PCR UAM 2012 - cbm.uam.esjalopez/Personal/Biorad/PresentaRicardoRamos.pdf · Aplicaciones...
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17/07/2012 1 CURSO DE BIOTECNOLOGÍA ELEMENTAL CURSO DE BIOTECNOLOGÍA ELEMENTAL “Biotechnology Explorer” Julio 2012 PCR Punto de No Retorno de la Biología Molecular Ricardo Ramos Ruiz Unidad de Genómica, Cantoblanco Parque Científico de Madrid TÉCNICAS DE ANÁLISIS EN BIOLOGÍA MOLECULAR Qué es un gen Técnicas de aislamiento y estudio de los genes La PCR como técnica alternativa Aplicaciones adicionales de la PCR La nueva generación de la Genómica TÉCNICAS DE ANÁLISIS EN BIOLOGÍA MOLECULAR Qué es un gen Técnicas de aislamiento y estudio de los genes La PCR como técnica alternativa Aplicaciones adicionales de la PCR La nueva generación de la Genómica BIOTECNOLOGÍA BASADA EN LAS TÉCNICAS DE LA BIOLOGÍA MOLECULAR DESCODIFICADA Genoma CODIFICADA P í f ió ll UNIDAD GENÉTICA: UN GEN (UN GEN - - - UNA FUNCIÓN) Proteína: función celular
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17/07/2012
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CURSO DE BIOTECNOLOGÍA ELEMENTALCURSO DE BIOTECNOLOGÍA ELEMENTAL“Biotechnology Explorer”
Julio 2012
PCRPunto de No Retorno de la Biología Molecular
Ricardo Ramos RuizUnidad de Genómica, CantoblancoParque Científico de Madrid
g
TÉCNICAS DE ANÁLISIS EN BIOLOGÍA MOLECULAR
Qué es un genTécnicas de aislamiento y estudio de los genesy g
La PCR como técnica alternativaAplicaciones adicionales de la PCRLa nueva generación de la Genómica
TÉCNICAS DE ANÁLISIS EN BIOLOGÍA MOLECULAR
Qué es un genTécnicas de aislamiento y estudio de los genesy g
La PCR como técnica alternativaAplicaciones adicionales de la PCRLa nueva generación de la Genómica
BIOTECNOLOGÍA BASADA EN LAS TÉCNICAS DE LABIOLOGÍA MOLECULAR
DESCODIFICADA
Genoma
CODIFICADA
P í f ió l l
UNIDAD GENÉTICA: UN GEN (UN GEN - - - UNA FUNCIÓN)
Proteína: función celular
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GENOMICS
<<The study of genes and their function>>
Cells organize their genetic material in genesthat can be investigated at the molecular level
las tres funciones esenciales de los ácidos nucleicos
Finalidad:
1. REPLICACIÓN PERPETUACIÓN
2. TRANSCRIPCIÓN
ÓEXPRESIÓN GÉNICA
DNA paterno DNA hijo
3. TRADUCCIÓN
DNA GENÓMICO RNA intermediario proteína
transcripción traducción
A number of 20,000 genes is estimated in humansMost cells are supposed to actively express some thousands
ESTRUCTURA DEL DNA:Bases nitrogenadas
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DNA: Enlaces de hidrógeno
HIBRIDACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS
DNA: Enlaces de hidrógeno
G C
C G
A T
HIBRIDACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS
A T
T A
DNA: Doble hélice
LA ESTRUCTURA DETERMINA LA FUNCIÓN
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LA HIBRIDACIÓN / DESNATURALIZACIÓN ES UN PRCESO REVERSIBLEFactores que afectanla eficacia de hibridación:• Longitud de bases (tramo que se aparea)• Temperatura• Presencia de mismatches• Porcentaje de G C• Porcentaje de G-C
Especificidad /Efi i
HIBRIDACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS
Eficacia
TÉCNICAS DE ANÁLISIS EN BIOLOGÍA MOLECULAR
Qué es un genCómo describimos un geng
Técnicas de aislamiento y estudio de los genesLa PCR como técnica alternativaAplicaciones adicionales de la PCRLa nueva generación de la Genómica
1. LOCALIZACIÓN DENTRO DEL GENOMA2. DETERMINACIÓN DE LA SECUENCIA3. CONOCIMIENTO DE LOS ELEMENTOS REGULADORES
CARACTERIZACIÓN DE UN GEN
3. CONOCIMIENTO DE LOS ELEMENTOS REGULADORES4. PERFIL DE EXPRESIÓN GÉNICA5. GENES REGULADORES, GENES ASOCIADOS, GENES RELACIONADOS6. VARIANTES PRESENTES EN LA POBLACIÓN7. VARIANTES ASOCIADAS A ENFERMEDAD
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AISAMIENTO DEL RESTO DEL GENOMA PURIFICACIÓN PERPETUACIÓN (COPIAR CRECER MANTENER)
CÓMO SE CARACTERIZA UN GEN
PERPETUACIÓN (COPIAR, CRECER, MANTENER)
GENOMA HUMANO: 3x 10 9
GEN (DNA): ~ 10 5( )
GEN (RNA): ~ 10 3
RECORTAR NUCLEÓTIDOS PURIFICAR PERPETUAR (COPIAR, CRECER, MANTENER)
CÓMO SE “AISLA” UN GEN
PERPETUAR (COPIAR, CRECER, MANTENER)
ENZIMAS DE RESTRICCIÓN(endonucleasas)
46 = 4096
PROMEDIO DE APARICIÓN DE UNA SECUENCIA CUALQUIERADE HEXANUCLEÓTIDOS
ORIGEN BIOLÓGICO DE LASENDONUCLEASAS DE RESTRICCIÓN
TRANSFORMACIÓN BACTERIANA CON DNA EXÓGENO
procedente de otra bacteriao de un origen distinto
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LAS ENZIMAS DE RESTRICCIÓN DEFIENDENA LAS BACTERIAS DE UN “ATAQUE” EXCESIVO
DE DNA EXÓGENO
MAPAS DE RESTRICCIÓN
=…
AISAMIENTO DEL RESTO DEL GENOMA PURIFICACIÓN PERPETUACIÓN (COPIAR CRECER MANTENER)
CÓMO SE CARACTERIZA UN GEN
PERPETUACIÓN (COPIAR, CRECER, MANTENER)
OBTENCIÓN DE UN CLON (UNA COLONIA) DE BACTERIAS“TRANSFORMADAS” (HAN INTEGRADO) DNA EXÓGENO
(“RECOMBINANTES”)( RECOMBINANTES )
LOS DOS COMPONENTES DEL CLONAJE
Fragmentos (específicos)
Vector (No específico)PLÁSMIDOS
OTROS VECTORES: virus, YACs…
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Selección de clones positivos
SELECCIÓN DE UN CLON RECOMBINANTEMEDIANTE HIBRIDACIÓN
COLONIA POSITIVAS :Crecen en AmpCrecen en AmpBlancas en X-GalPositivas para una sonda específica
CARACTERÍSTICAS DEL CLONAJEDE FRAGMENTOS DE RESTRICCIÓN
ESTABLE DNA VIAJA DENTRO DE OTRO DNA
AUTOPERPETUACIÓN REQUIERE PURIFICACIÓN
MATERIAL BIOLÓGICO
TÉCNICAS DE ANÁLISIS EN BIOLOGÍA MOLECULAR
Algunos resultados
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TÉCNICAS DE ANÁLISIS EN BIOLOGÍA MOLECULAR
Qué es un genCómo describimos un geng
Técnicas de aislamiento y estudio de los genesLa PCR como técnica alternativaAplicaciones adicionales de la PCRLa nueva generación de la Genómica
UNA ALTERNATIVA AL CLONAJEDE FRAGMENTOS DE RESTRICCIÓN
PCR
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LA PCRES UNA COPIA DEL MECANISMO NATURAL
DE REPLICACIÓN(POLIMERIZACIÓN DE NUCLEÓTIDOS COPIANDO UN MOLDE)
Semiconservativa: cada cadena sirve de moldeLa incorporación se basa en la complementariedad de basesElongación a partir de un cebadorSíntesis en condiciones de fidelidad (reparación de errores)Baja especificidad (nulo efecto de secuencia ni organismo)
enzima (catalizador): polimerasa termoestable
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¿Cómo funciona la PCR?
OLIGOS, PRIMERS, CEBADORES
DIDEOXINUCLEOTIDOS
cada producto es molde de la siguiente reacción MÁXIMA SENSIBILIDAD
COMPARACIÓN PCR - CLONAJE
ESTABLE DNA VIAJA DENTRO DE OTRO DNA:
AUTOPERPETUACIÓN REQUIERE PURIFICACIÓN
MATERIAL BIOLÓGICO
NO REQUIERE PURIFICACIÓN
NO SE AUTOPERPETÚA
SENSIBILIDAD SUJETO A ERRORES DESENSIBILIDAD EXCEPCIONAL
SUJETO A ERRORES DE COPIA
REACCIÓN IN VITRO
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LA PCR RESUELVE EL PROBLEMA DE ENCONTRAR UNA AGUJA EN UN PAJAR:MILES DE MILLONES DE AGUJAS SE LOCALIZAN CON FACILIDAD
PRINCIPALES APLICACIONESTécnicas preparativas:Clonaje de fragmentos reacciones de secuenciaciónClonaje de fragmentos, reacciones de secuenciación
Técnicas analíticas:Detección de patógenosColonias positivas en un clonajeCuantificación génica
REQUISITOS PREVIOS
Conocimiento previo de secuencia LIMITADO HOMOLOGÍA con otras especies
VENTAJAS
Amplificación hasta millones de veces:productociclo n= sustratociclo n+1
S ibilid dSensibilidad desde 1 copiaAutomatización por cambios de temperatura
enzimas termoestablesSencillez: componentes: buffer, primers molde, dNTPsModificable por: composición de primers, aditivos del buffer,
polimerasa, temperaturap , pEstandarización componentes controladosAdaptable a múltiples necesidades (hot start, XL-PCR
nucleótidos modificados...)
INCONVENIENTES
Introducción de errores que quedan fijadosproductociclo n= sustratociclo n+1
S ibilid dSensibilidad desde 1 copia, también detecta contaminantesLimitaciones inherentes a la reacción de polimerización
longitud, agotamiento, reparación de erroresSistema in vitro No es ilimitada
… a pesar de los cuales se ha transformado en la técnica de elecciónpara clonar fragmentos, detectar variantes, buscar positivos …
TÉCNICAS AVANZADASBASADAS EN PCRBASADAS EN PCR
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PCR a tiempo realReacción exponencial
Finalización:Agotamiento de reactivos (oligos,dNTPs)Inhibición por productoCompetición de los productos amplificados
con los primers
96-replicate - Real TimePCR experiment
END
Repo
rter
sig
nal
0 6
0.8
1
1.2
1.4
1.6
ENDPOINT
+
+/-
Nor
mal
ized
R
Number of cycles
0
0.2
0.4
0.6
10 20 30 40
-PCR-Q
+
Perfiles de expresión asociadosa procesos biológicos
… C G T G T [A/G] T C C C T …
SEQUENCING: Revealing the primary structure of DNASanger sequencing on ≈ 1,000 base pairs
patient #202patient #28 patient #21[G/G] [A/G] [A/A]
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Identify contaminant bacteria or fungi
MÚLTIPLES APLICACIONES DE SECUENCIACIÓN:SE DEFINE REGIÓN DE INTERÉS PERO NO SE RESTRINGE SU LOCALIZACIÓN TÉCNICAS DE ANÁLISIS EN BIOLOGÍA MOLECULAR
Qué es un genCómo describimos un geng
Técnicas de aislamiento y estudio de los genesLa PCR como técnica alternativaAplicaciones adicionales de la PCRLa nueva generación de la Genómica
NGS or MASIVE PARALLEL SEQUENCINGconsists in ultra‐high throughput sequencing of
whole genomes
La nueva Generación de la genómica
whole genomesBased on PCR‐amplification
Demanding high capacities inDNA or cDNA library prepsEnrichmentComputing
Offering:No previous knowlwdgeNo matter how complex> 1 Gb per dayComputing > 1 Gb per day
PREPARACIÓN DE GENOTECASSIN ETAPA DE CLONAJE EN BACTERIAS
Binding to primer‐specific beadsor to primer‐bound surfaces
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RESULTADO:LECTURA DE ALTÍSIMA PRODUCTIVIDAD
(HASTA 4 Gb al DÍA)
READ ASSEMBLY
DOS EJEMPLOS
CANCER ATLAS
1.000 GENOMES
MEDICINA PERSONALIZADA
GENOME SEQUENCING
Clinical application:Acceso al genoma individual al alcance de la mano
LA VERDADERA MEDICINA PERSONALIZADA= LA VERDADERA MEDICINA PERSONALIZADA
www.fpcm.es
¡Gracias por vuestra atención!
