PNO Separación de Proteinas Para Entregar

PROCEDIMIENTO NORMALIZADO DE OPERACIÓN PARA EL PROCESAMIENTO DE MUESTRAS SANGUÍNEAS PARA LA SEPARACIÓN DE

PROTEÍNAS.

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NOMBRE: KARLA PAULA RAMÍREZ M., NOÉ ÁLVAREZ H.

PUESTO: QUÍMICA DE DOCUMENTACIÓN, QUÍMICO DE

DATOS Y RESULTADOS.

FECHA: 13-02-15

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NOMBRE: KARINA NAVARRO A.

PUESTO: SUPERVISORA

FECHA: 19-02-15

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AUTORIZÓ

NOMBRE: Q.F.B. MIREYA GARCÍA C.

PUESTO: ASESORA

FECHA: 20-02-15

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I. OBJETIVO

Establecer los lineamientos y la metodología a seguir para el procesamiento de muestras sanguíneas, separando las proteínas contenidas en ellas.

II. ALCANCE

Este procedimiento aplica para alumnos, profesores y todo aquel personal que lo requiera en el laboratorio de Desarrollo Analítico del área de Farmacia Clínica para la separación de proteínas en muestras sanguíneas.

III. RESPONSABILIDADES A. ASESORA.

Responsable de la revisión y autorización del PNO verificando que cumpla con las especificaciones previamente establecidas.

B. SUPERVISORA.

Responsable de la supervisión y revisión del documento, así como verificar que los ejecutores del PNO se apeguen a las indicaciones establecidas en el documento.

C. QUÍMICO EN INVESTIGACIÓN.

Responsable de la recopilación, selección y utilización de la información relacionada con el PNO para la separación de proteínas de muestras sanguíneas.

D. QUÍMICA EN DOCUMENTACIÓN.

Responsable de la elaboración y actualización del PNO. E. QUÍMICO DE DATOS Y RESULTADOS.

Se encargará de colaborar en la elaboración del PNO. F. EJECUTANTES.

Responsables de leer, conocer y ejecutar correctamente todas las actividades descritas para la separación de proteínas en el laboratorio de Desarrollo Analítico del Área de Farmacia Clínica.

IV. PRECAUCIONES

a) Usar equipo de seguridad al trabajar las muestras (bata, guantes ajustados de látex o nitrilo, cubre

bocas y lentes de seguridad). b) No comer en el laboratorio. c) Evitar el movimiento brusco de los tubos para evitar la hemólisis de las muestras.


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PUESTO: SUPERVISORA

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d) Nivelar los tubos junto con las camisas de la centrifuga y al término de la centrifugación esperar a que la centrifuga se detenga completamente. En caso de que se rompa un tubo dentro de la centrifuga seguir los pasos descritos en el Anexo 3.

e) Evitar tocarse el rostro mientras se ejecuta el procedimiento. f) No pipetear con la boca. g) No introducir la pipeta pasteur hasta el fondo del tubo al separar el suero para evitar resuspender el

paquete globular.

V. DESARROLLO DEL PROCESO A. Material Bata Guantes de látex o nitrilo Lentes de seguridad Cubre bocas 1 Gradilla 1 Balanza de dos platos Ohaus Harvard Trip 1 Centrífuga Marca Solbat 4 Tubos de ensayo 13x100 2 Pipetas Pasteur de vidrio con bulbo 1 pipeta graduada de 1mL 1 pipeta graduada de 5mL 1 Vaso de precipitados de 150 mL 1 Soporte universal 1 Pinza de presión doble para bureta 1 Termómetro de inmersión parcial de -10 a 150°C Parrilla de calentamiento y agitación Thermo Scientific Modelo SP131015 1 piceta 1 perilla de seguridad Papel parafilm o tapones de goma para tubos de ensayo 1 Aspersor con etanol al 70% Franela o tela magitel Jabón para manos marca blumen® Jabón para material de laboratorio (Extrán) 1 Escobillón 1 Fibra Scotch Brite 1 Marcador indeleble Sharpie.


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B. Método

MUESTRAS SANGUÍNEAS OBTENIDAS POR PUNCIÓN VENOSA

1. Portar equipo de seguridad (guantes de látex, lentes de seguridad, bata, cubre bocas).

2. Sanitizar el área de procesamiento de muestras con alcohol al 70%.

3. Acudir al área de toma y verificar que las muestras de sangre obtenidas de acuerdo al PNO-0001-15-01 estén en condiciones óptimas (bien rotulados, volumen de sangre a ¾ partes del tubo y sin haber destapado). En caso de que las muestras recibidas no estén en las condiciones indicadas devolver los tubos y pedir nuevas muestras hasta que cumplan los requisitos.

4. Colocar los tubos de forma vertical, con el tapón hacia arriba en la gradilla.

5. Trasportar los tubos contenidos en la gradilla al área de centrifugado, evitando movimientos bruscos.

6. Dejar reposar los tubos con de 25 a 30 minutos hasta la formación del coágulo (sólo aplica para tubos con tapón rojo).

7. Nivelar los tubos que contienen la sangre con tubos que contengan agua (adicionándola con ayuda de una piceta) y obtener el mismo peso de ambos tubos junto con las camisas de la centrífuga, pesándolos en la balanza de dos platos.

8. Centrifugar a 3000rpm durante 5 minutos para separar el suero y/o plasma del paquete celular.

9. Recolectar el suero y/o plasma de la superficie con una pipeta Pasteur dispuesta con bulbo procurando no resuspender el paquete celular en el suero y/o plasma y transferir a un tubo de ensaye rotulado como “suero” y/o “plasma”. Nota: Si la muestra no se procesa el mismo día refrigerar de 2 a 8°C (Ver Anexo 4).

10. Etiquetar el tubo que contienen el paquete celular con la leyenda “RPBI”, colocar en una gradilla y reservar.

11. Transferir una alícuota de 1mL del tubo rotulado como “suero” y/o “plasma” a un tubo de ensaye rotulado con el número 1 (suero con ácido tricloroacético) y/o (plasma con ácido tricloroacético).

12. Adicionar 4mL de ácido tricloroacético al 10 % al tubo número 1, cubrir el tubo con papel parafilm y mezclar 5 veces por inversión.


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13. Centrifugar el tubo 1 a 3000rpm durante 5 minutos (nivelando los tubos en la balanza de dos platos de acuerdo al paso 7).

14. Separar el sobrenadante con ayuda de una pipeta Pasteur y colocarlo en un tubo de ensaye rotulado con el número 2 (suero sin proteínas) y/o (plasma sin proteínas), cuidando no resuspender el precipitado.

15. Adicionar 4 mL de reactivo de Biuret al tubo 2 y colocar en baño María manteniendo una temperatura de 30-35°C, durante 15 min.

16. Sacar el tubo 2 del baño María y dejar reposar a temperatura ambiente durante 5 minutos.

17. Observar la coloración obtenida. Un color azul claro indica que no hay proteínas presentes en el suero y/o plasma y se reporta como negativo. Un color violeta –rosáceo indica la presencia de proteínas y se reporta como positivo. (Ver Anexo 7)

18. Transportar en una gradilla los tubos rotulados como RPBI y el tubo 1 que contiene el paquete celular y el suero y/o plasma respectivamente al área de desecho, de acuerdo al PNO-0002-15-01.

19. Tratar los residuos no peligrosos de acuerdo al Anexo 5.

20. Inactivar las pipetas que se utilizaron para fraccionar y separar el suero y/o plasma conforme al PNO-0002-15-01.

21. Lavar el material y sanitizar el área de trabajo con etanol al 70%.

VI. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. Arronte, C. Bioquímica Especializada: Manual de Prácticas. Universidad Veracruzana.

2. Comisión Permanente de la Farmacopea de los Estados Unidos Mexicanos. Suplemento para

establecimientos dedicados a la venta y suministro de medicamentos y otros insumos para la salud. 5a

ed. Comisión Permanente de la Farmacopea de los Estados Unidos Mexicanos, 2014.

3. Comité Ejecutivo de Calidad y Epidemiología Hospitalaria. Guía de Práctica Clínica: Precauciones para

prevenir la exposición accidental a sangre y manejo de post-exposición. Hospital Santiago de Oriente,

2004. Escalante, R. Manual de Prácticas de Bioquímica Celular y de los Tejidos I. Proyecto PAPIME

D0191398.


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4. Escalante, R. Manual de Prácticas de Bioquímica Celular y de los Tejidos I. Proyecto PAPIME

D0191398.

5. Koolman, J. Bioquímica: textos y atlas. 3a ed. Madrid: Médica –Panamericana, 2004.

6. Ministerio de Salud Pública y Asistencia Social. Manual de Procedimientos de Bioseguridad para los

Laboratorios Clínicos. El Salvador, C. A. 2008.

7. Morán-Villatoro L. Obtención de Muestras Sanguíneas de Calidad Analítica; México: Médica

Panamericana; 2001.

8. PNO-0001-15-01. Procedimiento Normalizado de Operación para toma de muestras sanguíneas por

punción venosa con sistema de vacío.

9. PNO-0002-15-01. Procedimiento Normalizado de Operación para la identificación, clasificación y

desecho adecuado de RPBI generados durante una punción venosa en el laboratorio de Desarrollo

Analítico.

10. Reglamento de Insumos para la Salud. Diario Oficial de la Federación. México, 14 de marzo de 2014.

11. Secretaría del Medio Ambiente y Recursos Naturales. Norma Oficial Mexicana NOM-087-ECOL-SSA1-

2002, Protección ambiental- Salud ambiental - Residuos peligrosos biológico-infecciosos - Clasificación

y especificaciones de manejo. Diario Oficial de la Federación. Febrero 2003.

12. Secretaría del Medio Ambiente y Recursos Naturales. Norma Oficial Mexicana NOM-052-SEMARNAT-

2005, que establece las características, el procedimiento de identificación, clasificación y los listados

de los residuos peligrosos.


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VII. ANEXOS ANEXO 1. DIAGRAMA DE FLUJO

Portar el material de

seguridad

Acudir al área de toma

y verificar las muestras

Sanitizar área de

trabajo.

¿Las muestras

están en óptimas

condiciones?

Si

No

1

Rechazar y solicitar

nueva muestra


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1

2

¿Son tubos sin

aditivo (rojos)?

Reposar tubos

25-30 min.

Transportar muestras

Si

Centrifugar a 3000 rpm

por 5 min.

Separar el suero

y/o el plasma

No


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FIRMA:

Adicionar ácido

tricloroacético

Tomas una

alícuota de suero

o plasma

2

3

¿Se utilizará

inmediatamente?

Refrigerar de 2 a

8 OC hasta su uso

No

Si

Centrifugar a 3000 rpm

por 5 min.


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Lavar material y

sanitizar área

Ádicionar Reactivo de

Biuret al sobrenadante

Separar sobrenadante

3

Colocar en baño maría

por 15 min.

Disposición final

de residuos

Observar coloración


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ANEXO 2. ABREVIATURAS NOM: Norma Oficial Mexicana PNO: Procedimiento Normalizado de Operación RPBI: Residuo Peligroso Biológico- Infeccioso. rpm: revoluciones por minuto. SEMARNAT: Secretaría de Medio Ambiente y Recursos Naturales

ANEXO 3. LIMPIEZA POR RUPTURA DE TUBOS EN CENTRÍFUGAS Al sospechar la ruptura de un tubo en el interior de la centrífuga se debe:

1. Interrumpir la centrifugación, apagando el motor. 2. No abrir la tapadera de la centrífuga para evitar los aerosoles, esperar 30 minutos. 3. Pasados 30 minutos, usar guantes gruesos y resistentes para extraer los vidrios rotos con una

pinza y desecharlos en un recipiente de paredes rígidas. 4. Utilizar algodón manipulado con pinzas para recoger el derrame dentro de la centrifuga. 5. Desechar el algodón de acuerdo al PNO-0002-15-01. 6. Limpiar la parte interna de la centrífuga, camisas, soporte y rotor con un algodón impregnado con

desinfectante no corrosivo (NO UTILIZAR CLORO) y manipulado con pinzas. 7. Desechar el algodón de acuerdo al PNO-0002-15-01. 8. Los tubos intactos con sus correspondientes tapones, deben limpiarse en su parte externa con

algodón o gasa humedecida con desinfectante o hipoclorito de sodio al 0.5%. 9. Sí la ruptura de los tubos se advierte al detenerse la centrífuga, se cerrará inmediatamente,

esperar por 30 minutos y proceder en la forma anteriormente descrita. ANEXO 4. ALMACENAMIENTO Y CONSERVACIÓN DEL SUERO Y/O PLASMA

Tan pronto como se adquiere la muestra sanguínea se tiene un límite máximo de 2 horas para extraer el suero o plasma para evitar la inexactitud al momento de la experimentación. El suero o plasma separado debe permanecer a 22°C por no más de 8 horas. Si los ensayos no se han terminado dentro de las 8 horas, el suero o plasma se debe refrigerar (2 a 8 °C). Si las pruebas no se han terminado dentro de 48 horas o si la muestra separada se debe conservar más de 48 horas la muestra debe ser congelada a -20°C. Una vez congelada la muestra y posteriormente descongelada no se debe volver a congelar, sin embargo, si se puede seguir refrigerando.

ANEXO 5. TRATAMIENTO DE RESIDUOS

Con base en la NOM-052-SEMARNAT-2005 que establece las características, el procedimiento de identificación, clasificación y los listados de los residuos peligrosos, no se considera al ácido tricloroacético ni al reactivo de biuret como peligrosos, sin embargo, al ser desechos de laboratorio es necesario colocarlos en un frasco de vidrio o plástico debidamente etiquetado con la leyenda “Trazas de suero, trazas de ácido tricloroacético y reactivo de biuret” y colocarse en el área designada para desechos de laboratorio, marcada con una letra “X” de color negro sobre un fondo amarillo.


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ANEXO 6. PREPARACIÓN DEL REACTIVO DE BIURET Se pesan las siguientes sustancias: 9g de tartrato doble de sodio y potasio, 3g de sulfato de cobre pentahidratado y 5g de yoduro de potasio. Cada sustancia se disuelve por separado en un vaso de precipitados de 100mL con unos 50mL de agua destilada. En un matraz volumétrico de 1L, se ponen 200mL de hidróxido de sodio 1N y se añaden las soluciones de los otros tres reactivos, terminando con la del sulfato de cobre, y mezclando bien durante cada adición. Posteriormente se afora con agua destilada y se mezcla cuidadosamente. Se pasa inmediatamente a un frasco ámbar pues la exposición a la luz puede causar descomposición. Nota: Las cantidades de cada sustancia se deben ajustar según la cantidad total de reactivo que se desee preparar.

ANEXO 7. CAMBIOS DE COLOR OBSERVADOS CON LA PRUEBA DE BIURET

Reactivo de Biuret

Prueba Positiva a Proteínas

Prueba Negativa a Proteínas


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ANEXO 8. CONTROL DE CAMBIOS

FECHA DESCRIPCIÓN DEL

CAMBIO JUSTIFICACIÓN REALIZADO

POR APROBADO

POR

1.

2.

3.

4.

ANEXO 9. FIRMAS DE CONOCIMIENTO

ÁREA NOMBRE FIRMA FECHA

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