Metodologías para implementar EstándaresMetodologías para implementar Estándares Internacionales de pureza del Azafrán

Análisis MicrobiológicosAnálisis Microbiológicos

Dª Olga Acevedo Regalado

Dr. Rafael Rotger

Dr. José Luis Novella

Dra. Leonor Nozal

Normativa microbiológica sobre especiessobre especies

• Normativa española (R.D. 2242/1984, de 26-IX):• Ausencia de microorganismos patógenos y sus toxinasAusencia de microorganismos patógenos y sus toxinas• Ausencia de Salmonella en 25 g• Escherichia coli: ≤10 UFC/g

3• Esporulados anaerobios sulfito-reductores: ≤103 UFC/g• Recomendaciones ICMSF (1974, 2005):

• Aerobios mesófilos totales: ≤106 UFC/gAerobios mesófilos totales: 10 UFC/g• Hongos y Coliformes: ≤104 UFC/g• E. coli y Clostridium perfringens: ≤103 UFC/g

R d i d l U ió E (2004/24/CE)• Recomendaciones de la Unión Europea (2004/24/CE):• Ausencia de Salmonella en 25 g• Bacillus cereus: satisfactorio ≤102 UFC/g; aceptable ≤103 UFC/gg; p g• Clostridium perfringens: satisfactorio ≤103 UFC/g; aceptable ≤104 UFC/g• Enterobacteriaceae: para discriminar especies irradiadas• Aflatoxinas: niveles permitidos por la normativa UE• Aflatoxinas: niveles permitidos por la normativa UE

Análisis de la calidad microbiológica de 80 muestrasmicrobiológica de 80 muestras

de azafrán • Origen:– Irán: 33Detección de Salmonella – Irán: 33– Italia: 15– Grecia: 15Detección de Enriquecimiento

Detección de Salmonella

– España: 14– Marruecos: 2

I di 1

25 g azafrán + 225 ml Agua Peptona + 0.1% Tween80 Pre-enriquecimiento (16 h 37 ºC)

Staphylococcusselectivo

– India: 1Pre enriquecimiento (16 h, 37 C)Homogeneizado

Stomacher

Recuentos de

Dil i d i l

Recuentos de bacterias y hongos

Diluciones decimales

Recuento de bacterias y hongos

Anaerobios sulfito-reductores

Filtración para recuento de mohos

5 min a 80 ºC para recuento de reductores,

Clostridium perfringens y Bacillus cereus

recuento de mohos y levaduras

recuento de esporulados

Bacillus cereus.

Dil i 10 1 10 4Sabouraud

Diluciones 10-1 a 10-4(2-4 días at 24 ºC)

Recuento de aerobios totales, lif E t b t i E licoliformes, Enterobacterias y E. coli.

Resultados del análisis microbiológico de 80 muestrasmicrobiológico de 80 muestras

de azafrán

• Ausencia de Salmonella en 25 g en todas las muestras, confirmada por PCR.P i d E li 5 t (6 25%)• Presencia de E. coli en 5 muestras (6.25%), confirmada por PCR.

• Presencia de Staphylococcus aureus en 3• Presencia de Staphylococcus aureus en 3 muestras (3.75%), confirmada por PCR.

• Ausencia de Aspergillus spp• Ausencia de Aspergillus spp.• 76 muestras (95%) cumplieron la normativa

española.española.

Niveles de microorganismos en azafrán

70Aerobios totales

50

60

Aerobios esporuladosEnterobacteriasColiformes totales

40

50

mue

stra

s Clostridios Sulfito-red.Clostridium perfringensLevaduras

20

30

% d

e m Levaduras

Mohos

0

10

< 10

10E1-1

0E210

E2-10E3

10E3-1

0E410

E4-10E5

10E5-1

0E610

E6-10E7

1 1 1 1 1 1

Porcentaje de muestras i l á l dcon niveles más elevados

70 Irán*Incumplen normativa española

50

60

ada

país Grecia

It li

**Sobrepasan recomendaciones ICMSF

30

40

tras

de

ca Italia

España

10

20

30

de m

uest

0

10

6 ** 0E4 4 ** E1 * 0E2

0E2 E4**%

erob Total

> 10E6

terobact

erias >1

0E4Colifo

rmes >10E

4

E. coli >

10E1

B. cereu

s >10E

perfringens >

10E2

Levaduras >

10E4

Aero

Enter Co

C. p L

Supervivencia de S l ll f áSalmonella en azafrán

1,E+07

1,E+05

1,E+06

1,E+04

g U

FC

1,E+02

1,E+03Log

Enteritidis

Enteritidis FT1

1,E+01

,Typhimurium DT104

Typhimurium DT104BControl*

Tiempo de reducción decimal (D): 2 días

1,E+000 4 7

Días

Control

Días

*Promedio de las 4 cepas en ausencia de azafrán

Propuesta de método microbiológicomicrobiológico

Triturar 25 g azafrán en molino de bolas para análisis químico y y

microbiológico

Pesar ∼5 g (±0 1) y resuspender en 45Detección de

Salmonella

PCR

Pesar ∼5 g (±0.1) y resuspender en 45 ml de agua de peptona tamponada

(ISO 6579) (±0,1% Tween80) CULTIVO(ISO 6579)

Salmonella

O

0,5 mlReposar 10 min Tª

amb.

( )

MezclarE. coli

Recuentos:Dos alícuotas 1 ml

Pre-enriquecimiento 16±1 h, 37 ºCAnaerobios

esporulados sulfito-reductoressulfito reductores

PCR Reacción en Cadena de la PolimerasaReacción en Cadena de la Polimerasa

Cebadores para el gen invA de Salmonella5’-CGGTGGTTTTAAGCGTACTCTT-3’

0,5 ml pre-enriquecimiento Nº de

ciclos: Minutos: Tª (ºC)

5 CGG GG GCG C C 35’-CGAATATGCTCCACAAGGTTA-3’

Electroforesis en

Filtración

ciclos:

1 5 94

1 94

agarosa

D t ió 30 1

1

55,6

72

1 3 72

Detección

1 3 72DNA +

cebadores + Taq-polimerasa

TOTAL: 4-6 HORAS

Lisis purificación DNA

Taq polimerasa

DNA

Detección de Salmonellapor cultivo (ISO 6579)por cultivo (ISO 6579)

• Caldo Rappaport-Vassiliadis• Caldo Muller-Kauffman

Dos alícuotas de 1 ml del pre-enriquecimiento

24 h

XLD

q

24 h

Otro agar selectivo

para

XLD Agar

24 hpara Salmonella

24-48 hIdentificación bioquímica y serológica

Resultados de la validación interlaboratorios

Método: PCR Cultivo (ISO 6579) E ifi id d 100 0 % 100 0 %Especificidad 100.0 % 100.0 %Sensibilidad

Concentración de Salmonella

Alta: [5×106] 77.8 % 100.0 % Media: [5×103] 66.7 % 83.4 % Baja: [5×102] 18.8 % 16.7 %

Exactitud 66.2 % 75.0 %

Media de dos réplicas analizadas por 9 laboratoriosMedia de dos réplicas, analizadas por 9 laboratorios.