Por: M. en C. de Educ. Guadalupe E. Daleth Guedea Fernándezdaleth.guedea@gmail.com

Trabajo publicado en www.ilustrados.com

La mayor Comunidad de difusión del conocimiento

Introduccion• En ocasiones al ver una serie en la t.v.; de las policíacas o de

médicos donde se hacen análisis a pequeñas muestras para averiguar si hay DNA y si este coincide con el de la “víctima” o con el “malo”, o si cierta sustancia puede afectar a la salud, etc.., entonces uno ve que los investigadores hacen una serie de estudios con las muestras, que en ocasiones son muy pequeñas, y dan resultados; en la vida real sucede algo similar; cuando se tiene en el laboratorio, en una solución, presencia de color, o cuando se sabe que hay ciertas cantidades de algún elemento pero no se sabe cuanto, se genera la inquietud de saber que elemento es, en que cantidad está y es entonces que se producen una serie de preguntas, tales como: ¿COMO LO MIDO? y otras más, entre ellas pueden estar: ¿Qué es la luz?, ¿qué es longitud de onda, ¿cómo se mide?, ¿que relación hay entre luz y color?; ¿para que sirve esto?, ¿de qué manera se mide una solución coloreada?.

• En este trabajo se propone de orientar de manera sencilla, sobre este tema tratando de dar una idea fundamental de las preguntas anteriores y otras más que se hacen en torno al tema que se está presentando; espero este trabajo sea útil tanto a profesores como alumnos para orientarse y poder entender más acerca de la espectrofotometría a nivel laboratorio de ciencias biológicas.

Espectroscopía

• Características de la Luz

• Colores

• ¡Qué es longitud de Onda?

• Relación entre frecuencia, velocidad y longitud de onda

• Absorción / Absorbitividad

• Las leyes de Lambert y Beer

Espectrofotometría

Colorimetría y Espectrofotometría como procedimientos analíticos

Fotocolorímetro

ESPECROFOTÓMETRO

Curva Patrón

Referencias e ImágenesReferencias e Imágenes

La espectroscopia es el estudio del espectro de la luz que emiten los cuerpos, sustancias y elementos.

De este estudio se puede conocer la composición, temperatura, densidad, velocidad de desplazamiento y otros factores que les son propios y componen a estos cuerpos, sustancias o elementos

La luz tiene una naturaleza dual: •Como onda •Como una corriente de partículas o paquetes de energía (fotones)

Albert Einstein desarrolló en 1905 la teoría de que la luz estaba compuesta de unas partículas denominadas fotones, cuya energía era inversamente proporcional a la longitud de onda de la luz.

Foton

1

2

3

La teoría electromagnética de la luz propuesta por Maxwell: La perturbación que se propaga como ondas de luz está formada por fuerzas eléctricas y magnéticas, y la perturbación se produce en cargas eléctricas en movimiento.

“Efecto de la emisión electromagnética”

El efecto fotoeléctrico demuestra el comportamiento de la luz como partícula (gránulos o corpúsculos)

La naturaleza corpuscular de la luz se observa en fotos de objetos iluminados muy débilmente.

La imagen se forma punto a punto, y muestra que la luz llega a la película fotográfica por unidades separadas que los producen.

Estos descubrimientos dieron origen a toda la tecnología moderna de telecomunicaciones

como la televisión

En estas imágenes se

puede apreciar, debido a la toma

fotográfica los elementos

“puntuales “ que apoyan a esta

teoría

Los seres humanos (y algunos animales) apreciamos una amplia gama de colores que, por lo general, se deben a la mezcla de luces de diferentes longitudes de onda. Se conoce como color puro al color de la luz con una única longitud de onda o una banda estrecha de ellas.

Cuanto más larga la longitud de onda de la luz visible tanto más rojo el color. Asimismo las longitudes de onda corta están en la zona violeta del espectro.

***

Así todos los elementos existentes poseen un espectro

Hay varios tipos de espectros, los más comunes son los espectros continuosespectros continuos, espectros de espectros de

emisiónemisión y los espectros de absorciónespectros de absorción. Si es colocado frente al espectroscopio se podrá ver, un elemento:

En situaciones en las que se le somete altas temperaturas y presiones y no se presentan líneas obscuras se trata de un espectro continuo.

En situaciones normales y se observan unas líneas de colores frente a un fondo negro, se trata de un espectro de emisión.

Y por último si sucede la primer situación y entre el elemento afectado y el espectroscopio se coloca un elemento a menor temperatura que el primero, se obtiene el espectro de absorción

La luz blanca produce al descomponerla La luz blanca produce al descomponerla lo que se llama un lo que se llama un espectro continuoespectro continuo, que , que

contiene el conjunto de colores que contiene el conjunto de colores que corresponde a la gama de longitudes de corresponde a la gama de longitudes de

onda que la integran.onda que la integran.

**Para ver espectros de la tabla periódica buscar en esta

página http://site.ifrance.com/okapi/quimica.htm **

Todos los elementos poseen un espectro propio, que se puede medir al someterse a temperaturas elevadas ya que producen

espectros discontinuos .

La distancia entre dos picos (o dos valles) de una onda se llama longitud de onda (λ = lambda).

λ

CARACTERÍSTICAS DE LAS ONDAS

nodo

La longitud y la frecuencia de onda son inversamente proporcionales y se

relacionan mediante la siguiente ecuación

La luz visible es sólo una pequeña parte del espectro electromagnético con longitudes de onda que van aproximadamente de 350 nanómetros hasta unos 750 nanómetros<nanómetro, nm = milmillonésimas de metro>.

Luz visible

350 nm

750 nm

U.V.

X

GAMMA

Infrarrojo

Microondas

Radio

La luz blanca está compuesta de ondas de diversas frecuencias. Cuando un rayo de luz blanca pasa por un prisma se separa en sus componentes de acuerdo a la longitud de onda

Así la luz blanca es una mezcla de todas las longitudes de onda visibles.

En el espectro visible, las diferencias en longitud de onda se manifiestan como diferencias de color.

La distribución de los colores se determina por la longitud de onda de cada uno de ellos.

UV Violeta Azul Verde Amarillo Naranja Rojo IR 4000 A Espectro Visible 7500 A

Ultravioleta Luz visible Infrarrojo

102 -104 ~ 104 104-107

Las longitudes de onda mas largas que las del rojo se les conoce como infrarrojas y las mas cortas que el

violeta, ultravioletas.

Relación entre frecuencia, velocidad y longitud de onda*

Frecuencia naturalCualquier objeto oscilante tiene una 'frecuencia natural', (vibración en ausencia de perturbación).

frecuencia es el Número de vibraciones por segundo

Así Frecuencia, es número de veces que la onda se repite por segundo.

La Frecuencia se mide en Hertz (Hz)

¿Quién es HERTZ?

HEINRICH HERTZ (1857-1894), Investigador alemán que construyó un dispositivo para generar y detectar en un laboratorio ondas electromagnéticas, demostrando su existencia así como, se reflejan estas ondas, se refractan y se comportan como las ondas de luz

Estimó que la frecuencia f de la onda era de alrededor de 3 x 107 Hz. Y determinó que su longitud l era de 10 m. Con estos valores estableció que la velocidad v de la onda es

vv = = f f l = (3 X 107 Hz) X (10 m) l = (3 X 107 Hz) X (10 m)

= 3 X 108 m/s = 300 000 km/s

o sea, la velocidad de la luz.

1 Hz (o hercio) es igual a 1 ciclo u oscilación por segundo. (1 Hertz =

1 ciclo/seg)

Un kilohercio (kHz) = mil de ciclos por segundo

Un megahercio (MHz) = un millon de ciclos por segundo

Un gigahercio (GHz) = mil millones de ciclos por segundo

Un péndulo de 1 m de longitud presenta una frecuencia de 0,5 Hz, es decir que el péndulo va y vuelve una vez cada 2 segundos.

= c / Donde c = vel. de la luz en m. por seg.

c = (m-1s-1)

= c / l

Longitud de onda = velocidad de propagación / frecuencia

c

Como la luz viaja a una velocidad de3 x 108 m/s

Frec = Vel /

Freclimite luz visible = 3x108 (m/s) / 10-6 (m)=

3x1014 Hz

Es decir: 300 000 000 000 ciclos por segundo

Relación entre Medidas en valores Hertz y Metros

Las ondas electromagnéticas de frecuencias extremadamente elevadas, como la luz o los rayos X, suelen describirse mediante sus longitudes de onda, que frecuentemente se expresan en nanómetros. Un ejemplo es: Una onda electromagnética con una longitud de onda de 1 nm tiene, aproximadamente una frecuencia de 300 millones de GHz.

El sonido se propaga a una velocidad de 340 m cada segundo

La nota La tiene una frecuencia de 440 Hz

= 340 (m/s) / 440 Hz (ciclos por seg) = 0.77 m

vel /

• 4 x 10-5 cm = 400 nm (luz violeta)

• 7 x 10-5 cm = 700 nm (luz roja)

1 0.001 mm 10-6 m

nm = m 0.001 10-9 m

1Å 0.0001nm 10-10 m

Algunas equivalencias

Comparación de las mediciones de las longitudes de onda con la luz visible.

El color de un cuerpo depende de la luz que recibe, refleja o transmite. Por ejemplo, el color rojocolor rojo se dá se dá cuando cuando absorbe en casi suabsorbe en casi su totalidad, todas las totalidad, todas las radiaciones menos las rojas, las cuales radiaciones menos las rojas, las cuales refleja o deja refleja o deja pasar dependiendo su pasar dependiendo su estructura (sólida o transparente)estructura (sólida o transparente)..

El color de un cuerpo depende de la luz que recibe, refleja o transmite. Por ejemplo, el color rojocolor rojo se dá se dá cuando cuando absorbe en casi suabsorbe en casi su totalidad, todas las totalidad, todas las radiaciones menos las rojas, las cuales radiaciones menos las rojas, las cuales refleja o deja refleja o deja pasar dependiendo su pasar dependiendo su estructura (sólida o transparente)estructura (sólida o transparente)..

Con base a lo anterior se puede entender que existe una relación inversa entre la longitud de onda y la energía del fotón correspondiente.

La energía UV es mayor que, cualquier color del espectro visible. Sin embargo los rayos X son más energéticos que la luz UV, como se puede apreciar por su longitud de onda.

Entonces, las energías en el rango ultravioleta-visible excitan los electrones a niveles de energía superiores dentro de las moléculas y las energías infrarrojas provocan solo vibraciones moleculares

El color percibido de una solución depende de la combinación de colores complementarios que la atraviesan

Proceso de Absorción

La energía de excitación a una molécula proveniente de un fotón durante el proceso de absorción se representa así:

A + hn A* A + calor donde:A es el absorbente en su estado de energía bajo, A* es el absorbente en su nuevo estado de excitación energética hn representan a la constante de Planck y la frecuencia respectivamente  

• La energía del fotón incidente posee una longitud de onda ()

 • A* es inestable y rápidamente revierte

a su estado energético más bajo, perdiendo así la energía térmica correspondiente.

 • La absorción de determinadas

longitudes de onda depende de la estructura de la molécula absorbente (absortividad, “a”)

Luz incidente (I0) Luz absorbida Luz emergente (I)

Longitud del medio absorbente o ancho de la celda

I0

c = concentración. (número de partículas por

cm3)

I

a = absortividad

Cuando un rayo de luz monocromática con una intensidad I0 pasa a través de una solución, parte de la luz es absorbida resultando que la luz emergente I es menor que I0

b

a

Absortividad (a)

a es una constante de proporcionalidad que comprende las características químicas de cada compuesto, o molécula y su magnitud depende de las unidades utilizadas para b y c.

Cuando se expresa la concentración en moles por litro y la trayectoria a través de la celdacelda en centímetros, la absortividad se denomina absortividad molar y se representa con el símbolo e .

En consecuencia cuando b se expresa en centímetros y c en moles por litro.

A = e bc

Donde A representa la absorbancia del compuesto

o los fundamentos de la interrelación de la luz que se absorbe y la que se transmite

Las leyes de Lambert y Beer *

Ley de Lambert: cuando un rayo de luz monocromática (I0) pasa a través de un medio absorbente, su intensidad disminuye exponencialmente (I) a medida que la longitud del medio absorbente aumenta

I = I0e-ab

1 cm. 2 cm. 3 cm.

I0 I I0 I0I I

Ancho de la celda

Ley de Beer: Cuando un rayo de luz monocromática pasa a través de un medio absorbente, su intensidad disminuye exponencialmente a medida que la concentración del medio absorbente aumenta

I = I0e-ac

I0 I0 I0I I I

Lo que significa que combinando ambas leyes se crea la Ley de Beer-Lambert donde la fracción de luz incidente que es absorbida por una solución es proporcional a la concentración de soluto y al espesor de la sustancia atravesada por la luz. La relación entre la luz incidente (I0) y la reflejada (I) dará una idea de la cantidad de radiación que ha sido absorbida por la muestra.

Ley de lambert Beer:

I = I0e-abc

Si despejamos: I/I0 = e-abc

Al cociente de las intensidades se denomina Transmitancia

T = I/I0 = e-abc

Sacando logaritmos:

Loge I/I0 = abc

Convirtiendo a log10:

Log10 I/I0 = 2.303 abc

Log10 I/I0 = abc

Absorbancia = Log10 I/I0 = abc

La Transmitancia (T) es la relación entre la intensidad de luz transmitida por una muestra problema (I) con la intensidad de luz incidente sobre la muestra (Io):

T = I / I0

Se expresa como % T

La absorbancia es directamente proporcional a la longitud del recorrido b a través de la solución y la concentración c del color absorbente. Estas relaciones se dan como:

A = a·b·c

• A menudo b es dada en términos de cm. y c en gramos por litro, entonces la absortividad tiene unidades de l·g–1·cm–1.

I0 I

LUZ A B S O R B I D A

Luz transmitida

¿Qué relación guardan la transmitancia y la absorbancia?

De acuerdo a las características de la sustancia analizada, la luz que no se absorbe atraviesa la solución

T = I/I0

Por lo tanto la absorbancia es reciproca de la transmitancia

Absorbancia contra concentración (comportamiento lineal)

% Transmitancia contra concentración (pendiente con signo negativo y comportamiento exponencial)

Concentración

Absorbancia

Concentración

% Transmitancia

De lo anterior se desprende que la Absorbancia (A) o luz que es absorbida por la muestra es igual al logaritmo en base diez del recíproco de la transmitancia (T) o bien al -log10 de la transmitancia, en el que el disolvente puro o (“blanco”) es el material de referencia; esto es:

A = log10 1/T = log101- log10 T = 0 – log10 T = – log10 T

mg

A

Absorbancia

La representación gráfica correspondiente a absorbancia y transmitancia en un gradiente de concentraciones es la siguiente:

Concentración

Obtención de TRANSMITANCIA utilizando valores de Absorbancia

Con base en la relación: T = 10-abc

y considerando que T se menciona en porcentaje (%)

%T = 10-abc x 100.

Aplicando logaritmos a la expresión anterior

log10 %T = -abc log 10 10 + log10 100

Invirtiendo términos

log %T = log10 100 -abc log 10 10 = 2 – abc * 1

log10 %T = 2 – abc

Como abc = Absorbancia = A

log10 %T = 2 – A.

log10 %T = 2 – A.

Ejemplo:Ejemplo:

Una absorbancia de 0.6 ¿a que equivale en Una absorbancia de 0.6 ¿a que equivale en % T?% T?

LogLog10 10 % T = 2 – 0.6 = 1.4% T = 2 – 0.6 = 1.4

Log10Log10 % T = 1.4 % T = 1.4

%T = 1 / %T = 1 / Log10Log1010101.4 1.4

Aplicando antilog. aAplicando antilog. a

1.4 = 15 % de transmitancia1.4 = 15 % de transmitancia

Obtención de absorbancia a partir de un valor de % de transmitancia

RECORDANDO:

A = log10 1/T

Ejemplo de cálculo

%T = 30

T = 0.30

Sustituyendo (1/T) 1/0.30 = 3.33

Log10 3.33 = 0.523 de absorbancia

Se le llama espectrofotometría a la medición de la cantidad de energía radiante que absorbe un conjunto de elementos o un elemento en su estado puro, en función de la longitud de onda de la radiación lumínica y a las mediciones a una determinada longitud de onda.

* Arco iris en * Arco iris en MarteMarte

¿Cómo se puede medir la radiación que emiten o absorben los cuerpos?.

Un aparato capaz de obtener el espectro de una radiación, es decir, de separar la radiación en sus componentes, se llama un espectroscopio.

Si el aparato es capaz de fotografiarla se llama un espectrógrafo, y

Si es capaz de medirla diremos que se trata de un espectrómetro.

Cuando es capaz de medir también la intensidad de la radiación, se llama espectrofotómetro.espectrofotómetro.

Espectroscopio

1817

Espectógrafo

Espectómetro

Imagen de Marte vista con ayuda de espectómetro de rayos Gamma

De fluorescencia

De Emisión Óptica

Para metales

Colorimetría y Espectrofotometría

como procedimientos

analíticos *

Las técnicas colorimétricas se fundamentan con la medición de la absorción de radiación visible por sustancias coloreadas.

Sin embargo, cuando una muestra a determinar no posee coloración, es necesario llevar a cabo un tratamiento de color empleando substancias que que reaccionen de forma proporcional con el compuesto de interés

Las diferentes sustancias se analizan mediante reacciones coloreadas. Cuanto mayor es la concentración de la sustancia a analizar mayor es el color de la reacción.

También es posible que la muestra pueda ser “leída” cuando su espectro de absorción se encuentra en las regiones no visibles del espectro, como las referentes a las regiones de UV o infrarroja

Casiopea A: ecos de luz en infrarrojo  Orbitas de TITANOrbitas de TITAN

Visón de las abejasVisón de las abejas

La diferencia entre colorimetría y espectrofotometría consiste en el tipo de instrumental empleado:

El colorímetro es un aparato en los que la longitud de onda se selecciona por medio de filtros ópticos que son insertados en este.

En el espectrofotómetro la longitud de onda es seleccionada mediante dispositivos monocromadores los cuales están integrados a la máquina.

Algunos de los procedimientos colorimétricos o espectrofotométricos con los que se cuenta para precisar la concentración de una sustancia en solución son los siguientes:

Referencia de color

Colorímetro Klett

Espectrofotómetro

M.C.I/2005

FOTOCOLORÍMETRO KLETT / SUMMERSON

Fundamento de colorímetro Klett

Una solución que absorbe el rojo pero no el amarillo y el azul con la combinación de estos dará un color

verde.

Rojo

Amarillo

Azul

Amarillo

Azul }}

Luz incidente Luz absorbida Luz emergente

Verde

Por lo anterior podemos aplicar un sencillo método para precisar con cual filtro podríamos leer una solución dependiendo el color de esta

Cuando la soluciónsolución sea rojaroja nono se deberá utilizar utilizar un filtrofiltro de color rojo rojo porque justamente ese es el color que no absorbe.

En relación a esto, en el manual del fotocolorimetro Klett aparece la siguiente tabla que se puede utilizar para determinar que filtro se debe emplear de acuerdo al color de la solución a estudiar:

Color del filtro Rango espectral

Soluciones coloreadas

Azul 400-465 Roja, Naranja,Amarilla,

Verde, Turbias

Verde 500-570 Roja, Amarilla, Violeta,

Naranja, Azul

Rojo 640-700 Azul, Verde, Amarilla

A menudo se hace referencia a la “estrella de colores” para facilitar el recordar la elección del color de filtro para lectura colorimétrica. Para soluciones de color azul verde y amarilla correspondería un filtro rojo. Para soluciones de color rojo, naranja o amarrillo seleccionaríamos un filtro color azul. Finalmente para soluciones con color verde, azul o amarilla elegiríamos un filtro rojo.

Manejo del Fotocolorímetro

1. Confirmar, que el filtro (A) adecuado se encuentre dentro del portafiltros (B) y este en su lugar (C)

2. Compruebe que la aguja indicadora (D) este en el centro, en cero; si no es así ajuste a cero con la perilla (E) que se localiza en la parte superior; siempre y cuando la lámpara se encuentre apagada

M.C.I/2005

A

B

CD E

3. La lámpara (F) se enciende con el apagador (G), deje calentar entre 5 y 10 minutos.

4. Ajuste la escala del potenciómetro (H) con la perilla correspondiente (I) a cero

5. Coloque la cubeta (limpia) (J) con el “blanco”, en su sitio (K) y encienda con el interruptor (L)

M.C.I/2005

F G

H

I

J

K

L

6. Mediante la perilla (M) del galvanómetro , se acopla la lectura a cero , lo que implica que la aguja (D) y la escala (H) deben estar en cero.

7. Para leer las soluciones problema : Hay que retirar de la cubeta el “blanco” y colocar la solución problema, la aguja (D) se desviará de su posición , es necesario nuevamente ajustar (con I) a cero, la lectura que proporcione la escala (H) es la correspondiente al “problema “

M.C.I/2005

M

D

H

I

• Las lecturas se realizan en U.K. (unidades Klett)

• Las lecturas que se mayores a 500 U.K y las menores a 25 U.K., no se usaran para calcular concentraciones

• U.K / 500 = Absorbancia

•U.K. X 500 = Transmitancia

CUIDADOS

• Las muestras no deben tener burbujas, encontrarse turbias o con precipitados.

• El volumen de la muestra no debe ser excesivo para evitar que se desborde, en caso de que sucediera, se debe limpiar con un paño limpio o papel absorbente suave, para evitar rayarla.

• La cantidad a adicionar es, máximo, hasta ¾ partes de la cubeta

• No se deben derramar líquidos, sobre todo solventes, ácidos o álcalis; dentro del contenedor de la cubeta, se puede dañar parte del mecanismo

• El fotocolorímetro nunca se debe encender sin filtro.

• No deje que se sobrecaliente, mantenga apagado si no lo utiliza.

Un espectrofotómetro es un instrumento que descompone un haz de luz (haz de radiación electromagnético), separándolo en bandas de longitudes de onda específicas, formando un espectro atravesado por numerosas líneas oscuras y claras, semejante a un código de barras del objeto, con el propósito de identificar, calificar y cuantificar su energía

Distribución de la luz en el espectrofotómetro

 

Espectrofotómetro Mecanismo Interno

Met.Cient. I

 

COLOR LONGITUD DE ONDA ()

Rojo (R) 700 nm

Verde (G) 546.1 nm

Azul (B)435.8 nm

 

¿Porque leer a diferentes (longitudes de onda) compuestos parecidos pero diferentes?

Es usual que al seguir una “receta” para la determinación de la concentración de un compuesto en particular se indica una longitud de onda (específicaa la que hay que leer con el colorímetro o espectrofotómetro.

La explicación radica en el hecho de que cada producto químico se caracteriza por zonas del espectro visible o no visible en el cual absorbe con mayor o menor intensidad conformando en su conjunto el espectro de absorción de tal sustancia.

Cada compuesto (de complejo a simple) presenta un espectro de absorción característico

Las longitudes de onda con mayor absorción (picos) corresponderán de forma general a aquellas con las que se leerá la muestra para determinar su concentración

La relación entre la absorbancia por una sustancia a una determinada y su concentración es directamente proporcional es decir: a mayor concentración mayor proporción de luz absorbida.

Absorbancia Conc.

Absorbancia

Absorbancia

Así, el espectro de absorción de la clorofila es:

Espectro de Absorción (línea contínua) y Espectro de Transmisión (línea discontínua).

Colorante común, la Rodamina 6G en Metanol..

celda de 5uL

La muestra se coloca en una cubeta* de forma prismática

Se asume que el tubo, celda o “cubeta” en la cual se vierte la solución a leer no debe desviar la trayectoria de la luz como requisito para el cumplimiento de la ley de Beer

Como el cuarzo aparte de ser muy transparente presenta un comportamiento constante ante la variación de la longitud de onda es común que las celdas del espectrofotómetro o colorímetro sean de este material .

El razonamiento para el proceso de determinación de una concentración desconocida es:

A partir de concentraciones conocidas de las cuales también se sabe su absorbancia (curva patrón), es posible interpolar (intercalar) la concentración del problema sabiendo su absorbancia (línea roja en figura siguiente)

Curva Patrón

CURVA PATRÓN

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0 2 4 6 8 10 12

Concentración mg/lt

AB

S

0

R

B

A

N

C

I

A

Interpolación

Absorbancia del problema

Con base en que la Absorbancia guarda una relación lineal con la concentración, se comprende la existencia de una relación de proporcionalidad entre la Absorbancia y la concentración:

A1 / A2 = C1 / C2 Donde:A1 = Absorbancia del problema.A2 = Absorbancia de un estándar de concentración conocida.C1 = Concentración del problema.C2 = Concentración del estándar.

Si despejamos C1 = Conc del problema A1 (problema) * Conc estándarConc. (problema) = A2 (estándar)

Ejemplo de curva patrón para la determinación de safranina; donde se solubiliza este colorante únicamente en agua siendo por tanto el agua misma el tubo blanco o de referencia para la calibración del equipo (colorímetro o espectrofotómetro)

TUBO Stock de Safranina

(3 x10 -4 g/ml) ml

Agua Destilada ml

1 0 10

2 0.05 9.95

3 0.10 9.9

4 0.20 9.8

5 0.40 9.6

6 0.80 9.2

En este ejemplo de determinación de Glucosa, en la preparación de los tubos para la lectura de la curva patrón, se incluyen más elementos y por lo cual el tubo “blanco” (0) contiene todos los componentes excepto la glucosa con el fin de de poder calibrar la absorbancia del equipo a cero

Compuesto1

(blanco)

2 3 4 5 6 7

Glucosa 0,1 mg/ml (mL)

0.0 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0

Agua destilada (mL)

1.0 0.4 0.9 0.8 0.2 0.6 0.0

Fenol al 5% (mL) 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0

Acido sulfúrico (mL)

5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0

Tubos

Absorbancia

1 0

2 0.135

3 0.253

4 0.417

5 0.658

6 0.574

7 0.768

Absorbancia en el Espectrofotómetro a 490 nm

RESULTADO de la curva patrón anterior

Curva de calibración de glucosa

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1 2 3 4 5 6 7

Tubos

Abso

rban

cia

Un aspecto importante de la evaluación espectrofotométrica, es que muchas moléculas orgánicas no absorben en el intervalo del espectro visible sino en el rango de longitudes de onda acordes al ultravioleta o al infrarrojo

Por lo que es común, actualmente, que la mayoría de los espectrofotómetros, actuales, se encuentren provistos con lo necesario para leer en de tales intervalos

Así, los grupos carbonilo presentes en los aldehídos (RCHO), cetonas (RCOR), ácidos carboxílicos (RCOOH), l ésteres (RCOOR´) y amidas (RCONHR´) dan lugar a absorciones intensas en la región del espectro de infrarrojo situada entre 1780-1640 cm-1.

Absorciones máximas (picos de absorción) de algunos compuestos que absorben en la región

ultravioleta:

Grupos funcionales cuyos picos de absorción se localizan en la región del infrarojo

Tipos de EspectrofotómetroExisten en la actualidad diversos tipos de aparatos con los mismos principios los hay mecánicos y digitales; unos miden solo la luz visible, otros son más precisos y miden también luz U.V. , Infrarroja, de absorción atómica (AA), flurescencia de rayos-X de emisión de plasma (ICP),, multipropósitos (para medir directamente la solución con suspensión, muestras sólidas y biológicas), acoplado a masas,etc..

Diferentes tipos de espectrofotómetros

MCI MCI

MCI

Para medir Luz Visible

Para medir Luz Visible y U.V.

Para medir Luz Visible y U.V.

Spectronic 20 D Spectrónic 20

Partes del Spectronic 20 D

Manejo de espectrofotómetro

En la siguiente diapositiva se les proporciona el instructivo para el manejo el espectrofotómetro Modelo Spectronic 20.

Manejo de espectrofotómetro • Prender el aparato (a)10 minutos antes de utilizarse,

se activará la luz roja de encendido (b).• Seleccionar la longitud de onda con el botón (c).• Ajuste (con a) a 0% de transmitancia, con la tapa

cerrada y sin muestra.• Insertar la cubeta con el blanco en su sección (d).

a

b

cd

• Ajustar (con e) a 100% transmitancia (0 absorbancia)• Retirar el blanco de la cubeta, agregarle la muestra

problema, e insertar en su espacio, bajar la tapa.• La aguja (d) del lector se deslizará sobre la escala (f) , se

lee en % de transmitancia ó en unidades de absorbancia

e

d

f

CUIDADOS• Las muestras no deben tener burbujas, encontrarse

turbias o con precipitados.• El volumen de la muestra en la cubeta, no debe ser

excesivo para evitar que se desborde, en caso de que sucediera, se debe limpiar con un paño limpio o papel absorbente suave, para evitar rayarla.

• La cubeta se sujeta por los lados opacos.• La cantidad a adicionar es, máximo, hasta ¾ partes

de la cubeta• No se deben derramar líquidos, sobre todo

solventes, ácidos o álcalis; dentro del contenedor de la cubeta, se puede dañar parte del mecanismo

• Se debe mantener, el espectrofotómetro, limpio y libre de humedad

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• * Basado en el trabajo de ppw : Arriaga F. Alberto y Guedea Fdz. Guadalupe., “ Fundamentos de colorimetría y espectrometría” Julio de 2005, para Met. Científica 1 Biología , FES Iztacala UNAM. Sin publicar

• ***Imagenes proporcionadas por Carlos S. Chinea casanchi@ya.com

• Las imágenes señaladas con MCI fueron tomadas en el 2005 de los aparatos que se encuentran en el Laboratorio de Metodología Científica I de la Carrera de Biología en la Facultad de Estudios Superiores Iztacaca UNAM México.

AUTOR

• Maestra en Ciencias de la Educación Guadalupe Eugenia Daleth Guedea Fernández. México 2006

• Correo: daleth_guede@yahoo.com.mx

dalethguedea@hotmail.com y/o daleth.guedea@gmail.com