Perfil genético y epigenético en

neoplasias linfoides. Su asociación con parámetros clínicos

Dra. Irma Slavutsky

Laboratorio de Genética de Neoplasias Linfoides

Instituto de Medicina Experimental CONICET - Academia Nacional de Medicina

- Las neoplasias del sistema linfoide constituyen un

grupo heterogéneo de patologías con un amplio

espectro de variación desde el punto de vista clínico,

morfológico, inmunofenotípico, citogenético y

molecular.

- Representan alrededor del 4% de todas las

neoplasias, ubicándose como el quinto cáncer más

frecuente, con igual prevalencia para ambos sexos.

- Los estudios epidemiológicos muestran un aumento

de su incidencia a nivel mundial, encontrándose entre

las más frecuentes causas de muerte.

Neoplasias linfoides

Linfomas no-Hodgkin (LNH)

- Linfomas no-Hodgkin a células B: 90% de los casos

- Linfomas no-Hodgkin a células T y NK: 10% restante

LNH B

Difuso a células grandes 30,0%

Folicular 22,0%

Marginal (MALT) 7,6%

Leucemia linf. crónica 6,7%

De células del manto 6,0%

Burkitt 2,5%

LNH T

Periférico 7,6%

Nasal NK 1,4%

Leu/Lin T del adulto <1%

Micosis fungoides 0,5%

- Nodales o extranodales

Linfomas no-Hodgkin (LNH)

14q11.2

TRA@/TRD@

7q34 TRB@

7p14 TRG@

BCR TCR

Linfomas no-Hodgkin Alteración Citogenética Genes implicados

Linfoma de Burkitt t(8;14)(q24;q32) c-MYC-IGH@

t(8;22)(q24;q11) c-MYC-IGL

t(2;8)(p12;q24) c-MYC-IGK

Linfoma folicular t(14;18)(q32;q21) BCL2-IGH@

Linfoma del manto t(11;14)(q13;q32) CCND1-IGH@

t(12;14)(p13;q32) CCND2-IGH@

LDCGB t(14;18)(q32;q21) BCL2-IGH@

t(3;14)(q27;q32) BCL6-IGH@

rearreglos 3q27 BCL6

t(8;14)(q24;q32) c-MYC-IGH@

Linfoma de MALT t(11;18)(q21;q21) API2-MALT1

t(1;14)(p22;q32) BCL10- IGH@

t(14;18)(q32;q21) IGH@-MALT1

+3, +18

Linfoma T anaplásico

de células grandes

t(2;5)(p23;q35)

t(1;2)(q25;p23)

NPM-ALK

TPM3-ALK

inv(2)(p23q35) ATIC-ALK

Mieloma múltiple Hiperploidía

t(11;14)(q13;q32) CCND1/IGH@

t(12;14)(p13;q32) CCND2/IGH@

t(4;14)(p16;q32) FGFR3-MMSET/IGH@

t(14;16)(q32;q23) IGH@/MAF

t(14;20)(q32;q11) IGH@/MAFB

Leucemia linfocítica crónica

Trisomía 12

del(13)(q14) D13S319

del(11)q22) ATM

del(17)(p13) TP53

Alteraciones genéticas en neoplasias linfoides

- Alteraciones

primarias

- Requieren otros

eventos para el

desarrollo neoplásico

Linfoma difuso a grandes células B

Diffuse large B-cell lymphoma (DLBCL), NOS

Germinal center B-cell type* Activated B-cell type* T-cell/histiocyte-rich large B-cell lymphoma Primary DLBCL of the central nervous system (CNS) Primary cutaneous DLBCL, leg type EBV1 DLBCL, NOS* EBV1 mucocutaneous ulcer* DLBCL associated with chronic inflammation Lymphomatoid granulomatosis Primary mediastinal (thymic) large B-cell lymphoma Intravascular large B-cell lymphoma ALK1 large B-cell lymphoma Plasmablastic lymphoma Primary effusion lymphoma HHV81 DLBCL, NOS*

NOS: not otherwise specified WHO Clasification, Blood 2016, 27:2375-2390

Patogénesis de LBDCG

Subtipos de LDCGB

Alizadeh et al, Nature 2000; 403: 503-511

Rosenwald et al, NEJM 2003; 346: 1937-47 Rosenwald et al, J Exp Med 2003; 198: 851-62

Linfomas difusos a células grandes B

Centroblastos célula B CG

Plasmoblastos célula B post-CG

Célula B del timo

Pasqualucci L, et al. Curr Opin Hematol 2013; 20: 336-44

Alteraciones compartidas

Alteración Genómica

CG-LDCGB (%)

ABC-LDCGB (%)

PM (%)

t(14;18) (BCL2-IGH) 40 0 18

amp 18q21 (BCL2) 10 34 16

trans BCL6 (3q27) 10 25 1

amp REL (2p13) 28 5 19

gan/amp SPIB (19q13)

3 26 3

gan/amp (9p24) JAK2

0 0 43

trisomía 3 1 26 0

del(9p21) INK4A/ARF

1 20 0

Mut/del PRDM1 (Blimp-1) (6q21)

0 24 na

Amp: amplificación; trans: translocación; gan: ganancia; del: deleción: Mut: mutación; na: no analizado

Lenz et al, EHA, 2010 Bea et al, Blood 2005; 106: 3183-90

LDCGB Centro germinal (CG)

Alteración genómica

Frecuencia (%)

Consecuencias biológicas

Consecuencias funcionales

t(14;18) (BCL2-IGH) mutación BCL2

30-40 Inhibición de la apoptosis

Desregulación transcrip Expresión ectópica de BCL2 Escape represión BCL6

t(8;14)/t(2;8)/ t(8;22) MYC

10-15 Aumento prolif y SV celular

Expresión ectópica de MYC Escape represión BCL6

trans BCL6 (3q27) 10 Alt resp. daño al ADN Bloqueo dif. cél. B Aumento prolif cel Resistencia apoptosis

Desregulación transcripcional Pérdida autoreg BCL6

Mutación activante EZH2 (7q36)

22 Reprogramación epigenética

Aumento trimetilación histona H3K27

Mutación inactivante MLL2 (12q13)

20 Reprogramación epigenética

Disminución trimetilación histona H3K4

Mut/del CREBBP/ EP300 (16p13/22q13) pérdida de función

40 Reprogram epigenética Aumento activ BCL6 Pérdida actividad p53

Reducida act acetiltranferasa Deterioro acetilación BCL6 y p53

Mut activante PIK3CA (3q26)

- Activación del camino de señaliz de AKT

Aumento de acti catalítica

Del PTEN (10q23) 10 Act camino señaliz AKT Pérdida reg negativa de PIP3

Amp REL (2p13) 28 No claras Aumento dosis génica

IGH@

BCL2

LDCGB Centro germinal (CG)

t(14;18) / Rearreglo BCL2-IGH@ (30-40%)

t(8;14) y variantes (10%)

MBR-JH

Célula B normal: Acetilación mediada por CBP lleva a la inactivación de BCL6 y la activación de p53 LDCGB: Mutación/deleción de CBP altera este mecanismo, activa constitutivamente BCL6 y downregula p53, aumenta la tolerancia al daño al ADN y favorece la transformación maligna.

Pasqualucci L, Curr Opin Hematol. 2013; 20: 336–44

Mutación /deleción de CREBBP(16p13)/ EP300 (22q13) (40%)

t(3q27) (10%)

Mutaciones activantes EZH2 (22%), MLL2 (20%) y PIK3CA Deleción PTEN (10%) ; amplificación REL (28%)

LDCGB células B activadas (ABC)

Alteración genómica

Frecuencia (%)

Consecuencias biológicas

Consecuencias funcionales

Amplif BCL2 (18q21) 30 Inhibición de la apoptosis

Aumento expresión BCL2 Aumento dosis génica

trans BCL6 (3q27) 25 Alt resp. daño al ADN Bloqueo dif. cél. B Aumento prolif cel Resistencia apoptosis

Desregulación transcripcional Pérdida autoreg BCL6

Mut bialél/deleción PRDM1/BLIMP1 (6q21)

25 Bloqueo diferenciación Pérdida de función

Mut bialél/deleción TNFAIP3 (A20) (6q23)

20 Activación constit NFkB Aumento SV celular

Pérdida reg negativa de NFkB

Mut activante MYD88 (3p22)

29 Act y ensamblaje del complejo IRK1/IRAK4

Ganancia de función Activación constit NFkB

Mut act CD79A/ CD79B (19q13/17q23)

20 Aumento expresión BCR Reducida activación Lyn

Ganancia de función Activación constit NFkB

Mut activante CARD11 (7p22)

9 Activación constit NFkB Aumento SV celular

Ganancia de función

Del homoc INK4/ARF (9p21)

? Inhibición apoptosis Inac camino p53

Pérdida de función

Rearreglo BCL-6 (3q27) (25%)

BCL 6: bloquea diferenciación de

células B del centro germinal.

- Activación por mecanismo de

sustitución del promotor.

LDCGB células B activadas (ABC)

Mutaciones /deleciones génicas (~50%)

Pasqualucci L, et al. Curr Opin Hematol 2013; 20: 336-44

BCL2 ampl (30%)

Inhibición apoptosis

Mutaciones (50%), Caminos de señalización -NFkB (CARD11, TNFAIP3 (A20) (9%) -BCR (CD79A/CD79B) (20%) - JAK/STAT (MYD88) (30%) - M/D PRDM1/BLIMP1 (25%) (bloquea diferenc)

Mutaciones que desregulan NF-kB

Bohers et al, Lek Lym 2015 ; 56: 1213-22

Linfoma primario mediastinal

Linfoma primario mediastinal

Linfoma primario mediastinal de células B

Alteración genómica

Frecuencia (%)

Consecuencias biológicas

Consecuencias funcionales

Amplif JAK2 (9p24) 50 Aumento de prolif y transfomación celular

Aumento de dosis génica Activación del camino JAK/STAT

Amplif PDL1/PDL2 50 Evasión resp. inmune mediada por células T

Aumento de dosis génica

Mut/del SOCS1 (16p13) 45 Aumento señaliz JAK2 Pérdida degradación JAK2

Mut /deleción TNFAIP3 (A20) (6q23)

36 Activación constit NFkB Aumento SV celular

Pérdida reg negativa de NFkB

Amp REL (2p13) 28 No claras Aumento dosis génica

Célula normal: JAK2—fosforila STAT—ingresa al núcleo—promueve activación génica—SOCS1 PMBCL: amp 9p24 (JAK2)/Mut SOCS1 (16p13)—JAK2 sobreexpresado—SOCS1 inactivo

Desregulación JAK2/STAT

Desregulación de NF-kB

Ganancia de REL (50%) Mut/del A20 (36%)

Bohers et al. Leuk & Lym 2015; 56: 1213-22

Distribución de mutaciones en los diferentes subtipos histológicos

Conclusiones

- Cada subtipo de LDCGB se encuentra asociado a alteraciones genómicas que llevan a la desregulación de diferentes vías de señalización.

- El subtipo CG presenta lesiones recurrentes a nivel de modificadores de histonas y cromatina, sugiriendo un rol crítico del remodelamiento epigenético durante la transformación maligna.

- El subtipo ABC se asocia a mutaciones y deleciones que impactan en el camino de señalización de NF-kB, de importancia patogénica.

-El PM presenta desregulación del camino de señalización JAK/STAT, con un rol crítico en su desarrollo.

-B-cell receptor (CD79A/CD79B) -NF-κB (CARD11; A20) -Toll like receptor (MYD88) -Immunity (CD58, TNFSRF14, B2M) -Cell cycle/apoptosis (TP53, BCL2) -Epigenetic regulation (EZH2, CREBBP, MLL2)

Vías de señalización

Leucemia linfocítica crónica

- Es la leucemia más frecuente en Occidente (40%

mayores de 65 años).

- La LLC es la consecuencia de la acumulación de

linfocitos B monoclonales, morfológicamente maduros

pero inmunológicamente incompetentes, en sangre

periférica, médula ósea y órganos linfoides.

- Esta acumulación es la resultante de una disminución de

la apoptosis y un aumento proliferativo de algunas células

B de la LLC.

Leucemia linfocítica crónica

Rearreglos genómicos y características clínicas

_______________________________________________________________________ Anomalía Frecuencia Características Clínicas _______________________________________________________________________ +12 15-28% Morfología atípica Necesidad de tratamiento Relativamente corta SV del(13q14) 5-15% Morfología típica (D13S319) 35-60% Pronóstico favorable (si es única alt) del(11q22) 5-10% LLC típica (ATM) 15-40% Linfopatías masivas Individuos jóvenes Corta SV del(17p13) 4-17% Más frecuentemente LLC atípica (TP53) Enfermedad avanzada Refractaria a los análogos de las purinas y agentes alquilantes _______________________________________________________________________

ATM TP53

13q14.3 miR-15a miR-16-1

- Genes miR-15a y miR-16-1

frecuentemente delecionados o con

expresión disminuida en pacientes

con LLC.

- Representarían los blancos de

inactivación por pérdida alélica en

LLC, pudiendo actuar como genes

supresores de tumor.

- miR-15a y miR-16-1 regulan

negativamente BCL-2 promoviendo la

apoptosis.

- Bajos niveles de estos miRNAs

inhiben la apoptosis, llevando al

desarrollo tumoral.

Calin et al; PNAS 2002; 99: 15524-9

microRNA

BCL-2 antiapoptótico

D13S319 C 12

13q34

Meltzer P et al, Nature 2005; 435: 745-6

miRNAs

-Son pequeñas moléculas de RNA no codificante de simple cadena (21 a 25 nucleótidos de longitud), que actúan como reguladores de la expresión génica.

- Más del 50% de los miRNAs están ubicados en regiones asociadas a cáncer.

Biogénesis

pri-miRNA

pre-miRNA ( 65 nt)

miRNA doble ( 22 nt)

RISC (RNA-induced silencing complex)

mRNA blanco (silenciamiento génico)

Mutaciones en leucemia linfocítica crónica

NOTCH1 (Notch homolog 1, translocation associated) (9q34.3) BIRC3 (baculoviral IAP repeat-containing protein 3) (11q22.2) SF3B1 (splicing factor 3B subunit 1) (2q33.1) MYD88 (Myeloid differentiation primary response 88) (3p22)

Mutaciones del gen NOTCH1 (9q34.3)

- Codifica para una proteína de transmembrana que actúa como un factor de transcripción (5-11%). - Asociada a +12 e IGVH no mutada

Fabri et al, J Exp Med 2011; 208: 1389-1401 Rossi et al, Blood 2012; 521-9

Mutaciones de BIRC3 (11q22) y SF3B1 (2q33)

BIRC3 - Inhibidor de la apoptosis (5%) - Asociada a activación constitutiva de NF-kB

Rossi et al, Blood 2012; 521-9

SF3B1 -Componente del espliceosoma, involucrado en la regulación del splicing (5-10%). -Asociado a del11q22 y mutaciones de ATM.

Rossi et al, Blood 2011;118: 6904-8

Puente et al, Nature 2012; 475: 101-5

Mutaciones del gen MYD88 (3p22)

Involucrado en el camino de señalización de IL-1 y de receptores Toll-like

% de mutaciones LLC TP53 ATM NOTCH1 SF3B1 BIRC __________________________________________________ Diagnóstico 10 20 5-10 5-10 5 Progresión 15 35 13-20 15 25 Rec/refractaria 45 35 13-20 20 25

Evolución de alteraciones

Foa et al, Haematologica 2013, 98: 675-85

Probabilidad de SV a 10 años

Heterogeneidad clonal

Modelos de evolución clonal

Evolución lineal

Recaída con cambios

adicionales en el clon

mayoritario.

Múltiples clones

Recaída con subclones

minoritarios al diagnóstico,

con ventajas selectivas y

proliferativas.

Corre J, et al. Blood 2015; 125: 1870-6

Manier et al, Nature Rev Clin Oncol 2017; 14:100-13

Estabilidad clonal (mismo clon antes y después del tratamiento)

Heterogeneidad intraclonal

-La progresión tumoral estaría definida por la expansión de un

determinado clon con ventajas selectivas y proliferativas que

se convertiría en dominante.

-La competencia entre las diferentes poblaciones clonales

podría influir en el resultado del tratamiento:

Si impacta sobre los clones agresivos sería favorable

Si afecta a los clones indolentes sería desfavorable.

Morgan G, et al. Nature Rev 2012; 12: 335-48

Malcikova J, et al. Hum Mutat 2014; 35:663-71.

Detección de subclones NGS

Malcikova J, et al. Leukemia 2015; 29: 877–85 Davide Rossi, et al. Blood. 2014;123: 2139-47

Muchas gracias!!!!

CREBBP: CREB Binding Protein (factor de transcripción) EP300: E1A Binding Protein P300 (histone acetyltransferase ) EZH2: Enhancer Of Zeste 2 Polycomb Repressive Complex 2 Subunit (transcriptional repression). MLL2: Mixed-Lineage Leukemia 2 (histone methyltransferase) PIK3CA: Phosphatidylinositol-4,5-Bisphosphate 3-Kinase, Catalytic Subunit Alpha (protein kinase). PTEN: Phosphatase And Tensin Homolog (tumor suppressor gene) REL: V-Rel Avian Reticuloendotheliosis Viral Oncogene Homolog (transcription factor) PRDM1/ BLIMP1: PR Domain Containing 1, With ZNF Domain (repressor of beta-interferon gene expression). TNFAIP3 (A20): Tumor Necrosis Factor, Alpha-Induced Protein 3 (inhibit NF-kappa B activation and TNF-mediated apoptosis). MYD88: Myeloid Differentiation Primary Response 88 (innate and adaptive immune response). CD79A/CD79B: CD79a Molecule, Immunoglobulin-Associated Alpha and Betta CARD11: Caspase Recruitment Domain Family, Member 11 (positive regulator of cell apoptosis and NF-kappaB activation) JAK2: Janus Kinase 2 (tyrosine kinase ) PDL1/PDL2: Programmed Death 1 Ligand 1/2 (CD38 co-stimulation). SOCS1: Suppressor Of Cytokine Signaling 1 (regulatorsof cytokine signaling)

Juskevicius et al, Haematologica 2017; 102: 1139-49

Recaída post-tratamiento

Más homogéneo

Más heterogéneo