especies huésped (Inglis et. al, 2001 citado por Meyling &
Eilenberg, 2007), pero el estudio sobre la prevalencia de hongos en los insectos ha
sido enfocada a las especies plaga, como algunos depredadores y parasitoides
30
(Meyling & Eilenberg, 2007). Las apariciones de los hongos como infecciones en
huéspedes son presumiblemente la única parte del ciclo de vida en que los hongos
pueden acumularse en tamaños significativos de población mediante la producción de
un gran número de conidios parasitoides (Meyling & Eilenberg, 2007); contribuyendo
así a la disponibilidad de hospedantes susceptibles, lo que lo convierte en un
componente clave para estrategias de control biológico.
Múltiples ensayos de patogénesis de B. bassiana frente a muchas plagas en diferentes
cultivares se han hecho, y se ha comprobado que el hongo presenta actividad
entomopatogénica en variados tipos de insectos alrededor del mundo, incluyendo
órdenes Coleóptera, Lepidóptera, Homóptera y Arthropoda (Alcázar, et. al., 1999 citado
por Echeverría, 2006). En la agricultura, se ha utilizado para el combate de la
cucaracha de la papa de Colorado (Leptinotarsa decemlineata), termitas y hormigas
(Acromyrmex sp, Atta sp), barrenador del maíz (Ostrinia nubilalis), Anthonomus
grandis del algodón, Cosmopolites sordidus del banano, Ancognatha sp, Compsus sp
(EDAFON, 2005 citado por Echeverría, 2006). En ornamentales, Pseudococcus sp en
piña, Loxotama elegants en palma, Trips sp, ácaros en general y Corytucha sp en
hortalizas y frutales (EDAFON, 2005 citado por Echeverría, 2006), pero no ha sido
utilizado para el control de piojo harinoso (P. herreni) en yuca.
Diferentes estudios evidencian que B. bassiana tiene el potencial de vivir como endófito
(Meylin & Eilenberg, 2007). Su presencia en tejido interno de múltiples especies de
plantas puede tener implicaciones protectoras contra insectos herbívoros (Elliot, et al.,
2000; White, et al., 2002 citado por Meylin & Eilenberg, 2007). Además de su presencia
natural en hojas de maíz, ha mostrado que puede establecerse como endófito en cacao
(Theobroma cacao) (Posada & Vega, 2005 citado por Meylin & Eilenberg, 2007),
amapola (Papaver somniferum) (Quesada-Moraga, et al, 2006 citado por Meylin &
Eilenberg, 2007) y café (Coffea spp.) (Meylin & Eilenberg, 2007).
3.3.3 Metarhizium anisopliae. Es uno de los hongos patógenos más comúnmente
aislados de insectos, con más de 200 especies de insectos huésped (ST. Leger, 2007)
y es un habitante común de los suelos en todo el mundo (Sasan & Bidochka, 2012). M.
anisopliae var. anisopliae es la más común, en Colombia esta especie se ha aislado de
31
19 especies de insectos pertenecientes en su mayoría a los órdenes Coleóptera,
Homóptera, y Lepidoptera (Cenicafé, 2002). El hongo es muy frecuente en ecosistemas
de pastos, caña de azúcar, plátano, papa y arroz (Cenicafé, 2002). En todos estos
cultivos regula poblaciones de insectos del suelo como chisas (Scarabaeidae), salivitas
o miones de los pastos (Zulia colombiana), gusano blanco de la papa
(Premnotrypesvorax) y áfidos. M. anisopliae yaes comercialmente desarrollado y muy
promisorio para el control de muchos insectos plaga.
Diferentes estudios han reportado que M. anisopliae tiene la capacidad de establecerse
como endófito en tomate (Lycopersicon esculentum L.), maíz (Zea mays) y
recientemente en canola (Brassica napus), (Batta, 2013).Tiene la capacidad de
colonizar la rizosfera de plantas como el repollo (Brassica oleracea) (Hu& St. Leger
2002 citado por Kabaluk & Ericsson, 2007) y Picea abies, ésta última especie, una
conífera de gran importancia económica en Europa, donde se ha demostrado que las
raíces inoculadas con este hongo tienen la capacidad de controlar el picudo negro
(Otiorhynchus sulcatus) (García, Posadas, Perticari & Lecuona, 2011). García, et. al.,
(2011) menciona que M. anisopliae puede tener efectos adicionales sobre el desarrollo
de las plantas. En su estudio se evidencia que plantas de tomate tratadas incrementan
la longitud de sus raíces, el peso seco de brotes y raíces comparado con las plantas no
tratadas. Adicional, en otro estudio, semillas de maíz tratadas con M. anisopliae no se
ven afectadas en el porcentaje de germinación ni el crecimiento de las raíces, y resulta
en un incremento significativo del peso fresco, además de que ejerce control sobre el
gusano alambre (Agriotes obscurus L.) (Kabaluk & Ericsson, 2007; García, et. al.,
2011).
Hasta el momento, no se han encontrado reportes de B. bassianayM. anisopliae como
endófitos en yuca. El objetivo central de este estudio es explorar el potencial endofítico
de estos dos hongos en la yuca.
32
4. RESULTADOS
4.1 COLONIZACIÓN ENDOFÍTICA
La prueba de germinación indicó que la viabilidad de los conidios fue óptima en el
momento de la aplicación de los tratamientos a las estacas de yuca. El porcentaje de
conidios viable para B. bassiana fue del 96% y para M. anisopliae del 93%. Un conidio
se consideró germinado si la longitud del tubo germinativo era superior a la mitad del
diámetro del conidio 24 horas post-incubación.
Veintiún días después de tratar las estacas de yuca por inmersión en las suspensiones
conidiales, se encontró que M. anisopliae colonizó endofíticamente el 100% de las
plantas evaluadas y B. bassiana el 16%. Mientras que en las plantas evaluadas como
control no se evidenció la presencia de ninguno de estos hongos. Esta colonización
varió con respecto a las diferentes partes de la planta evaluadas: M. anisopliae colonizó
el 13.9 ± 10.6% de los fragmentos de raíz de cicatriz evaluados, el 20.8 ± 12.8% de los
fragmentos de raíz de cicatriz, el 40.3 ± 12.4% de tallo base y, el 16.7 ± 10.7% de tallo
medio. En el caso de B. bassiana solo se encontró colonización en tallo medio y fue de
2.8 ± 2.7% (Fig. 3).
33
Fig. 3. Porcentaje de la colonización endofítica de M. anisopliae (1), B. bassiana (2), y
Control (3) en tejido de yuca por parte de planta después de un tratamiento por
inmersión de estacas en las suspensiones conidiales. Las barras indican el error
estándar.
4.2 INFESTACIÓN
Aunque no se evidenció diferencia significativa en el número de hembras de P. herreni
encontradas en los tratamientos F=1.63, df= 15, P=0.2285, el promedio del número de
hembras obtenidas en el tratamiento con M. anisopliae fue ligeramente menor (5.8 ±
1.8) en comparación con el encontrado en B. bassiana (10.8 ± 3.1) y el control (11.7 ±
2.2) (Fig. 4). El peso de las hembras tampoco evidenció alguna diferencia entre
tratamientos F= 1.62, df = 15, P = 0.2292 (Fig. 4).
No se evidenciaron diferencias significativas en el número de peciolos F=1.65, df=15,
P=0.2244 entre los tratamientos, pero se evidenció un ligero incremento en el peso de
las hojas en las plantas tratadas con B. bassiana F=3.35, df=15, P=0.0624 (Fig. 5).
34
Se encontró una correlación entre el número de hembras con respecto al número de
peciolos y delnúmero de hembras con respecto al número de peciolos (R2 = 0.3060; P
= 0.0172*; F1,15= 7.0573).
Fig. 4. Efecto de los tratamientos B. bassiana, M. anisopliae y control sobre el estado
de P. herreni en una infestación de plantas de yuca. El estado de los insectos se
categorizó como número (izquierda) y peso promedio de las hembras (derecha). Las
barras indican el error estándar.
35
Fig. 5. Efecto de los tratamientos M. anisopliae, B. bassiana y control sobre el estado
de plantas de yuca atacadas por P. herreni treinta días después de una infestación. Las
barras indican el error estándar.
36
5. DISCUSIÓN DE RESULTADOS
Después del tratamiento por inmersión de estacas de yuca en dos suspensiones
conidiales condos cepas de hongos entomopatógenos,se evidenció colonización en
diferentes partes de las plantas. M. anisopliae mostró que tiene capacidad de colonizar
endofíticamente raíces y tallos de plantas de yuca. Mientras que B. bassiana se
evidenció colonizando en muy baja proporción muestras evaluadas del tallo medio.
Aunque se evidenció colonización de las dos cepas de hongos usados, esta no fue
suficiente para detectar algún efecto frente al ataque de P. herreni. Sin embargo, se
observa una ligera tendencia de la disminución entre el número de hembras en las
plantas tratadas con M. anisopliae comparada con las tratadas con B. bassiana y el
control. También, se ve una ligera tendencia en el incremento del peso de las hojas en
las plantas tratadas con B. bassiana comparado con las tratadas con M. anisopliae y el
control.
Es un punto importante que se haya detectado la presencia de M. anisopliae en tallo
base y en tallo medio de los brotes de yuca. Lo que puede estar mostrando que hay
movimiento y crecimiento de las hifas del hongo en las estructuras internas de las
plantas de yuca. Como señalan García et al. (2011), obtener reaislamientos del hongo
en un punto distante de la inoculación, indica que el hongo es capaz de moverse dentro
de la planta. Los autores argumentan que la circulación de un hongo endófito dentro
de una planta se debe al movimiento pasivo dentro del xilema y al desarrollo de hifas
dentro de los elementos vasculares (García et. al., 2011). Quizá si se hubiera
muestreado plantas de yuca de más días de desarrollo posiblemente se hubiera
encontrado colonización endofítica de M. anisoplie en hojas. Wagner y Lewis, (2000)
reportaron que el crecimiento de las hifas puede ser lento y muchas veces detenido,
por lo que es posible que en un período posterior a los 21 días, momento en que se
realizó la evaluación de colonización en este trabajo, el crecimiento de las hifas
estuviera aún en proceso. Sí el crecimiento de las hifas alcanzara el meristemo
caulinar, donde se encuentran los brotes de las hojas más jóvenes es posible que
37
pueda evidenciarse un efecto nocivo del hongo sobre insectos fitófagos como P.
herreni, ya que ésta es el área preferencial de alimentación de estos insectos.
Este estudio demuestra por primera vez la capacidad de M. anisopliae de establecerse
como endófito en plantas de yuca con mayor eficacia que B. bassiana. Pero, los
resultados indican que el tratamiento de semilla en una suspensión conidial no es la
metodología más eficiente para permitir que M. anisopliae se establezca
endofíticamente en plantas de yuca. La habilidad del establecimiento de M. anisopliae
después de tratamientos de inoculación artificial ha sido demostrado como una fuerte
asociación que se da únicamente en el sistema radical de diferentes especies de
plantas (Akutse et al., 2013; Meyling & Eilenberg, 2007). Sin embargo, García et al.
(2011) evidenciaron la colonización endofítica de tres aislamientos de M. anisopliae
(Ma8, Ma10 y Ma20) en los brotes y las raíces de plantas de tomate, y de un
asilamiento (Ma8) en las hojas. Resultados similares fueron obtenidos en este estudio,
donde se pudo recuperar la cepa empleada del tallo base y del tallo medio de brotes de
yuca de 21 días de desarrollo, y de las raíces provenientes de yemas y de la cicatriz
donde se hace el corte de la estaca. Pero, no se evidenció actividad endofítica de M.
anisopliae en las hojas.
Por otra parte, el éxito del establecimiento endofítico de B. bassiana después de una
inoculación artificial ha sido reportado en un considerable número de estudios.
Diferentes autores han reportado que B. bassiana tiene la habilidad de colonizar tejido
vegetal de maíz (Anderson y Lewis, 1991), banano (Akello et al., 2007), Sorgo (Reddy
et al., 2009; Tefera y Vidal, 2009), haba (Vicia faba) y frijol (Phaseolus vulgaris)
(Akutseet al., 2013; Parsa, Ortíz y Vega, 2013) después de tratamientos por aspersión
foliar, riego o “drench” e inyección del tallo. También, Ownley et al. (2009) y
Brownbridge et al. (2013) tuvieron éxito en la inducción artificial de B. bassiana con
tratamientos de semillas en pino radiata, tomate y algodón. En los diferentes estudios
reportados se ha podido comprobar la colonización de B. bassiana en raíces, tallos y
hojas,mientras que en el presente estudio no se evidenció claramente esta capacidad
de colonización después del tratamiento por inmersión de estacas. Cómo indica
Brownbridge et al. (2013), un resultado como este puede indicar que el método para re-
38
aislar B. bassianapuede no ser lo suficientemente sensible para evidenciar la incidencia
real del hongo en la planta. La incidencia de otros hongos y bacterias en el sistema
pueden estar influenciando en el éxito de la recuperación de la cepa, la competencia
puede conducir a la inhibición de la germinación o el crecimiento de B. bassianadentro
de la planta.
Aunque queda evidente la capacidad diferencial de colonización de M. anisopliae en las
plantas tratadas, no se detectóun efecto controlador sobre insectos de P. herreni. Sólo
se puede evidenciar una tendencia a la disminución del número de insectos en el
tratamiento con M. anisopliae.Estudios previos han demostrado que M. anisopliae tiene
una eficacia insecticida contra larvas de Plutella xylostella (Batta et al., 2013). Los
resultados evidenciaron que la mortalidad de las larvas de P. xylostella aumentó de
cero a 63.3% cuatro semanas después de la inoculación del hongo debido al efecto del
hongo endófito. Los autores atribuyen la mortalidad de las larvas al crecimiento interno
del hongo en los tejidos de las plantas después de la germinación y la penetración a
través del tejido vegetal, y al posterior desplazamiento de las hifas en la parte interna
de la planta. Respaldando esto, en otro estudio el método de penetración del hongo
entomopatógeno B. bassiana aplicado foliarmente fue demostrado por microscopía
óptica y electrónica por Wagner y Lewis (2000). Estos autores evidenciaron que
después de una inoculación por aspersión foliar con conidios el crecimiento de las hifas
fue al azar sobre la superficie del tejido, y que cuando la penetración ocurrió no se
necesitó de señales específicas en un sitio de entrada apropiado como ocurre con
algunos hongos fitopatógenos.
Hasta donde se tiene conocimiento este es uno de los primeros estudios donde se ha
evaluado la capacidad de colonización endofítica de dos hongos entomopatógenos en
plantas de yuca encaminado al control de plagas. Muchos esfuerzos se han puesto en
la investigación de M. anisopliae y B. bassiana como agentes de control biológico para
su aplicación en la agricultura (Revisado por Meyling & Eilenberg, 2007). Evidencias
recientes sugieren que ambas especies tienen el potencial de establecerse en los
tejidos internos de las plantas sin causar síntomas, y que proporcionan a sus
hospederos protección contra patógenos y herbívoros (Arnold et al. 2003; Arnold &
39
Lewis, 2005; Schulz & Boyle, 2005; Rudgers et al. 2007 revisado por Vega et al. 2009;
Meyling & Eilenberg, 2007). Cómo afirman diferentes autores, el establecimiento
endofítico puede depender del aislamiento usado, la especie y la variedad de la planta
hospedera e incluso la metodología de inoculación implementada para establecer
hongos entomopatógenos como endófitos (Akutse et al., 2013; Parsa, et al., 2013).
Debido a la ausencia de literatura sobre investigaciones que hablen acercadel
tratamiento de estructuras de reproducción vegetativa, este estudio muestra que es
necesario investigar diferentes metodologías que hagan más eficiente la inoculación de
hongos entomopatógenos. Quizás metodologías en las cuales no sea necesario tratar
la estaca completamente sino sólo una parte. Técnicas como riego del suelo o “drench”
con la suspensión conidial 10 días después de la siembra, pueden permitiruna mayor
asociación del hongo con las raíces recién emergidas. También, una aspersión foliar 10
días después de la siembra cuando esté estimulado el proceso de germinación y
apenas la yema este brotando. Estas técnicas podrían facilitar y aumentar la
colonización del hongo en tallo y meristemo apicalpermitiendo el acceso del hongo a
las hojas. Esto podría mejorar la eficiencia de la colonización y evidenciar más
fácilmente si existe algún tipo de efecto sobre el ataque de piojo harinoso.
40
6. CONCLUSIONES
Los resultados de este ensayo demostraron que el tratamiento de estacas de yuca con
hongos endófitosevidenció que la cepa 9236 de M. anisopliaetuvo mayor éxito de
colonización que la cepa GHA deB. bassiana.
La cepa 9236 deM. anisopliaetiene la capacidad de colonizar endofíticamente las
raíces provenientes de yema y de cicatriz donde se hace el corte de la estaca, yel tallo
base de plantas de yuca.
La cepa GHA deB. bassianademostró una baja capacidad de colonizar
endofíticamenteplantas de yuca.
En comparación con los controles no se evidenció algún efecto de los hongos
inoculados sobre una infestación de P. herreni.
El tratamiento de inmersión de estacas en una suspensión conidial permitió evidenciar
colonización endofítica.Pero,no es un método eficiente en comparación con métodos
de inoculación como la aspersión foliar o “drench” que han permitido hasta un 80% de
colonización de hongos entomopatógenos en diversas especies de plantas.
Aunque se evidenció colonización endofítica, el tratamiento de semilla en una
suspensión conidial no es un método que permita establecer eficazmente hongos
entomopatógenos como endófitos en plantas de yuca a un nivel que pueda evidenciar
algún efecto sobre un ataque de piojo harinoso.
M. esculenta variedad CMC40 tiene más habilidad de establecer asociación con la
cepa 9236 de M. anisopliae que con la cepa GHA de B. bassiana.
41
7. RECOMENDACIONES
Ampliar el rangode hongos entomopatógenos para tratamientos de estacas de
yuca. Evaluar diferentes cepas de M. anisopliae y B. bassiana para seleccionar
las más promisorias para el manejo de piojo harinoso.
Consultar otras variedades de M. esculenta de importancia económica y evaluar
en más de una variedad los tratamientos con hongos entomopatógenos para
determinar si las asociaciones se dan diferencialmente entre una variedad de
yuca y una cepa de un hongo entomopatógeno endófito.
Evaluar la eficacia de otros métodos de inoculación como la aspersión foliar y
riego de suelo o “drench” durante la primera etapa de desarrollo de plantas de
yuca.
Explorar el uso de un método biotecnológico para la detección de hongos
endófitos inducidos, que permita explorar un mayor porcentaje de tejido vegetal.
Evaluar diferentes concentraciones de inoculo para tratamientos de estaca,
partiendo de un aumento de la concentración usada en este trabajo.
Tras el tratamiento de inmersión de estacas yuca permitir un desarrollo de las
plantas mayor a 21 días, para determinar si la cepa 9236 de M. anisopliae y/o la
cepa GHA de B. bassianatienen la capacidad de moverse y/o crecer dentro del
tejido y poderlas detectar en la parte aérea de la planta.
Determinar cuánto es el tiempo de persistencia y de acción de un hongo
entomopatógeno endófito en una planta de yuca.
42
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