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PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANAFACULTAD DE CIENCIAS

CARRERA DE MICROBIOLOGIA INDUSTRIAL

EFECTO COMBINADO DE LAS ALTAS PRESIONES HIDROSTÁTICAS Y DEL POLVO DE ACEITUNA EN LA INACTIVACION DE Bacillus cereus EN

UNA BEBIDA DE VEGETALES

LINA MARIA VELASCO CUCAITA

Director:ANTONIO MARTINEZ LOPEZ

Ph.D. INSTITUTO DE AGROQUIMICA Y TECNOLOGIA DE

ALIMENTOS (IATA) VALENCIA. ESPAÑA

Codirectora: CARMEN FERRER BERNAT

Asesora:ANA KARINA CARRASCO


CARRERA DE MICROBIOLOGIA INDUSTRIALBOGOTÁ, D.C.

ENERO 2009






TRABAJO DE GRADO Presentado como requisito parcial

Para optar al título de

MICRIOBIÓLOGA INDUSTRIAL


CARRERA DE MICROBIOLOGIA INDUSTRIALBOGOTÁ, D.C.

ENERO 2009

NOTA DE ADVERTENCIA

Artículo 23 de la Resolución No13 de julio de 1946.

"La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos en

sus trabajos de tesis. Solo velará por que no se publique nada contrario al dogma y a la

moral católica y por que las tesis no contengan ataques personales contra persona

alguna, antes bien se vea en ellas el anhelo de buscar la verdad y la justicia".





APROBADO

______________________Antonio Martínez López

PhD. Director

____________________Carmen Ferrer Bernat

Lic. Tecnología Alimentos U.P.V

____________________

Ana Karina CarrascoMsC.

______________________Jurado

____________________Jurado






APROBADO

______________________

Ingrid SchulerPhD.

Decana académica Facultad de Ciencias

____________________ Janeth del Carmen Arias

M.Sc- M.EdDirectora carrera de

Microbiología Industrial

DEDICATORIA

A mi familia, a mi madre quién con sus oraciones en la distancia siempre supo como animarme a seguir adelante.

A mis hermanos, que han sido mi mayor apoyo y un ejemplo a seguir.

A Julio R. Sánchez, quién hizo que en tierras lejanas me sintiera como en casa.

AGRADECIMIENTOS

Al Dr. Antonio Martínez López, vicedirector del Instituto de agroquímica y Tecnología

de alimentos IATA, por brindarme la oportunidad de hacer parte de su equipo de

trabajo.

A la Licenciada Carmen Ferrer Bernat, investigadora del Instituto de agroquímica y

Tecnología de alimentos IATA por su colaboración para sacar adelante este trabajo de

grado.

A la Dra. Aurora Marco, funcionaria del Instituto de agroquímica y Tecnología de

alimentos IATA, por su infinita paciencia, su dedicación y su espíritu de colaboración.

A Daniela Saucedo Reyes, becaria del Instituto de agroquímica y Tecnología de

alimentos IATA, por su valiosa colaboración y su apoyo, más que una compañera de

trabajo una amiga incondicional.

A la profesora Ana Karina Carrasco, profesora de la Pontificia Universidad Javeriana,

Bogotá, por asesorarme y colaborarme con la realización de esta investigación

Gracias a todos…………

TABLA DE CONTENIDOS

Página

INTRODUCCIÓN 1

1. JUSTIFICACIÓN Y PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA 4

2. OBJETIVOS 6

2.1. Objetivo general 6

2. 2. Objetivos específicos 6

3. MARCO TEÓRICO 7

3.1. BEBIDA VEGETAL 7

3. 1.1. Inactivación enzimática 8

3. 1. 2. Compuestos bioactivos 9

3. 1. 3. Biodisponibilidad de nutrientes 9

3. 2. CONTROL MICROBIOLOGICO 10

3. 3. TRATAMIENTOS TÉRMICOS DE CONSERVACIÓN 10

3. .3. 1. Esterilización 11

3. 3. 2. Pasteurización 11

3. 3. 3. Escaldado 11

3. 4. CARACTERÍSTICAS DEL ALIMENTO A TENER EN CUENTA PARA ELEGIR EL TRATAMIENTO TÉRMICO

12

3. 4. 1. pH 12

3. 4. 2. Viscosidad 12

3. 4. 3. Caracterización microbiológica del producto 13

3. 5. PROCESADO MÍNIMO DE ALIMENTOS VEGETALES: NUEVAS TECNOLOGIAS DE CONSERVACION NO TERMICAS

13

3. 5. 1. Aditivos naturales 14

3. 5. 2. Altas Presiones Hidrostáticas (APH) 14

3. 5. 3. Pulsos eléctricos de alta intensidad 14

3. 5. 4. Campos magnéticos oscilatorios 15

3. 5. 5. Ultrasonidos de alta intensidad 15

3. 5. 6. Irradiación 15

3. 6. DESCRIPCIÓN DEL MICROORGANISMO DE ÍNTERES (Bacillus cereus)

16

3. 6. 1. Género Bacillus 16

3. 6. 2. Bacillus cereus 16

3. 6. 3. Características generales 16

3. 6. 4. Hábitat y condiciones de crecimiento 17

3. 6. 5. Aislamiento e identificación 18

3. 6. 6. Infección alimentaria por Bacillus cereus 18

3.7. LA ESPORA BACTERIANA 19

3. 7. 1. Estructura de la espora 21

3. 7. 1. 1. Exosporium 22

3. 7. 1. 2. Cubiertas esporales 22

3. 7. 1. 3. Córtex 22

3. 7. 1. 4. Membrana interna o intina 23

3. 7. 1. 5. Protoplasto 23

3. 8. PROCESO DE ESPORULACIÓN 24

3. 9. PROCESO DE ACTIVACIÓN DE LA ESPORA 27

3. 9. 1. PROCESO DE GERMINACION DE LA ESPORA 28

3. 10. SUSTANCIAS ANTIMICROBIANAS 29

3. 10. 1. Absorción de los biocidas y su respuesta en las células 30

3. 10. 2. Objetivo de acción de un biocida 30

3. 10. 3. Clasificación de los antimicrobianos 31

3. 10. 4. Antimicrobianos de origen químico 31

3. 10. 5. Antimicrobianos de origen natural 32

3. 10. 6. Polifenoles y su efecto antimicrobiano 33

3. 10. 6. 1. Propiedades del polvo de aceitunas como antimicrobiano 35

3. 11. FUNDAMENTOS Y DEFINICIONES DE LAS ALTAS PRESIONES HIDROSTTICAS

36

3. 11. 1. Aspectos técnicos de las Altas Presiones Hidrostáticas 39

3. 11. 1. 1. Generación de la Alta presión 39

3. 11. 1. 2. Operación de una cámara de Alta Presión Hidrostática 42

3. 11. 2. Descripción general de un sistema de Alta Presión industrial 43

3. 12. EFECTOS BIOLÓGICOS DE LA ALTA PRESIÓN 44

3. 12. 1. Efectos sobre los microorganismos 45

3. 12. 2. La alta presión hidrostática y las reacciones bioquímicas 47

3. 3. 13. Efecto de las Altas Presiones sobre los alimentos 51

3. 12. 2. 1. Agua 51

3. 12. 2. 2. Lípidos 51

3. 12. 2. 3. Carbohidratos 52

3. 12. 2. 4. Proteínas 52

3. 12. 2. 5. Enzimas 52

3. 12. 2. 6. Vitaminas 53

3. 12. 4. Aplicación de las Altas Presiones en jugos de frutas y/o vegetales

54

3. 13. MODELOS CINÉTICOS DE INACTIVACIÓN Y CRECIMIENTO MICROBIANO.

54

3. 13. 1. Modelos matemáticos de inactivación 55

3. 13. 1. 1. Modelo de Bigelow 55

3.13. 1. 2. Modelos de Weibull 56

3. 13. 2. Modelos matemáticos de crecimiento 58

3. 13. 2. 1. Modelo de Baranyi 58

3. 13. 2. 2. Modelo de Gompertz 59

4. MATERIALES Y MÉTODOS 61

4.1. Esporulación del microorganismo 61

4. 2. Recuento de Bacillus cereus 62

4. 3. Ingrediente utilizado como antimicrobiano 62

4. 4. Preparación del medio de referencia 63

4. 5. Efecto del polvo de aceitunas sobre el crecimiento de Bacillus cereus en función del tiempo en medio de referencia

63

4.6. Preparación de la bebida vegetal 63

4. 7. Efecto del polvo de aceituna en el crecimiento de Bacillus 64

cereus en sustrato vegetal

4. 8. Prelación de los viales para el tratamiento con APH 64

4. 9. Tratamiento a Altas Presiones Hidrostáticas APH 65

4. 10. Efecto de las Altas Presiones y el polvo de aceitunas en la inactivación de Bacillus cereus en medio de referencia

66

4. 11. Efecto de las Altas Presiones y el polvo de aceitunas en la inactivación de Bacillus cereus en la bebida vegetal

67

4. 12. Modelización 67

4. 12. 1. Desarrollo del modelo 67

4. 13. Análisis estadístico 68

5. DISCUSIÓN DE RESULTADOS 69

5. 1. Efecto del polvo de aceituna en medio de referencia y bebida vegetal

69

5. 2. Efecto de las Altas Presiones Hidrostáticas en medio de referencia y bebida vegetal

77

5. 3. Efecto del tiempo de tratamiento con APH en la bebida de vegetales

82

6. CONCLUSIONES 85

7. RECOMENDACIONES 86

8. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS 87

9. ANEXOS 100

9.1. ANOVA SIMPLE ENTRE PRESIONES Y CONCENTRACIONES PARA MEDIO DE REFERENCIA

100

9. 2. ANOVA MULTIPLE ENTRE MEDIO DE REFERENCIA Y BEBIDAVEGETAL (10 MINUTOS)

103

9. 3. ANOVA MULTIPLE ENTRE 10 Y 25 MINUTOS DE 105

TRATAMIENTO EN BEBIDA VEGETAL

LISTA DE TABLAS

PáginaTabla 3.1. Resumen de Condiciones de crecimiento para Bacillus cereus

18

Tabla 6.1. Valores medios y desviación estándar de la población de B. cereus (Log N (UFC/ml)) en medio de referencia a diferentes temperaturas y concentraciones de polvo de aceitunas tras 24 horas de almacenamiento

70

Tabla 6. 2. Valores medios y de desviación estándar para la tasa máxima de crecimiento (µmax) y la fase de latencia (λ) a diferentes condiciones de estudio en medio de referencia

72

Tabla 6. 3. Valores medios y desviación estándar de logaritmo de la fracción de recuentos de B. cereus después de 24 horas de almacenamiento a diferentes condiciones de estudio en sustrato vegetal

76

Tabla 6. 4. Valores medios y desviación estándar de la población de B. cereus (N/N0), en medio de referencia y bebida vegetal, sometidos a tratamiento por APH a 200, 400 y 500 MPa (10 min) y con diferentes concentraciones de polvo de aceitunas

79

Tabla 6. 5. Valores medios y desviación estándar de Log N/No de B. cereus, después de 24 horas de almacenamiento en sustrato vegetal con APH con dos tiempos de tratamiento a APH

84

LISTA DE FIGURAS

PáginaFigura 3. 1. Estructuras químicas de compuestos fenólicos identificados en un extracto acuoso procedente de residuos de la industria de las aceitunas.

35

Figura 3. 2. Compresión directa. 40Figura 3. 3. Compresión indirecta. 41Figura 3. 4. Sistema de Altas Presiones Hidrostáticas a nivel industrial

44

Figura 3. 5. Productos hechos en base a frutas y verduras en el mercado tratados con APH.

49

Figura 3. 6. Zumos en el mercado tratados con APH. 50

Figura 3. 7. Ejemplo de curva de supervivencia de esporas de B. stearothermophilus a temperatura constante (115 ºC)

56

Figura 4.1 Dilución y siembra de las muestras tratadas 62Figura 4. 2. Unidad de Altas Presiones Hidrostáticas. Fuente: Instituto de Agroquímica y Tecnología de Alimentos (IATA).

66

Figura 6. 1. Ejemplo de curvas de crecimiento al 2.5 % de polvo de aceituna a las diferentes temperaturas estudiadas

70

Figura 6. 2. Ejemplo de curva de crecimiento de B. cereus log N (UFC/ml) en la bebida vegetal sin polvo de aceitunas y con una concentración del 2,5% almacenado a una temperatura de 20 ºC.

73

Figura 6. 3. Ejemplo de curva de crecimiento de B. cereus Log N (UFC/ml) en la bebida vegetal sin polvo de aceituna y con una concentración del 1,5% almacenado a una temperatura de 32 ºC.

74


74

Figura 6. 5. Curva de crecimiento de fracción de B.cereus Log N (UFC/ml), comparando con el control en presencia de 2.5% de polvo

75

de aceituna a 32 ºC de almacenamiento.

Figura 6. 6. Comparación del logaritmo de recuento de B. cereus entre medio de referencia bebida de vegetales a diferentes presiones sin polvo de aceitunas

77

Figura 6. 7. Comparación del logaritmo de recuento de B. cereus entre medio de referencia y bebida vegetal a diferentes presiones en presencia de polvo de aceitunas a 200 MPa

77

Figura 6. 8. Comparación del logaritmo de recuento de B. cereus entre medio de referencia y bebida vegetal a diferentes presiones en presencia de polvo de aceitunas a 500 MPa

78

Figura 6. 9. Efecto de la presión y la concentración de polvo de aceitunas sobre la población de B. cereus en medio de referencia y bebida vegetal, sometidos a 10 min de tratamiento con APH.

80

Figura 6. 10. Comparación del logaritmo de recuento de B. cereus entre dos tiempos de tratamiento con APH diferentes.

82

Figura 6.11 Efecto del tiempo de tratamiento con APH sobre la población de B. cereus (N/N0) en bebida vegetal a las diferentes presiones y concentraciones de polvo de aceitunas estudiadas

83

Resumen

La reciente demanda de los consumidores por productos listos para comer que sean

similares en apariencia y valor nutricional a los alimentos “frescos”, han conducido a

una creciente investigación en el uso de tecnología no térmicas de conservación, como

es el caso de las Altas Presiones Hidrostáticas (APH) y el empleo de conservantes de

origen natural, como los extractos de plantas, con el objetivo de sustituir el tratamiento

térmico y el uso de conservantes químicos que poseen desventajas en términos de

calidad de los alimentos. El presente estudio evalúa el efecto antimicrobiano del polvo

de aceituna en diferentes concentraciones (0, 1,5, 2,5 y 5%) para el control de esporas

de Bacillus cereus en medio de referencia (caldo de infusión cerebro corazón) y en una

bebida de vegetales elaborada a partir de zanahorias y judías verdes.

Además, se evalúo también el efecto de la APH (Alta Presión Hidroestática) que fue

estudiado en 200, 400 y 500 MPa, en los diferentes sustratos y para las diferentes

concentraciones de polvo de aceituna. Los resultados obtenidos sugieren que el polvo de

oliva tiene un efecto bacteriostático en la concentración del 2.5 %; por lo tanto esto

podría ser usado como una medida de control adicional en combinación con

tratamientos físicos y el almacenamiento a bajas temperaturas, prolongando la vida útil

de la bebida vegetal susceptible a contaminarse por la presencia de esporas de Bacillus

cereus, lo cual es un riesgo para la salud humana No obstante los tratamientos con

APH, en presencia o ausencia de polvo de aceituna, no presentaron un efecto importante

desde el punto de vista microbiológico, ya que el número de reducciones logarítmicas

alcanzadas no fue significativo como para garantizar la seguridad microbiológica de

bebida.

Abstract

The recent consumer demands on ready to eat, that they are similar by all appearances

and nutritional value to the “like fresh”, products leads to the increasing research in the

use of technology not thermal of conservation application of new not thermal

technologies of conservation, as is the case of High Hydrostatic Pressures (HHP), and

the use of natural preservative compounds, especially plant extracts. With the aim to

replace the thermal treatment and the use of chemistry additives that possess

disadvantages in field quality food.

The present study evaluates the antimicrobial effect of olive powder in different

concentrations (0, 1,5, 2,5 and 5%) to control Bacillus cereus spores on reference media

(Brain Heart Infusion Broth) and a vegetable beverage based on carrots and green

beans. Moreover, the effect of HHP (high hydrostatic pressure) was studied at 200, 400

and 500 MPa, in the different substrates and for the different concentrations of olive

powder. The obtained results suggest that olive powder has a bacteriostatic effect at

2.5% concentration; therefore it could be used as an additional control measure in

combination with other physical treatments and low temperature storage prolonging the

life of the vegetable beverage wich is susceptible to contamination by the presence of

Bacillus cereus spores becoming a risk to human health.

However, HHP treatments, in the presence or absence of olive powder, did not present

an important effect from the microbiological point of view, as the number of logarithm

reductions achieved was not significant to ensure the beverage safety.

INTRODUCCIÓN

La alimentación es un proceso necesario para todos los organismos, que tiene que

producirse cumpliendo determinados requisitos en dependencia de requerimientos

nutricionales específicos, así la demanda por parte de los consumidores de alimentos sanos

que aporten nutrientes y energía necesarios para la vida diaria es un tema de interés

científico.

Los cambios demográficos y sociales producidos en los últimos diez años, han ejercido un

efecto muy marcado sobre el consumo de alimentos tanto en España como en el conjunto

de países Europeos. Cada día aumenta el número de consumidores interesados en conocer

con exactitud la composición de los alimentos que ingieren y el efecto de la dieta en su

salud, bienestar y en la prevención de determinadas enfermedades degenerativas.

Resulta necesario pensar en sistemas de conservación de alimentos que eviten la

contaminación con microorganismos deteriorantes y patógenos, no obstante muchos

métodos de conservación afectan considerablemente a los alimentos, los tratamientos como

el calor o la adición de conservantes químicos afectan no solamente el valor nutricional

sino las cualidades sensoriales de los alimentos.

La gran mayoría de los alimentos que consumimos a diario son perecederos y se deterioran

con el paso del tiempo cuando no existe un método adecuado de conservación. Diferentes

cambios físicos, químicos y reacciones enzimáticas tienen lugar en los alimentos dando

como resultado la proliferación de microorganismos indeseables que pueden alterar los

alimentos e incluso causar enfermedad en el ser humano. Muchas de las tecnologías de

conservación de microorganismos pueden inhibir el crecimiento microbiano (temperaturas

bajas, reducción de la actividad de agua, acidificación, y adición de conservantes). Sin

embargo, estas tecnologías no son suficientes ya que no eliminan las formas de resistencia

como el caso de las esporas bacterianas.

1

Los frutos y hortalizas han de ser procesados y conservados por conveniencia y razones

económicas, lo que implica numerosos cambios desde el momento de la cosecha, durante

las operaciones de acondicionamiento, procesamiento, almacenamiento, hasta que es

adquirido y consumido fresco o cocinado por el consumidor. Todos estos cambios suponen

un impacto potencial en los compuestos fitoquímicos y en las propiedades antioxidantes de

estos productos vegetales así como en las propiedades beneficiosas para la salud que

poseen en fresco (Cano et al., 2005).

En términos de inactivación microbiana el tratamiento térmico es el más utilizado. La

eliminación de microorganismos usando altas temperaturas da como resultado alimentos

más estables y seguros. Sin embargo el proceso implica altos costos en términos de uso de

energía y alteración de las propiedades del alimento como sabor, color y el valor

nutricional. Por estas limitaciones y debido a la demanda creciente por parte de los

consumidores de alimentos de alta calidad, seguros y agradables al gusto, se han

desarrollado nuevas tecnologías para inactivar microorganismos como es el caso de las

Altas Presiones Hidrostáticas (APH). Por otra parte en los últimos años se han adelantado

muchas investigaciones sobre antimicrobianos de origen natural a modo de alternativa a los

antimicrobianos químicos tradicionales.

Muchos estudios demuestran que el uso combinado de tecnologías no térmicas como las

Altas Presiones Hidrostáticas (APH) y de antimicrobianos de origen natural como aceites

esenciales de plantas o extractos en polvo, suponen un efecto sinérgico que permite

mantener poblaciones microbianas controladas en alimentos manteniendo niveles

permisibles para el consumo humano, cumpliendo con la legislación vigente en cuanto al

tema de la seguridad alimentaria y en respuesta de la alta demanda de alimentos seguros.

Las investigaciones sobre antimicrobianos de origen natural han aumentado en los últimos

años, no obstante muchos aceites esenciales y extractos de plantas con propiedades

antimicrobianas no están autorizados para su uso como aditivos en alimentos. Un ejemplo

de antimicrobiano de origen natural autorizado por las autoridades sanitarias en España es

el olive powder ó polvo de aceitunas. Este ingrediente alimentario se utiliza en panadería.

En las aceitunas de este ingrediente hay polifenoles, los cuales han mostrado una

interesante actividad antimicrobiana.

2

En el presente trabajo, se estudiará el efecto de las Altas Presiones Hidrostáticas y el polvo

de aceitunas a diferentes concentraciones frente a esporas de Bacillus cereus en un medio

de referencia caldo BHI y posteriormente en una bebida de vegetales elaborada a base de

zanahorias y judías verdes.

3

1. JUSTIFICACION Y PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

Las nuevas demandas de los consumidores por productos saludables y con un valor

funcional agregado unido al desarrollo de nuevas tecnologías, está impulsando el desarrollo

del sector de aditivos de origen natural. El resultado es una amplia gama de productos que

se adaptan a las necesidades de todo tipo de consumidores. Por otro lado la creciente alarma

social por el uso de conservantes artificiales en la elaboración de alimentos impulsa a

sustituir aditivos artificiales por ingredientes naturales.

Numerosos estudios epidemiológicos asocian una dieta rica en productos de origen vegetal

con una menor predisposición a padecer ciertas enfermedades degenerativas como cáncer y

enfermedades cardiovasculares,

Para el desarrollo de este proyecto de investigación se elaborará una bebida con dos

ingredientes: zanahorias y judías verdes. Se evaluará en ella la capacidad antimicrobiana de

un ingrediente alimentario (polvo de aceitunas) actualmente comercializado como

ingrediente en productos de panadería. En estudios previos (Serra y col. 2008 y Pereira y

col. 2007) sobre aceitunas demuestran que estás poseen un amplio espectro de actividad

antimicrobiana. En el caso de alimentos mínimamente procesados entre ellos bebidas de

vegetales, Bacillus cereus es un microorganismo alterador y patógeno difícil de controlar

por su capacidad de producir esporas resistentes que pueden germinar durante el

almacenamiento de la bebida ó bien si se interrumpe la cadena de frío.

Para inactivar esporas de Bacillus cereus se estudiará experimentalmente el efecto

combinado de las Altas Presiones Hidrostáticas y diferentes concentraciones de Polvo de

aceitunas.

Tradicionalmente el tratamiento térmico es el más utilizado para evitar la contaminación y

deterioro de muchos alimentos, no obstante dicho tratamiento altera el sabor, la textura, el

color y el valor nutricional de los alimentos. Existen también tratamientos térmicos suaves

4

de conservación como la pasteurización con el inconveniente de que los alimentos tratados

deben ser inmediatamente almacenados en refrigeración y pueden aparecer después

bacterias patógenas esporuladas sin que la refrigeración evite su desarrollo.

Bajo estas premisas la industria tiene que adaptarse para desarrollar alimentos sometidos a

métodos de conservación menos drásticos para satisfacer las necesidades actuales del

consumidor. Es así como las Altas Presiones Hidrostáticas son una alternativa al uso de

tratamientos térmicos.

La presente investigación tiene un impacto socio- económico en la medida que la materia

prima empleada en la elaboración de la bebida es muy asequible en países como Colombia.

Conocer acerca de tecnologías como las Altas Presiones Hidrostáticas, hace posible pensar

en implementarlas en un futuro, para aumentar la calidad de los productos alimenticios

producidos en Colombia y proyectar la incursión en el mercado mundial de alimentos

mínimamente procesados. El interés científico de esta investigación gira en torno a obtener

resultados que revelen la utilidad de combinar tecnologías nuevas con aditivos alimentarios

que puede tener actividad antimicrobiana para prolongar la vida útil de la bebida, además

de obtener un producto de origen natural con un valor agregado de poseer compuestos

bioactivos (antioxidantes, vitaminas, flavonoides, etc.)

5

2. OBJETIVOS

2.1. Objetivo general

Evaluar el efecto conjunto de los tratamientos con altas presiones hidrostáticas y del polvo

de aceitunas como posible antimicrobiano sobre el crecimiento e inactivación de esporas

Bacillus cereus y su uso potencial en alimentos.

2.1. Objetivos específicos

1 Desarrollo de una nueva bebida de vegetales con características organolépticas

agradables y que a su vez, sirva como sustrato de tratamiento para medir el efecto

de las Altas Presiones y el Polvo de aceitunas.

2 Aplicar tratamientos de altas presiones con antimicrobiano a escala de laboratorio

primero en sustrato de referencia y luego en sustrato vegetal.

3 Aplicar estos tratamientos en alimentos mínimamente procesados (bebida de

vegetales) y evaluar su utilidad en términos de alargar la vida útil del producto.

4 Modelizar matemáticamente los datos obtenidos experimentalmente ajustándolos a

modelos matemáticos conocidos.

6

3. MARCO TEÓRICO

3.1 BEBIDA VEGETAL

Los jugos son una bebida refrescante y nutritiva. Aportando al organismo aquellos

nutrientes y además son una forma original de tomar ciertos alimentos entre ellos vegetales

que no muy atractivos en su preparación tradicional. Aunque los zumos más comunes sean

los de frutas, los zumos de verduras y hortalizas son también un buen complemento a la

alimentación y en los últimos años distintas industrias del sector de producción de zumos

han sacado al mercado jugos de vegetales por ejemplo, HERO España, Coca cola

Company en España con Minute Vergelia, Granini, España. En Latinoamérica el consumo

de este tipo de bebidas no es masivo no obstante, Herdez. México que comercializa zumos

en toda Latinoamérica con su línea de “jugos de vegetales”. En Colombia estas bebida de

vegetales se comercializan en supermercados tipo gourmet, no son bebidas tratadas, puesto

que en Colombia hay oferta de vegetales frescos todo el año; sin embrago, al no ser tratadas

las bebidas tienen un vida útil muy corta que no permite almacenarlas por intervalos de

tiempo muy extensos.

La bebida de vegetales utilizada como sustrato en este estudio se compone de dos

ingredientes, zanahorias y judías verdes. La zanahoria (Daucus carota) es una fuente de

vitaminas A y K, minerales como calcio y potasio, fibra y pigmentos, por otra parte las

judías verdes (Phaseolus vulgaris var. vulgaris) contiene vitaminas A, C, B1, B3, B6 y

B12; minerales como: potasio, calcio, fósforo, hierro, magnesio, cromo, yodo; también

ácido fólico y beta caroteno (Biesalki y Tinz, 2008).

Durante el procesado de las zanahorias y las judías ocurren diferentes cambios físicos y

químicos por ejemplo la rotura del tejido por el corte supone un incremento de la intensidad

respiratoria y transpiración además de favorecer determinadas reacciones enzimáticas

(polifenoloxidasa, peroxidasa, pectinasas, ascorbato oxidasa, etc) que conducen a un rápido

deterioro del producto, con posible pérdida de alguna de sus características sensoriales,

nutricionales y propiedades beneficiosas para la salud. Además, el corte aumenta la

superficie de tejido susceptible de alteraciones microbianas, por lo que la seguridad de los

7

frutos mínimamente procesados cortados en fresco es una de las principales preocupaciones

de investigadores y productores (Cano et al., 2007)

Las bebidas funcionales se pueden definir como productos que poseen componentes

fisiológicos que complementan su aporte nutricional y que representan un beneficio extra

para la salud de las personas, como por ejemplo en el metabolismo del colesterol, la

mineralización ósea y la reducción de riesgos de enfermedad. Existen al menos tres

categorías principales de bebidas funcionales; las bebidas enriquecidas (jugos y aguas con

vitaminas y minerales), bebidas isotónicas y las bebidas energéticas o estimulantes

Las bebidas a base de vegetales sean o no funcionales presentan muchas ventajas en

términos de nutrientes y aporte de energía sin embargo, esta son susceptibles a la

contaminación microbiana más aún cuando las condiciones de almacenamiento no son

adecuadas, B cereus es un microorganismo patógeno en alimentos que se ha asilado con

mucha frecuencia de bebidas de este tipo (Chen. J. L. et al. 2008)

El procesamiento térmico de jugos cítricos a altas temperaturas si bien elimina la

posibilidad de daño microbiológico y reduce la actividad enzimática, afecta la calidad del

producto, produce la pérdida de componentes termolábiles y termosensibles responsables

de las propiedades sensoriales y nutricionales de los alimentos. La calidad de los alimentos

esterilizados difieren mucho de los frescos, particularmente el aroma, las vitaminas y

componentes volátiles de estos productos son influenciados dramáticamente por los

tratamientos térmicos. Por otra parte tratamientos no térmicos como las APH influyen de

manera menos agresiva en los productos vegetales de tal manera que se pueden encontrar

una serie de ventajas en diferentes aspectos como:

3. 1. 1. Inactivación enzimática

La efectividad de los tratamientos de APH sobre la inactivación enzimática depende de

variables del tratamiento (presión, tiempo, temperatura), de la composición del alimento y

del tipo de enzima. Para la desactivación de enzimas relacionadas con la pérdida de calidad

de los alimentos vegetales (peroxidasas (POD), lipoxigenasas (LOX), pectinmetilesterasas

(PME), etc.) (Knorr,1995; Seyderhelm et al., 1996; Cano et al., 1997; Hendrix et al.,1998;

8

Hernández; Cano et al., 1999; Palou et al., 2000; Plaza et al., 2003; Tangwongchai et al.,

2000; Crelier et al., 2001). Probablemente las polifenoloxidasas (PPO) sean las enzimas

más estudiadas en relación con la efectividad de los tratamientos APH, debido a los graves

problemas de calidad sensorial relacionados con su actividad (pardeamiento enzimático)

(Weemaes et al., 1998; Cano et al., 1997; Hernández y Cano, 1998).

3. 1. 2. Compuestos Bioactivos.

El efecto de los tratamientos de APH sobre los compuestos bioactivos (vitaminas A, C y E,

Carotenoides: licopeno, -caroteno, luteína, zeaxantina, criptoxantina y flavonoides)

presentes en distintos productos vegetales. En general, los carotenoides con actividad

antioxidante (licopeno, criptoxantina, -caroteno, zeaxantina), no son afectados por los

tratamientos de APH solos o combinados con calor.

3. 1. 3. Biodisponibilidad de nutrientes.

El efecto de los tratamientos de APH sobre los compuestos bioactivos (vitaminas A, C y E,

Carotenoides: licopeno, -caroteno, luteína, zeaxantina, criptoxantina y flavonoides)

presentes en distintos productos vegetales no se ven afectados por tratamientos a APH. Por

lo tanto la biodisponibilidad de compuestos tampoco se ve afectada (Cano et al., 2007).

9

3. 2. CONTROL MICROBIOLÓGICO

La contaminación microbiológica es uno de los problemas más importantes en el desarrollo

de este tipo de alimentos. Aunque la composición, propiedades físico-químicas y naturaleza

del fruto entero de partida determinan en gran medida la predisposición al ataque de un tipo

u otro microorganismos será el proceso de elaboración y en especial las fases de pelado y

corte de los productos, cuando se destruye la barrera natural de protección del vegetal y se

facilita la disponibilidad de nutrientes celulares liberados (azúcares, etc.), favoreciendo la

contaminación con microorganismos alterantes y/o patógenos (Nguyen,1994; Bracket,

1997). Los alimentos mínimamente procesados que presentan valores de pH y actividad de

agua (aw) altos (pH 4.6 y aw 0.85) son considerados como alimentos altamente perecederos

si no se realiza ningún proceso de conservación (Willey, 1997).

3. 3. TRATAMIENTOS DE CONSERVACION TÉRMICA

Los zumos de frutas y verduras son productos muy sensibles a la pérdida de sus

características organolépticas más importantes:

• Pérdida de color.

• Modificación del aroma.

• Destrucción de vitaminas.

• Desnaturalización de proteínas.

• Cambios físicos.

Por lo general, el almacenamiento de las materias primas y los jugos de fruta frescos, se

realiza a temperaturas de refrigeración, ya que se ha observado que a temperaturas

superiores se incrementa el pardeamiento no enzimático (reacción de Maillard,

caramelización de azúcares, reacción oxidativa de ácido ascórbico) y como resultado una

disminución en la calidad sensorial y valor nutritivo de los jugos frescos(Selman. 1994). El

tratamiento térmico altera en mayor medida las características del jugo y acelera las

reacciones de deterioro descritas anteriormente.

10

Desde hace varias décadas, el tratamiento de conservación por calor, ha sido la tecnología

más utilizada para la conservación de alimentos. A través de los años, se ha conseguido la

elaboración de alimentos microbiológicamente seguros y con baja actividad enzimática,

pero en detrimento de la calidad del producto.

Los dos métodos mas utilizados hoy en día para la conservación de alimentos son la

esterilización y la pasterización.

3. 3. 1. Esterilización

La esterilización comercial es un tratamiento de conservación por calor que tiene como

objetivo inactivar la totalidad de microorganismos patógenos y alteradores, y de enzimas

presentes en el alimento permitiendo prolongar la vida útil del producto en condiciones

microbiológicamente seguras a temperatura ambiente. Por lo general este tratamiento se

denomina también HTST (high temperature-short time) o UHT (ultra high temperature) que

supone aplicar temperaturas de proceso entre 100-120 ºC durante un periodo corto de

tiempo 2-5 segundos (Aleixandre, 1994).

3. 3. 2. Pasteurización

La pasteurización es un tratamiento de conservación por calor que tiene como objetivo

inactivar la mayoría de microorganismos y enzimas presentes en el alimento pudiendo

quedar una fracción residual resistente al tratamiento. Por lo general este proceso se

caracteriza por aplicar un rango de temperaturas inferior al de esterilización, no superando

los 100 ºC haciéndose necesario su almacenamiento y distribución en condiciones de

refrigeración (Aleixandre, 1994).

3. 3. 3. Escaldado

El escaldado es un tratamiento térmico que tiene como objetivo reducir la actividad

enzimático y modificar la textura de ciertos vegetales. El tratamiento consiste normalmente

en la inmersión de los vegetales cortados, en agua a temperaturas entre 80 y 100ºC, este

tratamiento se considera previo al procesado de vegetales en conserva. Se utiliza en la

conservación de las hortalizas para fijar su color o disminuir su volumen, antes de su

congelación, con el fin de destruir enzimas que puedan deteriorarlas durante su

11

conservación. Esta manipulación no constituye un método de conservación, sino un

tratamiento aplicado en la preparación de la materia prima. El escaldado reduce el número

de microorganismos contaminantes, principalmente mohos, levaduras y formas bacterianas

vegetativas de la superficie de los alimentos, y contribuye, por tanto, al efecto conservador

de operaciones posteriores.

3. 4. CARACTERÍSTICAS DEL ALIMENTO A TENER EN CUENTA PARA

ELEGIR EL TRATAMEINTO TERMICO

A la hora de aplicar un tratamiento de conservación por calor, es necesario identificar con

claridad las características físico-químicas y microbiológicas del alimento que influyen

sobre el proceso como:

3. 4. 1. pH

El pH del alimento es un factor determinante a la hora de elegir el tratamiento térmico

adecuado para su conservación. Podemos clasificar los alimentos respecto a su valor de pH

como: alimentos muy ácidos, cuyo rango de pH es inferior a 3.5 (jugo de limón); alimentos

ácidos, cuyo valor de pH se encuentra entre 3.5-4.5 (jugos de frutas y conservas vegetales a

las que se adiciona un corrector de la acidez). El valor de pH crítico se sitúa en 4.5. Este es

el valor de pH al cual crece Clostridium botulinum, microorganismo esporulado y

termorresistente, que se encuentra ampliamente en la naturaleza, cuya toxina es una de las

más letales del mundo. Y por último, alimentos de baja acidez serán aquellos con un pH

superior a 4.5 (carnes, leche, huevo liquido y productos lácteos)

3. 4 .2. Viscosidad

La viscosidad del alimento es también un parámetro importante que definirá el tipo de

intercambiador de calor adecuado para la aplicación del tratamiento térmico. El

pasteurizador de placas será adecuado para alimentos poco viscosos mientras que un

pasteurizador tubular será más idóneo para el tratamiento de alimentos viscosos o con

partículas (Montaner, 2007).

12

3. 4 .3. Caracterización microbiológica del producto

Es esencial caracterizar la flora natural existente en el producto fresco y materias primas ya

que de este modo se definirán las condiciones del tratamiento térmico a aplicar para su

conservación. Caracterizaremos también la carga microbiana final tras el tratamiento para

asegurar que un producto cumpla con la legislación vigente. (Montaner, 2007).

3. 5. PROCESADO MÍNIMO DE ALIMENTOS VEGETALES. NUEVAS

TECNOLOGÍAS DE CONSERVACIÓN NO TÉRMICAS

El estudio de nuevas tecnologías de conservación de alimentos (Alta Presión, Pulsos

Eléctricos de Alta Intensidad de Campo, radiación ionizante, campos magnéticos

oscilantes, envasado en atmósfera modificada, antimicrobianos naturales, etc.) surge en el

contexto de las sociedades de países industrializados donde los consumidores valoran

positivamente aquellas características de los alimentos que les confieren mayor valor

añadido como son: una escasa manipulación en su preparación, el empleo de aditivos

naturales o la ausencia de los mismos, conservación de las características sensoriales

propias del alimento fresco de partida y la conservación o potenciación de las propiedades

nutricionales y las cualidades beneficiosas para la salud de los productos vegetales. Los

alimentos de origen vegetal que presentan estas características se han denominado

Alimentos Vegetales Mínimamente Procesados (MP). Como “Procesado Mínimo de

alimentos”, se entiende la aplicación de una serie de tecnologías (barreras), que combinadas

o no, deben mantener las características del alimento lo más cercanas posible a las del

producto fresco, además de mejorar su vida comercial útil en términos microbiológicos,

sensoriales y nutricionales. Dentro de esta terminología se incluyen dos tipos de productos

distintos (Cano et al., 2005).

Durante los últimos años se han desarrollado diferentes tecnologías de conservación que

han tratado de dar respuesta a las demandas del consumidor por alimentos

microbiológicamente seguros y de mayor calidad. Dentro de este grupo podemos encontrar

las denominadas “tecnologías de conservación no térmicas” que son aquellas que no

utilizan la temperatura como principal forma de inactivación de microorganismos y

13

enzimas. Si bien es cierto que en la mayoría de estos tratamientos se produce un leve

incremento de la temperatura, este nunca llega a ser tan elevado como en un tratamiento

térmico.

El objetivo principal de estas tecnologías no térmicas es lograr alimentos que conserven al

máximo todas las características de frescura y sabor sin renunciar a la seguridad

alimentaria. Dentro de las nuevas tecnologías las más aplicadas hasta el momento son:

3. 5. 1. Aditivos naturales

Los aditivos de origen natural incluyen una gran variedad de compuestos antimicrobianos

naturales (canela, lisozimas y diferentes aceites aromáticos) que inhiben el crecimiento de

ciertos microorganismos alteradores y patógenos y que son susceptibles de ser combinados

con otras tecnologías de conservación.

3. 5. 2. Altas Presiones Hidrostáticas APH

Esta tecnología esta adquiriendo mayor relevancia en los últimos años como alternativa al

tratamiento térmico en cierto tipo de productos (productos cárnicos, jugos de frutas y

salsas), ya que se han obtenido resultados importantes en inactivación de microorganismos

y enzimas sin alterar su calidad final (Mertens et al., 1992).

3. 5. 3. Pulsos eléctricos de alta intensidad

Esta tecnología es uno de los tratamientos no térmicos desarrollados en la conservación de

alimentos líquidos cuyos componentes nutricionales son sensibles al calor, tales como jugos

de frutas, leche o huevo liquido, debido a que durante el tratamiento se alcanzan

temperaturas inferiores a los tratamientos térmicos convencionales (Quass, 1997).

Los pulsos eléctricos de alta intensidad consisten en la aplicación de pulsos de alto voltaje

(10-80 kV/cm) directamente sobre el alimento líquido el cual se encuentra entre dos

electrodos, durante un periodo de tiempo muy corto (50-2000 microsegundos). Entre otras

ventajas, esta tecnología no altera las propiedades sensoriales ni físico-químicas de los

alimentos consiguiendo niveles de inactivación de microorganismos considerables (Barbosa

et al., 1998).

14

3. 5. 4. Campos magnéticos oscilatorios

Esta nueva tecnología se caracteriza por afectar de forma muy variada al microorganismo

provocando cambios estructurales y morfológicos en su membrana. El tratamiento tiene

como características principales tiempos de tratamiento cortos (25 milisegundos) y fuerzas

de campo altas (2-100 teslas) con una frecuencia de 5 a 500 kHz.

Dicho tratamiento afecta directamente a la multiplicación de los microorganismos ya que

actúa principalmente sobre la membrana provocando un cambio en la fluidez e interfiriendo

en el flujo de iones. En algunos casos estas alteraciones no llegan a producir la muerte

celular por lo que la eficacia del tratamiento en la inactivación de microorganismos es baja,

consiguiendo reducir únicamente dos ciclos logarítmicos en células vegetativas (Hendrickx

et al., 2001).

3. 5. 5. Ultrasonidos de alta intensidad

Esta técnica se ha desarrollado para la conservación de alimentos ya que es capaz de

inactivar microorganismos en forma vegetativa y reducir la resistencia térmica de las

esporas.

La temperatura es un factor que influye directamente en el tratamiento ya que se produce

un efecto sinérgico a temperaturas moderadas, pero al incrementarse la temperatura, el

sinergismo se reduce. Para aumentar la efectividad del tratamiento a temperaturas altas, se

aplica una ligera sobrepresión sobre el producto. Esta tecnología podría reducir las

temperaturas de esterilización y pasterización pero únicamente en alimentos bombeables o

con características semisólidas (Earnshaw y et al., 1995; Villamiel et al., 2000).

3. 5. 6. Irradiación

Este tratamiento consiste en la aplicación de ondas electromagnéticas o electrones al

alimento, utilizándose con mayor frecuencia rayos gamma y rayos X. La tecnología es

adecuada para la higienización de sólidos y superficies. Últimamente se esta desarrollando

su aplicación en la higienización de vegetales y productos de cuarta gama obteniendo

resultados importantes en la reducción de la carga microbiana (Al-Bachir & Zeinou, 2006)

15

3. 6. DESCRIPCIÓN DEL MICROORGANISMO DE INTERES (Bacillus cereus)

3. 6. 1. Género Bacillus

El género Bacillus pertenece a la familia Bacillaceae, es un género que hoy en día incluye

más de 60 especies de bacilos. Este género está formado por microorganismos bacilares

Gram positivos, formadores de endosporas, quimioheterotrofos, que normalmente son

móviles y rodeados de flagelos perítricos. Son aerobios o anaerobios facultativos y catalasa

positivos. Las células bacterianas de este género tiene un amplio tamaño que varía entre

0,5–2,5×1,2–10µm (Ingraham & Ingraham., 1998).

Taxonómicamente, según la segunda edición del Manual Bergey (1982), el género Bacillus

pertenece a la Familia I Bacilliaceae, del orden I Bacillales, de la clase III Bacilli, del fillum

BXIII Firmicutes del Dominio Bacteria. En la primera edición el género es claramente

diverso desde el punto de vista fenotípico y genotípico. Más recientemente, los datos de la

secuencia de rRNA se han empleado para dividir el género Bacillus en al menos cinco

líneas diferentes. Entre las especies más representativas del género Bacillus se encuentran:

B. alkalophilus, B. anthracis, B. azotoformans, B. brevis, B. cereus, B. subtillis, B.

coagulans, B. firmus, B. insolitus, B. licheniformis, B. polymixa y B. turingiensis, entre

otros (Delgado, 2005).

3. 6. 2. Bacillus cereus

En 1887 Frankland y Frankland aislaron y describieron por primera vez la bacteria Bacillus

cereus. No fue hasta 1950 cuando se confirmo definitivamente que este microorganismo

podría producir una enfermedad transmitida por alimentos. Esto fue gracias a Hauge quien

publicó en 1950 y 1955 descripciones de cuatro brotes en salsa de vainilla. (Delgado,

2005).

3. 6. 3. Características generales

B. cereus es un microorganismo aerobio, aunque también puede crecer anaerobicamente. Es

Gram positivo, catalasa positivo, reduce nitratos a nitritos y positivo en Voges-Proskauer

16

fermentando la glucosa por vía butanodiólica, la sacarosa y el glicerol. Es manitol negativo

y produce lecitina. Normalmente es móvil, gracias a sus flagelos perítricos. Aunque existen

variables inmóviles (Prescot et al., 2004)

3. 6. 4. Hábitat y condiciones de crecimiento

B cereus esta muy difundido en la naturaleza. Se puede encontrar en el suelo, agua y aire,

por lo que es frecuente encontrarlo en los vegetales, en cosechas de cereales, en el pelo de

los animales y en muchos alimentos, tanto crudos como tratados o industrializados (Kramer

y Gilbert, 1989).

Las diferentes cepas de B. cereus son muy variables en cuanto a su forma de crecimiento y

características de supervivencia. La Tabla 3.1 resume los límites de crecimiento de este

microorganismo. Existen cepas mesófilas y que crecen en un intervalo de temperaturas

entre 15 ºC y 55 ºC. Pero hay algunas cepas psicrótrofas, que son capaces de crecer a 4 ó 5

ºC (Lechner et al., 1998). Éstas últimas representan un peligro para productos refrigerados

(Valero et al., 2003). En general para B. cereus la temperatura óptima de crecimiento es de

30 a 40 ºC.

En cuanto al pH ocurre algo muy similar que con la temperatura. El pH mínimo de

crecimiento es distinto de unas cepas a otras, aunque en general B. cereus crece a un pH

mínimo de 5 y máximo de 8.8 teniendo un intervalo de pH óptimo entre 6 y 7.

El efecto de la actividad del agua sobre las cepas causantes de intoxicaciones alimentarías

no está bien documentado, pero se acepta que B cereus necesita una (a w) mínima de 0.93.

Condiciones Mínimo Óptimo Máximo

Temperatura (ºC) 4 30 - 40 55

pH 6.0 6.0-7.0 8.8

a w 0.93 - -

Tabla 3.1. Resumen de Condiciones de crecimiento para Bacillus cereus. Adaptado de:

Delgado, 2005.

17

3. 6. 5. Asilamiento e identificación

Los procedimientos de choque térmico y de selección de esporas con etanol son excelentes

métodos para la recuperación cuantitativa de especies de Bacillus de materia fecal y otras

muestras (incluidos alimentos) que contengan poblaciones mixtas de microorganismos.

3. 6. 6. Infección alimentaria por Bacillus cereus

Las células vegetativas de B. cereus pueden ser eliminadas fácilmente mediante un

tratamiento térmico, sin embargo las esporas son más resistentes. Esto garantiza su

supervivencia a través de todas las fases de tratamiento de los alimentos (excepto después

de un tratamiento con autoclave) y de ahí que el microorganismo se halle en la mayoría de

las materias primas que se usan en la elaboración de alimentos. Es normal encontrarlo en

concentraciones de 10-2–10-3 por gramo, una concentración inocua, pues se ha estimado que

para causar enfermedad es necesaria una concentración mínima de 105 UFC/ gramo (Hobbs

y Gilbert, 1974). Pero las esporas que quedan en los alimentos son un peligro potencial, ya

que si las condiciones del medio son favorables, se induce la germinación aumentando

considerablemente en poco tiempo el número de microorganismos presentes en el alimento;

provocando el deterioro del alimento y una posible intoxicación.

Aunque, en un principio se pensó que el aumento del número de bacterias era el

responsable de la patología intestinal, más tarde se descubrió que las células vegetativas de

B. cereus producían una variedad de toxinas y enzimas extracelulares causantes de dicha

enfermedad. Estas enzimas son: lecitinasa, proteasas, β-lactamasas, cereolisina (hemolisina

I ó primaria) y hemolisina BL.

B. cereus se asocia con dos tipos de enfermedades alimentarias o intoxicaciones: una con

síndromes diarreicos y otra con síndromes eméticos ocasionados por dos tipos diferentes de

toxina que constituyen factores de virulencia en B. cereus (Granum et al., 1997). Por un

lado esta la toxina conocida como “cereulidina” causante del síndrome emético, en

términos de composición química se trata de una proteína de un dodecapéptido lactónico y

lipofílico de aproximadamente 1.2 KDa, posee residuos de aminoácidos como la alanina,

18

leucina y valina que le dan la capacidad de actuar como un potente ionóforo de potasio.

(Kuse et al., 2000; Pitchayawasin et al. 2003,2004). Recientemente se ha investigado sobre

esta toxina encontrándose su lata termorresistencia así con ciclos de esterilización de 121

ºC por 15 minutos no se inactiva y los residuos hidrofóbicos de esta toxina requieren

inactivación química para su inactivación (Rajkovic 2008).

El síndrome diarreico está producido por una toxina formada por un complejo tripartido

integrado por los componentes B, L1 y L2 que se denominan Hemolisina BL (HB) Esta

toxina provoca hemólisis, histólisis, dermonecrosis, permeabilidad vascular y actividad

enterotóxica. Y aunque no se ha demostrado que exista una enterotoxina única parece que

la HBL es la responsable del síndrome diarregénico (Rajkovic 2008).

3. 7. LA ESPORA BACTERIANA

A fines del siglo XIX, Tyndall, Cohn y Koch descubrieron de forma independiente la

capacidad de ciertas especies bacterianas para diferenciar estructuras resistentes al calor y a

otros agentes letales, que les permitían mantenerse en estado de latencia durante largos

periodos de tiempo. Ferdinand Cohn descubrió que dichas estructuras se formaban en el

interior de los bacilos del heno, llamándolas endosporos. Cohn descubrió, además el ciclo

de vida de B subtilis y la formación y germinación de los endosporos mediante minuciosos

estudios microscópicos (Keynan y Sandler, 1983).

Basándose en los trabajos de Cohn y en sus propios hallazgos, el inglés John Tyndall

desarrolló y método eficaz para la eliminación de los endosporos mediante ciclos sucesivos

de ebullición e incubación a 37 ºC durante tres días. Este método de esterilización

fraccionada o intermitente es conocido como tindalización.

Por su parte Roberth Koch estudió el proceso de esporulación en B anthracis (agente causal

del ántrax o carbunco) y la participación de sus esporas en la transmisión de esta

enfermedad a animales sanos.

Las esporas son consideradas ahora como una de las formas más resistentes en la tierra a la

temperatura y la desecación. Son muchas las especies esporofomadoras y están distribuidas

19

principalmente dentro del grupo de la bacterias Gram positivas (Prescott et al., 2004). Esto

sugiere que la capacidad de esporulación esta relacionada con la capacidad de síntesis de

una pared gruesa, que además es indispensable para desarrollar esporas resistentes (Moat et

al., 2002).

Las bacterias esporuladas pueden encontrarse en hábitats muy diversos, en el agua y el

suelo y es en este último donde se haya en mayor abundancia. Las condiciones del suelo

son muy variables con periodos de sequía o escasez de nutrientes.

En la primera edición del Bergey´s Manual of Systematic Bacteriology (1982) basado en

similitudes fenotípicas, se agrupan a las bacterias formadoras de esporas en la sección 13,

que incluye a los géneros Bacillus, Clostridium, Desolfotomaculum, Oscillospirina,

Soporolactobacillus y Sporosarcina.

La segunda edición del Bergey´s Manual of Systematic Bacteriology (1984) se basa en

criterios filogenéticos (secuenciación de ARNr, ADN y proteínas). Esta edición considera

esporulados los géneros Bacillus, Desolfotomaculum, Paenibacillus, Sporohalobacter,

Soporolactobacillus, Sporosarcina y Thermoactinomyces, pertenecientes a la familia

Bacillaceae, y algunos géneros que se encuentran repartidos entre diferentes familias

taxonómicas (Prescott et al., 2004).

Funcionalmente la formación de la endospora es un claro ejemplo de adaptación de algunas

especies bacterianas a la falta de nutrientes. Ante el agostamiento de éstos, una célula

vegetativa se verá obligada a producir la endospora, en un proceso que involucra cambios

morfológicos, bioquímicos, fisiológicos y una diferenciación funcional clara. De tal modo

que puede considerarse a la esporulación como un ejemplo de diferenciación celular en

procariotas.

En su estado de latencia las esporas no muestran metabolismo detectable (fenómeno

conocido como abiosis) y, por tanto, se pueden considerar inertes, mostrando una marcada

resistencia a la inactivación por agentes físicos (desecación extrema, vacío, presión

hidrostática, temperatura, radiaciones ionizantes) o sustancias químicas (ácidos bases,

fenoles, aldehídos, etc.). Sin embargo, en dicho estado de latencia pueden responder ante un

20

incremento de cualquiera de los nutrientes para empezar la germinación, reiniciar el

crecimiento vegetativo y dar paso a una un incremento de población activa.

Tanto en la industria alimentaria, como en el campo de la microbiología clínica, las esporas

tienen una alta relevancia, gracias a su resistencia a casi cualquier método de inactivación,

lo cual constituye un problema y por esto se han desarrollado mayor control en los

alimentos, bebidas, quirófanos, hospitales, etc. Además de su influencia en el deterioro de

lo alimentos, muchas de estas especies esporoformadoras son patógenas, ya sea por

transmisión directa por aire o agua o a través de instrumentos quirúrgicos, utensilios de

cocina y manipuladores. Debido a la alta resistencia de las esporas hay dificultad a la hora

de diseñar y estandarizar métodos de esterilización y conservación que preserve las

características físicas y valor nutricional del alimento. Las esporas bacterianas resisten

condiciones de esterilización por calor mucho más drásticas que las toleradas por las

células vegetativas y esta resistencia es aplicable también cuando se emplean la radiación o

sustancias químicas desinfectantes. De hecho, las esporas bacterianas pueden utilizarse

como indicadores biológicos en el control de calidad de los procesos de esterilización

(Yawger, 1978).

3. 7. 1. Estructura de la espora

Las endosporas tienen una serie de características comunes en todos los procariotas y son

las siguientes: Tamaño: el tamaño medio de la endospora oscila entre 0.5 µm y 1.5 µm,

localización: se forman y se localizan en el citoplasma de la célula, refringencia: gracias a

esta propiedad las endosporas pueden verse en el microscopio óptico. Esta refringencia se

debe a los bajos valores de aw de las endosporas, debido a la compleja estructura

multilaminar de las esporas estas son muy impermeables a los colorantes. En su estructura

la espora tiene diferentes capas de proteínas y polisacáridos (Delgado, 2005).

3. 7. 1. 1. Exosporium

21

Es la capa más externa, su tamaño varía mucho entre esporas de diferentes especies, en

esporas de B. cereus la capa es muy grande en comparación con el exosporium de B.

subtillis que siendo pariente cercano es muy pequeño (Driks, 2002). El exosporium se

compone de carbohidratos y proteínas, posee macromoléculas exclusivas de las esporas. La

función exacta del exosporium es desconocida aún y no se sabe con certeza si la su

estructura juega un rol en la resistencia de las esporas (Setlow, 2006).

3. 7. 1. 2. Cubiertas esporales

Se encuentra debajo del exosporium y a su vez se compone de varias capas dichas capas se

componen principalmente de proteínas. Se han identificado más de treinta proteínas

diferentes únicas de las esporas en las cubiertas de esporas de B. subtillis. La cubierta

esporal es importante en la resistencia de la espora frente algunos agentes químicos, quizás

reacciona detoxificando el compuesto químico antes de que dañen puntos más profundos de

la espora. (Setlow, 2006). La cubierta protege también de la lisis y de ataques enzimáticos

(p. e. lisozimas) mediante la restricción del acceso de la enzimas al peptidoglicano. Una

gran proporción de la proteína de la cubierta puede ser separada mediante extracción con

detergentes sin dañar definitivamente a la espora. En esporas de B. subtilis se ha encontrado

que las cubiertas pueden presentar daños a nivel de las proteínas que conforman la

estructura de la cubierta. Se ha encontrado que esporas con cubiertas dañadas conservan su

capacidad de resistencia a altas presiones hidrostáticas, sugiriendo entonces que esta

cubierta no es importante en la resistencia de la espora a altas presiones; sin embargo,

estudios recientes han demostrado que esporas con cubiertas defectuosas retienen también

la resistencia a destrucción mecánica (Delgado, 2005).

3. 7. 1. 3. Córtex

Esta es una capa de grosor variable compuesta de peptidoglicano modificado con enlaces

más complejos que en las células vegetativas, lo que le proporciona mayor flexibilidad, el

peptidoglicano de las esporas contiene ácido diaminopimélico, mientras que el de células

vegetativas es sustituido por el aminoácido L-lisina. Adicionalmente, mucho del ácido

murámico en el peptidoglicano del córtex está presente como ácido murámico δ- Lactámico

(MAL), con pequeñas cantidades de ácido murámico enlazado solo a L- alanina (Black et

al., 2007). El córtex es más rígido y su función en la resistencia a la presión no ha sido

22

investigada aún, pero tiene mucha importancia en mantener a la espora en estado de

dormancia, manteniendo bajos los niveles de agua en la región central del protoplasto. El

peptidoglicano del córtex es degradado durante estadios tempranos de la germinación y la

hidrólisis de este córtex es esencial para que la espora “vuelva a la vida (Black et al., 2007).

3. 7. 1. 4. Membrana interna o intina

Se encuentra por debajo del córtex y es la pared que rodea al propoplasto. Es una

membrana completa que provee una externa de baja permeabilidad a moléculas pequeñas si

están cargadas o son hidrofobicas, inmoviliza lípidos e incluso el paso de agua a través de

la membrana (Black et al., 2007). La membrana interna parece estar comprimida en las

esporas, con la hidrólisis del córtex durante la germinación, en ausencia de producción de

fosfolípidos y síntesis de ATP el volumen abarcado por la membrana aumenta unas 2 a

3veces. La baja permeabilidad de la membrana interna es muy importante como barrera que

impide el acceso y posterior daño del ADN contenido en el protoplasto, por parte de

agentes químicos (Cortezzo & Setlow, 2005). Dentro de esta membrana están contenida

muchas proteínas que intervienen en el procesote germinación (Setlow, 2003). La inusual

composición de esta membrana indudablemente influye en el comportamiento de estas

proteínas; no obstante la estructura de esta membrana no se conoce.

3 .7. 1. 5. Protoplasto

Este núcleo se compone de solo dos constituyentes y tiene dos propiedades bioquímicas

importantes, una es que el contenido de agua es muy bajo en comparación con el de una

célula vegetativa donde un 80% del peso seco de la célula es agua, en una espora la

proporción es de 25% a 55% dependiendo de la especie; este bajo porcentaje de agua es la

mayor contribución a la resistencia de la espora al calor, cuanto mayor sea el contenido de

agua menor será la resistencia a altas temperaturas. El bajo contenido de agua es sin duda lo

que permite el estado de dormancia, en niveles normales de agua las proteínas tienen

solubilidad y movilidad, en el protoplasto están inmovilizadas. La segunda propiedad

bioquímica del protoplasto es que posee un pH con 1.0 a 1.5 unidades más bajo que la

célula vegetativa el cual es generalmente 7.5 a 8.0 (Paidhungat y Setlow, 2002), el pH bajo

se mantiene después de la esporulación y es un regulador en la actividad de enzimas clave

23

en el desarrollo de la espora durante la esporulación, el pH aumenta en la germinación en

los primeros minutos a través de la excreción de protones al medio.

Como se menciono anteriormente, el cortex de la espora tiene una baja cantidad de agua y

esto esta relacionado con la presencia de una molécula pequeña, el ácido dipicolínico (acido

dicarboxilico 2-6 pirimidina) (DPA), este DPA, esta presente en el citoplasma en una

proporción 1:1 como quelato con cationes divalentes donde predomina el Ca+2, formando

Ca-DPA, el DPA se hace en etapas tardías de la esporulación y se acumulan un 20% en

peso seco, en el protoplasto de la espora. Esporas de cepas mutantes que no sintetizan ni

acumulan DPA tiene un mayor contenido de agua y por lo tanto son más sensibles que las

cepas normales. El DPA también es importante porque ejerce una barrera de protección a

ADN (Setlow et al., 2006)

Existen en el protoplasto una serie de proteínas solubles, las SASP proteínas pequeñas

ácido solubles tipo α/β, estas proteínas provienen de una familia de genes que se expresan

solamente al final de la esporulación. Su tamaño es pequeño y comprenden solo un 5% del

total de las proteínas de la espora y se localizan solamente en el protoplasto de la espora, se

asocian estructuralmente solamente a ADN de la espora confiriéndole más resistencia a la

espora a altas temperaturas, desecación y radiación ultravioleta. En el momento de la

germinación las SASP son degradadas rápidamente mediante una proteasa específica

(Black et al., 2007)

3. 8. PROCESO DE ESPORULACIÓN

Es el proceso por el cual una célula vegetativa se transforma en endospora. Mientras las

condiciones ambientales son favorables, el crecimiento de una célula vegetativa continúa

hasta que se divide en dos células hijas mediante fisión binaria y no se producirá la

esporulación. La esporulación puede iniciarse la final de la fase exponencial probablemente

como consecuencia de la falta de nutrientes en el medio de crecimiento. La división o

separación asimétrica de la espora depende generalmente, de una señal nutricional,

24

mientras que los eventos que siguen dependen de un control a nivel genético. Durante el

crecimiento vegetativo rápido se suprime ele inicio de la esporulación, en apariencia debido

a un catabolito de bajo peso molecular que contiene átomos de carbono, nitrógeno y

fósforo. Este catabolito podría controlar la síntesis de una enzima necesaria para la

esporulación. Cuando la concentración de un nutriente crítico alcanza un nivel limitante, se

reduce o se interrumpe la síntesis de esta enzima (Collado, 2000)

La esporulación también puede deberse a la acumulación en el medio de productos

resultantes del metabolismo de las células bacterianas (Moseel y Moreno, 1985). También

puede iniciarse este proceso por la presencia de determinados componentes, como ciertos

nucleótidos y antibióticos (Freese, 1981)

El crecimiento vegetativo no siempre termina en la esporulación, puesto que esta se ve

influenciada por factores como la temperatura, pH, compuestos nitrogenados, oxígeno

describió los cambios morfológicos producidos durante la esporulación. La aplicación de la

microscopía electrónica ha permitido la identificación de diferentes estadios en la

formación de la endospora. Así se han reconocido siete etapas morfológicamente distintas

durante la esporulación (Russel, 2003).

• Estadío 0. Representa el momento final de la fase logarítmica de la célula

vegetativa. La inducción de la esporulación parece estar ligada a un

momento temporal en el ciclo de replicación del ADN, pues depende del

momento del ciclo de la célula. Una célula puede iniciar la esporulación una

vez se ha completado la replicación cromosómica, sí por ejemplo hay

limitación de nutrientes.

• Estadío 1 o preseptación. Cuando se produce la señal del inicio de la

esporulación, se forma un filamento axial de cromatina, que se extiende por

la mayor parte de la célula. Sucede en ausencia de síntesis de proteínas o

ADN, posiblemente a un cambio iónico en la célula, por falta de

determinados iones (Hurst & Gould, 1983).

25

• Estadío 2 o septación. Se inicia cuando una porción del material nuclear

migra a un polo de la célula. Se forma un septo asimétrico que da lugar a dos

compartimentos celulares separados, conteniendo cada uno parte del

material nuclear. A continuación, se inicia el englobamiento de la

protoespora por la membrana celular. En B cereus se ha comprobado que el

fenómeno de la esporulación es reversible en este punto, pues sí se

transfieren las endosporas en este estadío a medio fresco, vuelven a crecer,

mientras que, si alcanzan el siguiente estadío, continuarán su ciclo hasta la

formación de la espora (Setlow, 1981)

• Estadío 3. Comprende la inclusión de la protoepsora por una invaginación

de la membrana, que se separa totalmente de la célula madre. La protoespora

está rodeada por dos membranas de polaridad opuesta. En este momento,

aparecen enzimas específicas de la endospora y se observan gránulos de

ácido beta-hidroxibutírico en el citoplasma de las células vegetativas.

• Estadío 4. Se produce la deposición del córtex entre las dos membranas. El

córtex está constituido por péptidoglicanos distintos de los de la pared

celular y aumenta en grosor conforma la espora se desarrolla. En esta etapa

empieza a parecer la refringencia típica de la endospora.

• Estadío 5. Se produce la síntesis de la cubierta de la endospora. Las

proteínas de la cubierta se sintetizan en forma de precursor de célula madre

y son depositadas sobre la espora en desarrollo. El DPA se sintetiza también

en la célula madre y se acumula en la endospora. Hay una toma de calcio y

otros iones metálicos divalentes (magnesio y manganeso), que penetran en la

protoespora, siendo esto, un proceso de difusión facilitada. En el protoplasto,

el calcio se combina con el DPA, lo que disminuye la concentración de

calcio libre y posibilita así una mayor entrada del mismo (Setlow, 1981). En

este estadío, aparece la resistencia a alcoholes como el octanol. En algunas

especies bacterianas, se desarrolla el exosporium externamente a la cubierta.

26

• Estadío 6 o maduración de la espora. En este paso el córtex y las cubiertas

aumentan. Se produce la deshidratación del protoplasto, aumenta la

refractibilidad y se desarrolla la resistencia al calor, a la radiación ultra

violeta y a la lisozima.

• Estadío 7 ó final. Incluye la liberación de la endospora madura por autolisis

de la célula vegetativa.

Las condiciones para que se produzca la esporulación son precias e incluso más estrictas

que las condiciones de crecimiento.

Se han revisado los factores medioambientales críticos para la esporulación. Estos factores

según Rusell (1982) son:

• Temperatura

• pH

• Potencial de oxidación-reducción.

• Composición mineral.

• Presencia de determinados compuestos con carbono y nitrógeno.

• Composición global del medio de esporulación.

3. 9. PROCESO DE ACTIVACIÓN DE LA ESPORA

Es un proceso reversible por el cual la endospora bacteriana termina con el estado de

letargo o estadío fisiológico de incapacidad para germinar, sin terminar la criptobiosis

(estado fisiológico de metabolismo detenido). Al ser irreversible, la activación, puede

conducir a una nueva etapa de letargo conocida como desactivación, o a la pérdida de

viabilidad si las condiciones ambientales no son las adecuadas para la germinación (Curran

y Evans, 1974)

27

Como consecuencia de la activación, se produce un incremento en la velocidad de

germinación y en el porcentaje de endosporas (Cook y Pierson, 1983). Por ello, en los

estudios de termorresistencia se recomienda activar las esporas antes del tratamiento

térmico. La endospora activada es retráctil, no teñible y mantiene la resistencia a agentes

físicos y químicos que pueden dañar la célula. El método más empleado para activar

endosporas es el tratamiento térmico a temperaturas no letales, lo cual, no supone una

pérdida de resistencia térmica. Otros métodos que permiten activar la endospora son la

exposición a niveles de pH ácidos, a radiaciones ionizantes o el empleo de compuestos

químicos, aunque son menos efectivos que el calor.

3. 9. 1. PROCESO DE GERMINACION DE LA ESPORA

El proceso de germinación es aquel donde la espora abandona definitivamente y de manera

irreversible su estado de latencia y sufre una transformación restaurando su actividad

metabólica. Se trata de un proceso irreversible, aunque el paso al desarrollo celular puede

detenerse incluso durante días si las condiciones no son adecuadas. De esta forma se puede

controlar la germinación mediante la adición o eliminación de algunos aminoácidos

esenciales. A lo largo de este proceso la espora se hace sensible a la temperatura y a la

radiación.

En la naturaleza la germinación de las esporas esta indudablemente ligada a la presencia de

nutrientes. Dichos nutrientes son específicos y varían de una especie y cepa a otras de

microorganismo esporoformadores, no obstante tiene nutrientes en común como: L-

aminoácidos, D- azucares y nucleósidos tipo purina. Estos nutrientes poseen una forma

estereoespecífica de acoplarse a los receptores localizados en la membrana interna de la

espora. Los receptores de la germinación se encuentran codificados genéticamente

mediante operones tricistrónicos que solo se expresan durante el desarrollo de la espora.

Las endopsoras han de ser capaces de germinar para mostrar su viabilidad, algunos

tratamientos como el tratamiento térmico por ejemplo pueden dañar este mecanismo. No

obstante otros tipos de tratamientos como las Altas Presiones Hidrostáticas pueden inducir

28

la germinación de las endosporas, como se explicará más adelante. La germinación se

puede inducir por otros tratamientos con diferentes tipos de germinantes:

• Germinantes nutritivos, incluyen aminoácidos como L-alanina, ribósidos,

como Rosina o adenosina, azúcares, como la glucosa.

• Germinantes no nutritivos, incluyen surfactantes (n.dodecilamina), iones

metálicos (calcio, potasio, manganeso), quelatos (etilendiamintetrracético ó

dipicolinato cálcico) y bicarbonato (Gould, 1970)

• Enzimas, como la sublisina, enzimas líticas de la espora y la lisozima.

3. 11. SUSTANCIAS ANTIMICROBIANAS

Se conoce que una serie de factores pueden afectar la actividad antimicrobial: a saber

periodo de contacto, concentración, temperatura, pH, presencia de materia sólida orgánica y

tipo de microorganismo (Rusell, 2003).

La conservación y seguridad en alimentos tiene un récord extenso de descubrimientos e

innovaciones para impedir el deterioro y alargar la vida útil de alimentos durante su

almacenamiento. Los métodos de preservación de alimentos se pueden clasificar en: físicos,

químicos y biológicos. Los métodos físicos incluyen: secado, almacenamiento en frío,

congelamientos y empaque en atmósferas modificadas (Ricke et al., 2005).

Un biocida puede inactivar a un solo o varios tipos de microorganismo. Es pertinente

considerar, si es posible, explicar las similitudes y diferencias en respuesta a biocidas en

microorganismos diversos estructural y fisiológicamente. En muchas maneras esto

representa un reto para los antibióticos donde un conocimiento claro sobre los mecanismos

de inactivación y resistencia permite conocer la especificidad y selectividad de un biocida

29

3. 11. 1. Absorción de biocidas y respuesta en las células

La interacción de un biocida con la célula microbiana esta determinada por la absorción. Se

conocen cinco clases de absorción: (i) Modelo en forma de S, en el cual la molécula de

soluto es monofuncional, está orientado verticalmente y encuentra una fuerte competición

con las moléculas del solvente o con otras sustancias que se puedan absorber. (ii) Modelo L

(Langmuir) en el cual muchos sitios en la membrana están llenos, esto dificulta al soluto

encontrar un sitio vacío por donde penetrar. (iii) Modelo H (High afinity), en este caso el

soluto es completamente absorbido. (iv) Modelo C (partición constante) en este caso el

soluto penetra más rápidamente que el solvente. (v) Modelo Z hay un punto en el cual el

incremento de la respuesta, se cree es causado por la rotura de la estructura y el contacto

con el soluto, generando nuevos puntos de absorción (Rusell, 2003).

La superficie de la célula microbiana puede actuar como barrera en respuesta a algunos

biocidas o a uno solo en especial. La impermeabilidad o disminución de la respuesta es un

mecanismo común para reducir la susceptibilidad a antibióticos y biocidas en diferentes

microorganismos como mycobacterias, bacterias Gram negativas y esporas bacterianas

pero, también en algunos tipos de estafilococos (Rusell, 2003).

3. 11. 2. Objetivo de acción de un biocida

A pesar de las variaciones en la estructura celular y fisiología es claro que los sitios de

acción pueden estar presentes en células vegetativas de diferentes especies. Muchos de los

trabajos publicados se refieren a bacterias. Como ejemplo de un biocida convencional esta

el fenol, utilizado como desinfectante o preservante. Los fenoles por ejemplo inducen

progresivamente pérdida intracelular de constituyentes, si la concentración de fenol

intracelular es alta se producen daños en la membrana induciendo coagulación dentro de la

célula. En células fúngicas hay daño en la membrana plasmática, no obstante A. niger y C.

albicans son menos susceptibles que las bacterias. Las esporas bacterianas son muy

resistentes inclusos a altas concentraciones de fenol, pero la germinación es inhibida por

bajas concentraciones de fenol (Rusell, 2003).

30

3. 11. 3. Clasificación de los antimicrobianos

La lista de aditivos químicos desarrollados en los últimos años, es muy extensa, los

antimicrobianos naturales incluyen por ejemplo ácidos orgánicos, esteres, sales y

compuestos específicos como la lisozima (Davidson, 2001). En la naturaleza se dan

compuestos usados para la preservación de alimentos incluyendo algunos de origen animal,

como la lactoperoxidasa y algunas proteínas férricas, otros derivados de plantas como:

especias, aceites y compuestos fenólicos (Davidson, 2001). Los sistemas biológicos que

pueden desarrollar o tener potencial para preservar alimentos incluyen el control por

acidificación en alimentos con bacterias ácido lácticas que producen ácidos orgánicos

provenientes de la fermentación de carbohidratos (Monteville et al., 2001). Bacteriocinas y

bacteriófagos están capturando interés por su potencial contra patógenos específicos (Weld

et al., 2004).

3. 11. 4. Antimicrobianos de origen químico

Los compuestos antimicrobianos tienen aditivos como el lactato de sodio o de potasio,

citrato de sodio y una variedad de compuestos antioxidantes que exhiben propiedades

antimicrobianas. Otro tipo de antimicrobianos tipo gas (ozono, cloro, dióxido de cloro, que

general halógenos oxidados) usualmente son aplicados en solución acuosa dando como

resultado una reducción aproximada de 2 a 4 ciclos logarítmicos para algunos patógenos,

dependiendo de la concentración, temperatura de aplicación y tiempo de contacto (Ransom

et al., 2003). El efecto de esto antimicrobianos no es permanente después del tratamiento,

principalmente porque estos compuestos son altamente reactivos en sus enlaces

insaturados, de este, modo se desprenden rápidamente del medio acuoso impidiendo la

acción contra las células bacterianas después de un tratamiento. Por otra parte el fosfato

trisódico en una sal alcalina puede liberar radicales hidroxilo que luego impedirán el

crecimiento de células tras el tratamiento (Pohlman et al., 2002). No es de sorprenderse que

combinando antimicrobianos se potencie el efecto ya que muchos antimicrobianos actúan

sinérgicamente.

31

Algunos antioxidantes sintéticos como hidroxianisol butirato e hidroxitolueno butirato

(BHA/BHT) y el ácido benzóico también se pueden utilizar como aditivos antimicrobianos

pero su uso está limitado en algunos alimentos lo cual presenta una desventaja.

3. 11. 5. Antimicrobianos de origen natural

Se estima que hay de 250.000 a 500.000 especies de plantas en la Tierra, de los cuales más

o menos un 1 al 10 % son utilizadas en la alimentación de humanos y animales. Es posible

que un porcentaje más grande sea utilizado en medicina. Hipócrates (a finales del siglo v

A., C) mencionó la existencia de 300 a 400 especies de plantas medicinales. En el siglo

primero después de Cristo, Dioscorides, escribió De Materia Medica, un catalogo de

plantas medicinales qué se tomó como modelo para las farmacopeas que conocemos en la

actualidad. La Biblia ofrece una descripción de aproximadamente unas 30 plantas curativas;

como la mirra que gozó de estatus de planta milagrosa. Se reportó que tenía propiedades

antisépticas utilizándose también como enjuagues bucales (Cowan, 1999)

Los antimicrobianos naturales pueden definirse como una serie de sustancias químicas que

se encuentran repartidas de diversas formas en la naturaleza y que son capaces de inhibir el

crecimiento de los microorganismos que alteran alimentos actuando como bacteriostáticos e

incluso algunos antimicrobianos tienen acción bactericida (Delgado, 2005).

Muchos productos derivados de plantas (especias, preparaciones de frutas y vegetales) han

sido usadas desde hace siglos para la conservación y aumento de la vida útil de los

alimentos (Draughon, 2004). La mayor parte de la actividad antioxidante se atribuye a

varias preparaciones de frutas y vegetales que contienen compuestos fenólicos con grupos

hidroxil reactivos (ej. catequinas, ácido gálico, ácido colinérgico), ácido neocolinérgico y

otros compuestos como antocianinas, flavoniodes y carotenoides (Stacewicz-Sapuntzakis et

al., 2001). Estos compuestos son usados generalmente después de tratamientos

superficiales y son conocidos como ingredientes seguros. Muchos de estos antimicrobianos

pueden reducir de 1 a 2 ciclos logarítmicos, pero tienen que actuar sinérgicamente con

tratamientos térmicos o tratamientos químicos como adición de ácidos. Muchos de estos

antimicrobianos de origen natural proporcionan un efecto benéfico en la dieta humana.

32

La combinación de dos o más antimicrobianos en bajas dosis pueden tener un efecto

sinérgico reduciendo el número de patógenos manteniendo la calidad de los alimentos. Por

ejemplo, fuentes naturales de antioxidantes como extractos de especias tienen actividad

antimicrobiana y previenen la oxidación de lípidos por ejemplo en carnes. Sin embargo por

sí solo un antimicrobiano natural difícilmente actúa como bactericida y por lo general hay

que combinarlo con algún tratamiento como APH, pulsos eléctricos o temperaturas suaves.

En comparación con otros tratamientos más agresivos (ácidos orgánicos, tratamiento

térmico, tratamiento con vapor) el uso de antimicrobianos de origen natural tiene efecto

antimicrobiano y antioxidante, además de no alterar las propiedades organolépticas de los

alimentos.

Existen dos tipos de antimicrobianos naturales, las bacteriocinas y los aceites esenciales la

diferencia entre ambos radica en que las bacteriocinas son de origen bacteriano, mientras

que los aceites son de origen vegetal.

Las bacteriocinas son péptidos microbianos de reducido tamaño, con una actividad

antimicrobiana muy potente. Son resistentes al calor y son hidrolizadas por las proteasas

gástricas, lo que permite asegurar su inactivación por ingestión así como su posible

utilización como preservantes naturales de los alimentos. Se han aislado bacteriocinas de

muchos géneros, siendo la más importante la nisina, sintetizada por Lactococcus lactis. El

primer uso alimentario de la nisina lo hizo Hurst en queso suizo para inhibir el crecimiento

de Clostridium butyricum (Hurts, 1981). En 1998 la FDA (Food and Drug Administration)

reconoció la nisina como sustancia segura y muchos países, entre ellos España, permiten su

uso en alimentos en diferentes proporciones (Delgado, 2005)

3. 11. 5. Polifenoles y su efecto antimicrobiano

El árbol de oliva Olea europea L, es uno de los árboles frutales más importantes en los

países del mediterráneo ya que las olivas de mesa son parte vital de la dieta mediterránea y

su consumo se extiende en casi todo el mundo. También son ampliamente conocidas sus

propiedades benéficas en la salud humana como por ejemplo la disminución de riesgos de

enfermedades cardiovasculares.

33

Existen tres tipos de las olivas de mesa o aceitunas, las verdes de Estilo español, aceitunas

negras maduras o Californian style, y aceitunas naturalmente negras. La producción de

aceitunas de mesa verdes incluye un tratamiento anterior con cloro. Después del lavado,

para eliminar el exceso de álcali, la fermentación de ácido láctico que ocurre

espontáneamente en la salmuera. El método de tratamiento de aceitunas negras maduras

incluye el almacenaje de la fruta en la salmuera (el 5-10 % NaCl) durante 2-6 meses, con

acidificación a pH 4 con ácidos lácticos y acéticos y almacenaje en condiciones anaerobias/

aeróbicas para prevenir la fermentación. Las aceitunas entonces son tratadas con la solución

diluida de NaOH y son oxidadas. Después del lavado, las aceitunas son colocadas en la

salmuera y se añade gluconato ferroso o lactato ferroso para mantener el color negro

(Pereira, 2007).

Las aceitunas de mesa son fuentes conocidas de compuestos con importancia biológica,

dichas propiedades están relacionadas con los ácidos grasos, especialmente con aquellos

monoinsaturados y otros componentes que se encuentran en menor proporción como

tocoferoles y compuestos fenólicos. Los polifenoles actúan como antioxidantes naturales,

son los principales metabolitos secundarios, representando aproximadamente el 2-2.5 % de

la pulpa (Pereira, 2007).

El contenido de compuestos fenólicos en la aceituna depende de varios factores, como las

condiciones de cultivo, el clima, los regímenes de irrigación, el grado de madurez de la

fruta, y el proceso de elaboración. En la figura 3. 1 se observan las diferentes estructuras

químicas de los principales compuestos fenólicos aislados de las aceitunas.

34

Figura 3. 1. Estructuras químicas de compuestos fenólicos identificados en un

extracto acuoso procedente de residuos de la industria de las aceitunas. Fuente:

Pereira, 2007.

3. 11. 5. 1. Propiedades del polvo de aceitunas como antimicrobiano

El polvo de aceitunas es un producto nuevo desarrollado por la multinacional farmacéutica

Natraceutical S.A. Es un extracto 100% natural de olivas, rico en nutrientes, fibra dietaria,

antioxidantes, polifenoles y se espera que ayude a mejorar la salud de los consumidores,

porque contiene también ácido oleico, escualeno, tocoferoles y pigmentos naturales

Investigaciones recientes señalan que el polvo de aceitunas como ingrediente alimentario,

tiene una nueva aplicación como antimicrobiano, este producto se ha utilizado

recientemente en España en la elaboración de productos de panadería y repostería. Existe

un alto riesgo de contaminación de panes y otros productos por hongos de los géneros

Aspergillus y Penicillium. Estos hongos generan defectos muy visibles en los panes, textura

más viscosa, cambios en el aroma y en el color. Por otra parte las materias primas de

35

panadería como la harina, la malta, la levadura en barra, los aditivos e incluso la maquinaria

y los utensilios se pueden contaminar por esporas termorresistentes de B. cereus y que

posteriormente pueden germinar durante el almacenamiento en el producto terminado. En

respuesta a este problema se buscan nuevos aditivos capaces de controlar esporas durante

periodos de almacenamiento del producto.

Actualmente se están estudiando muchos compuestos de olivas y sus derivados,

compuestos presentes en las olivas como los secoiriodoides (oleuropeina y derivados) son

la clase de polifenoles presentes en mayor proporción, el hidroxitirosol es un derivado

fenólico de la oleuropeina que ha sido estudiado en pruebas in Vitro contra bacterias Gram

positivas y Gram negativas mostrando una notable actividad antimicrobiana (Serra et al.,

2007).

La actividad in Vitro de ocho aldehídos alifáticos de cadena larga provenientes de olivas

mostraron actividad antimicrobiana contra cepas bacterianas frescas Adicionalmente

aldehídos α-β- insaturados mostraron tener un amplio espectro antimicrobiano contra

bacterias tanto Gram positivas como Gram negativas (Bisignano et al., 2001). Otro estudio

reveló el potencial antimicrobiano de ocho compuestos fenólicos aislados de pasta de oliva,

contra E.coli, Klebsiella pnueumoniae, Bacillus cereus, Aspergillus flavus y Aspergillus

parasiticus, con resultados bastante promisorios. Los compuestos fenólicos incluían ácidos

p-hidroxibenzóico, vainillínico, cafeíco, protocatequico, siringico y p-cumárico;

oleuropeina y quercetina (Bisignano et al., 2001).

3. 12. FUNDAMENTOS Y DEFINICIONES DE LAS ALTAS PRESIONES

HIDROSTÁTICAS APH

Se entiende por Altas Presiones, a la tecnología que utiliza las presiones comprendidas

entre 100 y 1000 MPa junto con un liquido presurizante normalmente el medio utilizado

para transmitir a presión es el agua, así este tratamiento se le conoce como hidrostático.

Existen dos principios fundamentales en los que se basa la aplicación de las Altas Presiones

(Cheftel., 1991):

36

• El primero indica que la presión se transmite de manera uniforme e

instantánea a través de todo el material biológico tratado, tratándose así de

un proceso isostático. Este proceso evita la presencia de zonas sobretratadas,

así como la deformación de producto y hace que este sea más homogéneo.

• El segundo se refiere al principio de Le Chatelier que indica que los

fenómenos acompañados de una disminución de volumen (reacciones

químicas modificación de las configuraciones moleculares) son favorecidos

por un aumento de presión y viceversa. Según este principio la aplicación de

la alta presión desplaza el equilibrio de un proceso hacia el estado que ocupa

menos volumen. Por ejemplo en una macromolécula proteica donde hay

enlaces tipo puentes de hidrógeno, la aplicación de presión induce la ruptura

de interacciones hidrófobas y también pares de iones son acompañados de

una restricción de volumen favorecida por la presión (Cheftel., 1991), sin

embargo otros estudios suponen que los puentes de hidrógeno de las

proteínas son casi insensibles a la presión (Mozhaev, 1994).

Los efectos de la disociación iónica son favorecidos en general por el fenómeno de

electrostricción. Así la presión causa la separación de cargas eléctricas ya que el agua se

organiza de manera más compacta alrededor de las cargas iónicas y de los centros

polarizados de las moléculas, lo que causa una reducción del volumen total (Cheftel, 1991).

Se ha observado que los enlaces covalentes tiene baja compresibilidad y no se ven

afectados por presiones inferiores a 1000 – 2000 MPa (Hayasi, 1992; Tauscher, 1995). De

esta manera la estructura de las biomoléculas de bajo peso molecular (carbohidratos, lípidos

y proteínas) y la estructura primaria de las moléculas no se ve modificada (Heremans,

1995). Se ha reportado también que diferentes reacciones de Maillard (por ejemplo xilosa-

lisina) son reducidas o inhibidas bajo presión. La alta presión también contribuye a la

disociación de grupos ácidos de las cadenas laterales de los aminoácidos y a la ruptura de

los puentes salinos intramoleculares (Heremans, 1995).

El comportamiento de las Altas Presiones sobre diferentes sistemas alimentarios demuestra

la utilidad de la aplicación de esta técnica en la conservación de alimentos, que además de

37

extender su vida útil, mantiene la textura, el sabor, las vitaminas y otros nutrientes naturales

en muchos productos.

Para conseguir la inactivación de microorganismos y enzimas se utilizan presiones que

varían entre 4000-9000atm. Con tiempos relativamente cortos (del orden de varios minutos)

y combinación de temperatura moderada (30-50ºC) sin afectar sensiblemente las

características sensoriales del producto. Las condiciones de procesado dependen

principalmente del alimento a tratar, la tecnología de APH es todavía ineficaz, sin la

combinación con temperatura alta, contra algunos microorganismos esporulados, ya que

estos presentan una alta tolerancia a las altas presiones (Barbosa et al., 1998; Mills et al.,

1998).

La efectividad de los tratamientos de APH sobre la inactivación microbiana depende de

variables del tratamiento (presión, tiempo, temperatura), de la composición del alimento y

de la naturaleza del microorganismo. Existen investigaciones que muestran la inactivación

microbiológica de los tratamientos de APH (Patterson, 2000). En general presiones entre

400 y 600 MPa producen importantes reducciones (4 unidades logarítmicas) de la mayoría

de los microorganismos de la forma vegetativa, mientras que las esporas pueden resistir

presiones superiores a los 1000 MPa. En general los microorganismos Gram negativos son

más sensibles a los tratamientos de APH, seguido de las levaduras y hongos, Gram

positivos y por último esporas. En productos vegetales de pH 4 es necesaria la combinación

de los tratamientos de APH con otras tecnologías de conservación como el calor suave

(Smelt, 1998; Patterson, 2000; Plaza et al., 2003). Aditivos como la nisina, la

lactoperoxidasa o lisozima (García, Graells et al., 1999, 2000; Cano et al., 2005)

En materia de APH hay estudios que datan del siglo XIX que tratamientos relativamente

cortos a presiones de 2 a 3000 bares son suficientes para reducir considerablemente el

número de microorganismos. Posteriormente un número de investigadores han centrado su

atención en formas vegetativas y latentes de los microorganismos, lo cual muestra que

evidentemente no es posible por ejemplo eliminar esporas a temperatura ambiente incluso

cuando se opera a Altas Presiones por encima de los 17000 bares. (Spilimbergo et al.,

2002)

38

La resistencia de las esporas bacterianas a agentes químicos y físicos y su habilidad para

estar en dormancia durante largos periodos de tiempo, representan un problema en la

industria alimentaria. El método más utilizado para la inactivación de esporas es el

tratamiento térmico, pero causa pérdida de nutrientes y modificaciones en el sabor de los

alimentos.

El principal objetivo de las tecnologías no térmicas es preservar los alimentos sin alterar sus

cualidades.

El tratamiento con Altas Presiones Hidrostáticas (APH) puede inactivar microorganismos a

temperatura ambiente o en combinación con bajas temperaturas en un tratamiento de

calentamiento suave manteniendo los nutrientes y las características organolépticas otra

ventaja sobre los tratamientos térmicos es que la presión empleada en el tratamiento es

independiente de la muestra, porque la presión actúa instantánea y uniformemente en los

alimentos; y mantiene la muestra bajo presión por un periodo extendido de tiempo sin

requerir energía adicional. (Mertens, 1992).

3. 12. 1. Aspectos técnicos de las Altas Presiones Hidrostáticas

La tecnología de la alta presión es la aplicación de una presión uniforme en todo el

producto, y se aplica básicamente para presionar de forma isostática en principio se

utilizaba en la industria mineral y metalúrgica por ejemplo en la fabricación de cuarzo y

reactores químicos. Algunas reacciones químicas se llevan a cabo a alta presión para

aumentar el rendimiento de la reacción. Las cámaras de Alta Presión se utilizan también

como simuladores para probar equipos que se usan en un ambiente de Alta Presión; por

ejemplo, en el fondo del mar.

3. 12. 1. 1. Generación de Alta Presión

Las cámaras son vasos de presión que pueden soportar las Altas Presiones se utilizan en la

industria del metal y la cerámica. Sin embargo, la industria alimentaría requiere equipos

que toleren presiones de más altas de 4000 atm con un ciclo más eficiente y duradero de

100.000 ciclos/año. La alta presión se puede generar del siguiente modo:

39

Compresión directa, que es generada por presurización de un medio con la parte final de un

pistón de diámetro pequeño. El diámetro de la parte final del pistón se mueve con una

bomba de baja presión este es método de compresión permite una compresión muy rápida,

pero las limitaciones del cierre dinámico de alta presión entre el pistón y la superficie

interna de la cámara restringe el uso de este método a escala de laboratorio o sistemas de

planta piloto la figura 3. 2 ilustra las partes que componen un sistema de compresión

directa.

Figura 3. 2. Compresión directa. Fuente: CURSO DOCTORADO: PROCESADO DE

ALIMENTOS POR CALOR Y NUEVAS TECNOLOGÍAS: ALTAS PRESIONES

HIDROSTÁTICAS. Universidad de Talavera, 2006

Compresión indirecta, que utiliza un intensificador de la Alta presión para bombear el

medio de presión desde un depósito hacia la cámara de presión cerrada hasta que alcanza la

presión deseada la figura 3. 3. muestra un esquema de la estructura de un sistema de

compresión indirecta. La mayoría de los sistemas industriales de presión isostática utiliza el

método de compresión directa.

Bomba de baja presión

Pistón

Cámara de presión Medio de presión

Cierre del fondo

40

Figura 3. 3. Compresión indirecta. Fuente: CURSO DOCTORADO: PROCESADO

DE ALIMENTOS POR CALOR Y NUEVAS TECNOLOGÍAS: ALTAS

PRESIONES HIDROSTÁTICAS. Universidad de Talavera, 2006

Con respecto al aumento de temperatura durante un tratamiento a APH se puede decir que

el calentamiento del medio de presión, utiliza la expansión del medio de presión mediante

el aumento de temperatura para generar alta presión. Por tanto el calentamiento del medio

de presión se usa en combinación con alta temperatura; eso requiere un control muy

estrecho de la temperatura con el volumen interno entero de la cámara de presión (Rodrigo

2003).

Los sistemas de presión isostática pueden operar como sistemas fríos, templados y

calientes:

Presurización isostática fría (PIF), que es esencialmente una técnica antigua utilizadas en

las industrias del metal, cerámica, carbón, grafito y plástico. Los materiales en polvo se

colocan en un molde elastómero y sometido a alta presión. El proceso de PIF utiliza

configuraciones de bolsas húmedas y bolsas secas. En el método de bolsa húmeda el molde

se llena fuera de la cámara de alta presión.

Cierre superior

Intensificador

Depósito del medio de

presión

Medio de presión

Cierre inferior

41

Presurización isostática templada (PIT), la presión se aplica con temperaturas que van

desde la temperatura ambiente hasta 200ºC. PIT se usa en situaciones en las que una

reacción química tiene lugar durante la pasteurización.

Presurización isostática caliente (PIC), el material es uniformemente calentado y

presurizado. La temperatura puede llegar a los 2200ºC y la presión es de 1000- 4000 atm.

El medio de presión utilizado es un gas, como argón, nitrógeno, helio o aire (Barbosa,

1997)

3. 12. 1. 2. Operación de una cámara de Alta Presión Hidrostática (APH)

Las muestras a tratar se colocan en un envase estéril con hielo y posteriormente es sellado y

se coloca en la cámara de presurización. Para el envasado de los alimentos en tratamientos

con APH se recomiendan películas de alcohol de polivinilo y películas de copolímero de

etilén–vinilo. Una vez que la cámara se haya cargado con el alimento envasado y se haya

cerrado, se llena con el medio de presión- transmisión. El fundamento para la aplicación de

la alta presión en alimentos, es la compresión del agua que rodea el alimento. A

temperatura ambiente, el volumen del agua decrece un 4 % a 1000 atm. Debido a la

compresión del líquido que provoca un pequeño cambio de volumen., las cámaras de alta

presión utilizan agua, ya que no presentan los peligros de operación de las cámaras que

utilizan gases comprimidos.

El alimento se coloca a presión durante un determinado periodo de tiempo. El tiempo de

tratamiento en la cámara de presión depende del tipo de alimento y de la temperatura del

proceso. Al final del tiempo de procesado se descomprime la cámara para sacar la carga

tratada. Se coloca una nueva carga de alimento en la cámara y se inicia de nuevo el ciclo.

Los retos de la ingeniería en la aplicación de APH en la industria alimentaría básicamente

son: la fabricación de las cámaras de presión para el manejo de grandes volúmenes de

alimentos y la resistencia a presiones elevadas. La cámara de presión debe tener un ciclo de

tiempo corto, ser fácil de limpiar y segura de operar. Desde el punto de vista industrial es

deseable el desarrollo de procesos continuos de pasteurización con costes de inmovilizado y

operación razonablemente bajos. La mayoría de estos retos se han cumplido, pero todavía

42

se llevan a cabo investigaciones para desarrollar tecnología de alta presión y el equipo

necesario.

3. 12. 2. Descripción general de un sistema de Alta Presión industrial

Un sistema industrial de alta presión consiste en una cámara cerrada, un sistema de

generación de presión, un dispositivo de control de la temperatura y un sistema de manejo

que puede ser automatizado o no.

La cámara de alta presión y su cierre: el corazón del sistema es la cámara de presión, la

cámara cilíndrica se construye en acero de baja aleación de resistencia a alta tracción.

Generación de la presión: una vez cargada y cerrada, la cámara se llena con el líquido

presurizante. Comúnmente en aplicaciones de presión isostática fría o tibia el medio

presurizante es simplemente agua mezclada con aceite soluble para lubricar y evitar la

corrosión. Alternativamente puede ser usado un aceite mineral de baja viscosidad. También

se puede utilizar agua destilada pero requiere que el equipo sea construido en acero

inoxidable en la cámara de presión, la tubería y los conductos de todo el sistema.

La alta presión hidrostática es generada mediante compresión directa, compresión indirecta

o a través del calentamiento del medio de presión. En el caso de compresión directa se hace

a través de un pistón, el medio de presión en la cámara de alta presión es presurizado

directamente mediante un pistón manejado por una bomba de baja presión.

Con respecto a como controlar la temperatura durante el tratamiento durante la fase de

carga y del medio de transmisión de presión dentro de la cámara de alta presión existen dos

métodos, uno, por calentamiento o enfriamiento de la cámara desde afuera o internamente

por una fuente de calor o enfriamiento ubicada dentro de la cámara, la manera más simple

de control externo de temperaturas se realiza mediante bandas eléctricas de transmisión de

calor que están alrededor de la cámara. Este método solo permite calentar el contenido de la

cámara por encima de la temperatura ambiente; cuando se requiere calentar o enfriar la

cámara puede tener una chaqueta con medio de calentamiento /enfriamiento en circulación.

43

La figura 3. 4 es una fotografía del equipo de Altas Presiones Hidrostáticas utilizado en

industria.

Figura 3. 4. Sistema de Altas Presiones Hidrostáticas a nivel industrial CURSO

DOCTORADO: PROCESADO DE ALIMENTOS POR CALOR Y NUEVAS

TECNOLOGÍAS: ALTAS PRESIONES HIDROSTÁTICAS. Universidad de

Talavera, 2006

3. 13. EFECTOS BIOLOGICOS DE LA ALTA PRESIÓN

La alta presión induce cambios en los sistemas biológicos, morfológicos, bioquímicos y

genéticos; así como cambios en la membrana y pared celular de los microorganismos. En

general las bacterias Gram negativas se inactivan a una presión menor que las Gram

positivas.

44

3. 13. 1. Efecto sobre los microorganismos

Los primeros estudios sobre inactivación de microorganismos por efecto de la presión

fueron realizados en Francia por Certes en 1884 y en EUA por Hite en 1914 (Hoover,

1993).

Las altas presiones inducen cambios de tipo morfológico, bioquímico y genético que tiene

lugar en la membrana y en la parte celular de los microorganismos, además provocan

cambios en la reproducción de los microorganismos (Cheftel, 1999). Se han observado

varios cambios de la célula bajo el efecto de la presión como la compresión de las vacuolas

de gas, la elongación de la célula, la contracción con formación de poros y la modificación

del núcleo (Cheftel, 1992).

En cuanto al material genético este se ve afectado a nivel de las enzimas implicadas en la

replicación y la trascripción del ADN (Cheftel, 1992). Algunos sistemas enzimáticos son

inhibidos por la presión como es el caso de las deshidrogenasas en E.coli a 100 MPa y las

carboxilasas de las levaduras a 400MPa (Cheftel, 1992).

Según Cheftel (1992) la destrucción celular puede ser causada por la inhibición de la

ATPasa o por la cristalización de la membrana de fosfolípidos en cambios irreversibles en

la permeabilidad celular y el intercambio iónico.

En resumen los cambios que ocurren en la célula se pueden resumir así:

Inactivación microbiana: las altas presiones moderadas disminuyen la velocidad de

crecimiento y reproducción, las presiones muy elevadas provocan la inactivación de los

microorganismos. El umbral de presión para el retraso en la reproducción e inactivación

depende de cada microorganismo y especie.

Aunque las esporas son altamente resistentes a las altas presiones, estas pueden ser

germinadas bajo presión. Este proceso lleva a la aparición de células vegetativas que son

más sensibles a la presión y a otros métodos de inactivación (Earnshaw, 1996). Presiones

45

de 50 a 300 MPa son suficientes para inducir la germinación de las esporas (Wuytak et al,

1997). Los efectos en las esporas bacterianas se pueden resumir así:

Un aumento en la sensibilidad al calor y a la radiación, a la actividad respiratoria, a la

turbidez y coloración de la suspensión de esporas. Pérdida de la refractibilidad. Pérdida de

peso, liberación de calcio y ácido dipicolínico al medio circundante.

Con un tratamiento de APH, las esporas germinan en células vegetativas, entonces las

células vegetativas son inactivadas. A bajas temperaturas, una presión baja causa la

germinación y una sensibilidad al calor pero no se aprecia inactivación de las esporas

germinadas. Presiones medias causan una considerable germinación y gran producción de

esporas germinadas se inactivan. Presiones altas causan menor germinación y solo una

pequeña porción de las esporas germinadas se inactivan. Por encima de los 65 ºC, la

inactivación de esporas es debido al calor y no a la presión. Los intervalos de temperatura y

presión para la germinación e inactivación dependen de la clase de esporas. La pérdida de

resistencia el calor durante la germinación se asocia con el aumento de hidratación de las

células, y la transformación de sol a gel (Barbosa, 1997)

La inactivación de esporas por presión está fuertemente influenciada por la temperatura y

menos fuertemente por el pH, actividad del agua y fuerza iónica. La temperatura óptima

para la iniciación de la germinación de esporas difiere a diferentes presiones. La

inactivación de esporas es mayor cerca de la neutralidad y más pequeña a niveles extremos

de pH. Los solutos no iónicos a baja actividad del agua (aw) tienen un pequeño efecto en la

activación de esporas por presión, mientras que la presencia de solutos como NaCL y más

efectivamente CaCL2 disminuyen la inactivación. La mayoría de esporas no pueden

germinar por altas presiones en ausencia de iones inorgánicos. Los iones pueden afectar la

degradación catalizada por enzimas de peptidoglicano durante la germinación. La prioridad

efectiva de iones en la germinación inducida por presión es H> K > Mn> Ca, Mg, Na. Los

iones también causan un aumento de la pérdida de la resistencia al calor de esporas en

soluciones tampón con respecto a suspensiones en agua destilada a la misma presión y

temperatura (Raso y col. 1998)

46

La germinación iniciada por presiones bajas es afectada por los constituyentes del medio en

suspensión. Por ejemplo, los aminoácidos alanina e inosina ribosita son potenciadores

efectivos de la germinación por presión de esporas de B. cereus. Los potenciadotes e

inhibidores de la germinación se vuelven menos efectivos en la aceleración o prevención de

la germinación, respectivamente, a medida que la presión aumenta. Los inhibidores alcohol

octilo (10 mM) y cloruro de mercurio (1 mM y 10 mM) previene completamente la

germinación de B. cereus y B. coagulans a 400 y 600 atm, respectivamente, a medida que

la presión aumenta. El azúcar y la sal son entonces inhibidores de la inactivación de esporas

(Delgado, 2005).

3. 13. 2. La Alta Presión Hidrostática y las reacciones bioquímicas

Las reacciones químicas que más deben afectarse por la alta presión son las reacciones con

reactantes que experimentan o bien un aumento o un descenso del volumen. La presión

provoca un descenso en el espacio molecular disponible, o un aumento en las interacciones

en cadena. La Alta Presión favorece las reacciones afectadas con formación de puentes de

hidrógeno debido a que los enlaces provocan un descenso en el volumen.

La alta presión desnaturaliza las moléculas de proteína. La desnaturalización de las

proteínas por la presión es un fenómeno complejo que depende de la estructura de la

proteína, del intervalo de presión, del pH y de la composición del disolvente

El principal interés de la aplicación de las APH en los alimentos se centra esencialmente en

introducir cambios positivos en ellos como la mejora de su conservación, textura y sabor

sin variar el valor nutricional del producto original. El tratamiento con Altas Presiones

Hidrostáticas se utiliza desde la década de los noventa en diferentes países y en distintos

productos tal como lo muestran las figuras 3. 5 y 3. 6 que muestran un resumen de la

evolución de las APH en el mercado mundial y los efectos de estas en diferentes alimentos

disponibles en el mercado.

La tecnología de la APH se puede aplicar para alargar la vida comercial de los alimentos y

modificar la textura y propiedades sensoriales de los alimentos y para el almacenamiento de

alimentos sin necesidad de congelación. La vida comercial de los alimentos se aumenta por

inactivación de los microorganismos esporas y enzimas indeseables, utilizando las

47

presiones apropiadas. Es deseable descongelar los alimentos congelados de modo uniforme.

La Alta Presión Hidrostática puede descongelar uniformemente los alimentos. La

descongelación con presión es más rápida cuando los alimentos contienen más sólidos,

tales como NaCL o azúcares.

Al exponer los alimentos a alta presión se producen cambios sensoriales dependiendo del

tipo de alimento. Por ejemplo, la estructura interna de los tomates se vuelve más firme, los

tejidos de pollo y filetes de pescado se vuelven opacos y la ternera se ablanda.

La alteración de la estructura del almidón y la proteína por alta presión se puede utilizar

para que el arroz se pueda cocinar en pocos minutos.

Bajo la influencia de la alta presión, los enlaces covalentes permanecen intactos, mientras

que los no covalentes se rompen. El tratamiento de presión aumenta la digestibilidad de las

proteínas cárnicas. El valor aparente biológico de las proteínas y la razón de eficacia

proteica de la carne tratada con presión son equivalentes a las proteínas cárnicas ablandadas

a presión atmosférica. Generalmente las enzimas de las hortalizas se inactivan mediante

escaldado con agua caliente. Las desventajas del escaldado incluyen el deterioro térmico,

extracción de nutrientes y la posible contaminación medioambiental debido a la producción

de efluentes con alta demanda bioquímica de oxígeno. El escaldado con agua reduce los

recuentos totales de microorganismos en 3 ciclos, mientras que la reducción de recuentos

totales por Ultra Alta Presión (UHP) es generalmente de 4 ciclos logarítmicos (Universidad

de Talavera, 2006)

País

(año)

producto Proceso envasado Vida útil Interés de las APH

Japón

1990

Mermeladas (fresa, manzana)

Salsas (naranja, cebolla y manzana)

Indirecto 400 MPa 10–30 minutos

Vidrio con cubierta plástica

2 a 3 meses a 4ºC

Higiniezación, mejora del proceso de gelificación

48

Japón 2000 Arroz precocido hipoalergénico

400 MPa Conservado a Tº ambiente

Desnaturalización por APH de proteínas hipoalergénicas seguido de una esterilización térmica

Italia

2001

Postres de fruta Indireto 600MPa 3-5 minutos a 17ºC

Envases triangulares de plástico

1 a 2 meses Inactivación enzimática PPO , higienización, mantenimiento de las propiedades sensoriales

USA

2002

Productos derivados del aguacate

Indirecto Inactivación enzimática PPO higienización, mantenimiento de las propiedades sensoriales, sustitución del tratamiento térmico

USA

2003

Ensalada de vegetales

Indirecto Inactivación enzimática PPO higienización, mantenimiento de las propiedades sensoriales, sustitución del tratamiento térmico, incremento de vida útil

Canadá 2003

Cebollas loncheadas Indirecto Bolsas plásticas (225g)

45 días Eliminación del sabor amargo, aumento de la frescura y alargamiento de vida útil

USA 2004 Productos de soja, tofú

Higienización, aumento de vida útil

España 2005

Platos preparados de verduras “listos para consumir”

500 MPa Envasados al vacío Skin pack

Higienización, aumento de vida útil

Figura 3. 5. Productos hechos en base a frutas y verduras en el mercado tratados con APH. Fuente:

CURSO DOCTORADO: PROCESADO DE ALIMENTOS POR CALOR Y NUEVAS

TECNOLOGÍAS: ALTAS PRESIONES HIDROSTÁTICAS. Universidad de Talavera, 2006

49

País

(año)

producto Proceso envasado Vida útil Interés de las APH

Japón

1993

Sake (licor de arroz) Indirecto (bolsas PE)

400 MPa 15 minutos 30ºC

Botellas de vidrio 300 ml

6 a 12 meses a 4ºC

Inactivación de levaduras , mantenimiento del sabor original del producto

Francia 1994

Zumos de cítricos Indirecto

400 MPa 1 minuto Tº ambiente

Botellas de PE de 75 cl y 1L

18 días a 4ºC Higienización sin alteración de sus propiedades sensoriales

Líbano

2001

Zumos de frutas Indirecto 500 MPa

Botellas de plástico 0,25, 0,5, 1 y 2L

Higienización sin alteración de sus propiedades sensoriales

México

2000

Zumos de citricos Indirecto 500 MPa

Botellas de plástico


USA

2001

Zumo de manzana orgánico

Directo y semicontinuo

Botellas de plástico

2 o 3 veces del zumo normal


Portugal 2001

Zumo de manzana y cítricos

Indirecto 450 MPa 20 a 90 segundos a 12ºC

Bolsas plásticas (225g)

28 días Higienización sin alteración de sus propiedades sensoriales

Italia 2001 Zumos de frutas: manzana, cítricos y zanahoria

Indirecto 600 MPa 3-5 minutos 17ºC

Bolsas plásticas 1 a 2 meses Higienización, aumento de vida útil

República Checa 2004

Zumo de brócoli y manzana

Indirecto 600 MPa 10 minutos

PET botellas 21 días Higienización sin alteración de sus propiedades sensoriales. Anticarcinógenos

Figura 3. 6. Zumos en el mercado tratados con APH. Fuente: CURSO DOCTORADO: PROCESADO

DE ALIMENTOS POR CALOR Y NUEVAS TECNOLOGÍAS: ALTAS PRESIONES

HIDROSTÁTICAS. Universidad de Talavera, 2006

50

3. 13. 3. Efecto de las Altas Presiones sobre los alimentos

3. 13. 3. 1 Agua

La presión modifica muchas propiedades del agua. El volumen de agua disminuye a un 4%

con 100 MPa y un 15% a 600 MPa a una temperatura de 22 ºC (Cheftel, 1992). Esta

disminución de volumen implica un aumento en la densidad y como consecuencia, los

coeficientes de difusión de los solutos disminuyen. La compresión adiabática del agua

causa un aumento de 2 a 3ºC por cada 100 MPa, aumento que depende de la temperatura

inicial del agua y de la velocidad de compresión. Este cambio es reversible cuando se

realiza la descompresión ya que se produce una disminución de la temperatura de la misma

magnitud (Cheftel y Culioli, 1997). El punto de fusión del agua disminuye con la presión,

de –5ºC a 70 MPa y –20ºC a 200 MPa. El pH del agua disminuye bajo presión de 7 a 6.27

cuando la presión aumenta de 0.1 MPa a 1000 MPa.

3. 13. 3 2. . Lípidos

La temperatura de fusión de los lípidos en especial de los triglicéridos, aumenta con la

presión de manera reversible en más de 10 ºC por cada 100 MPa. Por esta razón los lípidos

en estado líquido a temperatura ambiente pueden cristalizar bajo presión. La presión induce

la formación de cristales densos y más estables que tiene un nivel de baja energía y alta

temperatura de fusión. Esto puede explicar algunas de las causas de la destrucción de

microorganismos por la presión debido a los cambios en los fosfolípidos de la membrana

celular (Cheftel, 1995). El aumento de presión puede producir un aumento en la oxidación

de lípidos insaturados del alimento. Se ha observado que el tratamiento de Alta Presión en

alimentos con alto contenido proteico produce un aumento en la oxidación lipídica. Se cree

que el aumento de oxidación esta relacionado con la desnaturalización de las proteínas

causadas por la presión así en algunos casos libera iones metálicos que pueden catalizar la

oxidación lipídica (Beltran et al., 2003).

51

3. 13. 3. 4. Carbohidratos

Cheftel, 1992 asegura que los azúcares simples no resultan afectados por este tratamiento.

Las reacciones de Maillard son inhibidas por la aplicación de Alta presión entre 50 y 200

MPa (Sangonis et al., 1997). En consecuencia el color y sabor típicos de esta reacción no se

producen. La alta presión afecta el paso de sol a gel de los polisacáridos formándose geles

diferentes a los que se forman por calor.

3. 13. 3 .4. Proteínas

Las modificaciones de las proteínas se deben a modificaciones a nivel inter e

intramolecular entre grupos funcionales de los aminoácidos. Resultan efectos como el

aumento de las interacciones hidrofóbicas a presiones de 300 a 400 MPa, debido a la alta

compresibilidad del agua libre comparada con la de los puentes de hidrógeno. Por otra parte

los grupos sulfíhidrilo pueden oxidarse dando lugar a puentes disulfuro en presencia de

oxígeno (Funtenberger et al., 1995), aunque en muchos casos este tipo de enlace son los

responsables de mantener la estructura de algunos tipos de proteínas debido a su gran

estabilidad frente a la presión. En general la aplicación de presiones superiores a 100-200

MPa a temperatura ambiente provocan la disociación de macroestructuras en subunidades,

así como el despliegue y desnaturalización de estructuras monómericas, probablemente

debido al debilitamiento de las interacciones hidrofóbicas y la separación de los puentes

salinos intermoleculares e intramoleculares (Cheftel, 1992). La desnaturalización inducida

por la presión es a veces reversible, pero la renaturalización puede ocurrir después de que

se haya liberado la presión. Los efectos de la alta presión en la estabilidad proteica están

gobernados por el principio de Le Chatelier: los cambios positivo/negativos en el volumen

con un aumento en la presión provocan un desplazamiento del equilibrio hacia la

rotura/formación de enlaces. Aplicación de las altas presiones hidrostáticas en el procesado

de alimentos.

3. 13. 3. 5. Enzimas

La alta presión induce cambios en la velocidad de las reacciones que catalizan las enzimas

así como cambios estructurales. La función enzimática puede verse afectada de diferentes

52

maneras; la inactivación puede ser parcial o total dependiendo del tipo de enzima, del nivel

de presión, del tiempo y la temperatura o el pH del medio. Se ha sugerido que la eficiencia

de la alta presión en la inactivación de enzimas se puede aumentar mediante la aplicación

de ciclos de presión. Se trata de aplicaciones sucesivas de altas presiones produciendo una

mayor inactivación enzimática y una menor actividad residual que la obtenida después de

un proceso de presión continuo durante el mismo tiempo total del tratamiento (Basak et al.,,

2001). El trabajo realizado por Seyderhelm et al., 1996 sobre el efecto de la alta presión

sobre algunas enzimas en tampón fosfato, observaron que la sensibilidad a la presión en

orden ascendente fue: lipoxigeneas, lactoperoxidasa, pectiesterasa, lipasa, fosfatas, catalasa,

polifenoloxidasa y peroxidasa. El aumento en la temperatura indujo una mayor inactivación

de estas enzimas. La alta presión podría afectar la interacción sustrato enzima, sí el sustrato

es una macromolécula la alta presión podría modificar la conformación de la

macromolécula o la disociación en subunidades afectando su actividad (Balny y Masson,

1993).

3. 13. 3. 6. Vitaminas

El efecto de las altas presiones sobre la estabilidad de las vitaminas ha sido uno de los

estudios que más interés ha suscitado entre los diferentes autores que evalúan este proceso

en comparación a los tratamientos térmicos (Mertens, 1993; Kübel et al., 1997 y Taukis et

al., 1998). En una investigación desarrollada por Sancho et al., 1999 sobre el efecto de la

alta presión en vitaminas hidrosolubles B1, B6 y C diluidas en tampón fosfato a pH 6.67

mostraron que los tratamientos a 200, 400 y 600 MPa durante 30 minutos a 20ºC no

tuvieron ningún efecto significativo sobre las vitaminas B1 y B6, mientras que la vitamina

C fue afectada y mostró un 87.8% y 88.6% de retención después del tratamiento de 200 y

600MPa, respectivamente. En otro estudio sobre el efecto de las altas presiones sobre la

vitamina C en jugo de frutas ácidas se observó una ligera degradación de esta vitamina

después de un tratamiento a 600 MPa a 40ºC durante 40 minutos la cual fue del orden del

15 al 26% (Taukis et al., 1998).

53

3. 13. 4. Aplicaciones en jugos de frutas y/o vegetales

Gran número de investigaciones muestran que es posible estabilizar productos ácidos como

jugos de frutas y derivados del tomate a partir de 300 MPa a temperatura ambiente

(Castellari et al., 2000).

Las bebidas de vegetales tradicionales en países mediterráneos como España se demoninan

“Gazpachos” y son una especie de sopas que se sirven frías. Tienen como ingredientes gran

variedad de hortalizas, que contienen gran número de vitaminas, compuestos antioxidantes,

son fuente de fibra vegetal o dietética soluble que se encuentra principalmente en los

vegetales e incluye también gomas, pectinas, mucílagos, algunos tipos de hemicelulosa y

carbohidratos de reserva (Bellaterra, 2004). Los gazpachos poseen un alto contenido en

minerales y glúcidos así como una serie de sustancias de interés fisiológico como los

compuestos fenólicos presentes en hortalizas que en muchos casos contribuyen al sabor y

color que estos poseen. Los compuestos fenólicos presentes en las plantas poseen acciones

farmacológicas y antioxidantes tal como se demuestra al inhibir en ensayos in Vitro la

peroxidación de los lípidos y lipoxigenasas (Bellaterra, 2004)

3. 14. MODELOS CINÉTICOS DE INACTIVACIÓN Y CRECIMIENTO

MICROBIANO.

Habitualmente, para el estudio de la resistencia microbiana a distintos agentes letales se

utilizan las denominadas curvas de supervivencia en las que se representa el logaritmo

decimal del número de supervivientes frente al tiempo de tratamiento. Estas gráficas se

suelen describir mediante distintos modelos matemáticos a partir de los cuales se obtienen

diferentes parámetros que permiten cuantificar y predecir la resistencia bacteriana.

La obtención de modelos y parámetros cinéticos son básicos para el desarrollo de nuevos

procesos de conservación de alimentos. Su aplicación directa en la industria se aprovecha

para optimizar procesos y mejorar la seguridad microbiológica de los alimentos, así como

para implementar planes de análisis de peligros y puntos de control críticos (APPCC)

54

también permite realizar estimaciones cuantitativas, considerando la acción simultánea de

diversos factores limitantes extrínsecos e intrínsecos; lo cual implica una gran ventaja, en

tiempo y costo, comparado a los métodos utilizados tradicionalmente en microbiología de

alimentos

Las técnicas de modelación matemática están siendo gradualmente aceptadas y reconocidas

para estimar la vida útil y seguridad en muchos productos alimentarios. El desarrollo

Muchos modelos de crecimiento para patógenos han sido reportados en la literatura desde

la pasada década e incluyen modelos para Aeromonas hydrophila, Clostridium botulinum,

Listeria monocytogenes, Salmonella spp, Shigella flexneri, Staphylococcus aureus y

Yersinia enterocolitica. No obstante no existen muchos informes para bacterias

esporoformadoras (Meng y Schaffner, 1997).

El conjunto de estos modelos y simulaciones en microbiología creció al punto de ser

reconocida como una disciplina de la microbiología de alimentos, denominada

“microbiología predictiva”, concepto introducido por McMeekin et al., 1993.

3. 14. 1. Modelos matemáticos de inactivación

Una gran parte de las investigaciones en inactivación microbiana se refieren a tratamiento

térmico y varios autores como Vijay & Eblen (1999), desarrollaron modelos matemáticos

que describen el efecto del pH y la temperatura en tratamientos térmicos, tomando como

parámetros D que es el tiempo de reducción decimal definido como el tiempo requerido

para reducir un ciclo logarítmico la concentración de microorganismos sumiendo una

relación lineal y logarítmica entre el número de microorganismos sobrevivientes y el

tiempo, después de un tratamiento térmico. Sin embargo no siempre se puede asumir esta

relación lineal por la presencia de colas y hombros en la curva de sobrevivientes. Por lo

tanto se pueden utilizar modelos matemáticos de distribución probabilística (Fernández,

2002)

3. 14. 1. 1. Modelo de Bigelow

Los modelos cinéticos clásicos asumen una relación de primer orden entre la población

microbiana y la intensidad de tratamiento. El modelo desarrollado por Bigelow, Ball y

55

Stumbo (Stumbo, 1973) (Ecuación 1) se ha usado principalmente para explicar las curvas

de supervivencia debidas al tratamiento térmico:

Log S = Dt−

Ecuación 1

donde S es la fracción de supervivientes calculada como la fracción entre el número de

microorganismos vivos tras un tratamiento especifico y el numero inicial de

microorganismos; D es el tiempo de reducción decimal definido como el tiempo requerido

para reducir un ciclo logarítmico la concentración de microorganismos (figura 7) y t es el

tiempo de tratamiento (en segundos). El valor de D o tiempo de reducción decimal se

calcula a partir de la pendiente de la recta.

Figura 3. 7. Ejemplo de curva de supervivencia de esporas de B. stearothermophilus a

temperatura constante (115 ºC).

3. 14. 1. 2. Modelo de Weibull

La distribución de Weibull se ha aplicado en la industria mecánica para inquirir el tiempo

de fallo de un determinado componente. Este modelo consiste en una distribución de

frecuencias que considera al microorganismo como una población, donde cada individuo

56

tiene una resistencia al tratamiento, por lo tanto las curvas de inactivación representan la

distribución de la resistencia del conjunto de la población al tratamiento. Bajo esta

perspectiva es más fácil explicar que no exista una relación lineal entre el tiempo de

tratamiento y la muerte del microorganismo. Aparte de su sencillez, puede interpretar

curvas con hombros y colas, y líneas rectas.

( )

−=

n

attS exp

Ecuación 2

Donde S es la fracción de supervivientes, t es el tiempo de tratamiento expresado en µs, a

es el parámetro de escala expresado en µs relacionado con la intensidad del tratamiento y n

es el parámetro de forma, cuyo valor depende de la forma de la curva de supervivencia.

Cuando el valor de n<1 las curvas de supervivencia presentan colas, es decir, la fracción

residual de células que quedan por inactivar tienen menos probabilidades de morir, son las

mas resistentes o las que mejor se han adaptado al estrés producido por los tratamientos.

Cuando el valor de n>1, las curvas de supervivencia presentan hombros indicando que

durante las primeras condiciones del tratamiento las células son resistentes al tratamiento y

conforme aumentamos la intensidad del tratamiento se produce un aumento de la

inactivación. En el caso que el valor de n sea igual a 1 la probabilidad que el

microorganismo muera no depende del tiempo de tratamiento, en otras palabras, cada célula

es igual de sensible al tratamiento sin importar lo que dure el mismo.

Otro de los parámetros utilizados en el modelo de Weibull es el tiempo crítico que se puede

definir como el tiempo donde se produce la mayor muerte del microorganismo tras el

tratamiento y se puede expresar con la siguiente ecuación:

)1(* 1−+Γ= batcw Ecuación 3

Donde a y b son los parámetros de la ecuación 1.3 y Γ es la función gamma.

57

3. 14. 2. Modelos matemáticos de crecimiento

3. 14. 2. 1. Modelo de Baranyi

El modelo de Baranyi fue desarrollado originalmente para curvas de crecimiento

microbiano (Baranyi et al.1993; Baranyi et al. 1994), sin embargo Xiong et al. 1999

adaptaron el modelo a las curvas de supervivencia, obteniendo la siguiente ecuación:

))1(log(log ))((

0

max tBtkBB eqq

NN −−−+=

Ecuación 4

Siendo,

)3

1arctan33

2arctan3)(ln21(

3)( 22

2

+−++−

+=r

rttrtr

trrtB Ecuación 5

Este modelo se adapta bien a curvas de supervivencia sigmoidales, donde qB puede ser

usado como indicador de la existencia de colas en las curvas de supervivencia. El

parámetro kmax es el índice de muerte máximo y puede ser considerado como una constante

en la fase lineal de la curva de supervivencia. B(t) es una función que explica la fase lag

(hombro) de la curva y viene definida por el parámetro r.

Este modelo también se adapta a curvas de supervivencia no sigmoidales. En caso de la no

existencia de colas en las curvas (qB=0), la Ecuación 1.5 se transformaría en:

min0

)()log(D

tBtNN −−=

Ecuación 6

Donde Dmin=2.303/kmax., siendo Dmin el tiempo de reducción decimal. Como kmax se puede

considerar como una aproximación del índice de muerte para la fase lineal de la curva, Dmin

se define como el tiempo mínimo requerido para disminuir un ciclo logarítmico la

población de microorganismos a una temperatura de referencia. En caso de no presentar la

58

curva fase de latencia, entonces el modelo se puede simplificar a un modelo cinético lineal

de primer orden:

Dt

NN −=)log(

0 Ecuación 7

Donde D es el tiempo de reducción decimal. Definido como el tiempo requerido para

reducir un ciclo logarítmico la concentración de microorganismos.

3. 14. 2. 2. Modelo de Gompertz

El modelado matemático es realizado, generalmente, asumiendo condiciones constantes

para determinar los valores de los parámetros cinéticos de crecimiento. Sin embargo,

condiciones tales como temperatura, pH o composición de la atmósfera gaseosa no se

mantienen constantes durante el almacenamiento refrigerado de los alimento. Debido a este

hecho, en la actualidad el modelado matemático está orientado a la obtención de modelos

dinámicos, es decir, modelos que permitan predecir la seguridad o vida útil de los alimentos

bajo condiciones fluctuantes. En microbiología predictiva se distinguen tres niveles entre

los modelos matemáticos: los modelos de nivel primario describen los cambios en el

número de microorganismos en el tiempo; los de nivel secundario brindan datos acerca del

efecto de las condiciones ambientales y los modelos de nivel terciario combinan los dos

primeros (Whitin, 1995)

Modelo de Gompertz: es considerado como un modelo primario esta definido por la

siguiente ecuación

log(Nt) = Log(N0) + C . e -e[-B(t-M)] Ecuación 8

Donde: t es el tiempo en horas, Nt y N0 son la densidad de población expresada como UFC/

ml, a tiempo final e inicial respectivamente, C es el logaritmo de la población que cambia

desde la inecuación hasta la fase estacionaria, B es la tasa de crecimiento relativo la cual es

adimensional, M es el tiempo en horas en el cual se alcanza la máxima tasa de crecimiento.

59

Las ecuaciones de cinética de crecimiento en este modelos se pueden determinar mediante

dos parámetros la µ (velocidad específica de crecimiento) y λ (factor de latencia).

60

4. MATERIALES Y MÉTODOS

4. 1. Esporulación del microorganismo

Para inducir la esporulación de B cereus se tomaron dos matraces de 50ml que contendrán

20ml de caldo nutritivo para inocular con colonias de B cereus. Se incubaron en un baño

termostatado a 32ºC con agitación durante 24 horas al cabo de las cuales se observarán

colonias características de B. cereus. (Barbosa y col., 1998)

La cepa de B cereus utilizada fue la ATCC 14579 proveniente de la Colección Española de

Cultivos Tipo. La esporas se obtuvieron usando el medio de esporulación descrito por

Mazas y col (1995), ligeramente modificado en su composición: Caldo nutritivo(g/L) de

acuerdo con la British Pharmacopoeia (Scharlau Chemie), 13 g: agar bacteriológico

(Scharlau Chemie) 0.05g; CaCl2 (Panreac, Montplet and Esteban) 0.06 g; glucosa (Panreac,

Monplet and Esteban) 0.1 g; (NH4)2S (Merck) 0.08 g; MnCl2 4H2O (Merck) 0.008 g;

CuSO45H2O (Panreac, Montplet & Esteban) 0.005 g y ZnSO47H2O (Panreac, Montplet &

Esteban) 0.005g y se distribuirá en frascos Roux esterilizándose durante 20 minutos a

121ºC.

Se utilizaron aproximadamente 20 frascos Roux con 0,5 ml del cultivo de células

vegetativas de B cereus. La suspensión de microorganismos se extenderá con un asa de

vidrio estéril. Posteriormente los frascos Roux se incubaran en una estufa a 30 ºC durante

24 horas (Delgado, 2005).

A partir de las 48 horas se realizaron tinciones diarias para controlar la esporulación.

Cuando la tasa de esporulación sea aproximadamente del 90% se procedió a recoger las

esporas. Para ello la superficie de agar se lavó con una mínima cantidad de agua estéril y se

rasparon cuidadosamente con un asa estéril. El agua con las esporas se depositó en frascos

de centrifuga de 250 ml esterilizados, centrifugándose posteriormente en una centrifuga

Beckman J2-21 a 2500 g durante 15 minutos a una temperatura de 5 ºC, se eliminó el

sobrenadante, se resuspendío el sedimento en agua destilada y se volverá a centrifugar en

las mismas condiciones (Larsen, 1999)

61

Las esporas limpias se almacenaron a 4 ºC en agua destilada estéril hasta su uso. Con este

procedimiento se alcanzó una concentración de 10 8 esporas por ml. (Delgado, 2005)

4. 2. Recuento de Bacillus cereus

Para determinar el número de microorganismos sobrevivientes se hicieron diluciones

seriadas, se sembró en agar BHI (profundidad) 100 µl de las diluciones 10-3 hasta 10-7 las

siembras se hicieron cada 24 horas, se incubaron a 32 ºC y todos los ensayos fueron

realizados por duplicado, teniendo en cuanta solo los recuentos que se encontraran en el

rango del microorganismo (30-300 UFC/ml). La misma técnica fue utilizada en todos los

ensayos de este estudio. Figura 4.1

Figura 4.1 Dilución y siembra de las muestras tratadas (IATA., 2006)

4. 3. Ingrediente utilizado como antimicrobiano

Se utilizará un ingrediente comercial a base de polvo de aceitunas denominado Olive

Powder comercializado por la multinacional Natraceutical S.A., España. Este aditivo fue

almacenado se mantuvo almacenado a temperatura ambiente a lo largo del estudio.

62

4. 4. Preparación del medio de referencia:

Como medio de cultivo de referencia se utilizará BHIB (caldo de infusión cerebro corazón).

Se prepararon frascos con un contenido de 30 ml de caldo BHIB (1.1 g x 30ml de agua)

para los controles del experimento. Frascos con 30 ml de caldo BHI a los que se les

agregarán diferentes concentraciones de polvo de aceituna: 1,5% (0.45 g/30ml de caldo

BHIB), 2.5% (0,75 g/30ml de caldo BHI), 5% (1,5 g/30ml de caldo BHI) y 10% (3g/30ml

de caldo BHI).

4. 5. Efecto del polvo de aceitunas sobre el crecimiento de B cereus en función del

tiempo en medio de referencia

Se estudió el comportamiento de las esporas de B cereus en medio de referencia (caldo

BHI) en presencia de diferentes concentraciones de polvo de aceitunas 0, 1,5, 2,5 y 5%. Se

evaluó el crecimiento del microorganismo a tres temperaturas diferentes de

almacenamiento 7, 20 y 32 ºC. La temperatura de 7 ºC se utilizó como temperatura

promedio de refrigeración para observa la influencia del polvo de aceitunas sobre las

esporas de B cereus. La temperatura de 20 ºC fue una manera de simular una interrupción

en un sistema de almacenamiento en refrigeración y 32 ºC es una temperatura muy cercana

a la temperatura óptima de crecimiento de B cereus. El crecimiento del microorganismo en

estas condiciones se siguió en el tiempo hasta 30 horas, tomándose muestras en los

intervalos de tiempo 0, 1, 2, 3, 6, 10, 24, 27 y 30 horas, el recuento de Bacillus cereus se

realizo según la metodología descrita anteriormente.

4. 6. Preparación de la bebida vegetal

Para preparar la bebida de vegetales se utilizaron 2 kilogramos de zanahorias frescas y 2

kilogramos de judías verdes frescas embolsadas adquiridas en un mercado local. Se lavaron

y picaron por separado, posteriormente se escaldaron a 90ºC durante tres minutos. El

proceso de escaldado tuvo como propósito inactivar enzimas y eliminar la flora

acompañante natural que esta presente en los vegetales. Tras el escaldado se pasaron por un

triturador de alimentos (Moulinex, Barcelona, España) tres veces con el fin de extraer la

mayor cantidad de zumo en volumen. La bebida obtenida se pasó por tres veces por un

63

tamiz. Finalmente se mezclo el zumo de judías verdes y el de zanahoria en una proporción

50:50 sin agregar agua. Se midió pH inicial. La bebida mezcla de vegetales resultantes se

distribuyó en tubos Falcon de 50ml que pasaron a congelación a 4º C para posteriores

ensayos.

4. 7. Efecto del polvo de aceitunas en el crecimiento de Bacillus cereus en sustrato

vegetal

Se estudió el efecto del polvo de aceitunas a distintas concentraciones (0, 1.5 y 2,5%) en el

sustrato vegetal sobre el crecimiento de B. cereus, se evaluaron solamente dos

temperaturas de almacenamiento 20 y 32 ºC. Se utilizaron controles negativos con bebida y

sin ingrediente (polvo de aceitunas) se utilizaron frascos de 50 ml con perlas de vidrio (dos

por cada concentración de polvo de aceitunas se colocaron 2 ml de bebida de vegetales para

los controles y 2ml más con polvo de olivas), se inocularon con 10µl de la suspensión de

esporas refrigerada directamente a los frascos 10 µl de suspensión de esporas previamente

agitada, se procederá a agitar durante dos minutos y se tomarán 100µl que fueron

transferidos a viales con 900 µl de agua peptonada y se realizarán diluciones seriadas con

un factor de dilución de 1:10 (de 10 -2 a 10-7), se sembrarán las diluciones de 10-3 hasta 10-7.

El crecimiento del microorganismo se siguió en el tiempo hasta las 72 horas y se tomaron

muestras en las horas 0, 6, 24, 30, 48, 55 y 72. Para la realización de los recuentos se siguió

la metodología descrita previamente.

4. 8. Preparación de los viales para el tratamiento a Altas Presiones Hidrostáticas

Previo a cada experiencia, la bebida mezcla de vegetales fue descongelada e

inmediatamente esterilizada a 121 ºC por 21 minutos, permitiendo climatizarse a

temperatura ambiente. Treinta minutos antes de los tratamientos con APH, las suspensiones

de esporas fueron sacadas del refrigerador y se agitaron durante dos minutos. Se tomaron

dos viales (tubos Ependorf de 2ml) para cada tratamiento y control, así: dos viales para

tratamiento a altas presiones APH con caldo BHI sin polvo de aceitunas, dos para

tratamiento a APH con caldo BHI y polvo de aceitunas (2 por cada concentración), dos

viales de control con caldo BHI sin polvo de aceitunas y dos más con BHI. Se utilizarán

tubos capilares de vidrio 10 µl para inocular en los eppendorf con 10 µl de la suspensión de

64

esporas refrigeradas a los eppendorf que contenían los 10 µl de esporas de B. cereus se les

adicionaron 1.8 µl de caldo BHI en el caso de los controles y 1.8 µl de caldo BHI con polvo

de aceitunas en el resto de los eppendorf. Una vez preparados los viales se colocaron en

bolsas de polieteileno llenas de agua y se termosellaron (Thermosealer MULTIVAC) antes

de ser introducidas al equipo de APH.

4. 9. Tratamiento a Altas Presiones Hidrostáticas APH

La unidad de Altas presiones hidrostáticas utilizada para este estudio fue High Pressure

Food Processor EPSI NV, Walgoedstraat 19, Temse, Belgium (figura 4. 2) Este equipo

alcanza presiones nominales de hasta 680 MPa con 2,35 litros de capacidad. La vasija

contenedora de la presión hidrostática (diámetro interno de 100 mm y altura de 300 mm)

está rodeada de una doble cámara por la que fluye el líquido refrigerante y que la mantiene

a la temperatura de trabajo deseada, para este estudio la temperatura de tratamiento en

todos los ensayos fue de 20 ºC (baño termostatado externo). El líquido de presurización es

una mezcla de agua y glicol. El nivel de presión, el tiempo de presurización y la

temperatura son controlados automáticamente. La velocidad del incremento de la presión es

de 300 MPa/min y el tiempo de despresurización es menor a 1 min. El tiempo de

tratamiento descrito en este estudio no incluye los tiempos de subida y bajada. Se utilizaron

presiones de 200, 400 y 500 MPa, tiempos de tratamiento de 10 minutos para el medio de

referencia y la bebida vegetal, 25 minutos solamente para la bebida de vegetales y para las

concentraciones de polvo de aceitunas (0, 1,5 y 2,5%)

65

Figura 4. 2. Unidad de Altas Presiones Hidrostáticas. Fuente: Instituto de

Agroquímica y Tecnología de Alimentos (IATA). Valencia

4. 10. Efecto de las Altas Presiones y el polvo de aceitunas en la inactivación de

Bacillus cereus en medio de referencia

Para esta parte del estudio se utilizaron presiones de 200, 400 y 500 MPa con un tiempo de

tratamiento de 10 minutos. Se tomaron 12 viales de 2ml y se inocularon con 10µL de

suspensión de esporas de B. cereus. De estos viales 8 fueron tratados con APH, 4 viales

para la concentración 1.5% y 4 para la de 2.5% los 4 viales restantes fueron utilizados como

controles, La toma de muestra se tomó únicamente tras 24 horas después de los

tratamientos.

66

4. 11. Efecto de las Altas Presiones y el polvo de aceitunas en la inactivación de

Bacillus cereus en la bebida vegetal

Para evaluar el efecto de las APH y del polvo de aceitunas se utilizaron presiones de 200,

400 y 500 MPa con un tiempos de tratamiento de 10 minutos para las presiones 200, 400 y

500MPa con concentraciones de polvo de aceituna (0,1,5 y 2,5%), por otra parte se ensayó

un tiempo de tratamiento más largo de 25 minutos pero solo con las presiones de 200 y

400MPa, ya que 500MPa con 25 minutos de tratamiento conducen a una sobrecarga de

presión en la máquina de APH. La toma de muestras se tomó únicamente tras 24 horas

después de los tratamientos.

4. 12. Modelización

Para este experimento se definieron tres variables independientes: Concentración de polvo

de aceitunas (0, 1,5, 2,5, 5%), presión (200, 400y 500 MPa) y temperatura de

almacenamiento (20 y 30 ºC) las variables de respuesta para el caso del efecto del polvo de

aceitunas en el medio de referencia en la cinética de crecimiento fueron velocidad máxima

específica de crecimiento µmax y Factor Lag (Factor de latencia) simbolizado con la letra λ.

Todos lo experimentos se realizaron por duplicado.

4. 12. 1. Desarrollo del modelo: los recuentos en palca fueron transformados a valores de

Log10 y la curva de crecimiento fue determinada mediante la prueba de Gompertz

(Zwietering et al., 1990) mediante el software GraphPad prisma 4.0. La ecuación de

Gompertz modificada definida como:

Ecuación 1

67

Donde:

Y0, es el logaritmo del número inicial de células

Y max, es el logaritmo del número final de células

µ max, es la tasa máxima específica de crecimiento

λ, es el factor de latencia

t, tiempo

4. 13. Análisis estadístico

Los estudios estadísticos se realizaron utilizando el software Statgraphics plus XV. Para

determinar el efecto de la concentración de polvo de aceitunas, la presión de tratamiento y

la temperatura de almacenamiento, se realizó un análisis de la varianza por ANOVA

factorial. En los casos en que los efectos fueron significativos, se aplicó el estudio de las

menores diferencias significativas de Fisher (LSD) (P<0.05).

68

5. DISCUSIÓN DE RESULTADOS

5. 1. Efecto del polvo de aceituna en medio de referencia BHI y bebida vegetal

Se estudió el efecto de diferentes concentraciones de polvo de aceitunas (0, 1,5, 2,5 y 5%)

en el crecimiento y supervivencia de B. cereus incubado a 7, 20 y 32 ºC. La figura 5.1

muestra las curvas de crecimiento de B. cereus a las diferentes temperaturas de estudio en

presencia de 2,5% de polvo de aceitunas, concentración recomendada por los fabricantes.

El polvo de aceitunas mostró un efecto bacteriostático, ya que tras 24 horas de

almacenamiento el crecimiento fue menor en las muestras con polvo de aceitunas, que en

aquellas que no contenían dicho ingrediente, para todas las temperaturas y concentraciones

(tabla 5.1). En general se observó un mayor crecimiento a 32 ºC que a 20 y 7 ºC para todas

las concentraciones de polvo de aceitunas debido a que esta temperatura es muy cercana a

la óptima del microorganismo. Del mismo modo, a todas las temperaturas se observó un

menor crecimiento con el tiempo de incubación al aumentar la concentración de polvo de

aceitunas, si bien las diferencia observadas fueron mayores a la temperatura más baja. 7ºC,

es una temperatura tan baja que apenas hubo crecimiento de B.cereus, sin embargo la

reducción microbiana fue mayor que en las muestras que contenían el polvo de aceitunas.

Esto indica que aunque la temperatura fue muy baja el polvo de aceitunas tuvo un efecto de

control lo cual tiene relevancia en los procesos de conservación de alimentos en

refrigeración. Estos resultados concuerdan con los observados por Tassou et al., (1991)

quienes observaron una inhibición de la germinación y crecimiento de esporas de B. cereus

en presencia de oleuropeina y otros compuestos fenólicos extraídos de la aceituna.

69

012345678

0 10 20 30 40 50 60

tiempo (h)

Log

N (U

FC/m

l)

7ºC 20ºC 32ºC

Figura 6. 1. Ejemplo de curvas de crecimiento al 2.5 % de polvo de aceituna a las

diferentes temperaturas estudiadas

Tabla 6.1. Valores medios y desviación estándar de la población de B. cereus (Log N

(UFC/ml)) en medio de referencia a diferentes temperaturas y concentraciones de

polvo de aceitunas tras 24 horas de almacenamiento

Concentración polvo de aceitunas (%)

T (ºC) 0 1.5 2.5 5

32 8,20 a2 ± 0,01 8,20 a1 ± 0,04 8,12 ab1 ± 0,05 8,02 b1 ± 0,07

20 8,72 a1 ± 0,04 7,80 b1 ± 0,04 7,48 c2 ± 0,02 6.0 d2 ± 0,3

7 5,8 a3 ± 0,1 4,7 d2 ± 0,4 5,13 b3 ± 0,04 4,83 bc3 ± 0,05

1-3: valores con diferente número indican diferencias significativas entre temperaturas de

almacenamiento a la misma concentración.

a-d: valores con letras diferentes indican diferencias significativas entre concentraciones a la

misma temperatura

Posteriormente se modelizó el crecimiento y la cinética de inactivación de B. cereus en

presencia de polvo de aceitunas, los datos experimentales fueron ajustados a la ecuación de

70

Gompertz modificada (ecuación 1) descrita en materiales y métodos, utilizando el programa

estadístico Statgraphics plus XV.

La ecuación de Gompertz ha sido utilizada en diversas investigaciones para diferentes

microorganismos (McKellar y Lu, 2004). Chorin y et al., (1997) utilizaron este modelo

para describir el crecimiento de B. cereus en caldo BHI.

La tabla 6. 2 muestra los valores medios y la desviación estándar para la velocidad

específica de crecimiento μmax y la fase de latencia λ. En el caso de µmax, el análisis ANOVA

indicó diferencias significativas (p<0.05) con un intervalo de confianza del 95% entre los

valores de µmax a las distintas temperaturas para cada concentración de polvo de aceitunas,

excepto en el control, donde no se añadió polvo de aceitunas. A 32 ºC el análisis ANOVA

indicó que no hubo diferencias significativas entre las concentraciones, excepto al 1,5 y

2,5% de polvo de aceituna. A 20 ºC, el análisis indicó diferencias significativas (p<0.05)

entre todas las concentraciones excepto entre 1,5 y 2,5%. De acuerdo con estos resultados,

la concentración de polvo de aceitunas no afecta a la velocidad de crecimiento del B.

cereus a la temperatura óptima de crecimiento (32 ºC) utilizada en este estudio. Sin

embargo, a 20 ºC, que puede ser considerada como una temperatura de rotura de la cadena

de frío, se observó una disminución del valor µmax al aumentar la concentración del

ingrediente comparado con el control, al que no se le añadió el ingrediente.

Respecto a los valores medios y la desviación estándar para el factor de latencia (λ, tabla 6.

2), el análisis de la varianza para las distintas condiciones del estudio indicó que hubo

diferencias significativas entre 0 y 1,5% de polvo de aceitunas a 32 y a 20 ºC. En general, al

aumentar la concentración de polvo de aceitunas aumentó el factor de latencia. La fase de

latencia es el periodo durante el cual las células se modifican para poder iniciar el

crecimiento exponencial. Desde el punto de la vista de la seguridad alimentaria, ese

aumento en la fase de latencia es importante por ejemplo en caso de que se interrumpa la

cadena de frío, ya que las fluctuaciones de temperatura son un factor importante en la

conservación de los alimentos. Una manera de simular una interrupción de la cadena de

frío, por ejemplo en muchos lugares de Colombia la temperatura ambiente sobrepasa los 20

ºC, o bien no se utilizan condiciones de almacenamiento a bajas temperaturas, de esta

71

manera la presencia de polvo de aceitunas permitiría mantener la población de B.cereus en

niveles considerados seguros, en caso de condiciones inadecuadas. Es razonable decir que a

temperaturas desde 8 hasta 12 ºC el comportamiento de B.cereus en presencia de polvo de

aceitunas es similar a temperaturas de almacenamiento mayores. Medidas en la temperatura

de refrigeradores de uso doméstico en Europa, muestran que los alimentos son almacenados

a temperaturas no adecuadas (≥9 ºC) (Sergelidis et al., 1997; Bakalis et al., 2004). Estas

determinaciones de la temperatura sugieren la necesidad de aplicar barreras como la adición

de ingredientes con propiedades bacteriostáticas o bactericidas en alimentos que requieren

refrigeración.

Tabla 6. 2. Valores medios y de desviación estándar para la tasa máxima de

crecimiento (µmax) y la fase de latencia (λ) a diferentes condiciones de estudio en medio

de referencia

Tasa máxima de crecimiento

específico (µmax)

Fase de Latencia (λ)

Temperatura Temperatura

32ºC 20ºC 32ºC 20ºC

0 0.56 ab ± 0.08 0.50 a ± 0.03 1.5 c2 ± 0.1 5.8 c1 ± 0.7

1.5 0.473 b1 ± 0.006 0.183 c2 ± 0.006 1.6 c2 ± 0.2 5.9 c1 ± 0.2

2.5 0.59 a1 ± 0.08 0.133 c2 ± 0.006 3.5 b2 ± 0.2 8.3 b1 ± 0.6

5 0.55 ab1 ± 0.04 0.28 b2 ± 0.09 9.5 a2 ± 0.7 21.05a1 ± 2.4

1-3: valores con diferente número indican diferencias significativas entre temperaturas de almacenamiento a la misma concentración.

a-d: valores con letras diferentes indican diferencias significativas entre concentraciones a la misma temperatura

El efecto bacteriostático del polvo de aceitunas se observó también en la bebida de

vegetales, respecto a la concentración 2,5 % de polvo de aceitunas se encontró un efecto de

72

control sobre el crecimiento de B. cereus desde la hora 6 hasta la hora 54 para las dos

temperaturas de almacenamiento (figura 2 y 3) La causa probable del incremento de la

concentración de microorganismos es la recuperación de algunas células que sufrieron daño

por parte del polvo de aceitunas y que la temperatura de 32 ºC es cercana a la temperatura

óptima de B. cereus. Por otra parte la concentración de 1.5% mostró también un efecto de

control sobre B. cereus a 20 ºC de almacenamiento (figura 4). En la figura 5 se observa una

diferencia con respecto al control a 32 ºC el comportamiento de B. cereus fue diferente en

presencia de 1,5 % de polvo de aceitunas, la curva correspondiente al polvo de aceitunas

creció más que el control, esto debido probablemente a que 32 ºC es una temperatura muy

cercana a la óptima al microorganismo, o bien que 1,5% de polvo de aceituna no es

suficiente para disminuir el número de microorganismos a una temperatura de abuso

extremo en materia de almacenamiento como lo son 32 ºC.

0

1

2

3

4

5

6

7

8

0 10 20 30 40 50 60

tiempo (h)

Log

N (U

FC/m

l)

sin polvo de aceitunas 2,5% polvo de aceituna

Figura 6. 2. Ejemplo de curva de crecimiento de B. cereus log N (UFC/ml) en la bebida vegetal sin polvo de aceitunas y con una concentración del 2,5% almacenado a una temperatura de 20 ºC.

73

0

1

2

3

4

5

6

7

8

0 20 40 60 80

tiempo (h)

Log

N (U

FC/m

l)

sin polvo de aceitunas 2,5% polvo de aceituna


6,26,36,46,56,66,76,86,97,07,17,2

0 10 20 30 40 50 60

tiempo (h)

Log

N (U

FC/m

l)

sin polvo de aceituna 1,5%polvo de aceituna


74

0,01,02,03,04,05,06,07,08,09,0

0 10 20 30 40 50 60

tiempo (h)

Log

N (U

FC/m

l)

sin polvo de aceituna 1,5% polvo de aceituna

Figura 6. 5. Curva de crecimiento de fracción de B.cereus Log N (UFC/ml), comparando con el control en presencia de 2.5% de polvo de aceituna a 32 ºC de almacenamiento.

Los resultados del análisis ANOVA (Tabla 3) muestran que existen diferencias

significativas (p<0.05) con un intervalo de confianza del 95% entre las concentraciones de

polvo de aceitunas de 0, 1,5 y 2,5%, no obstante no hay diferencias significativas entre las

temperaturas de almacenamiento 20 y 32 ºC. Los recuentos correspondientes a la

temperatura 20 ºC en presencia de 1,5% de polvo de aceituna muestran una desviación

estándar mayor que en los demás experimentos pero aún así se aprecia un efecto de control

bajo estas condiciones.

75

Tabla 6. 3. Valores medios y desviación estándar de logaritmo de la fracción de

recuentos de B. cereus después de 24 horas de almacenamiento a diferentes

condiciones de estudio en sustrato vegetal

Temperatura de almacenamiento

% Polvo de aceitunas 20ºC 32ºC

0 7.389ª1± 0,020 6,730ª1 ± 0,098

1.5 6.519b1± 0,051 6,568b1 ± 0,126

2.5 6.441c1 ± 0.069 4.852c1 ± 0.057

1-3: valores con diferentes números indican diferencias significativas entre temperaturas de

almacenamiento a la misma concentración.

a-d: valores con letras diferentes indican diferencias significativas entre concentraciones a la

misma temperatura.

Las propiedades antimicrobianas de extractos de olivas han sido investigadas, Serra y col

(2008) reportan que el contenido de polifenoles: quercetina, hidroxitirosal y oleuropeina

tienen efecto antimicrobiano frente a B. cereus, otras dos especies de bacterias como E.

coli, S. ponna y dos especies de levaduras S. cerevisiae y C. albicans. Una concentración de

500 mg/L de oleuropeina pueden inhibir considerablemente a B. cereus.

Otras investigaciones como la de Pereira et al (2007) utilizaron el extracto de olivas para

evaluar su actividad antimicrobiana. La capacidad antimicrobiana de los compuesto

fenólicos es conocida, pero la de los extractos pueden ser mas benéficos que los

constituyentes aislados se habla entonces de un efecto sinérgico de sustancias fitoquímicas

en frutas y vegetales es responsable de las propiedades bioactivas, lo cual explica porque un

solo antimicrobiano no puede inhibir o controlar diferentes microorganismos.

76

5. 2. Efecto de las Altas Presiones Hidrostáticas en medio de referencia y bebida

vegetal

Se estudió el efecto del tratamiento por APH sobre las esporas de B. cereus. Los resultados

obtenidos muestran que las presiones estudiadas no tienen un efecto significativo en cuanto

a la reducción del número de esporas presentes en la muestra y por tanto en la población de

microorganismos viables. Las figura 6,6, 6,7 y 6,8 muestra el efecto de las APH solas

sobre el número de microorganismos

0,00

0,20

0,40

0,60

0,80

1,00

1,20

1,40

200 400 500

Presión (MPa)

N/N

0

MR BV

Figura 6. 6. Comparación del logaritmo de recuento de B. cereus entre medio de

referencia bebida de vegetales a diferentes presiones sin polvo de aceitunas

200 MPa

0,00

0,10

0,20

0,30

0,40

0,50

0,60

0,70

0,80

0,90

1,00

0 1,5 2,5

COP (%)

N/N

0

MR BV

77


referencia y bebida vegetal a diferentes presiones en presencia de polvo de aceitunas

a 200 MPa

500 MPa

0,00

0,20

0,40

0,60

0,80

1,00

1,20

1,40

0 1,5 2,5

polvo de aceituna (%)

N/N

0

MR BV


referencia y bebida vegetal a diferentes presiones en presencia de polvo de aceitunas

a 500 MPa

En la tabla 6. 4 se resume el efecto de las altas presiones y la concentración de polvo de

aceituna sobre la población de B. cereus en los diferentes sustratos, medio de referencia y

bebida vegetal. En general, tanto en el medio de referencia como en la bebida vegetal, se

observan diferencias significativas (Anexos 9.1 y 9.2) debidas a la concentración de polvo

de aceituna (p<0,01) que indican una mayor supervivencia de las esporas a mayores

concentraciones de polvo de aceituna. En cuanto al efecto de la presión, también es

significativo (p<0,001) en ambos sustratos, observándose generalmente una menor

inactivación de las esporas de B. cereus a la presión de 400 MPa. Sin embargo, debido al

efecto de la interacción entre presión y concentración de polvo de aceituna (p<0,001) estos

78

efectos no se observan con claridad en todas las combinaciones de presión y polvo de

aceituna

Tabla 6. 4. Valores medios y desviación estándar de la población de B. cereus (N/N0),

en medio de referencia y bebida vegetal, sometidos a tratamiento por APH a 200, 400

y 500 MPa (10 min) y con diferentes concentraciones de polvo de aceitunas

Altas Presiones Hidrostáticas% P.A Medio de referencia Bebida vegetal

200 400 500 200 400 5000 0,592±0,24 1,02ab1±0,14 0,73b12±0.28 0,54a2±0,15 0,84a1±0,05 0,40b2±0,06

1.5 0,901± 0,02 0,84b2±0,01 0,61b3±0,05 0,29b2±0,10 0,30b2±0,06 0,59a1±0,052.5 0,892± 0,02 1,13a1± 0,11 1,10a1±0,19 0,38ab2±0,12 0,68ab1±0,18 0,43b12±0,03P *** ***

CPA *** **Px

CPA *** ***

1-3: valores con números diferentes indican diferencias significativas efecto de las diferentes presiones a la misma concentración de polvo de aceituna y en el mismo substrato.a-c: valores con letras diferentes indican diferencias significativas defecto de las diferentes concentraciones de polvo de aceitunas a la misma presión y en el mismo substrato.P: efecto de la presión, CPA: efecto de la concentración de polvo de aceituna, PxCPA: efecto de la interacción entre la concentración de polvo de aceituna y las altas presiones. ***: p<0.001, **: p<0.01.

Los resultados referentes al efecto de la presión obtenidos en este estudio coinciden con los

de otros autores que observaron que a presiones relativamente bajas se puede inducir la

germinación de las esporas (Rasso et al., 1998), así podría ser que la mayor inhibición

observada a 200 MPa pudiera ser debida a la germinación de las esporas que se

transformarían en células vegetativas, volviéndose más sensibles al tratamiento por APH.

Por otra parte, 500 MPa es una presión alta que sí puede afectar a las esporas y disminuir su

supervivencia, sin embrago estas disminuciones no garantizan la calidad microbiológica de

la bebida de vegetales ya que son menores de un ciclo logarítmico. En cuanto al efecto de la

concentración de polvo de aceituna, los resultados parecen indicar un posible efecto

protector en el tratamiento por APH, que podría ser debido al efecto inhibidor de la

germinación, anteriormente descrito para este ingrediente (Tassou et al., 1991). Sin

embargo, este efecto podría ser de interés durante la vida útil del producto, por tanto sería

79

necesario estudiar la evolución de los diferentes sustratos a lo largo del periodo de

almacenamiento.

La figura 6. 9. permite observar las diferencias en la población de B. cereus debidas a los

diferentes sustratos. En general, a todas las presiones se puede observar que, en ausencia de

polvo de aceituna no hay diferencias significativas entre el número de esporas viables en el

medio de referencia y la bebida vegetal, sin embargo al 1,5 y 2,5% de polvo de aceituna se

observa que la supervivencia de las esporas es mayor en el medio de referencia que en la

bebida vegetal. Esto pueda deberse probablemente a que el comportamiento de algunos

microorganismos en sustratos vegetales muestran que algunos alimentos pueden tener un

efecto protector propio innato contra microorganismos, esto puede ser debido a los

componentes naturales como fitoatoalexinas presentes fluidos celulares y vasculares son

liberados a consecuencia del rompimiento de las células de zanahoria durante un

tratamiento como el de Altas Presiones (Pilavtepe-Çelik1 et al., 2008), estos resultados son

relevantes en comparación con los obtenidos en este estudio ya que las fitoalexinas están

presentes en la zanahoria del sustrato vegetal.

0,00

0,20

0,40

0,60

0,80

1,00

1,20

1,40

200 400 500

Presión (MPa)

N/N

0

0 1,5 2,5 BV 0% BV 1,5% BV 2,5%

80

Figura 6. 9. Efecto de la presión y la concentración de polvo de aceitunas sobre la

población de B. cereus en medio de referencia y bebida vegetal, sometidos a 10 min de

tratamiento con APH.

La temperatura de tratamiento en Altas Presiones es un factor importante así, con

temperaturas superiores a los 40 ºC pueden inactivar hasta un ciclo completo a 100 MPa

para esporas de B. cereus (Black et al., 2008).

El sustrato en el cual se realizan los tratamientos puede influir en la inactivación de los

microorganismos, en alimentos por ejemplo los microorganismos son más resistentes a la

presión que en sistemas de referencia como búferes (Alpas et al., 2003; Chen y Hoover

2003; Van, Opstal et al., 2005); así la composición del medio de referencia puede estar

relacionada con la resistencia del microorganismo a las APH, así algunos aminoácidos

como la glicina y la betaina (presente en el BHI) puede actuar como agente osmoprotector

impidiendo que la membrana de las células se vea afectada por las APH (Jofré et al., 2007).

La bebida de vegetales de este estudio tiene una composición sencilla (zanahorias y judías

verdes) presento un pH de 6.32 muy cercano a la neutralidad de tal manera que el pH del

sustrato no es una barrera extra contra microorganismos.

81

0,00

0,20

0,40

0,60

0,80

1,00

1,20

1,40

200 400 500

Presión (MPa)

N/N

0

0 1,5 2,5 BV 0% BV 1,5% BV 2,5%

Figura 6. 10. Comparación del logaritmo de recuento de B. cereus entre dos tiempos de tratamiento con APH diferentes.

5. 3. Efecto del tiempo de tratamiento con APH en la bebida de vegetales

El tiempo y la temperatura son factores clave a la hora de aplicar cualquier tecnología para

disminuir carga microbiana. Otros autores han observado que un incremento del tiempo de

tratamiento con APH conduce a un aumento en la inactivación de células vegetativas

(Bellaterra, 2004). En este estudio se consideró alargar el tiempo de tratamiento a 25

minutos para ver si esto tendría un efecto mayor sobre las esporas de B. cereus. En la figura

6. 11. se pueden observar los resultados en la bebida vegetal tras tratarla con APH durante

10 y 25 min. Como se ve en la figura no se observaron diferencias significativas debidas al

tiempo de tratamiento.

82

0,00

0,20

0,40

0,60

0,80

1,00

1,20

200 400

Presión (MPa)

N/N

0

10 min, 0% 25 min, 0% 10 min, 1.5% 25 min, 1,5% 10 min, 2,5 % 25 min, 2,5%

Figura 6. 11. Efecto del tiempo de tratamiento con APH sobre la población de B. cereus (N/N0) en bebida vegetal a las diferentes presiones y concentraciones de polvo de aceitunas estudiadas

En la tabla 6.5 se pueden apreciar En general, tanto en el medio de referencia como en la

bebida vegetal, no se observaron diferencias significativas en respuesta al aumento del

tiempo de tratamiento a Altas Presiones ni a la concentración de polvo de aceituna

(p>0,001) y (p>0,01) respectivamente (anexo 9.3 ). Para esta experiencia se sigue

observando una leve disminución de la carga microbiana para la presión de 200 MPa

porque el polvo de aceitunas puede inhibir en algún grado la germinación de las esporas.

83

Tabla 6. 5. Valores medios y desviación estándar de Log N/No de B. cereus, después de

24 horas de almacenamiento en sustrato vegetal con APH con dos tiempos de tratamiento a

APH

Tratamiento 10 min Tratamiento 25min

% P.A 200MPa 400Mpa 200MPa 400Mpa

0 0.59± 0.24 1.02± 0.14 0.20 ±1,09 1.06 ± 0.59

1.5 0.90± 0.02 0.84± 0.01 0.61 ±1,09 0.49 ± 0.11

2.5 0.89± 0.02 0.68± 0.12 0.22 ±1,09 0.66 ± 0.08

Esta tabla solo presenta datos de medias y desviaciones estándar, porque no hay diferencias significativas.

6. CONCLUSIONES

Mediante los datos obtenidos para las diferentes concentraciones de polvo de aceitunas en

medio de referencia y en sustrato vegetal se puede decir que el polvo de aceitunas en

concentraciones de 1.5 % ó de 2.5%, se puede utilizar como aditivo en alimentos para

84

controlar B. cereus junto a otros sistemas de preservación físicos como almacenamiento a

bajas temperaturas.

A las temperaturas de almacenamiento 20 y 32ºC el polvo de aceitunas mostró una

capacidad de controlar poblaciones de B. cereus, lo cual es importante en caso de que se

interrumpa la cadena de frío de un alimento o bien hayan problemas durante el transporte

de la bebida de vegetales.

El tratamiento de APH no tuvo influencia importante sobre el número de reducciones de B.

cereus en medio de referencia y sustrato vegetal. En consecuencia, la tecnología de APH

sola o combinada con el polvo de aceituna no fue suficiente para garantizar la seguridad

microbiológica de la bebida de vegetales.

Un aumento en el tiempo de tratamiento tampoco mostró una disminución importante en el

número de microorganismos.

La temperatura de tratamiento del estudio fue para todo los ensayos 20 ºC, dicha

temperatura se considera baja, puesto que las esporas son termorresistentes, con lo cual se

indujo la germinación pero no la destrucción significativa de esporas de B. cereus

7. RECOMENDACIONES

Se considera necesario pensar en un efecto conjunto de las APH y el ingrediente, para

controlar al B. cereus durante el almacenamiento; es decir, estudiar la influencia de los

tratamientos con APH´s, una concentración de 2,5% de polvo de aceitunas y los

85

componentes de la bebida (sustancias fotoquímicas) a través del tiempo a diferentes

condiciones de almacenamiento.

Como se menciono en la discusión de resultados, la temperatura de tratamiento influye en

la reducción de microorganismos, un aumento de la temperatura de tratamiento junto con

las APH y la adición del polvo de aceitunas pueden inhibir el crecimiento de Bacillus

cereus o mantenerlo bajo niveles que no causen deterioro en la bebida vegetal ni nocivos

para el consumidor.

En materia de seguridad alimentaria es importante tener en cuenta la manipulación de los

alimentos durante su preparación, sí se mantienen condiciones de higiene, Buenas

Prácticas de Manufactura se puede disminuir el riesgo de contaminación en los alimentos.

En muchas ocasiones se piensa que una tecnología muy avanzada garantiza seguridad

microbiológica, pero si no se manejan condiciones aptas durante el proceso de preparado de

un alimento cualquiera será más difícil garantizar calidad y alargar la vida útil de un

producto.

Con respecto al uso de antimicrobianos de origen natural, cabe mencionar que en el

mercado europeo y colombiano existen muchos condimentos y especias, permitidos por las

respectivas legislaciones y que pueden tener actividad antimicrobiana, por lo tanto las

investigaciones en el área de aditivos y antimicrobianos se debería tener en cuantos

aquellos ingredientes que ya son conocidos.

El mercado de las bebidas vegetales actualmente tiene demanda por sectores muy

específicos, en Colombia por ejemplo existe una gran variedad de hortalizas que pueden

combinarse para hacer bebidas refrescantes, por lo que se debería pensar en investigar más

9. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

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99

9. ANEXOS

9 .1 ANOVA SIMPLE ENTRE PRESIONES Y CONCENTRACIONES PARA MEDIO DE REFERENCIA

Dependent variable: RECUENTOFactor: CONCENTRACIONSelection variable: HHP=200

Number of observations: 7Number of levels: 3ANOVA Table for RECUENTO by CONCENTRACIONSource Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-ValueBetween groups 0,155411 2 0,0777054 1,85 0,2703Within groups 0,168275 4 0,0420688Total (Corr.) 0,323686 6

Multiple Range Tests for RECUENTO by CONCENTRACION

Method: 95,0 percent LSDCONCENTRACION Count Mean Homogeneous Groups0 4 0,5925 X2,5 1 0,88 X1,5 2 0,9 X

Contrast Sig. Difference +/- Limits0 - 1,5 -0,3075 0,4931750 - 2,5 -0,2875 0,6366861,5 - 2,5 0,02 0,697454

• denotes a statistically significant difference.

Dependent variable: RECUENTOFactor: CONCENTRACIONSelection variable: HHP=400ANOVA Table for RECUENTO by CONCENTRACIONSource Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-ValueBetween groups 0,144171 1 0,144171 30,29 0,0027Within groups 0,0238 5 0,00476Total (Corr.) 0,167971 6


Method: 95,0 percent LSDCONCENTRACION Count Mean Homogeneous Groups1,5 4 0,84 X2,5 3 1,13 X

Contrast Sig. Difference +/- Limits

100

1,5 - 2,5 * -0,29 0,135455* denotes a statistically significant difference.

Dependent variable: RECUENTOFactor: CONCENTRACIONSelection variable: HHP=500

ANOVA Table for RECUENTO by CONCENTRACIONSource Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-ValueBetween groups 0,382831 2 0,191415 3,17 0,0787Within groups 0,725462 12 0,0604552Total (Corr.) 1,10829 14


Method: 95,0 percent LSDCONCENTRACION Count Mean Homogeneous Groups1,5 3 0,61 X0 8 0,77625 XX2,5 4 1,0625 X

Contrast Sig. Difference +/- Limits0 - 1,5 0,16625 0,3626840 - 2,5 -0,28625 0,328061,5 - 2,5 * -0,4525 0,409163* denotes a statistically significant difference.

Dependent variable: RECUENTOFactor: HHPSelection variable: CONCENTRACION=0ANOVA Table for RECUENTO by HHPSource Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-ValueBetween groups 0,647009 2 0,323504 10,51 0,0005Within groups 0,769663 25 0,0307865Total (Corr.) 1,41667 27Multiple Range Tests for RECUENTO by HHP

Method: 95,0 percent LSDHHP Count Mean Homogeneous Groups200 4 0,5925 X500 8 0,77625 X0 16 1,0 X

Contrast Sig. Difference +/- Limits0 - 200 * 0,4075 0,2020110 - 500 * 0,22375 0,156477200 - 500 -0,18375 0,221292* denotes a statistically significant difference.

Dependent variable: RECUENTOFactor: HHPSelection variable: CONCENTRACION=1,5ANOVA Table for RECUENTO by HHPSource Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-ValueBetween groups 0,341047 3 0,113682 217,33 0,0000Within groups 0,0068 13 0,000523077

101

Total (Corr.) 0,347847 16Multiple Range Tests for RECUENTO by HHP

Method: 95,0 percent LSDHHP Count Mean Homogeneous Groups500 3 0,61 X400 4 0,84 X200 2 0,9 X0 8 1,0 X

Contrast Sig. Difference +/- Limits0 - 200 * 0,1 0,03906170 - 400 * 0,16 0,03025710 - 500 * 0,39 0,0334505200 - 400 * 0,06 0,04279200 - 500 * 0,29 0,0451046400 - 500 * 0,23 0,0377372

• denotes a statistically significant difference.

Dependent variable: RECUENTOFactor: HHPSelection variable: CONCENTRACION=2,5ANOVA Table for RECUENTO by HHPSource Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-ValueBetween groups 0,063825 3 0,021275 1,81 0,1990Within groups 0,141075 12 0,0117562Total (Corr.) 0,2049 15Multiple Range Tests for RECUENTO by HHP

Method: 95,0 percent LSDHHP Count Mean Homogeneous Groups200 1 0,88 X0 8 1,0 X500 4 1,0625 X400 3 1,13 X

Contrast Sig. Difference +/- Limits0 - 200 0,12 0,2505710 - 400 -0,13 0,1599360 - 500 -0,0625 0,144667200 - 400 -0,25 0,272788200 - 500 -0,1825 0,264125400 - 500 0,0675 0,180432

102

9. 2. ANOVA MULTIPLE ENTRE MEDIO DE REFERENCIA Y BEBIDAVEGETAL (10 MINUTOS)

Dependent variable: recuentoFactors: DISTINTIVOCovariates: CONCENTRACION=0Selection variable: hhp=200Analysis of Variance for recuento - Type III Sums of SquaresSource Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-ValueCOVARIATES CONCENTRACION=0 0,00016309 1 0,00016309 0,00 0,9509MAIN EFFECTS A:DISTINTIVO 0,410803 1 0,410803 9,91 0,0071RESIDUAL 0,580313 14 0,0414509TOTAL (CORRECTED) 1,01917 16All F-ratios are based on the residual mean square error.Multiple Range Tests for recuento by DISTINTIVO

Method: 95,0 percent LSDDISTINTIVO Count LS Mean LS Sigma Homogeneous Groups2 10 0,394294 0,0654281 X1 7 0,722473 0,0787312 X

Contrast Sig. Difference +/- Limits1 - 2 0,328179 0,447173

• denotes a statistically significant difference

Dependent variable: recuentoFactors: DISTINTIVOCovariates: CONCENTRACION=1,5Selection variable: hhp=200Analysis of Variance for recuento - Type III Sums of SquaresSource Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-ValueCOVARIATES CONCENTRACION=1,5 0,00236612 1 0,00236612 0,06 0,8143MAIN EFFECTS A:DISTINTIVO 0,437594 1 0,437594 10,60 0,0058RESIDUAL 0,57811 14 0,0412936TOTAL (CORRECTED) 1,01917 16All F-ratios are based on the residual mean square error.

Multiple Range Tests for recuento by DISTINTIVO




103

Dependent variable: recuentoFactors: DISTINTIVOCovariates: CONCENTRACION=2,5Selection variable: hhp=200Analysis of Variance for recuento - Type III Sums of SquaresSource Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-ValueCOVARIATES CONCENTRACION=2,5 0,00415365 1 0,00415365 0,10 0,7554MAIN EFFECTS A:DISTINTIVO 0,427949 1 0,427949 10,40 0,0061RESIDUAL 0,576322 14 0,0411659TOTAL (CORRECTED) 1,01917 16All F-ratios are based on the residual mean square error.Multiple Range Tests for recuento by DISTINTIVO




Dependent variable: recuentoFactors: DISTINTIVOCovariates: CONCENTRACION=0Selection variable: hhp=400Analysis of Variance for recuento - Type III Sums of SquaresSource Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-ValueCOVARIATES CONCENTRACION=0 0,0796036 1 0,0796036 2,36 0,1428MAIN EFFECTS A:DISTINTIVO 0,561718 1 0,561718 16,66 0,0008RESIDUAL 0,573182 17 0,0337166TOTAL (CORRECTED) 1,29648 19All F-ratios are based on the residual mean square error.Multiple Range Tests for recuento by DISTINTIVO


Contrast Sig. Difference +/- Limits1 - 2 0,340907 0,382606* denotes a statistically significant difference.

Dependent variable: recuentoFactors: DISTINTIVOCovariates: CONCENTRACION=1,5Selection variable: hhp=400

104

Analysis of Variance for recuento - Type III Sums of SquaresSource Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-ValueCOVARIATES CONCENTRACION=1,5 0,332658 1 0,332658 17,67 0,0006MAIN EFFECTS A:DISTINTIVO 0,672619 1 0,672619 35,72 0,0000RESIDUAL 0,320128 17 0,018831TOTAL (CORRECTED) 1,29648 19All F-ratios are based on the residual mean square error.Multiple Range Tests for recuento by DISTINTIVO


Contrast Sig. Difference +/- Limits1 - 2 * 0,368807 0,271596


Dependent variable: recuentoFactors: DISTINTIVOCovariates: CONCENTRACION=2,5Selection variable: hhp=400Analysis of Variance for recuento - Type III Sums of SquaresSource Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-ValueCOVARIATES CONCENTRACION=2,5 0,0984018 1 0,0984018 3,02 0,1005MAIN EFFECTS A:DISTINTIVO 0,714896 1 0,714896 21,92 0,0002RESIDUAL 0,554384 17 0,0326108TOTAL (CORRECTED) 1,29648 19All F-ratios are based on the residual mean square errorMultiple Range Tests for recuento by DISTINTIVO


Contrast Sig. Difference +/- Limits1 - 2 * 0,386277 0,363104* denotes a statistically significant difference.

9. 3. ANOVA MULTIPLE ENTRE 10 Y 25 MINUTOS DE TRATAMIENTO EN BEBIDA VEGETAL

Dependent variable: RECUENTOFactors: TRATAMIENTO TIEMPOCovariates: CONCENTRACION=0Selection variable: HHP=200

105

Analysis of Variance for RECUENTO - Type III Sums of SquaresSource Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-ValueCOVARIATES CONCENTRACION=0 1,68497 1 1,68497 4,37 0,0502MAIN EFFECTS A:TRATAMIENTO TIEMPO 2,37258 1 2,37258 6,16 0,0226RESIDUAL 7,31913 19 0,385217TOTAL (CORRECTED) 11,2392 21All F-ratios are based on the residual mean square error.Multiple Range Tests for RECUENTO by TRATAMIENTO TIEMPO

Method: 95,0 percent LSDTRATAMIENTO TIEMPO Count LS Mean LS Sigma Homogeneous Groups10 10 0,384215 0,196338 X25 12 1,04416 0,179221 X

Contrast Sig. Difference +/- Limits10 - 25 -0,659944 1,19001* denotes a statistically significant difference.

Dependent variable: RECUENTOFactors: TRATAMIENTO TIEMPOCovariates: CONCENTRACION=1,5Selection variable: HHP=200Analysis of Variance for RECUENTO - Type III Sums of SquaresSource Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-ValueCOVARIATES CONCENTRACION=1,5 0,575187 1 0,575187 1,30 0,2690MAIN EFFECTS A:TRATAMIENTO TIEMPO 2,3137 1 2,3137 5,22 0,0341RESIDUAL 8,42892 19 0,443627TOTAL (CORRECTED) 11,2392 21All F-ratios are based on the residual mean square error.Multiple Range Tests for RECUENTO by TRATAMIENTO TIEMPO



Dependent variable: RECUENTOFactors: TRATAMIENTO TIEMPOCovariates: CONCENTRACION=2,5Selection variable: HHP=200

Analysis of Variance for RECUENTO - Type III Sums of SquaresSource Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-ValueCOVARIATES CONCENTRACION=2,5 3,97869 1 3,97869 15,04 0,0010

106

MAIN EFFECTS A:TRATAMIENTO TIEMPO 2,65394 1 2,65394 10,03 0,0051RESIDUAL 5,02542 19 0,264496TOTAL (CORRECTED) 11,2392 21All F-ratios are based on the residual mean square error.Multiple Range Tests for RECUENTO by TRATAMIENTO TIEMPO



Dependent variable: RECUENTOFactors: TRATAMIENTO TIEMPOCovariates: CONCENTRACION=0Selection variable: HHP=400Analysis of Variance for RECUENTO - Type III Sums of SquaresSource Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-ValueCOVARIATES CONCENTRACION=0 0,706632 1 0,706632 19,11 0,0004MAIN EFFECTS A:TRATAMIENTO TIEMPO 0,0251791 1 0,0251791 0,68 0,4200RESIDUAL 0,665523 18 0,0369735TOTAL (CORRECTED) 1,4413 20All F-ratios are based on the residual mean square error.Multiple Range Tests for RECUENTO by TRATAMIENTO TIEMPO



Dependent variable: RECUENTOFactors: TRATAMIENTO TIEMPOCovariates: CONCENTRACION=1,5Selection variable: HHP=400

Analysis of Variance for RECUENTO - Type III Sums of SquaresSource Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-ValueCOVARIATES CONCENTRACION=1,5 0,584107 1 0,584107 13,34 0,0018MAIN EFFECTS A:TRATAMIENTO TIEMPO 0,069143 1 0,069143 1,58 0,2249RESIDUAL 0,788048 18 0,0437804TOTAL (CORRECTED) 1,4413 20All F-ratios are based on the residual mean square error.

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Multiple Range Tests for RECUENTO by TRATAMIENTO TIEMPO


Contrast Sig. Difference +/- Limits10 - 25 -0,11595 0,406984

Dependent variable: RECUENTOFactors: TRATAMIENTO TIEMPOCovariates: CONCENTRACION=2,5Selection variable: HHP=400Analysis of Variance for RECUENTO - Type III Sums of SquaresSource Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-ValueCOVARIATES CONCENTRACION=2,5 0,0011904 1 0,0011904 0,02 0,9019MAIN EFFECTS A:TRATAMIENTO TIEMPO 0,0662306 1 0,0662306 0,87 0,3634RESIDUAL 1,37096 18 0,0761647TOTAL (CORRECTED) 1,4413 20All F-ratios are based on the residual mean square error.

Multiple Range Tests for RECUENTO by TRATAMIENTO TIEMPO



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PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS ... · Efecto de las Altas Presiones y el...

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