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REPÚBLICA BOLIVARIANA DE VENEZUELA UNIVERSIDAD DEL ZULIA

FACULTAD DE INGENIERÍA DIVISIÓN DE POSTGRADO

PROGRAMA DE POSTGRADO EN INGENIERÍA QUÍMICA

OBTENCIÓN DE AZÚCARES FERMENTABLES A PARTIR DEL BAGAZO DE LA CAÑA DE AZÚCAR MEDIANTE LA HIDRÓLISIS ÁCIDA

DILUIDA EN DOS ETAPAS

Trabajo de Grado presentado ante la Ilustre Universidad del Zulia

para optar al Grado Académico de

MAGÍSTER SCIENTIARUM EN INGENIERÍA QUÍMICA

Autor: Ing. Nercy Josefina Villalobos Quintero. Tutora: Cintia Chandler

Co-tutora : Cateryna Aiello Mazzarri

Maracaibo, febrero de 2012.

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Villalobos Quintero, Nercy Josefina. Obtención de azúcares fermentables a partir del bagazo de la caña de azúcar mediante la hidrólisis ácida diluida en dos etapas (2012). Trabajo de Grado. Universidad del Zulia. Facultad de Ingeniería. División de Postgrado. Maracaibo. República Bolivariana de Venezuela. p.83. Tutora: Cintia Chandler. Co-tutora: Cateryna Aiello Mazzarri.

RESUMEN El objetivo de esta investigación fue obtener azúcares fermentables a partir de la hidrólisis ácida diluida en dos etapas del bagazo de la caña de azúcar. La hidrólisis se llevó a cabo en un reactor autoclave de 100mL de capacidad, tiempo de reacción de 3 minutos, 1%v/v de ácido sulfúrico y relación líquido-sólido de 15:1. La primera etapa de la hidrólisis se realizó en un rango de temperatura de 100-160 ºC. La fase sólida se separó de la fase líquida mediante filtración al vacío, el hidrolizado se almacenó bajo refrigeración a ± 4°C y el sólido remanente se utilizó en la segunda etapa, la cual se realizó a dos temperaturas: 160 y 180°C, manteniendo constante el resto de las condiciones. La temperatura tiene un efecto significativo sobre la producción de azúcares reductores, así como también en la generación de subproductos tóxicos para los microorganismos. Los mejores valores de temperatura para la hidrólisis del bagazo de caña de azúcar mediante dos etapas secuenciales por carga son 140°C para la primera etapa y 180°C para la segunda. La presencia de furfural, hidroximetilfurfural, acido acético y compuestos fenólicos indican que se producen reacciones de degradación asociadas tanto a pentosas y hexosas derivadas de la hidrólisis de la hemicelulosa y la celulosa. La conversión total de azúcares reductores, expresados como glucosa, a partir de las dos etapas secuenciales de hidrólisis fue de 306,07 g/Kg de bagazo seco, equivalente al 39,41% del valor teórico.

Palabras Clave: Bagazo de caña de azúcar, hidrólisis en dos etapas, ácida diluida, azúcares fermentables, compuestos inhibidores. E-mail: nercyvillalobos@hotmail.com

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Villalobos Quintero, Nercy Josefina. Obtaining fermentable sugars from bagasse of sugarcane by dilute acid hydrolysis in two stages (2012). Trabajo de grado. Universidad del Zulia. Facultad de Ingeniería. División de Postgrado. Maracaibo. República Bolivariana de Venezuela p.83.Tutora: Cintia Chandler. Co-tutora: Cateryna Aiello Mazzarri.

ABSTRACT

The aim of this research was to obtain fermentable sugars from two stages diluted-acid hydrolysis of sugarcane bagasse. The hydrolysis was conducted in a 100 mL autoclave reactor, reaction time of 3 minutes, 1% v/v sulphuric acid and liquid-solid ratio of 15:1. The first stage of hydrolysis was performed in a temperature range of 100-160ºC. The solid phase was separated from the liquid phase by vacuum filtration, the hydrolyzate was cooled to ± 4ºC and the remaining solid was used in the second stage, which was conducted at two temperatures: 160 and 180ºC, maintaining constant the other conditions. Temperature had a significant effect on the sugar production, as well as on the generation of by products toxic to microorganisms. The best values of temperature for the hydrolysis of sugar cane bagasse by two sequential batch stages were 140 and 180°C for the first and second, respectively. The presence of furfural, hydroxymethylfurfural, acetic acid, and phenolic compounds indicated that degradation reactions associated with both pentoses and hexoses, derived from the hemicellulose and cellulose hydrolysis were occurring. Total fermentable sugars yield from the sequential batch stages was 306, 41 g/Kg dry matter, equivalent to 39,41% of the theoretical value. Key words: Sugarcane bagasse, two-stage hydrolysis, dilute-acid hydrolysis, fermentable sugars, inhibitory compounds.

E-mail: nercyvillalobos@hotmail.com

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DEDICATORIA

Este trabajo va dedicado a lo más hermoso

que Dios me ha dado, mi hijo Jesús David

y a la memoria de mi querida madre, Nora

5

AGRADECIMIENTO

A Dios por sobre todas las cosas, por darme fortaleza para seguir adelante.

A mi madre que está en el cielo, por haber hecho de mí todo lo que soy.

A mi hijo Jesús David, por haber cambiado mi vida.

A mi familia, por apoyarme en todo momento y acompañarme a cumplir esta

meta. Sin ellos no hubiese sido posible.

A la Profesora Cintia Chandler, por darme la oportunidad de realizar este

trabajo de investigación, por sus sabios consejos, por decirme “si se puede”

cuando más lo necesité, por brindarme una buena relación tutor-tesista. A

usted profe mil gracias.

A la Profesora Cateryna Aiello, por su ayuda incondicional, su orientación y

su apoyo en todo momento.

A Elsy Arenas, por compartir conmigo sus conocimientos y ofrecerme siempre

una mano amiga.

A mis amigas Yadira Cubillán y Pragedes Paredes, por estar siempre

conmigo, brindándome su apoyo.

Al personal del Laboratorio de Tecnología de Alimentos y Fermentaciones

Industriales, en especial a la Profesora Marisela Rincón, al Ing. Albert Zabala,

al Br. Jhon Sánchez y a la Profesora Karelen Araujo por su inmensa

colaboración.

Al Consejo de Desarrollo Científico, Humanístico y Tecnológico (CONDES),

por su apoyo en el financiamiento para la realización de la tesis.

Al Postgrado de Ingeniería por su colaboración en todo momento.

A la Profesora Gisela Páez, por su disposición incondicional y su

comprensión.

A los Profesores Gilberto Colina y Gerson Chávez, por contribuir con sus

conocimientos en la realización de este trabajo.

Al Instituto Zuliano de Investigaciones Tecnológicas (INZIT) por toda la

colaboración prestada, en especial al Dr. Alexis Ferrer y a la Lic. Josybel.

Ríos. Gracias amiga por todo tu apoyo.

A todo el personal del INSUC, por adoptarme como tesista del instituto y por

ayudarme en todo momento, especialmente a la Profesora Dora Finol y al

Profesor Eduardo González.

6

A Laira Chirinos, por los momentos de amistad compartidos y su ayuda.

Y a todas aquellas personas que de una u otra forma prestaron su más

sincera ayuda para hacer posible la realización de esta investigación.

Nercy

7

TABLA DE CONTENIDO

Página

RESUMEN……………………………………………………………………………. 3

ABSTRACT…………………………………………………………………………… 4

DEDICATORIA……………………………………………………………………….. 5

AGRADECIMIENTO…………………………………………………………………. 6

TABLA DE CONTENIDO. …………………………………………………………... 8

LISTA DE TABLAS…………………………………………………………………... 10

LISTA DE FIGURAS…………………………………………………………………. 11

INTRODUCCIÓN…………………….....……………………………………............ 12

CAPÍTULO

I REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA............... ………………………………………. 14

II METODOLOGÍA EXPERIMENTAL...........…………………………………… 32

2.1 Sustrato………………………………...................................................... 32

2.2 Caracterización del bagazo................................................................... 32

2.3 Hidrólisis ácida diluida……….……………………………………………. 33

2.4 Análisis de las muestras........................................................................ 34

2.5 Análisis de datos……………………………………………………………. 36

III RESULTADOS Y DISCUSIÓN…..........................………………………….. 37

3.1 Composición del bagazo de caña de azúcar……………………………. 37

3.2 Primera etapa de hidrólisis………………………………………………… 38

3.3 Segunda etapa de hidrólisis………………………………………………. 47

CONCLUSIONES…………………………………………………………………… 51

RECOMENDACIONES…………………………………………………………….. 52

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS……………………………………………….. 53

APÉNDICES…................................................................................................... 58

A: Procedimiento para el manejo del reactor autoclave parr 4593……………... 58

B: Determinación de nitrógeno y proteína cruda…………………………………. 59

C: Determinación de fibra neutro detergente, fibra ácido detergente y lignina ácida detergente………………………………………………………………………

61

D: Método de ácido 3,5 dinitrosalicílico (DNS)……………………………………. 68

E. Determinación de compuestos fenólicos……………………………………….. 71

8

Página

F: Curvas de calibración para la determinación de compuestos fenólicos, ácido acético, furfural e hidroximetilfurfural……………………………………….. 72

G: Cromatogramas............................................................................................. 75

H: Resultados experimentales............................................................................ 76

9

LISTA DE TABLAS

Tabla Página

1 Tipos de inhibidores y sus estructuras químicas…………………… 27

2 Caracterización del bagazo de caña de azúcar sin hidrolizar……. 37

3 Rendimiento de los azúcares reductores producidos en la primera etapa de la hidrólisis con ácido sulfúrico diluido al 1%, relación líquido-sólido de 15:1 y diferentes temperaturas…………………..

39

4 Contenido de celulosa y hemicelulosa en el bagazo de caña de azúcar sometido a la primera etapa de hidrólisis…………………... 41

5 Contenido de lignina en el bagazo de caña de azúcar sometido a la primera etapa de hidrólisis………………….................................

46

6 Valores promedio de los resultados obtenidos en la primera etapa de hidrólisis………………...............................................................

46

7 Producción de azúcares reductores durante la segunda etapa de la hidrólisis (H2E) del bagazo de la caña de azúcar con ácido sulfúrico diluido al 1%, relación líquido-sólido de 15:1 y diferentes temperaturas……………………………………………………………..

47

8 Contenido de furanos, ácido acético y compuestos fenólicos generados durante la segunda etapa de la hidrólisis (H2E) del bagazo de la caña de azúcar con ácido ácido sulfúrico diluido al 1%, relación líquido-sólido de 15:1 y diferentes temperaturas …....

48

9 Temperaturas seleccionadas en las etapas de la hidrólisis ácida y concentración de los productos obtenidos en cada etapa………….

50

10

LISTA DE FIGURAS

Figura Página

1 Fuente de energía en la biomasa..................................................... 14

2 Representación de la estructura lignocelulósica.............................. 15

3 Estructura del polímero de celulosa…………………………………... 15

4 Estructura representativa de la celulosa……………………………… 16

5 Representación esquemática de la estructura de la hemicelulosa... 17

6 Representación esquemática de la estructura de química de la lignina...............................................................................................

20

7 Estructuras de los alcoholes precursores de la lignina……………... 21

8 Degradación de la celulosa y hemicelulosa…………………............ 28

9 Productos de la degradación de la lignina....................................... 30

10 Reactor Autoclave modelo 4593 (Pressure Reaction Apparatus, Parr Instruments)………………………………………………………..

34

11 Producción de azúcares reductores durante la primera etapa de las hidrólisis con ácido sulfúrico diluido al 1%, relación líquido–sólido de 15:1 y diferentes temperaturas (H1E-xxx : hidrólisis primera etapa a 100, 120,140 y 160°C)………………………………

38

12 Concentración de furfural e hidroximetilfurfural (HMF) en el hidrolizado producto de la primera etapa de hidrólisis (H1E) del bagazo de caña de azúcar a diferentes temperaturas (100, 120, 140 y 160°C)…………………………………………………………......

42

13 Concentración de ácido acético en el hidrolizado producto de la primera etapa de hidrólisis (H1E) del bagazo de caña de azúcar a diferentes temperaturas (100, 120, 140 y 160°C)……………………

44

14 Concentración de compuestos fenólicos en el hidrolizado producto de la primera etapa de hidrólisis (H1E) del bagazo de caña de azúcar a diferentes temperaturas (100, 120, 140 y 160°C)………...

45

11

INTRODUCCIÓN

El bagazo de caña de azúcar es un material lignocelulósico constituido

principalmente por celulosa (38-50%), hemicelulosa (17-32%) y lignina (15-30%). Se

obtiene como subproducto en los centrales azucareros y representa

aproximadamente entre el 25 y 40% del total de materia procesada, dependiendo del

contenido de fibra de la caña y la eficiencia en la extracción del jugo (Pernalete y

col., 2008; Vargas y col., 2011).

Debido al alto contenido de carbohidratos y al bajo contenido de lignina, así como

su disponibilidad a nivel agroindustrial, se considera que el bagazo es un residuo

agroindustrial con un alto potencial para obtener azúcares fermentables. Para tal

efecto se utilizan una serie de tratamientos, siendo la hidrólisis ácida uno de los

métodos más utilizado para solubilizar la fracción de hemicelulosa y permitir el

acceso hacia la celulosa. Estas hidrólisis se pueden realizar con ácido concentrado o

diluido, siendo el uso de ácidos concentrados menos atractivo para la producción de

etanol debido a la formación de compuestos inhibidores. Además, ocurren

problemas de corrosión en los equipos, difícil recuperación del ácido y alto costo de

mantenimiento operacional, lo que hace que el método de poco interés a escala

comercial (Alvira y col., 2010).

Con la hidrólisis ácida diluida se tienen las siguientes ventajas: consumir menos

cantidad de ácido comparado con la hidrólisis con ácido concentrado. Solubilizar la

hemicelulosa, principalmente xilano, facilitando así la conversión de azucares

fermentables. Sin embargo, dependiendo de la temperatura del proceso, se pueden

generar algunos compuestos de degradación de los azúcares, furfural e

hidroximetilfurfural, y de la lignina, los cuales afectan el metabolismo del

microorganismo en la etapa de fermentación (Alvira y col., 2010).

Quizás la mayor desventaja de la hidrólisis con ácidos diluidos radica en la

formación de compuestos que inhiben el crecimiento de microorganismos durante la

fermentación a etanol. Para evitar la degradación de los azúcares a altas

temperaturas, así como la formación de inhibidores, la hidrólisis se puede llevar a

cabo en dos etapas. Una primera etapa para convertir la hemicelulosa en sus

monómeros constituyentes, a temperaturas relativamente bajas (100-160ºC). Una

segunda etapa en la cual se hidroliza el sólido restante, transformando a la celulosa

12

en glucosa, bajo condiciones más severas, a temperaturas más elevadas, entre 200-

240 ºC (Sánchez y col., 2008; Gírio y col., 2010).

Estudios previos reportan que en la primera etapa se obtiene un rendimiento de

azúcares, pentosas y hexosas de la hemicelulosa, entre 80 y 95% de los azúcares

disponibles, mientras que en la segunda etapa el rendimiento de la hidrólisis de la

celulosa es bajo, entre 40 y 60% (Nguyen y col., 1999; Kim y col., 2005; Karimi y

col., 2006; Taherzadeh y col., 2007). Estos bajos rendimientos parecieran no ser un

problema si se consideran los bajos costos de los materiales lignocelulósicos y la

posibilidad de utilizar el material residual en la producción de energía. Sin embargo,

las condiciones de la hidrólisis en cada etapa deben ser estudiadas dependiendo del

material a utilizar, ya que la complejidad estructural y composición depende del tipo

de residuo o desechos que se esté utilizando.

El objetivo de esta investigación fue encontrar las mejores condiciones de

hidrólisis del bagazo de caña de azúcar, utilizando un proceso en dos etapas con

ácido sulfúrico diluido, que permitan obtener el mayor rendimiento en la producción

de azúcares, evaluando a su vez la formación de subproductos que puedan inhibir el

crecimiento de los microorganismos empleados en las fermentaciones.

14

CAPÍTULO I

REVISION BIBLIOGRÁFICA

La caña de azúcar es una gramínea característica de las zonas tropicales y

subtropicales, la cual ha sido cultivada para producir azúcar y generar una gran

cantidad de productos, que a su vez se convierten en materia prima para la

producción de etanol, pasta de papel, alimento para animales, furfural e

hidroximetilfural, entre otros (Pattra y col., 2008; Abreu y De la Rosa, 2011).

El bagazo de caña de azúcar es un residuo poroso que se genera después de la

extracción del jugo de la caña de azúcar y representa el 25% de la masa total. Brasil

genera grandes cantidades de bagazo en la producción de azúcar; durante la zafra

del 2010-2011 más de 629 millones de toneladas de caña de azúcar fueron

trituradas, las cuales generaron alrededor de 229 millones de toneladas de residuos

sólidos (De Moraes y col., 2011). Este residuo está constituido por 43,8% celulosa,

28,6% de hemicelulosa, 23,5% de lignina, 1,3% de cenizas, y 2,8% de otros

componentes (Pereira y col., 2011).

La biomasa se define como toda aquella materia orgánica, ya sea vegetal, animal

o procedente de su transformación natural o artificial. Estas provienen de la

fotosíntesis, la cual es un proceso por el cual los cloroplastos presentes en las

células vegetales son capaces de formar sustancias más complejas a partir del CO2

existente en el aire, utilizando la energía solar como catalizador y promotor de esta

reacción (Figura 1).

Figura 1. Fuente de energía en la biomasa (Saidur, R. y col., 2011)

15

Básicamente la celulosa forma un esqueleto el cual está rodeado por

hemicelulosa y lignina, como se ilustra en la Figura 2. Adicionalmente, se encuentran

presentes las fracciones químicas como: el agua procedente de los fluidos biológicos

de la planta y del carácter higroscópico de los residuos, su proporción en los

materiales lignocelulósicos depende de las condiciones ambientales; las cenizas

procedentes de sales minerales tales como cloruros y sulfatos, así como también de

incrustaciones (sílice); los extractos correspondientes a restos de los fluidos

biológicos de las plantas y se denominan así por ser fácilmente extraíbles con

distintos disolventes y las proteínas (Caparrós, 2009).

Figura.2. Representación de la estructura lignocelulósica. (Mussato y col., 2010)

La celulosa, es un homopolímero lineal compuesto de monómeros de D-glucosa

unidos por enlaces glicosídicos (1-4), en los que dos moléculas de glucosas se

unen con la eliminación de una molécula de agua entre dos hidroxilos de los

carbonos 1 y 4, como se puede observar en la Figura 3.

Figura 3. Estructura del polímero de celulosa

16

La configuración sólo es posible por la rotación de la unidad de glucosa

siguiente del eje C1-C4 del anillo de la piranosa, por eso la unidad de cadena de

celulosa que se repite es la celobiosa (disacárido). Los numerosos grupos hidroxilo

favorecen la formación de enlaces de hidrógeno intra e intermoleculares, formando

en cada unidad de glucosa dos enlaces intramoleculares y uno intermolecular. Los

enlaces de hidrógeno intermoleculares se establecen con otras cadenas que están

en el mismo plano, así como con cadenas en planos superiores e inferiores, de este

modo, las cadenas de celulosa se unen dando lugar a microfibrillas, y la unión de

estas entre sí a la fibra de la celulosa, cuyos agregados forman la pared celular

(Márques, 2010). En la Figura 4 se muestra una representación esquemática de la

estructura de la celulosa en la cual se distinguen los enlaces de hidrógeno que se

forman.

Figura 4. Estructura representativa de la celulosa (Adaptada de Márques, 2010)

Los enlaces de hidrógeno intermoleculares son los que permiten una estructura

altamente cristalina en la celulosa. En cambio, en las zonas amorfas el número de

enlaces por puentes de hidrógeno establecidos es menor y más desorganizado que

en las zonas cristalinas, siendo por lo tanto, la celulosa amorfa más fácil de disolver

y más reactiva, pues la accesibilidad a los grupos hidroxilos es mayor (Márques,

2010).

17

Las regiones donde las microfibrillas presentan una estructura altamente

ordenada se llaman regiones cristalinas y las regiones con una estructura menos

ordenada se denominan amorfas, por ello la celulosa se considera un polímero

semicristalino. Las dos formas cristalinas que se encuentran en la celulosa nativa, es

decir, en las fibras naturales, son la celulosa I y la celulosa II, siendo la más

abundante la celulosa I, donde las cadenas de glucosa están orientadas

paralelamente. Por el contrario, en la celulosa nativa II, que es sintetizada

principalmente por algas y algunas bacterias, las cadenas de glucosa son

antiparalelas (Tomás, 2010).

La hemicelulosa es un heteropolisacárido de D-xilosa, D-glucosa, D-manosa, D-

galactosa, L-arabinosa, ácido D-glucurónico y ácido 4-O-metil-D-glucurónico, cuya

estructura se representa en la Figura 5. Es el segundo polisacárido más abundante

en el mundo vegetal después de la celulosa, representa aproximadamente el 25-

35% de la biomasa lignocelulósica. Dentro de las hemicelulosas pueden incluirse

otros componentes que presentan una estructura y composición química relacionada

con ella, aunque no formen parte de la pared celular, como las sustancias pécticas

(Waldford, 2008, Gómez F., 2008).

Figura 5. Representación esquemática de la estructura de la hemicelulosa

HOOC

HOOC

ácido p-cumáricoácido [4-metoxil]-D-glucurónico

ácido D-glucurónico

L-arabinof uranosa

ácido f erúlico

cadena central de D-xilopiranosa

O

HOH

HH

H

H

OOH

OH

O

HO

HH

H

H

OOH

H

O

HOH

HH

H

H

OOH

H

O

HOH

HH

H

H

OHO

H

O

OH

HH

H

H

H OHOH

O

HO

HH

H

H

OH

OH

O

OH

HH

H

H

H OHOCH3

OH

OH

H

H

OH

CH2

H

O

OH

OCH3

C

O

OH O

HO

HH

H

H

H

O

OH

O O

CH3

18

Las hemicelulosas se clasifican de acuerdo al azúcar que esté presente en la

cadena principal del polímero en xilanos, mananos, galactanos, glucanos y

xiloglucanos.

Los xilanos son los heteropolímeros mayoritarios en las maderas de

frondosas (también llamadas maderas duras) y en residuos agrícolas,

apareciendo en porcentajes apreciables en las maderas resinosas (maderas

blandas). En las maderas de resinosas aparece como arabinoglucoxilano, que

corresponde a un esqueleto de xilosa con residuos laterales de ácido

metilglucurónico o arabinofuranosa (muy susceptible a los ácidos por su anillo

de cinco miembros), que estabilizan la molécula frente a las bases. En las

maderas de frondosas es frecuente la sustitución de xilanos con grupos 4-O-

acetil-metil-glucourónico. Es un polímero más largo (grado de polimerización

medio de aproximadamente 190 unidades) que también presenta sustitución

con grupos acetilo. Como promedio cada 7 monómeros de xilosa tienen un

sustituyente acetilo, unido por igual al carbono 2, al 3. Las ramificaciones son

de una o dos unidades, normalmente de ácido metilglucurónico o de grupos

acetilo, encontrándose trazas de arabinosa y otros monómeros. En los

materiales agrícolas encontramos diversidad de xilanos, normalmente más

parecidos a los de las frondosas pero con más arabinosa. Por ejemplo, en

materiales como el bambú, la cebada o canela, presentan heteropolímeros

similares a los de las maderas frondosas, con menor grado de polimerización

(90-130) y una distribución de azúcares diferente destacando la mayor

cantidad de arabinosa.

Los mananos son el heteropolímero principal en las maderas resinosas, y

aparece en pequeñas proporciones en maderas frondosas y en materiales

agrícolas. Los enlaces entre unidades de manosa son más fácilmente

hidrolizables por ácidos que entre unidades de glucosa. En las maderas

frondosas aparecen cadenas formadas por manosa y glucosa, sin

ramificaciones. En maderas resinosas y materiales agrícolas se observa el

mismo esqueleto pero con ramificaciones de galactosa, muy susceptibles a la

hidrólisis con ácidos, y ramificaciones de un grupo acetilo. Pueden

distinguirse dos tipos en función de la cantidad de galactosa (que recibe el

nombre de galactoglucomananos o glucomananos). A mayor número de

19

unidades de galactosa aumenta la solubilidad en agua y disminuye la

solubilidad en álcalis.

Los galactanos están presentes en pequeñas proporciones en las maderas de

resinosas (0,5-3%) salvo en los alerces, en que pueden llegar al 25%.

Normalmente se encuentran en el espacio intercelular. Son polímeros muy

ramificados, con residuos laterales de arabinosa y/o ácidos urónicos o

cadenas de varias unidades que comienzan por galactosa. Los galactanos

son polisacáridos extracelulares muy solubles en agua, por lo que resulta

habitual introducirlos en la fracción de extractos. Aparecen también en

maderas de frondosas con ramnosa en las ramificaciones, pudiendo

encontrarse en menores proporciones xilosa, ácido glucurónico y ácido

galacturónico.

Los glucanos son polímeros compuestos mayoritariamente por unidades de

glucosa, sin incluir la celulosa. Hay un heteropolímero llamado laricina,

presente en maderas resinosas y algunos materiales agrícolas en porcentajes

del 2-4%, con grado de polimerización de 170-205, ramificado y con enlaces

, 1-3. La laricina presenta trazas de ácidos glucurónico y galacturónico y

fracciones (el 6-7% del total del polímero) pueden presentar enlaces , 1-4.

Los xiloglucanos están presentes en pequeñas proporciones en las maderas

resinosas. Es un heteropolímero de glucosa (con enlaces ,1-4) y xilosa (, 1-

6) que puede presentar trazas de arabinosa, galactosa, mucosa, ramnosa y

grupos acetilo. Probablemente desempeñen su función durante el crecimiento

de la planta.

La lignina es un polímero tridimensional aromático formado por la condensación

oxidativa de precursores fenólicos. Es muy amorfo y heterogéneo constituido a partir

de unidades de fenilpropano oxigenadas (p-coumaril, coniferil y alcohol sinapílico)

unidas por enlaces carbono-carbono o enlaces tipo éter (Figura 5). Es importante

destacar que es la única fibra no polisacárida que se conoce. Aumenta conforme la

planta madura y sus ligaduras químicas, en especial con la celulosa y la

hemicelulosa, reducen en forma notable la reactividad de esta última (Bieto y Talon,

1993; Thompson, 1993; Guarnizo y col., 2009; Caparrós, 2009; Ahuja, 2011).

20

La lignina es extremadamente resistente al ataque químico y enzimático, rodea y

protege a las fibras de celulosa, proporcionado rigidez y soporte estructural a las

paredes de las células de las plantas. (Palmqvist y Hahn-Hägerdal, 2000). Es un

componente característico de la pared celular de las plantas vasculares y su función

principal es actuar como material incrustante en las paredes de las fibras y como

cemento en la lámina media. De esta forma protege a la celulosa del ataque

microbiano y confiere estructura, resistencia e impermeabilidad a los materiales

lignificados. (Del Río y col., 2005).

Figura 6. Representación esquemática de la estructura química de la lignina (Adaptada de Waldford, 2008).

Los precursores de la lignina son los alcoholes p-hidroxicinamílicos (Figura 7),

que incluyen los alcoholes p-cumarílico (4-hidroxicinamílico); coniferílico (4-hidroxi-3-

metocinamílico) y sinapílico (4-hidroxi-3,5-dimetoxicinamílico) que difieren entre sí

por el número de grupos metoxilo sustituyentes. Estos precursores dan lugar a

unidades p-hidroxifenilo, unidades guayacilo y unidades siringilo respectivamente,

cuya proporción también varía en las maderas duras, maderas blandas y biomasa

herbácea (Tomás, 2010; Márques, 2010).

Lignina

Lignina

21

Figura 7. Estructuras de los alcoholes precursores de la lignina

La polimerización de estos precursores durante la etapa de formación de la pared

celular se produce mediante la sucesión de una etapa enzimática y una etapa

química. En la primera, los precursores son oxidados por peroxidasas de la pared

dando radicales fenoxilo que, a continuación y durante la etapa química reaccionan

al azar entre ellos. En este proceso se originan una gran variedad de formas

resonantes que pueden reaccionar unas con otras, por ello la lignina no presenta

una única estructura (Domínguez, 2003).

La lignina confiere rigidez estructural al endurecer y sostener las fibras de

polisacáridos, además de participar en el transporte interno de agua, nutrientes y

metabolitos. Las uniones lignina-hemicelulosa se realizan mediante intermediarios

cinamílicos tales como el ácido ferúlico, el ácido diferúlico y el ácido p-cumárico, los

cuales se unen mediante diferentes intermediarios monoméricos a la cadena

principal del xilano ( Tomás, 2010).

Estos carbohidratos, celulosa y hemicelulosa, presentes en los materiales

lignocelulósicos a través de un proceso llamado hidrólisis se convierten en azúcares

simples, para su posterior fermentación y conversión en bioetanol (Taherzadeh y

col., 2007). Existen varios métodos para hidrolizar las lignocelulosas, sin embargo,

los más comúnmente aplicados son la hidrólisis ácida y la hidrólisis enzimática.

p-cumarílico coniferílico sinapílico

22

Celulosa Hidrólisis Glucosa Fermentación Etanol (1)

Hemicelulosa Hidrólisis Pentosas y Hexosas Fermentación Etanol (2)

La hidrólisis es crucial para la conversión de los polisacáridos del bagazo,

principalmente celulosa, en productos de alto valor agregado. Sin embargo, el fuerte

arreglo cristalino de la celulosa y los efectos protectores de la lignina y de la

hemicelulosa dificultan el acceso de las enzimas y de los catalizadores ácidos a los

enlaces glucosídicos β 1-4, los cuales constituyen una serie de obstáculos para tal

proceso (De Moraes y col., 2011).

La hidrólisis enzimática requiere de la aplicación de pretratamientos a la

lignocelulosa, ya que el requisito para la hidrólisis es la accesibilidad a la superficie

celulósica por las enzimas celulolíticas. Estos pretratamientos pueden ser físicos,

que involucran la reducción de tamaño y la explosión con vapor; químicos en los

cuales se altera la estructura de la biomasa con solventes que promueven la

degradación de la celulosa, hemicelulosa y lignina; o biológicos que utilizan

microorganismos, como hongos para degradar la hemicelulosa y la lignina. (Ferrer y

col., 2002; Mateus, 2011). Hasta el presente la hidrólisis enzimática no ha tenido

éxito como para ser desarrollada a nivel industrial y se requerirá, previamente, un

esclarecimiento de manera integral, de los aspectos económicos del proceso, en los

que el costo de las enzimas tiene un rol determinante.

La hidrólisis ácida, en cambio, ha sido llevada a escala comercial desde 1909 en

EEUU y otros países de Europa y Asía, para fermentar la glucosa en alcohol,

utilizando madera como sustrato (Ferrer y col., 2002; Abreu y De la Rosa, 2011). Es

uno de los métodos de pretratamiento más investigado y documentado. Una gran

variedad de biomasa ha sido tratada con ácidos tales como sulfúrico, nítrico,

hidroclórico y fosfórico, siendo el sulfúrico el más común.

Hay dos tipos de hidrólisis ácida, una en la cual se usa ácidos concentrados y

otra en la que se usa ácido diluido. La hidrólisis concentrada toma lugar a bajas

temperaturas (por ejemplo 40ºC), usando una concentración de ácido de 30-72%.

Este método proporciona altos rendimientos de azúcares, cercanos al 100% del

rendimiento teórico de hexosas. Tiene la ventaja de trabajar a bajas temperaturas,

sin embargo, requiere de grandes volúmenes de ácido, los cuales son tóxicos y

23

corrosivos, requiriendo de reactores altamente resistentes a la corrosión (Leitäo,

2009).

La hidrólisis con ácido diluido es el más utilizado ya que tiene la ventaja de

consumir menos cantidades de ácido en comparación con la hidrólisis con ácido

concentrado Emplea bajas concentraciones de ácidos (0,3 - 5,0%) y altas

temperaturas (120 - 220ºC), con varios tiempos de tratamientos (de algunos minutos

a horas). Puede ser utilizado como un pretratamiento para incrementar la

accesibilidad de las enzimas a la celulosa, o como un método de sacarificación

directa (Leitäo, 2009).

Abreu y De la Rosa, (2011) evaluaron la producción de azucares fermentables

por hidrólisis ácida diluida del bagazo de caña de azúcar mediante ebullición a

reflujo, empleando ácido sulfúrico a varias concentraciones (0,5; 1,0; 1,5 y 2,0 % v/v)

y tiempos de reacción (1,2, 3 y 4 h) con una relación líquido-sólido de 15:1, logrando

alcanzar un concentración máxima de azucares fermentables de 11,54 g/L a las 4

horas de reacción y 2% de ácido.

Pattra y col., (2008) realizaron hidrólisis del bagazo de la caña de azúcar en un

autoclave a 121 ºC 1.5 Kg/cm2, usando ácido sulfúrico a varias concentraciones

(0,25 - 7,0 % v/v) y tiempos de reacción (15 – 240 min.). Reportaron que las

condiciones óptimas fueron 0,5% de ácido y 60 min, con un rendimiento de azúcares

de 24,5 g/L. Indican que la concentración de glucosa, xilosa y arabinosa fueron de

11,00, 11,29 y 2,22 g/L, respectivamente, encontrando también, 2,48 g/L de ácido

acético y 0,12 g/L de furfural.

Piña y col., (2007) trabajaron con la hidrólisis ácida del bagacillo de la caña de

azúcar por medio de ebullición a reflujo variando la concentración de ácido sulfúrico

(1-4% v/v) y la relación líquido-sólido (30:1, 25:1, 20: y 15:1) con un volumen fijo de

ácido de 150 mL a un tiempo constante de 4h. Indican que obtuvieron la máxima

producción de azúcares reductores, 27,2 g/L, a una relación líquido-sólido de 15:1

para una concentración de ácido de 1%.

Aguilar y col., (2002) estudiaron la cinética del proceso de la hidrólisis ácida

diluida a diferentes temperaturas (100, 122 y 128 ºC) y concentraciones de ácido

sulfúrico (2, 4, y 6 %v/v) determinando la variación en el tiempo de la producción de

xilosa, glucosa, ácido acético y furfural. Encontraron que las condiciones óptimas de

24

fueron concentración de ácido de 2%, 122ºC y tiempo de reacción de 24 minutos,

indicando que aproximadamente el 90% de la hemicelulosa fue hidrolizada,

obteniendo un rendimiento de 21,6 g/L de xilosa, 3,0 g/L de glucosa, 0,5 g/L de

furfural y 3,65 g/L de ácido acético.

Lavarack y col., (2002) realizaron hidrólisis de bagazo y bagacillo de caña de

azúcar variando las condiciones de reacción, temperatura (80-200ºC), relación

líquido-sólido (1:5 – 1:20), concentración del ácido (0,25 – 8 %v/v), tipo de ácido

(H2SO4 o HCl) y tiempo de reacción (10 – 2000 min.). Encontraron que el HCl es

menos activo para la degradación de la xilosa en comparación con el H2SO4.

Reportan que el rendimiento máximo de xilosa estuvo por encima del 80% del valor

teórico.

Ferrer y col., (2002) estudiaron la producción de azúcares reductores a partir de

la hidrólisis ácida del bagacillo de caña de azúcar. Hidrolizaron el bagacillo tratado

por inmersión al agua a temperatura ambiente y el no tratado hidrolizado, mediante

ebullición a reflujo, utilizando diferentes concentraciones de ácido sulfúrico diluido

(2, 4, 6 y 8% v/v) a diferentes tiempos de reacción (4, 8 y 12h) con una relación

líquido-sólido de 30:1. Reportan que la mayor producción de de azucares (16,76 ±

1,7 g/L) la obtuvieron durante la hidrólisis del bagacillo no tratado a las 4h de

reacción utilizando ácido sulfúrico al 6% v/v.

La mayoría de los reportes de la literatura indican que la xilosa es el azúcar que

se presenta en mayor proporción como producto de la hidrólisis ácida diluida. Esto

muestra que la hidrólisis ácida diluida en una etapa ataca efectivamente a la

hemicelulosa, dejando libre el acceso a la celulosa en el material lignocelulósico. Sin

embargo, la mayor desventaja que quizás presenta la hidrólisis con ácidos diluidos

radica en la formación de compuestos que inhiben el crecimiento de

microorganismos durante la fermentación a etanol. A altas temperaturas ocurre la

descomposición de los monosacáridos en compuestos no deseables, disminuyendo

el rendimiento en azúcares y provocando la inhibición de los microorganismos que

intervienen en la formación de etanol durante el proceso de fermentación (Lenihan y

col., 2010). Estos compuestos son furfural, 5-hidroximetifurfural (HMF), ácidos

carboxílicos (fórmico, acético y levulínico), ácido urónico, ácido 4-hidroxibenzoico,

fenol, formaldehido, entre otros, (Chandel y col., 2006).

25

Para evitar la degradación de los azúcares a altas temperaturas, así como la

formación de inhibidores, la hidrólisis se puede llevar a cabo en dos o más etapas.

Una primera etapa para convertir la hemicelulosa en sus monómeros constituyentes,

a temperaturas relativamente bajas (100-160ºC), la cual sería equivalente a un

pretratamiento con ácido diluido. La segunda etapa en la cual se hidroliza el sólido

restante, transformando a la celulosa en glucosa, bajo condiciones más severas, a

temperaturas más elevadas, entre 200 - 240ºC (Domínguez y col., 2003; Sánchez y

col., 2008).

Estudios previos reportan que en la primera etapa se obtienen pentosas y

hexosas producto de la hidrólisis de la hemicelulosa, con un rendimiento entre 80 y

95% de los azucares disponibles, mientras que en la segunda etapa el rendimiento

es menor, entre 40 y 60% y corresponde a la hidrólisis de la celulosa. Estos bajos

rendimientos parecieran no ser un problema, si se consideran los bajos costos de los

materiales lignocelulósicos y la posibilidad de utilizar el material residual en la

producción de energía (Taherzadeh y col., 2007). Sin embargo, las condiciones de la

hidrólisis en cada etapa deben ser estudiadas dependiendo del material a utilizar, ya

que la complejidad estructural y composición depende del tipo de residuo o

desechos que se esté utilizando.

Cheng y col., (2008) llevaron a cabo hidrólisis de la hemicelulosa del bagazo de

caña de azúcar utilizando un proceso con reciclo de ácido sulfúrico, realizando la

detoxificación del hidrolizado por electrodiálisis. Encontraron que luego de dos

ciclos de ácido la concentración de azúcares reductores aumento de 28 a 63,5 g/l y

el consumo de ácido se redujo a 0,056 g por gramo de bagazo, recuperándose más

del 85% del ácido. Indican que luego de un tratamiento con electrodiálisis se retiró el

90% del acido acético producido.

Karimi y col., (2006) estudiaron la conversión de la paja de arroz a azúcares por

hidrólisis ácida diluida, a altas temperaturas y presiones en una y dos etapas. Las

hidrólisis fueron realizadas en un reactor de 10 L, donde fueron evaluados el tiempo

de reacción (3-10 min), la presión (10-35 bar) y la concentración del ácido (0-1%).

Los resultados muestran la habilidad de la primera etapa de despolimerizar el xilano

a xilosa con un máximo rendimiento de 80,8% a una presión de hidrólisis de 15 bar,

tiempo de retención de 10 minutos y una concentración de ácido del 0,5%. Sin

embargo, el rendimiento de la glucosa a partir del glucano fue relativamente bajo con

26

un máximo del 25,8%. Por otro lado, los rendimientos de todos los componentes

fueron prácticamente independientes del tamaño de partícula.

Los autores indicaron también que en la segunda etapa se obtuvieron los mejores

resultados al utilizar H2SO4 al 0,5%, presión de hidrólisis de 30 y 25 bar para un

tiempo de retención de 3 minutos, donde un total de 46,6% de glucano y 78,9% de

xilano fueron convertidos a glucosa y xilosa respectivamente. Además, los altos

rendimientos de glucosa y xilosa estuvieron acompañados por bajos contenidos de

furfural (8,9-9,1 g/Kg de paja de arroz) e hidroximetilfurfural (2,4-2,5 g/Kg de paja de

arroz), mientras que el contenido de ácido acético (22,9-26,9 g/Kg de paja de arroz)

se mantuvo casi constante a presiones tan altas como 10 bar y un tiempo total de

retención de 10 minutos.

Sánchez y col., (2004) estudiaron la hidrólisis ácida diluida para la fermentación

de la paja brava. Para el desarrollo de este estudio los investigadores precalentaron

la muestra seca, impregnaron con H2SO4 diluido (0,5-1,0 %p/p) y seguidamente la

hidrolizaron en un reactor a temperaturas entre 170-220 ºC, para la primera etapa,

con un tiempo de reacción entre 3 y 10 minutos. La segunda etapa la realizaron a

230 ºC con un tiempo de reacción de 10 minutos. Indicaron que condiciones

óptimas de la primera etapa fueron: concentración de H2SO4 al 0,5%, temperatura

de 190 ºC para hidrolizar la hemicelulosa con un tiempo de residencia de 5 minutos.

El rendimiento de xilosa reconvertida a estas condiciones fue cercano al 80% del

valor teórico. Para la segunda etapa obtuvieron un rendimiento de glucosa alrededor

del 30% del valor teórico.

Nguyen y col., (1999) trabajaron con astillas de maderas blandas para producir

etanol por hidrólisis ácida diluida en dos etapas. Impregnaron el material en H2SO4

diluido (0,4-0,7%) y lo hidrolizaron en un reactor a explosión de vapor durante un

tiempo de reacción de 3 a 5 min. La temperatura de la primera etapa estuvo

comprendida en un rango de 180-200ºC, mientras que para la segunda fue de 210 a

220ºC. Reportan que para la primera etapa, al utilizar concentración de H2SO4

0,7%, temperatura de 190ºC y tiempo de reacción de 3 min, obtuvieron las

concentraciones más altas de glucosa y manosa, siendo 27,8 y 33,9 g/L

respectivamente, con concentraciones de ácido acético de 7,0 g/L y furfural de 2,5

g/L. En la segunda etapa encontraron que las mejores condiciones fueron 0,4%, de

H2SO4, temperatura de 215ºC y tiempo de reacción de 3 min, a las cuales obtuvieron

una máxima concentración de glucosa de 74 g/L, con 5,8 g/L de hidroximetilfurfural.

27

La despolimerización de la hemicelulosa mediante procesos químicos produce

xilosa como principal fracción y arabinosa, manosa, galactosa y glucosa en

fracciones más pequeñas, además de compuestos que pueden actuar como

inhibidores potenciales de la fermentación (Chandel y col., 2007a; Chandel y col.,

2010a; Gíros y col., 2010). La naturaleza y concentración de estos compuestos

depende del tipo de biomasa, del pretratamiento utilizado, de las condiciones del

proceso y de la utilización o no de catalizadores ácidos (Sánchez y col., 2010),

Estos inhibidores tienen efectos tóxicos en los microorganismos de fermentación,

reduciendo el rendimiento y productividad en el proceso. Los niveles de toxicidad

dependen en parte de las variables de fermentación que incluye las condiciones

fisiológicas de la célula, la concentración del oxígeno disuelto y el pH de medio.

Además, los microorganismos pueden ser resistentes a los inhibidores o pueden

comenzar a adaptarse a su presencia. (Harmsen y col., 2010; Xiros y col., 2010).

En la Tabla 1 se muestran los tipos de compuestos inhibidores que son

generados durante la hidrólisis de la biomasa lignocelulósica. El efecto inhibidor de

estos compuestos es mayor cuando ellos se encuentran juntos debido a su efecto

sinergístico (Mussato y col., 2004; Xiros y col, 2010).

Tabla 1. Tipos de inhibidores y sus estructuras químicas (Harmsen y col., 2010)

Compuesto Estructura Química

Furfural

Hidroximetilfurfural (HMF)

Acido fórmico

Acido acético

Acido levulínico

Los derivados del furano, furfural y 5-hidroximetilfurfural, son producto de la

degradación de la hemicelulosa y celulosa durante el pretratamiento a altas

temperaturas y tiempos de residencia prolongados (Figura 8). El furfural es formado

por la degradación de las pentosas xilosa y arabinosa, mientras que el 5–

28

hidroximetilfurfural (HMF) es obtenido por la degradación de las hexosas glucosa,

manosa y galactosa (Mateus, L., 2010).

Figura 8. Degradación de la celulosa y hemicelulosa (Tomado de Domínguez, 2003)

La toxicidad relativa de varios inhibidores para la fermentación del etanol se

puede resumir como compuestos fenólicos > furfural > HMF > ácido acético >

extractivos. El efecto tóxico de estos furanos produce reducción de la tasa específica

de crecimiento del microorganismo y disminución de la producción de biomasa,

debido a que causa daño en la membrana plasmática celular e inhiben la acción

enzimática y por ende ocurre disminución de la productividad volumétrica y

específica del etanol (Sánchez y col., 2010).

Se ha reportado que el furfural es un fuerte inhibidor de la Saccharomyces

cerevisiae. Una concentración de furfural de 1g/L puede disminuir significativamente

la tasa de crecimiento (liberación) de CO2 y el número de células totales en la fase

de fermentación. El HMF afecta la fermentación de forma similar que el furfural.

Arabinosa

Furfural

Glucosa Galactosa Manosa Xilosa

Äcido fórmico Ácido levulínico

Ácido acético

HMF

HEMICELULOSA CELULOSA

29

Delgenes y col. (1996) demostraron que concentraciones de furfural de 0,5; 1,0 y

2,0 g/l reducen el crecimiento de P. stipitis en 25%, 47% y 99% respectivamente.

Roberto y col., (1991b) observaron que a concentraciones de furfural menores de

0,5g/L se obtiene un efecto positivo en el crecimiento celular, mientras que a

concentraciones por encima de 2 g/L inhiben el crecimiento celular casi

completamente. Nigam (2001) encontró que una concentración de furfural de 0,25

g/L en un medio de fermentación, no reduce el rendimiento y productividad del

etanol, pero a concentraciones tan altas como 1,5 g/L interfiere en la respiración y

crecimiento del microorganismo, disminuyendo el rendimiento y productividad de

etanol en 90,4% y 85,1% respectivamente.

De acuerdo a Delgenes y col. (1996), el crecimiento de P. stipitis disminuyó en un

43%, 70% y 100% cuando la concentración del HMF en el medio fue de 0,5; 0,75 y

1,5 g/L respectivamente. Martínez y col. (2000) observaron que la producción de

etanol por E. coli a partir del hidrolizado hemicelulósico del bagazo de caña de

azúcar fue afectado por furanos, solo cuando su concentración fue mayor a 0,9 g/L.

Estudios reportan que una concentración de 4g/L de HMF disminuye en un 32%

la tasa de producción de CO2, la producción de etanol disminuye en un 40% y la tasa

específica de crecimiento disminuye en un 70% (Villalobos, 2010).

Palmqvist y col. (2000b) reportó que el HMF tiene un efecto similar al furfural, sin

embargo, es considerado menos tóxico, y su concentración en el hidrolizado

hemicelulósico es más bajo debido a tres factores: la baja cantidad de hexosas en

la hemicelulosa, las condiciones empleadas en el proceso hidrolítico, el cual no

degrada a las hexosas en grandes cantidades y a la alta reactividad de este

componente.

Durante la hidrólisis ácida, una parte de la lignina (Figura 9) también se degrada

originando una gran variedad de compuestos (aromáticos, poliaromáticos, fenólicos

y aldehídos). Se trata de un grupo de compuestos muy heterogéneo que se puede

encontrar en forma de monómeros, dímeros y polímeros con una gran variedad de

sustituyentes. Los fenoles originados en la hidrólisis varían según el tipo de biomasa,

ya que existe una gran diferenciación de la lignina atendiendo al grupo taxonómico al

que pertenezca la especie vegetal (Domínguez, 2003, Xiros y col., 2010).

30

Figura 9. Productos de la degradación de la lignina (Tomado de Domínguez, 2003).

Los compuestos fenólicos tienen un considerable efecto inhibitorio y son más

tóxicos que el furfural e HMF, incluso a bajas concentraciones. Se ha encontrado

que los compuestos fenólicos de bajo peso molecular son más tóxicos para la

Saccharomyces cerevisiae que los fenólicos de alto peso molecular. La posición del

sustituyente, para, orto, meta, es también significante en la toxicidad de la molécula

(Harmsen y col., 2010; Xiros y col., 2010).

Palmqvist y col., (2000b) reportaron que los compuestos fenólicos tienen un

considerable efecto inhibidor en la fermentación de los hidrolizados lignocelulósicos,

principalmente los de bajo peso molecular. Ellos causan una división y pérdida de la

integridad de la membrana celular, afectando su habilidad para servir como barreras

selectivas y matrices de las enzimas.

El ácido acético, fórmico y levulínico son los principales ácidos débiles presentes

en el hidrolizado lignocelulósico. El ácido acético es derivado a partir de los grupos

acetil en la hemicelulosa, mientras que el ácido fórmico y levulínico son productos de

la degradación del HMF. El ácido fórmico puede adicionalmente formarse a partir del

4-hidroxibenzaldehído

LIGNINA

Vainillina

Guayacol

Ácido vainillínico Ácido 4-hidroxibenzoíco

Siringaldheído

Catecol

Ácido siríngico

31

furfural bajo condiciones ácidas a elevadas temperaturas (Almeida y col., 2007;

Hamser y col., 2010).

Algunos investigadores indican que la presencia de ácido acético produce efectos

negativos en el crecimiento de los microorganismos utilizados en las fermentaciones

para la producción de etanol. Pattra y col., (2008) reportaron que el ácido acético

puede ser considerado como un inhibidor del crecimiento microbiano cuando su

concentración está entre 4 y 10 g/L, ya que puede difundirse a través de la

membrana celular, disminuyendo el pH intracelular y causando efectos adversos en

el metabolismo de los microorganimos.

Ferrari y col., (1992) encontraron que concentraciones de ácido acético de 10,5

g/L afectan el crecimeinto de Pichia stipitis. Sin embargo para otros investigadores el

efecto del ácido acetico sobre el crecimiento de los microrganismos no esta claro.

Palmqvist y col., (1999) encontraron que concentraciones entre 9 y 10 g/L de ácido

acético mejoran el crecimiento y productividad de etanol de Saccharomyces

cerevisiae.

32

CAPITULO II

METODOLOGÍA EXPERIMENTAL

2.1 Sustrato

Se utilizó bagazo de la caña de azúcar proveniente del Central Azucarero La

Pastora, ubicado en el Municipio Torres, Parroquia Cecilio Zubillaga, Carora, estado

Lara. El bagazo se secó en una estufa a una temperatura que oscilaba entre 80-90

ºC para disminuir la humedad hasta aproximadamente el 10%. El bagazo se molió

utilizando un molino de cuchillas (Thomas Wiley Laboratory Mill, Model 4). Luego se

pasó por un tamiz de 20 mesh, para obtener un tamaño de partícula ≤ 1mm y se

almacenó en bolsas plásticas de cierre hermético a temperatura ambiente hasta el

momento de su uso.

2.2 Caracterización del sustrato

Contenido de humedad

El contenido de humedad se determinó por el método 1156-79 descrito en la

norma Venezolana COVENIN (1983) para bagazo de caña de azúcar. Se pesó un

gramo de muestra y se coloraron en crisoles de porcelana previamente pesados. Se

introducen en la estufa a 103±2 °C por cinco horas. Luego, se colocaron los crisoles

con la muestra en el desecador por 15 minutos y se pesan hasta obtener un peso

constante.

Contenido de celulosa, hemicelulosa y lignina

El contenido de celulosa, hemicelulosa y lignina presente en el bagazo de la caña

de azúcar se determinó a través de la metodología desarrollada por Goering y Van

Soest (1970), que se basa en las determinaciones de fibra neutro detergente (FND),

fibra ácido detergente (FAD) y lignina ácida, de acuerdo con las ecuaciones 3, 4 y 5.

Celulosa (%) = FAD (%) - LAD (%) (3)

Hemicelulosa (%) = FND (%) – FAD (%) (4)

Lignina (%) = LAD - cenizas (5)

33

Contenido de proteína cruda

El contenido de proteína cruda se determinó por el método de Kjeldahl descrito

en la norma 1195-80 (COVENIN, 1980), cuyo principio es transformar el nitrógeno

contenido en la muestra en sulfato de amonio, por medio de la digestión con ácido

sulfúrico en caliente. Los datos obtenidos se introdujeron en la fórmula para calcular

el contenido de nitrógeno y su conversión a proteína cruda que se muestra en las

ecuaciones 6 y 7:

%MS*muestraladegramos

100*1,4*N*V%N

HClHClgastado (6)

6.25*%N%PC (7)

Contenido de azúcares residuales

Para determinar el contenido de azúcares residuales, se mezcló el bagazo no

tratado (BNT) con agua destilada en un matraz Erlenmeyer de 250 mL, manteniendo

una relación L/S de 15:1. Luego, se coloco en un incubador rotatorio (Thermo

Electron Corporation) a 25°C y 150 rpm durante una hora. Los azúcares presentes

se midieron utilizando el método del ácido 3,5 dinitrosalicílico (DNS) propuesto por

Miller (1959). Los análisis se realizaron por triplicado.

2.3 Hidrólisis ácida diluida

Primera etapa

En la primera etapa, la hidrólisis ácida se realizó con ácido sulfúrico diluido al 1%

v/v en una relación líquido–sólido de 15:1, empleando diferentes temperaturas (100,

120, 140 y 160 ºC) por un tiempo de 3 min. Se utilizó un reactor autoclave modelo

4593 (Pressure Reaction Apparatus, Parr Instruments) de 100 mL de capacidad, el

cual se muestra en la Figura 10. El reactor está construido de acero inoxidable

(T316) y está provisto de un horno y un agitador eléctrico. La temperatura y

velocidad de agitación durante la hidrólisis fueron controladas y monitoreadas con

un controlador modular.

La fase líquida se separó de la fase sólida por filtración al vacío. La fracción

líquida o hidrolizado se guardó bajo refrigeración a ± 4 ºC para su posterior análisis.

La fracción de sólido fue lavada con agua destilada de 5 a 10 veces el líquido

34

extraído (Sánchez y col., 2004). El bagazo resultante se sometió a calentamiento por

2h a 120ºC para ser utilizado en la segunda etapa.

Figura 10. Reactor Autoclave Modelo 4593 (Pressure Reaction Apparatus, Parr

Instruments).

Segunda etapa

Una vez obtenidos los resultados de la primera etapa, se seleccionó la mejor

temperatura de la primera etapa, en la cual se obtuvo la mayor concentración de

azúcares reductores. El bagazo obtenido de la primera etapa a las condiciones

seleccionadas se sometió a la segunda etapa de la hidrólisis utilizando dos

temperaturas, 160 y 180 ºC durante un tiempo de 3 min. La cantidad de bagazo

recuperado se mezcló con la solución de H2SO4 al 1% v/v, manteniendo la relación

líquido-sólido de 15:1 y se empleó el mismo procedimiento utilizado en la primera

etapa para la separación de las fracciones liquida y sólida. El hidrolizado obtenido se

sometió a neutralización, ajustando el pH entre 4,5 y 5,5 con una solución 6N de

NaOH.

2.4 Análisis de las muestras

Las muestras del hidrolizado proveniente de la primera y segunda etapa de la

hidrólisis del bagazo de caña de azúcar se analizaron por triplicado, determinando el

contenido de azúcares reductores, furfural, hidroximetilfurfural y ácido acético,

utilizando la siguiente metodología:

35

Determinación de azúcares reductores

El contenido de azúcares reductores, presente en el hidrolizado se determinó

empleando el método del ácido 3,5 dinitrosalicílico (DNS), propuesto por Miller

(1959), utilizando glucosa como estándar. La absorbancia se midió en un

espectrofotómetro de rayos UV modelo (Genesys 10UV) a una longitud de onda de

550 nm.

Determinación de furfural y 5-hidroximetilfurfural (HMF)

El contenido de furfural e HMF generados durante la hidrólisis se determinó por

cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), utilizando un cromatógrafo Agilent,

modelo Serie 1100 (Agilent Tecnologies, vacum degasser G1379A y Quatpump

G1311A.). Para el desarrollo del método se dispuso de una columna C18 (4,6 mm ID

x 150 mm ,5m), la cual se trabajó a temperatura ambiente, con una velocidad de

flujo de 1,0 mL/min y un volumen de inyección de 20μL.

La inyección de la muestra en el equipo, se realizó en forma manual y la

detección con un detector UV visible (G1314A) a una longitud de onda de 280 nm.

Se utilizaron patrones grado HPLC para furfural (0,05 – 1,5 mg/mL) e HMF (0,05 –

1,0 mg/mL) y como fase móvil acetonitrilo:agua en proporción 30:70.

Previo a la inyección, tanto los patrones como las muestras de hidrolizado

neutralizadas, se filtraron dos veces utilizando filtros de membrana de celulosa de

0,2 µm (Whatman) y luego utilizando una jeringa de filtrado de acetato de celulosa

de 0,20 µm estéril (Advantec, Dismic – 25cs).

Determinación de compuestos fenólicos

El contenido total de compuestos fenólicos en el hidrolizado, se determinó por el

método colorimétrico de Singleton y Rossi (1965) con algunas modificaciones

descritas por Kim y col., (2003) utilizando ácido gálico seco para la curva patrón. La

absorbancia se midió en un espectrofotómetro de UV visible (Genesys 10UV,

Thermo Scientific, Electron Corp.) a una longitud de onda de 750 nm.

Determinación de ácido acético

El contenido de ácido acético presente en el hidrolizado se cuantificó por

Cromatografía de Gases, utilizando un cromatógrafo Agilent 6890N (Agilent

Technologies) provisto de autoinyector, portal de muestras automático y detector de

ionización a la llama (FID). Se utilizó helio como gas de arrastre y una columna

36

Capilar HP-5, de 30 cm longitud, diámetro interno de 0,320 mm y 0,25 µm nominal.

El análisis se realizó con temperatura del inyector 230°C, flujo de 0,8 mL/min,

Presión de 5 psi, Split de 30:1, temperatura del horno 70°C con rampa de 10°C/min

hasta 140°C, temperatura del detector FID 250°C, fase estacionaria 5% de fenil metil

xiloxano. La curva patrón del ácido acético se preparó de 0 a 72 ppm.

2.5 Análisis de los Datos

Determinación de la Conversión y Rendimiento de la hidrólisis

La conversión se calculó como los mg de azúcares reductores producidos por

gramo de bagazo en base seca y el rendimiento en la producción de azúcares se

calculó como el porcentaje de conversión de la fracción de carbohidratos (celulosa +

hemicelulosa) presente en el bagazo de caña de azúcar hasta azúcares reductores

obtenido por el cociente entre los de azúcares producidos por gramo de sustrato

seco (mg glucosa/g MS) y la producción de azucares teórica, es decir, los azúcares

provenientes de la hidrólisis total en medio ácido (NREL,1994). La cantidad de

azúcares teóricos se determinó multiplicando la cantidad de celulosa presente en el

bagazo de caña de azúcar (no tratado) multiplicados por 1,1 que es el factor que se

introduce por la incorporación de una molécula de agua por cada enlace hidrolizado,

tal como se muestra en las ecuaciones 7 y 8.

% Azúcar Teórico= % celulosa x 1,1 (7)

(8)

Estimaciones estadísticas

Se realizaron análisis de varianza (ANOVA) y pruebas de media HSD de Tukey

para todos los resultados, utilizando el paquete estadístico SPSS statistics 17.0.

37

CAPÍTULO III

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

3.1 Composición del bagazo de caña de azúcar

En la Tabla 2 se presentan los resultados obtenidos de la caracterización del

bagazo de caña de azúcar sin hidrolizar (BSH) utilizado en todos las experiencias.

Cada valor corresponde a los promedios de dos réplicas. Los valores encontrados

son similares a los reportados por Ferrer y col., 2002 y Abreu y De la Rosa (2011).

Sin embargo el contenido de celulosa se encuentra por encima del rango de 30-50%

reportado en otros trabajos (Holtzapple y col., 1991, Martin y col., 2002, Pernalete y

col., 2008, Urribarri, 2011) mientras que la hemicelulosa se encuentra muy por

debajo (20-30%) y la lignina es ligeramente inferior (15-20%).

El alto contenido de carbohidratos permite afirmar, que el bagazo de caña de

azúcar es un residuo agroindustrial que posee un gran potencial para ser

transformado por las distintas vías de sacarificación y convertido en producto de

mayor valor agregado.

Tabla 2. Caracterización del bagazo de caña de azúcar sin hidrolizar.

Componente

BSH

Materia Seca (%) 94,81 ± 0,32

Solubles (%) 17,28 ± 0,04

Celulosa (%) 62,25 ± 0,89

Hemicelulosa (%) 7,99 ± 1,01

Lignina (%) 12,49 ± 0,08

Azúcares residuales (g/L) 0,34 ± 0,02

Proteínas (%) 1,75 ± 0,09 Nota: BSH: bagazo sin hidrolizar.

38

3.2 Primera etapa de hidrólisis

Producción de azúcares reductores

En la Figura 11 se muestra la producción de azúcares reductores, expresados

como glucosa, durante la primera etapa de las hidrólisis con ácido sulfúrico diluido al

1% v/v, relación líquido–sólido de 15:1, tiempo de reacción de 3 minutos y

diferentes temperaturas. Se observa que la producción de azúcares reductores es

mayor cuando la hidrólisis se realiza a temperaturas mayores a 100°C, alcanzando

un máximo a 140°C. Sin embargo, al aumentar de 140 a 160°C el comportamiento

cambia, disminuyendo la cantidad de azúcares producidos. La máxima producción

de azúcares se alcanzó a 140°C y fue de 14,60 ± 0,21 g/L, valor este 9,7 veces al

mayor al obtenido a 100°C y 1,3 veces mayor al encontrado para 120 y 160°C.

Figura 11. Producción de azúcares reductores durante la primera etapa de las hidrólisis con ácido sulfúrico diluido al 1%, relación líquido–sólido de 15:1 y diferentes temperaturas (H1E-xxx : hidrólisis primera etapa a 100, 120,140 y 160°C)

39

En la Tabla 3 se presenta la conversión y el rendimiento en la producción de

azúcares durante la primera etapa de la hidrólisis del bagazo de caña de azúcar con

ácido sulfúrico diluido al 1% v/v, empleando una relación líquido–sólido de 15:1 y

diferentes temperaturas. La conversión se calculó como los mg de azúcares

reductores producidos por gramo de bagazo en base seca y el rendimiento en la

producción de azúcares se calculó como el porcentaje de conversión de la fracción

de carbohidratos (celulosa + hemicelulosa) presente en el bagazo de caña de azúcar

hasta azúcares reductores obtenido por el cociente entre los de azúcares producidos

por gramo de sustrato seco (mg glucosa/g MS) y la producción de azúcares teórica,

es decir los azúcares provenientes de la hidrólisis total en medio ácido.

Tabla 3. Rendimiento de los azúcares reductores producidos en la primera etapa de la hidrólisis con ácido sulfúrico diluido al 1%, relación líquido–sólido de 15:1 y diferentes temperaturas

Hidrólisis Concentración de azucares reductores

(g glucosa/L)

Conversión

(g glucosa/Kg bagazo)

Rendimiento

(%)

H1E-100 1,51 ± 0,09a 18,60 2,41

H1E-120 10,70 ± 0,78b 162,97 21,09

H1E-140 14,60 ± 0,21c 224,23 29,02

H1E-160 11,05 ± 0,51b 168,46 21,80

Nota: Letras diferentes en una misma columna indican diferencias significativas (p0,05). % Conversión; (g glucosa/Kg de bagazo seco), %Rendimiento: (mg azucares experimentales/mg azucares teóricos)*100. MS: materia seca H1E-xxx : hidrólisis primera etapa, donde xxx corresponde a 100, 120,140 y 160°C.

Tal como se esperaba a temperaturas bajas la concentración de azúcares

fermentables es baja, obteniéndose un valor máximo de 1,51 g/L que representa una

conversión del 18,60 g glucosa/Kg bagazo seco y un rendimiento del 2,41% en

relación a la cantidad de azúcar teórico. En la hidrólisis a 120°C aumenta la

concentración de azúcares, obteniéndose una conversión de 162,97 g glucosa/Kg

bagazo seco y un rendimiento del 21,09%. Estos valores representan un incremento

de más del 80% producto del incremento de la temperatura de la reacción de

hidrólisis de 100 a 120°C.

40

La máxima conversión, 224,23 g glucosa/Kg bagazo seco y el máximo

rendimiento, 29,02%, se obtuvieron en la hidrólisis a 140°C. Estos valores indican un

incremento en la producción de azúcares de más del 90% en comparación con la

hidrólisis realizada 100°C. Sin embargo, al aumentar la temperatura de la hidrólisis a

160°C la cantidad de azúcares producida disminuye en comparación con la obtenida

en la hidrólisis a 140°C, lo cual sugiere que pudieran estar ocurriendo algunas

reacciones de descomposición de los azúcares, por ejemplo hacia la formación de

furfural.

Este comportamiento es similar al reportado por Saucedo-Luna y col., (2010)

durante la primera etapa de la hidrólisis de bagazo de agave con ácido sulfúrico

diluido al 1%, quienes encontraron que a bajas temperaturas la concentración de

azúcares era muy baja, de 2,5 g/L a 100°C y diez minutos de reacción. Indican que

al aumentar la temperatura de la hidrólisis se produjo un aumento en la producción

de azúcares, alcanzando 15 g/L a 200°C y el mismo tiempo de reacción. Reportan

además que a 200°C la concentración de azúcares disminuye con el tiempo de

reacción, sugiriendo la existencia de reacciones de descomposición, con posible

formación de furfural.

Efecto de la hidrólisis ácida sobre la fracción de carbohidratos

En la Tabla 4 se muestra el contenido de celulosa y hemicelulosa del bagazo de

caña de azúcar que se obtiene como residuo sólido de la primera etapa de

hidrólisis con ácido sulfúrico diluido al 1% v/v, empleando una relación líquido–sólido

de 15:1 a diferentes temperaturas. Los valores del bagazo de caña de azúcar no

hidrolizado se presentan para efectos de comparación.

Estos resultados indican que durante la primera etapa de hidrólisis ocurre una

solubilización de la fracción de carbohidratos presente en el bagazo (celulosa +

hemicelulosa), lo cual concuerda con la presencia de azúcares en el medio

hidrolizado.

El contenido de celulosa permanece prácticamente constante durante las

hidrólisis a 100 y 120 °C, no encontrándose diferencias significativas (p0,05) entre

los valores obtenidos y el contenido del bagazo no hidrolizado. La hidrólisis a 140°C

provocó una disminución del contenido de celulosa de 6,5%, mientras que a 160°C

fue de 8,2%.

41

El contenido de hemicelulosa disminuye al aumentar la temperatura. A bajas

temperaturas la solubilización es menor, encontrándose que a 100°C se solubilizó el

35% de la hemicelulosa presente en el bagazo no hidrolizado, lo cual junto con la no

solubilización de la celulosa explica la poca producción de azúcares encontrada

durante la hidrólisis a esta temperatura.

Tabla 4. Contenido de celulosa y hemicelulosa en el bagazo de caña de azúcar sometido a la primera etapa de hidrólisis.

SUSTRATO

Celulosa (%)

Hemicelulosa (%)

BNH 62,25 ± 0,89 a 7,99 ± 1,01a

BH1E-100 60,15 ± 0,50a 5,20 ± 1,00b

BH1E-120 60,92 ± 1,81a 4,58 ± 0,12c

BH1E-140 58,21 ± 0,01b 4,66 ± 0,39c

BH1E-160 57,12 ± 1,00c 2,83 ± 0,44c

Nota: Los valores están expresados en base seca. BNH: Bagazo no hidrolizado BH1E-xxx: bagazo resultante de la primera etapa de hidrólisis, donde xxx corresponde a 100, 120,140 y

160°C. Letras diferentes en una misma columna indican diferencias significativas (p0,05).

Al aumentar la temperatura de la hidrólisis se observa que aumenta la

solubilización de la hemicelulosa, alcanzando un 42%, no existiendo diferencias

significativas en los valores obtenidos para la hidrólisis a 120 y 140°C. Esto coincide

con el aumento en la concentración de azúcares en el hidrolizado. A 140°C se

obtuvieron los valores máximos de conversión y rendimiento en la producción de

azúcares reductores, coincidiendo con el incremento en la solubilización de la

celulosa y de la hemicelulosa.

La mayor solubilización tanto de celulosa (8,2%) como de hemicelulosa (64,56%)

se encontró en la hidrólisis a 160°C, sin embargo la producción de azúcares fue

menor que a 140°C (p0,05) y similar a la encontrada a 120°C (p0.05). Esto indica

que existe una pérdida de azúcares, la cual puede estar asociada con reacciones de

degradación con la consecuente formación de furfural.

42

Efecto de la temperatura de hidrólisis sobre la producción de compuestos tóxicos

En las Figuras 12, 13 y 14 se muestra el contenido de la concentración de

furfural, hidroximetilfurfural (HMF), ácido acético y compuestos fenólicos encontrado

en el líquido hidrolizado, producto de las hidrólisis del bagazo de caña de azúcar con

ácido sulfúrico diluido al 1%, relación líquido–sólido de 15:1, tiempo de reacción de 3

minutos y diferentes temperaturas.

En la Figura 12 se puede observar que a todas las temperaturas (100, 120, 140 y

160°C) se encontró la presencia de furfural, mientras que el HMF solo se detectó en

las muestras de las hidrólisis a 140 y 160°C.

Figura 12. Concentración de furfural e hidroximetilfurfural (HMF) en el hidrolizado producto de la primera etapa de hidrólisis (H1E) del bagazo de caña de azúcar a diferentes temperaturas (100, 120, 140 y 160°C).

43

El furfural resulta de la degradación de las pentosas, por ejemplo xilosa, mientras

que el HMF es formado a partir de las hexosas, como por ejemplo glucosa (Modig,

2002).

La concentración de furfural en el hidrolizado muestra una fuerte relación con la

temperatura de la hidrólisis. A medida que la temperatura de la hidrólisis es más alta,

la concentración de furfural es mayor, coincidiendo con la aparición de las pentosas

en el hidrolizado producto de la solubilización de la hemicelulosa. La máxima

concentración de furfural, 1,62 g/L se encontró en la hidrólisis realizada a 160°C.

El HMF no se detectó a las temperaturas más bajas (100 y 120 °C) lo cual es

lógico ya a estas temperaturas no se observa que se hidroliza la celulosa (Tabla 4) y

por lo tanto la concentración de glucosa en el medio debe ser muy baja. El HMF se

detecta a 140°C con una baja concentración, 0,047 ±0,008 g/L, indicando que a esta

temperatura comienza a descomponerse la glucosa presente en el medio. La

máxima concentración de HMF, 0,276 ± 0,002 g/L, se encontró para la hidrólisis

realizada a 160°C.

Los valores encontrados tanto para furfural como HMF se encuentran en los

rangos reportados por algunos autores. Según Almeida y col., (2007) los niveles de

los compuestos furanos varían de acuerdo al tipo de de sustrato y el pretratamiento

empleado. Por ejemplo, la concentración de HMF en el hidrolizado puede variar de

2,0 g/L a 5,9 g/L, dependiendo de si la hidrólisis ácida diluida se trabaja con una o

dos etapas, mientras que el furfural se mantiene en niveles más bajos entre 0,5 y 1,0

g/L. En cambio, al tratar el bagazo de caña de azúcar con explosión a vapor, se

obtienen niveles de concentración de furfural e HMF de 0,6 y 1,9 g/L

respectivamente.

La presencia de furfural e HMF en el hidrolizado es una fuente tóxica para los

microorganismos, principalmente para las levaduras, utilizados en los procesos de

fermentación destinados a la producción de etanol. Sin embargo, el nivel de

toxicidad de estos compuestos varía no solo con el sustrato y tipo de tratamiento

empleado, sino también del tipo de microorganismo utilizado y de las condiciones

empleadas durante la fermentación.

En la Figura 13 se observa que el ácido acético se produjo en todas las hidrólisis

a las diferentes temperaturas ensayadas, aumentando a medida que la temperatura

de la hidrólisis fue mayor. El ácido acético se forma principalmente a partir de los

44

azúcares acetilados de la hemicelulosa durante las reacciones de hidrólisis

catalizada por ácidos a condiciones moderadas, su producción no depende

significativamente de la severidad del proceso y puede producirse hasta en

concentraciones mayores a 10 g/L (Taherzadeh y Karimi, 2007, Xiros y col., 2010).

La menor concentración (0,019 g/L) se encontró en la hidrólisis a 100°C, mientras

que la mayor concentración (0,079 g/L) se obtuvo a 160°C, lo cual se corresponde

con la menor y la mayor solubilización de hemicelulosa, respectivamente. A 120 y

140 °C las concentraciones de ácido acético fueron similares, 0,061 y 0,058 g/L,

respectivamente, no encontrándose diferencias significativas entre estos valores

(p0,05).

Figura 13. Concentración de ácido acético en el hidrolizado producto de la primera etapa de hidrólisis (H1E) del bagazo de caña de azúcar a diferentes temperaturas (100, 120, 140 y 160°C)

Las concentraciones de ácido acético obtenidas durante la primera etapa de

hidrólisis (0,019 - 0,079 g/L) se encuentran muy por debajo de los rangos de

concentración reportados (4 - 10 g/L) que causan efectos negativos sobre el

crecimiento de los microorganismos (Cardona y col., 2010).

45

En la Figura 14 se observa que durante la primera etapa de la hidrólisis del

bagazo de caña de azúcar, con ácido sulfúrico diluido al 1%, relación líquido–sólido

de 15:1, tiempo de reacción de 3 minutos, a diferentes temperaturas se formaron

compuestos fenólicos.

Figura 14. Concentración de compuestos fenólicos en el hidrolizado producto de la primera etapa de hidrólisis (H1E) del bagazo de caña de azúcar a diferentes temperaturas (100, 120, 140 y 160°C)

El contenido de compuestos fenólicos aumenta con el incremento en la

temperatura de la hidrólisis. La mayor concentración, 1,578 g/L, se encontró en la

hidrólisis realizada a 160°C. Este valor es 2, 4 y 10 veces mayor a los encontrados

en las hidrólisis a 140, 120 y 100 °C, respectivamente. Este valor es similar al

reportado por Chandel y col., (2007) para la hidrólisis de bagazo de caña de azúcar

en una sola etapa, con ácido sulfúrico diluido al 1,5% durante 30 minutos (1,58 g/L),

y menor al valor reportado (2,75 g/L) cuando utilizaron la concentración de ácido de

2,5% y el mismo tiempo de reacción.

46

Algunos autores atribuyen la formación de estos compuestos a la degradación de

la lignina durante la hidrólisis (Taherzadeh y Karimi, 2007), sin embargo los análisis

realizados al bagazo de caña de azúcar no permiten observar que este haya sido el

caso.

En la Tabla 5 se observa que el contenido de lignina aumenta con el incremento

de la temperatura de la hidrólisis, pero este aumento no es real. El método utilizado

(Goering y Van Soest, 1970), descrito en el Apéndice C, es un método secuencial y

al ocurrir la solubilización de parte de la hemicelulosa y de la celulosa, se produce un

aparente aumento de la lignina.

Tabla 5. Contenido de lignina en el bagazo de caña de azúcar sometido a la primera etapa de hidrólisis

SUSTRATO BSH BH1E-100 BH1E-120 BH1E-140 BH1E-160

Lignina (%)

12,49 ± 0,08 20,11± 1,21a 19,33 ± 0,45a 21,77 ± 0,16a 24,50 ± 0,54b

Los valores están expresados en base seca. BNH: Bagazo no hidrolizado BH1E-xxx : bagazo resultante de la primera etapa de hidrólisis, donde xxx corresponde a 100, 120,140 y 160°C. Letras diferentes en una misma columna indican diferencias significativas.

En la Tabla 6 se presenta un resumen de los resultados obtenidos del análisis de

las muestras del hidrolizado obtenido durante la primera etapa de las hidrólisis con

ácido sulfúrico diluido al 1%, relación líquido–sólido de 15:1, tiempo de reacción de 3

minutos y temperaturas de 100, 120, 140 y 160°C. El análisis de varianza (ANOVA)

indicó que la temperatura ejerce un efecto significativo (Pr<0,01) sobre todas las

variables (Apéndice H).

Tabla 6. Valores promedio de los resultados obtenidos en la primera etapa de hidrólisis.

Temperatura (°C)

AR (g/L)

Furfural

(g/L)

HMF

(g/L)

Ácido acético (g/L)

Compuestos fenólicos

(g/L)

100 1,51±0,09a 0,224±0,002a ND 0,019±0,001a 0,155±0,012a

120 10,70±0,78b 0,487±0,060b ND 0,061±0,003b 0,430±0,019b

140 14,60±0,21c 1,168±0,089c 0,047±0,008b 0,058±0,001b 0,717±0,047c

160 11,05±0,51b 1,656±0,016d 0,276±0,002c 0,079±0,003d 1,578±0,041d

Media con igual letra no difieren significativamente (p ≤ 0,05). ND: no detectable

47

En base a estos resultados, mayor rendimiento en la producción de azúcares

reductores y la menor formación de subproductos que puedan resultar tóxicos para

los microorganismos, se tomó la temperatura de 140°C como la mejor condición de

hidrólisis para la primera etapa y proceder a los ensayos de la segunda etapa a 160

y 180°C.

3.3 Segunda etapa de hidrólisis

En la Tabla 7 se muestran los resultados de la producción de azúcares

reductores luego de la segunda etapa de hidrólisis realizada al bagazo de caña de

azúcar previamente sometido a una primera etapa de hidrólisis a 140°C. En ambas

etapas la hidrólisis se realizó con ácido sulfúrico diluido al 1% y relación líquido

sólido de 15:1, durante 3 minutos.

Tabla 7. Producción de azúcares reductores durante la segunda etapa de la hidrólisis (H2E) del bagazo de caña de azúcar con ácido sulfúrico diluido al 1%, relación líquido–sólido de 15:1 y diferentes temperaturas

Hidrólisis

Azúcares reductores

(g glucosa/L)

Conversión

(g glucosa/Kg bagazo)

Rendimiento

(%)

H2E-160 4,89 ± 0,13a 74,40 10,76

H2E-180 5,38 ± 0,07b 81,84 11,83

Nota: Letras diferentes en una misma columna indican diferencias significativas (p0.05). % Conversión; (mg glucosa/g MS)*100, %Rendimiento: (mg azucares experimentales/mg azucares teóricos)*100. MS: materia seca. H2E-xxx : hidrólisis primera etapa, donde xxx corresponde a 160 y 180°C.

Se observa que cuando se incrementa la temperatura de la hidrólisis, se produce

un ligero aumento, en el orden del 10%, en la producción de azúcares,

alcanzándose un máximo de 5,38 ± 0,07 g/L a 180°C. Este valor representa una

conversión de 81,84% en función del bagazo seco y un rendimiento del 11,83% en

relación al valor teórico o cantidad de azúcar teórica presente en el sustrato.

Este mismo comportamiento fue reportado por Saucedo-Luna y col., (2010)

durante la segunda etapa de hidrólisis de bagazo de agave a diferentes

temperaturas (150, 175 y 200 °C) con ácido sulfúrico diluido al 2% previamente

hidrolizado a 150°C durante 10 minutos. Encontraron que la producción de azúcares

aumentó al aumentar la temperatura de la hidrólisis, con una producción máxima de

14 g/L de azúcares fermentables a los 10 minutos de reacción a 175°C, lo cual

48

equivale a una conversión de 84 g azucares/Kg de bagazo. Esta conversión es muy

similar a la encontrada en este estudio.

Como puede observarse en la Tabla 8, no se detectó la formación de furanos,

furfural e hidroximetilfurfural (HMF), en la segunda etapa de las hidrólisis realizadas

a 160 y 180°C, indicando que no se producen reacciones de degradación de los

azúcares.

Se observó generación de ácido acético en las hidrólisis realizadas tanto a

160°C, como a 180°C, con valores de 0,173 y 0,128 g/L respectivamente, no

encontrándose diferencias significativas (p0,05). Estos valores son superiores a los

encontrados en la primera etapa de las hidrólisis a las diferentes temperaturas

ensayadas y pudieran estar generándose cuando las reacciones de hidrólisis

ocurren a nivel de las pentosas acetiladas de la hemicelulosa (Rodríguez-Chong y

col., 2004). Sin embargo, las concentraciones encontradas están por debajo de los

valores reportados como tóxicos para los microorganismos.

Tabla 8. Contenido de furanos, ácido acético y compuestos fenólicos generados durante la segunda etapa de la hidrólisis (H2E) del bagazo de caña de azúcar con ácido sulfúrico diluido al 1%, relación líquido–sólido de 15:1 y diferentes temperaturas

Hidrólisis

Furfural

(g/L) Hidroximetilfurfural

(g/L) Acido acético

(g/L) Compuestos

fenólicos (g/L)

H2E-160 ND ND 0,173 ± 0,034a 2,183 ± 0,018a

H2E-180 ND ND 0,128 ± 0,038a 2,746 ± 0,025b

Nota: Letras diferentes en una misma columna indican diferencias significativas (p0.05). ND: no detectado H2E-xxx : hidrólisis primera etapa, donde xxx corresponde a 160 y 180°C.

El contenido total de compuestos fenólicos aumenta con el incremento en la

temperatura de la hidrólisis, encontrándose a 180°C (p0,05) con un valor de 2,746

g/L. El mismo es 25% mayor que el encontrado para la hidrólisis a 160°C. Ambos

contenidos son superiores a los valores encontrados en la primera etapa, lo cual

pudiera sugerir que existe una degradación de la lignina presente.

Se ha reportado que los productos de degradación de la lignina son más tóxicos

a los microorganismos que el furfural e HMF, incluso a bajas concentraciones. Los

compuestos fenólicos pueden penetrar las membranas biológicas causando pérdida

de integridad y de la capacidad de servir como barrera selectiva, afectando como

49

consecuencia el crecimiento celular, la asimilación de azúcar y por ende la

producción de etanol (Larsson y col., 1999, Palmqvist y col., 1999). Delgenes y col.,

(1996) reportaron que concentraciones de compuestos fenólicos (vainillina,

hidroxibenzaldehido y siringaldehido) de 1,0 g/L en el medio de fermentación inhiben

casi totalmente el crecimiento microbiano y la producción de etanol. Pajaró y col.,

(1998) indican que concentraciones de 3,5 y 5 g/L de vainillina inhiben parcial y

totalmente el metabolismo de Saccharomyces cerevisae.

En base a la mayor conversión de azúcares y dado que existe muy poca

diferencia en los valores encontrados de compuestos que pudieran causar inhibición

durante los procesos de fermentación, se puede indicar que la mejor temperatura

para la segunda etapa de hidrólisis es 180°C. Los posibles efectos que pudiera

causar la presencia de compuestos fenólicos en el hidrolizado pudieran solventarse

aplicando algún método de detoxificación, como por ejemplo tratamiento con

Ca(OH)2 a pH 10, que permita reducir los niveles a valores que no afecten el

metabolismo de los microorganismos utilizados (Martínez y col., 2001).

En la Tabla 9 se presenta un resumen de las condiciones seleccionadas y los

resultados obtenidos en cada etapa de la hidrólisis. La conversión total de azúcares

reductores, expresados como glucosa, a partir de las dos etapas secuenciales de

hidrólisis fue de 306,07 g/Kg de bagazo seco, equivalente al 39,41% del valor

teórico. Este rendimiento se considera aceptable tomando en cuenta que el bagazo

de caña de azúcar es un desecho lignocelulósico de muy bajo costo, además de la

posibilidad de utilizar el residuo sólido en procesos de combustión para generar

electricidad y calor.

54

Tabla 9. Temperaturas seleccionadas en las etapas de la hidrólisis ácida y concentraciones de los productos obtenidos en cada etapa

Hidrolisis

Etapa

Temperatura

(°C)

Azúcares reductores

(g glucosa/L)

Conversión

(g glucosa/Kg bagazo)

Furfural

(g/L)

HMF

(g/L)

Ácido acético

(g/L)

Compuestos fenólicos

(g/L)

1 140 14,60 ± 0.21

224,23 1,168±0,089 0,047±0,008 0,058±0,001 0,717±0,047

2 180 5,38 ± 0,07 81,84

N.D N.D 0,128± 0,038 2,746± 0,025

N.D.: no detectado, HMF: Hidroximetilfurfural.

51

CONCLUSIONES

Los mejores valores de temperatura para la hidrólisis del bagazo de caña de

azúcar con ácido sulfúrico diluido al 1%, relación líquido sólido de 15:1 durante 3

minutos, en un proceso de dos etapas secuenciales por carga son 140°C para la

primera etapa y 180°C para la segunda.

La temperatura tiene un efecto significativo sobre la producción de azúcares

reductores, así como también en la generación de subproductos que pueden causar

inhibición sobre el metabolismo de los microorganismos utilizados en los procesos

de fermentación para la producción de etanol.

La presencia de furfural, hidroximetilfurfural, ácido acético y compuestos

fenólicos, indican que se producen reacciones de degradación asociadas tanto a

pentosas y hexosas (derivadas de la reacción de hidrólisis de la hemicelulosa y

celulosa) y de la lignina.

La conversión total de azúcares reductores, expresados como glucosa, a partir

de las dos etapas secuenciales de hidrólisis fue de 306,07 g/Kg de bagazo seco,

equivalente al 39,41% del valor teórico.

El bagazo de caña de azúcar es un desecho agroindustrial con gran potencial

para la producción de azúcares fermentables.

52

RECOMENDACIONES

Realizar perfiles de azúcares mediante cromatografía líquida de alta

resolución (HPLC) para determinar la cantidad de cada uno de los

monómeros presentes en el hidrolizado.

Utilizar mayores temperaturas tanto para la primera como para la segunda

etapa, con el fin de lograr una mayor solubilización de la hemicelulosa y

celulosa.

Evaluar la hidrólisis en cada una de las etapas a diferentes tiempos de

reacción para estudiar su efecto sobre la producción de azúcares y demás

subproductos.

Realizar la caracterización del sólido remanente de la hidrólisis en cada una

de sus etapas, mediante métodos analíticos que permitan calcular la cantidad

de celulosa, hemicelulosa y lignina con mayor precisión.

53

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFÍCAS

Abreu M. y De La Rosa, O. (2011) Producción de azúcares fermentables por hidrólisis ácida diluida del bagazo de caña de azúcar. Trabajo Especial de Grado. Facultad de Ingeniería. Universidad del Zulia. Maracaibo, Venezuela.

Aguilar R., Ramírez J., Garrote G., Vázquez M. (2002). Kinetic study of the acid hydrolysis de sugarcane bagasse. Journal of Food Engineering, 55: 309 – 318

Ahuja, J. (2011) Degradación de azúcares por hidrólisis ácida. Tesis de Grado Universidad Michoacana de San Nicolás de Hidalgo. Departamento de Ingeniería Química. Morelia, Michoacán. 75.

Almeida J., Modig T., Petersson A., Hähn-Hägerdal B., Lidén G., Gorwa-Grauslund F. (2007) Increased tolerance and conversion of inhibitors in lignocelulosic hydrolysates by Saccaromyces cerevisiae. J Chem Technol Biotechnol. 82, 340-349

Alvira P., Pejó T., Ballesteros M., Negro M. (2010) Pretreatment technologies for an efficient bioethanol production process base on enzymatic hydrolysis: a review. Bioresource Technology. 101, 4851-4861.

Bieto, J., Talon, M., Fisiología y Bioquímica Vegetal. (1993). 1° Edición, Interamericana, McGraw-Hill, España, 1-24.

Cardona C.A., Quintero J. A. y Paz L.C. (2010) Production of bioethanol from sugarcane bagasse: Status and Perspectives. Bioresource Tecnology 101, 4754-4766.

Caparrós, S. (2009) Fraccionamiento integral de vegetales no alimentarios para la obtención de pasta celulósica y subproductos. Tesis Doctoral. Universidad de Huelva. Escuela Politécnica Superior. Departamento de Ingeniería Química, Química-Física y Química Orgánica. 127.

Chandel A., Kapoor R., Singh A., Kuhand R. (2007) Detoxification of sugarcane bagasse hydrolyzate improves ethanol production by Candida shehatae NCIM 2501. Bioresource Techology. 98, 1947-1950.

Chandel A., Singh O., Rao L. (2010) Biotechnological applications of hemicellulosic derived sugars: state-of-the-art. Sustainable biotechnology: renewable resources and new perspectives. 63-81.

Cheng K., Cai B., Zhang J., Ling H., Zhou Y., Ge J., Xu, J. (2008) Sugarcane bagasse hemicellulose hydrolysate from ethanol production by acid recovery process. Biochemical Engineering Journal .38, 105 – 109.

COVENIN (1979) Alimentos concentrados para animales. Determinación de humedad (norma 1156-79). Comisión Venezolana de normas Industriales. Ministerio de Fomento. Caracas, Venezuela. 10.

COVENIN (1980) Alimentos. Determinación de nitrógeno. Método de kjeldahl (norma 1195-80). Comisión Venezolana de normas Industriales. Ministerio de Fomento. Caracas, .Venezuela. 10.

54

Delgenes J., Moletta R., Navarro J. (1996) Effects of lignocellulose degradation products on ethanol fermentations of glucose and xylose by Saccharomyces cerevisiae, Zymomonas mobilis, Pichia stipitis and Candida shehatae. Enzyme Microb. Technol. 19, 220-225.

De Moraes G., Martín, C., Barbosa, I., Souto, A., Macedo, H., Moraes, C. (2011) Dilute mixed acid pretreatment of sugarcane bagasse for ethanol production. Biomass and Bioenergy. 35, 663-670.

Domínguez, J. (2003). Efecto de los productos de degradación originados en la explosion por vapor de biomasa de chopo sobre Kluyveromyces marxianus. Tesis Doctoral. Universidad Complutense de Madrid. Facultad de Ciencias Biológicas, Departamento de Biología.166.

Ferrari M., Neirotti E., Albornoz C., Saucedo E. (1992) Ethanol production from Eucalyptus Wood hemicellulose hydrolyzate by Picchia stipitis. Biotehnology and Bioengineering.40, 753-759.

Ferrer J., Páez G., Arenas de Moreno L., Chandler C., Mármol Z. y Sandoval L. (2002) “Cinética de la hidrólisis ácida de bagacillo de caña de azúcar. Revista de la Facultad de Agronomía 19: 23-33.

Galbe, M. & Zacchi, G. (2002) A review of the production of ethanol from softwood. Appl. Microbiol. Biotechnol. 59: 618 – 628.

Gírio F., Fonseca C., Carvalheiro F., Duarte L., Marques S., Bogel-Lukasik R. (2010). Hemicelluloses for fuel ethanol: a review. Bioresource Technology. 101, 4775-4800.

Goering, H. K. and Van Soest, P. J. (1970) Forage fiber analysis. Agricultural handbook. Nº 379. USDA, Washington, DC. USA.

Gómez, F. (2008) Métodos secuenciales de pretratamiento químico y enzimático de residuos agrícolas para la producción de metano. Tesis de Maestría. Instituto Potosino de Investigación Científica y Tecnológica (IPICYT). División de Ciencias Ambientales, México. 94.

Guarnizo, A.; Martínez, P.; Valencia, H. (2009) Pretratamientos de la celulosa y biomasa para la sacarificación, Scientia et Technica, (15): 284-289.

Harmsen P., Huijgen W., Bémudez L., Bakker R. (2010) Literature review of physical and chemical pretreatment processes for lignocellulosic biomass. Energy Research Center of the Netherlands.ECN-E-10-013, 1-49.

Holtzapple, M., Jun, J., Ashok, G., Patibandia, S., Dale, B., (1991) The ammonia freeze explosion (AFEX) process: A practical lignocellulose pretreatment. Appl. Biochem. Biotechnol., 28/29, 59-74.

Karimi, K., Emtiazi, G., Taherzadeh, M. J. (2006) Ethanol production from dilute – acid pretreated rice Straw by simultaneous saccharification and fermentation with Mucor indicus, Rhizopus oryzae, and Sacharomyces cerevisiae. Enzyme and Microbial Technology. 40, 138 – 144.

Kim D., Jeong S. and Lee, Ch. (2003) Antioxidant capacity of phenolic phytochemicals from various cultivars of plums. Food Chemistry. 81, 321-326.

55

Kim K., Tucker M., Nguyen Q. (2005) Conversion of bark-rich biomass mixture into fermentable sugar by two-stage dilute acid+catalyzed hydrolysis. Bioresource Technology. 96, 1249-1255.

Lavarack, B., Griffin, G., Rodman, D. (2002) The acid of sugarcane bagasse hemicellulose to produce xylose, arabinose, glucose and other products. Biomass and Bioenergy . 23, 367-380.

Larsson, S., Reimann, A., Nilvebrant, N. O., Jönsson, L. J. (1999) Comparison of different methods for the detoxification of lignocellulosic hydrolysates of spruce. Appl Biochem Biotechnol 79, 91–103.

Leitäo R. (2009). Dilute acid and enzymatic hydrolysis of sugarcane bagasse for biogas production. Tesis de Maestría en Ingeniería Biológica. Instituto Superior Técnico. Universidad Técnica de Lisboa, 109.

Lenihan, P.; Orozco, A.; O’Neill, E.; Ahmad, M.; Rooney, D.; Walker, G. (2010) Dilute acid hydrolysis of lignocellulosic biomass. Chemical Engineering Journal, (156): 395-403.

Nguyen Q., Tucker M., Keller F., Beaty D., Connors K., Eddy F. (1999) Dilute acid hydrolysis of softwoods. Applied Biochemistry and Biotechnology. 77-79. 133-142.

Nigam J. (2001). Ethanol production from wheat straw hemicellulose hydrolysate by Pichia stipitis. J. Biotechnol. 87, 17-27.

National Renewable Energy Laboratory (NREL), 1994. Dilute acid hydrolysis procedure for determination of total sugar in the liquid fraction of process samples, in: Chemical analysis and testing task, NREL, Golden, CO. 8.

Martín, C., Galbe, M., Nilvebrant, N., Jönsson, L. (2002) Comparision of fermentability of enzymatic hidrolizates of sugarcane bagasse pretreated by steam explosion using different impregnating agents. Appl. Biochem. Biotechnol., 98/100, 699-716.

Martínez A., Rodríguez M., Wells M., York S., Preston J., Ingram L. (2001) Detoxification of dilute acid hydrolysates of lignocellulose with lime. Biotechnol. Progr. 17, 287-293.

Marques G. (2010) Valorización de diferentes cultivos lignocelulósicos para la fabricación de pasta de papel: Caracterización química, modificación estructural de sus constituyentes orgánicos durante los procesos de cocción y blanqueo y aplicaciones biotecnológicas. Tesis Doctoral en Ciencias Químicas Universidad de Sevilla, España, 299.

Mateus, L. (2011) Evaluación de los pretratamientos con ácido sulfúrico diluido y AFEX en la biomasa lignocelulósica del tipo pasto gigante “Pennisetum Sp. Tesis de Maestría. Universidad Nacional de Colombia. Facultad de Ingeniería. Departamento de Ingeniería Química y Ambiental. Bogotá, D.C., Colombia, 83.

Miller, G. L. (1959). Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar. Anal. Chem. 31, 426-428.

56

Modig T. (2002). Kinetics and inhibition effects of furfural and hydroxymethyl furfural on enzymes in yeast. Disponible en línea en Chemical Engineering Department, Lund University: http://www.chemeng.lth.se/exjobb/012.pdf

Musatto S., Roberto I. (2004) Alternatives for detoxification of diluted-acid lignocellulosic hydrolyzates for use in fermentative process: a review. Bioresource Technology. 93, 1-10.

Musatto, S. and Teixeira J. (2010) Lignocellulose as raw material in fermentation process. Institute for Biotechnology and Bioengineering, Current Research, In: Technology and Education Topics in Applied Microbiology and Microbial Biotechnology. A Mendes Vilas, Eds. 897- 907.

Pajaró J., Domínguez H., Domínguez J. (1998) Biotechnological production of xylitol. Part 3: Operation in culture media made from lignocellulose hydrolyzates. Bioresource Technol. 66, 25-40.

Palmqvist, E., Almeida J., Hahn-Hagerdal, B. (1999) Influence of furfural on anaerobic glycolic kinetics of Saccharomyces cerevisiae in batch culture. Biotechnology and Bioengineering. 62, 447-454.

Palmqvist, E., Hahn-Hagerdal, B. (2000b) Fermentation of lignocellulosic hydrolyzates. II: inhibition and mechanisms of inhibition. Bioresource Technology 74, 25 – 33.

Pattra, S., Sanyoka, S., Bonmee, M.m Reungsang, A. (2008) Bio-hydrogen production from the fermentation of sugarcane bagasse hydrolisate by clostridium butyricum . International Journal of Hydrogen Energy. 33, 526 – 5265.

Pernalete Z., Piña F., Suárez M., Ferrer A., Aiello C. (2008) Fraccionamiento del bagazo de caña de azúcar mediante tratamiento amoniacal: efecto de la humedad del bagazo y la carga de amoníaco. Bioagro 20(1): 3-10.

Roberto I., Felipe M., Lacis L., Silva S., Mancilha I. (1991a) Utilization of sugar cane bagasse hemicellulosic hydrolyzate by Candida guilermondii for xilitol production. Bioresource Technology. 36, 271-275.

Rodríguez-Chong A, Ramírez JA, Garrote G, Vázquez M (2004) Hydrolysis of sugar cane bagasse using nitric acid: a kinetic assessment.J. Food Eng. 61: 143-152. Saidur R., Abdelaziz E.A., Demirbas A., Hossain M.S., Meknilef S. (2011) A review on biomass as a fuel for boilers”. Renewable and sustainable energy reviews. 15. 2262-2289.

Sánchez G., Pilcher L., Roslander C., Modis T., Galbe M., Linden G. (2004) Diluite-acid hydrolysis for fermentation of the Bolivian Straw material Paja Brava. Bioresouce Technology. 93, 249-256.

Sánchez O., Cardona C. (2008) Trends in Biotechnological production of fuel ethanol from different feedstock. Bioresource Technology, 99.5270-5295.

Sánchez R., Gutiérrez M., Muñoz H., Rivera B. (2010) Producción de bioetanol a partir de subproductos agroindustriales lignocelulósicos. Revista Tumbaga, 5, 61-91.

57

Saucedo-Luna J., Castro-Montoya A., Rico J. and Campos-García J. (2010) Optimization of acid hydrolysis of bagasse from Agave tequilana Weber. Redalyc. 9, 91 – 97.

Singleton, V.L., Orthofer, R., Lamuela-Raventos, R.M. (1965) Analysis of total phenols and other oxidation substrates and antioxidants by means of folin-ciocalteu reagent. Method Enzymol. 299, 152-178.

Taherzadeh, M. J. and Karimi, K. (2007) Acid-based hydrolysis processes for ethanol from lignocellulosic materials: A review. BioResources. 2(3), 491.

Thomson, J. (1993). Molecular biology of xylan degradation, FEMS Microbiol. Rey., 104, 65-82.

Tomás M. (2010) Bioetanol de paja de trigo: estrategias de integración de las etapas del proceso”. Tesis Doctoral. Universidad Complutense de Madrid. Facultad de Ciencias Biológicas, Departamento de Microbiología III, 135.

Urribarrí, L. (2011) Sacarificación y fermentación simultánea del bagazo de la caña de azúcar tratado con amoníaco”. Tesis Doctoral. Facultad Experimental de Ciencias. Universidad del Zulia. Maracaibo, Venezuela.

Vargas J., Ruíz M., Rodríguez R., Barrientos L. García P., López F. (2011) Fermentable sugars from Lupinus rotundiflorus biomasa by concentrated hydrochloric acid hydrolysis. BioResources 6(1). 344-355.

Villalobos, V. (2010) Comparación de pretratamientos en residuos forestales para la producción de bioetanol de segunda generación: hidrólisis ácida y líquidos iónicos. Tesis para optar al título de ingeniero civil químico y magister en ciencias de la ingeniería mención química. Universidad de Chile, Facultad de Ciencias Físicas y Matemáticas. Departamento de Ingeniería Química y Biotecnología, 133.

Walford, S.N. (2008) Sugarcane bagasse: How easy is it to measure its constituyents. Proc S Afr Sug Technol Ass. 81. 266-273.

Xiros Ch., Vafiadi C., Paschos T., Christakopolulos P. (2010) Toxicity tolerance of Fusarium oxysporum towards inhibitory compounds formed during pretreatment of lignocellulosic materials. J Chem Technol Bioethanol. 86, 223-230.

58

APÉNDICE A

PROCEDIMIENTO PARA EL MANEJO DEL REACTOR AUTOCLAVE PARR 4593

La hidrólisis ácida se realizó por triplicado en un reactor autoclave modelo 4593

Pressure Reaction Apparatus de 100 mL de capacidad, el cual está construido de

T316 acero inoxidable. El reactor usa un horno y un agitador eléctrico (Parr

instruments, 100 mL). La temperatura y velocidad de agitación durante la hidrólisis

fueron controladas y monitoreadas con un controlador modular. La muestra del

bagazo se mezcló con una solución de ácido sulfúrico al 1%v/v en una relación

líquido–sólido de 15:1. Esta mezcla se trató a 100, 120, 140 y 160 ºC por un tiempo

de 3 min para la primera etapa y de 160ºC – 180ºC para la segunda etapa,

mantenido el resto de las condiciones invariables.

PROCEDIMIENTO:

1. Pesar la muestra y medir el volumen de la solución (H2SO4 al 1%v/v).

Colocarlos dentro del reactor. El volumen no debe exceder 70 mL, ya que la

capacidad del reactor es de 100 mL.

2. Ajustar las turcas del reactor.

3. Colocar el reactor en su base, ajustar el rotor y subir el horno.

4. Cebar la bomba y colocar la l entrada y salida de agua en el rotor.

5. Encender el controlador, ajustar el setpoint a la temperatura deseada,

encender el rotor, con una velocidad media y el botón de calentamiento (hacia

abajo si la temperatura es ≤ 100ºC y hacia arriba si la temperatura es mayor

de 100ºC).

6. Esperar que alcance la temperatura deseada. Cronometrar el tiempo de

reacción.

7. Una vez alcanzada la temperatura deseada, apagar el calentamiento y

esperar que se enfríe aproximadamente a 30ºC.

8. Desmontar el reactor y filtrar el contenido por succión al vacío.

9. Refrigerar el hidrolizado a ± 4ºC.

10. Realizar el lavado del sólido de 5 a 10 veces la cantidad de hidrolizado

recolectado, con el fin de disminuir el pH de bagazo.

11. Secar en la mufla el bagazo por 2 h.

59

APÉNDICE B

DETERMINACION DE NITRÓGENO Y PROTEÍNA CRUDA

El nitrógeno de las proteínas y otros compuestos se transforma en sulfato de

amonio por medio de la digestión con acido sulfúrico en caliente. El residuo se

enfría, se diluye con agua y se le agrega hidróxido de sodio, para formar hidróxido

de amonio que se destila y recibe en una solución de acido bórico que luego es

titulada con acido estandarizado. El acido bórico no necesita estar estandarizado o

medido con precisión cuando se trabaja con muestras de alto contenido de

nitrógeno.

Reactivos

A. Solución digestora: en 1 mL de ácido sulfúrico concentrado disolver 25 g de

sulfato de potasio, preferiblemente en cristales finos. Agregar mientras se agita

25 mL de una solución saturada de sulfato cúprico (7,9g/25ml) que contenga

5g de selenito de sodio. Agregar luego 10 g de polvo de oxido de rojo de

mercurio. Homogeneizar en un agitador magnético por 6 horas.

B. Solución de hidróxido de sodio 40% p/v: disolver 400 g de hidróxido de sodio

con enfriamiento en aproximadamente 600 mL de agua. Añada luego 60 g de

tío sulfato de sodio afore a un litro con agua destilada. Guarde la solución en

una botella de polietileno bien tapada.

C. Solución de ácido bórico: disolver 100 g de acido bórico en 6 L de agua

destilada. Agregar luego 100 mL de rojo de metilo al 0,1% en etanol y 70 mL de

verde de bromocresol al 0,1% en etanol. Añadirle después 5 mL de NaOH al

4%. Aforar a 10 litros con agua destilada.

D. Solución de acido clorhídrico 0,2 N: colocar 16,7 ml de HCL concentrado (12 N)

en un balón de un litro y aforar con agua destilada.

Método analítico

1. Pese aproximadamente 0,5 g de muestra en un trozo de papel de rectangular

de 5 x 4 cm. aproximadamente. Doblarlo bien e introducirlo dentro de un tubo

para digestión Tecator. Agregar 10 mL de la solución digestota debidamente

agitada.

60

2. Colocar el tubo con la muestra en el digestor y digerir por 45 minutos a 450ºC.

Es conveniente encender el digestor mientras se están pasando las muestras

para que alcance la temperatura deseada. Enfriar y luego agregarle 75 mL de

agua destilada, agitar bien y enfriar.

3. Encender el equipo de destilación automática TECATOR. Chequear el nivel

de agua en el generador de vapor. El nivel de agua debe estar por encima de

los electrodos. Abrir la válvula de entrada de agua y graduela hasta obtener la

temperatura adecuada (Remítase al manual de operación del equipo

TECATOR para más detalles).

4. Coloque el tubo en el aparato de destilación automática TECATOR y baje la

ventana de seguridad. Espere hasta que se complete la destilación y

titulación. Anote el volumen de HCl gastado.

5. Levante la ventana de seguridad, saque el tubo de digestión y se va a

continuar destilando otras muestras. Coloque un nuevo tubo y proceda como

antes.

Cálculos

Contenido de Nitrogeno

MSmuestraladegramos

NVN

HClHClgastado

%*

100*4,1**%

Contenido de Proteína cruda, PC:

25.6*% NPC

61

APÉNDICE C

DETERMINACIÓN DE FIBRA NEUTRO DETERGENTE, FIBRA ÁCIDA

DETERGENTE Y LIGNINA ÁCIDA

FIBRA NEUTRO DETERGENTE

Este método determina la fibra neutro detergente, la cual es el residuo remanente

después de la digestión en presencia de una solución de detergente neutro. El

procedimiento aparentemente divide la materia seca al punto de que separa los

constituyentes nutricionales solubles y accesibles, de aquellos que son totalmente

aprovechables los cuales dependen de la fermentación microbiológica para su

aprovechamiento. Los residuos de la fibra son predominantemente hemicelulosas,

celulosa, y lignina. Este método es aplicable a granos, alimentos, forrajes y todo

material con contenido de fibra.

Reactivos

A. Solución neutro detergente : adicionar 30 g de sodio lauril sulfato, USP; 18,61 g

de etilendiaminatetraaceticadisodicadihidratada (EDTA); 6,81 g de tetraborato

de sodio decahidratado; 4,56 g de fosfato de sodio dibásico, anhidro y 10 ml de

trietilen glicol, en 1L de agua destilada. Chequear que el pH se encuentre entre

6,9 y 7,1. Agitar y calentar.

B. Acetona: Libre de color y que no deje residuo al evaporarla.

Método analítico

Preparación de la muestra

Moler las muestras para obtener tamaño de partícula de 1 – 2 mm. Muestras

molidas mas finas pueden presentar perdida de partículas en las bolsas de filtro, lo

que puede resultar en valores bajos.

Procedimiento

1. Utilizar un marcador resistente a solventes para rotular las bolsas de filtro.

Pesar la bolsilla (W1) y tarar la balanza. Nota – no presecar las bolsas;

cualquier contenido de humedad será corregido a partir de la bolsa blanco.

2. Pesar 0,45 – 0,55 de la muestra preparada (W2) directamente en la bolsa.

Evitar introducir o colocar muestra por encima de 4 mm ésta.

62

3. Utilizando el sellador de calor, sellar completamente el borde superior de la

bolsa a 4 mm del tope. Nota: usar suficiente calor para sellar completamente

la bolsa y permitir que se enfríe el tiempo necesario (2 seg) antes de quitarla

del sellador.

4. Pesar una bolsa blanco e incluirla en la corrida para determinar la corrección

correspondiente (C1).

5. Colocar un máximo de 24 bolsas dentro del porta bolsas. La bandeja superior

actúa como cubierta y no debe contener bolsillas. Colocar tres bolsas por

bandeja. Insertar el porta bolsas (colocar el peso para mantenerlo sumergido)

dentro de la cámara de digestión del analizador de fibra. Nota: si antes de

introducir las muestras, la cámara de digestión aun permanece caliente como

consecuencia de una corrida anterior, se debe adicionar agua fría y abrir la

válvula de drenaje.

6. Si se van a procesar 24 muestras, adicionar 1900 – 2000 ml de solución de

detergente neutro a temperatura ambiente. Si se procesan menos de 20,

adicionar 100 ml/bolsa de detergente neutro (utilizar un mínimo de 1500, para

asegurara que el porta bolsa se cubra totalmente). Adicionar 20 g de sulfito de

sodio (0,5 g/50 ml de detergente neutro), y 4 mL de alfa amilasa.

7. Encender la agitación y la temperatura, cerrar la cámara de digestión, y

extraer por 75 min.

8. Al final de la extracción, detener la agitación y el calentamiento. Abrir la

válvula de drenaje (lentamente) y dejar que la solución caliente salga antes de

abrir la tapa de la cámara de digestión. Nota – la solución dentro de la cámara

de digestión esta bajo presión. Se debe abrir la válvula de drenaje para liberar

la presión y la solución antes de abrir la tapa de la cámara.

9. Después de que la solución haya sido drenada, cerrar la válvula y abrir la

cámara. Adicionar 1900 ml de (70 – 90 ºC) de agua destilada y 4 ml de alfa

amilasa. Encender la agitación por 5 min. La tapa puede estar cerrada con el

control de calentamiento encendido o permanecer abierta con el control de

temperatura apagado. Repetir el lavado con agua caliente para un total de

tres veces.

10. Completado el proceso de lavado, se procede a remover las muestras.

Suavemente presionar las bolsas para extraer el exceso de agua. Colocar las

63

bolsas en un matraz de 250 ml y adicionar suficiente acetona como para

cubrir las bolsas y dejar reposar de 3 – 5 min.

11. Retirar las bolsas de la acetona y colocarlas a airear. Completar el secado en

una estufa a 102±2 ºC (la mayoría de las estufas completan el secado

después de 2 – 4 horas). Nota: no colocar las bolsas en la estufa hasta que la

acetona se evapore completamente.

12. Retirar las bolsas de la estufa, y colocarlas directamente dentro de la bolsa

desecante, presionarla para remover el aire y sellarla. Enfriar a temperatura

ambiente y pesar las bolsas (W3).Nota: No utilizar un desecador

convencional.

Cálculos

Donde:

W1 = peso de la bolsa,

W2 = peso de la muestra,

W3 = peso de las bolsas secas después de la extracción,

C1= corrección de la bolsa blanco (promedio de la corrida de los pesos secos finales

dividido por el peso original de la bolsa blanco).

% NDF (en base recibida) =

(W3 – (W1 x C1))

W2

X 100

64

FIBRA ÁCIDO DETERGENTE

Este procedimiento permite una rápida determinación de la lignocelulosa en los

alimentos. Sin embargo, en esta fracción también aparece la sílice. La diferencia

entre el valor de las paredes celulares y la fibra ácido detergente, da una estimación

del valor de la hemicelulosa, ya que esta diferencia también incluye una fracción de

proteína adherida a las paredes celulares. El método de fibra por ácido detergente

también se emplea como paso preliminar en la determinación de lignina.

Reactivos

A. Solución ácido detergente: ácido sulfúrico, grado reactivo, estandarizado a 1 N.

Ello se logra agregando 49,04 g de H2SO4 por litro de agua destilada. Para

preparar 18 litros de solución, se necesitan 882.72 g de H2SO4. Agregue 20 g de

bromuro de amonio cetyltrimetil (CTAB), grado técnico por litro de la solución 1 N

de H2SO4 ó 360 g por 18 litros y agitese para facilitar la disolución.

B. Acetona: grado reactivo.

Método analítico

1. Pesar por diferencia aproximadamente 0,5 g de muestra y deposítela en un

Beaker de Berzelius de 600 mL.

2. Agregar 50 ml de solución de ácido detergente a temperatura ambiente.

Caliente la solución para que hierva en el término de 5 a 10 minutos. Cuando

se inicia la ebullición, baje el calor para evitar la formación de espuma y

manténgase en reflujo por 60 minutos contados a partir del inicio de la

ebullición que debe ser lenta durante todo el procedimiento.

3. Filtrar la solución con poca succión, a través de un crisol de vidrio (poro

grueso de fibra de vidrio tipo 50C) previamente tarado. Con una varilla de

vidrio, afloje la capa de muestra que se ha compactado en el fondo del crisol y

lávela dos veces con agua caliente (90 – 100°C). Lave las paredes del crisol

de la misma manera.

65

4. Repetir igualmente el lavado con acetona hasta que desaparezca totalmente

el color, desintegrando cualquier grumo que se haya formado para que el

solvente entre en contacto con todas las partículas de fibra.

5. Si la formación de grumos constituye un problema, lave la muestra con

hexano mientras aún contenga acetona. Mantenga la muestra bajo succión

hasta que se libere del hexano y séquela a 105°C por 8 horas o durante toda

la noche; luego se saca de la estufa, se enfría en un desecador y se pesa.

Cálculos

MSaalmenteestraparciPesodelamu

soltaradoPesodelcriFibraácidasolPesodelcriFAD

%*sec

100*100*%

66

LIGNINA ÁCIDA DETERGENTE

Este procedimiento utiliza como primer paso, la técnica empleada para la

determinación de fibra ácido detergente. El detergente extrae la proteína y otros

materiales solubles en ácido que interfieren con la determinación de lignina. El

principio de este procedimiento estriba en que el residuo de la fibra ácido detergente,

consiste principalmente de lignocelulosa de cuyo compuesto se disuelve y separa la

celulosa por medio de la solución de H2SO4 72% p/p o 24 N quedando la lignina y la

ceniza no-soluble en ácido.

Reactivos

A. Ácido sulfúrico, 72% p/p: utilice 735 g de H2SO4 al 98% de pureza y 265 g de

H2O destilada o cantidades equivalentes si se desea preparar mayor o menor

cantidad de solución. Pese el agua necesaria en un beaker de 2000 ml y en un

recipiente aparte, pese al ácido que se va a necesitar. Lentamente agregue el

ácido al agua contenida en el beaker de 2000 mL, asentado en agua fría y

agítese ocasionalmente con una varilla de vidrio. Determine la gravedad

especifica de una alícuota de 5 mL de la solución (a 20 °C) con una pipeta

volumétrica, colocando la muestra en una botella de pesar tapada y pesándola

en una balanza analítica. Ajuste la gravedad especifica a 1,634 a 20 °C

mediante el agregado de cantidades pequeñas y medidas de agua o de ácido.

B. Acetona: Libre de color y que no deje residuo al evaporarla

.

Método analítico

1. El primer paso es el de preparar la fibra ácido detergente tal como se

describió en el apéndice C.

2. Coloque las bolsas en un Beakers de 250 mL.

3. Cubra las bolsas con el H2SO4 al 72% o 24 N a temperatura ambiente durante

un tiempo de 3h.

4. Transcurridas las 3 horas, extraiga todo el exceso de acido de las bolsas.

5. Realice lavados con agua de grifo y agua destilada hasta que el pH de lavado

alcance el pH del agua destilada.

6. Coloque nuevamente las bolsas en un Beakers de 250 mL.

67

7. Cubras las bolsas con acetona durante un tiempo de 5 min.

8. Retire el contenido de acetona y deje airear el residuo de acetona por una

noche.

9. Complete el secado de las muestras en una estufa a 102±2 ºC durante 4

horas

10. Transcurrido el tiempo retirar las bolsas de la estufa y colocarlas directamente

en la bolsa hermética que contiene la bolsa desecante durante una hora.

11. Realice el pesado de las bolsas.

Cálculos

Donde:

W1 = peso de la bolsa,

W2 = peso de la muestra,

W3 = peso de las bolsas secas después de la extracción,

C1= corrección de la bolsa blanco (promedio de la corrida de los pesos secos finales

dividido por el peso original de la bolsa blanco).

% ADL (en base recibida) =

W2

X 100 (W3 – (W1 x C1))

68

APÉNDICE D

MÉTODO DE ÁCIDO 3,5 DINITROSALICÍLICO (DNS)

El uso del método ácido 3,5 dinitrosalicílico (Miller, 1959) es extensamente

aceptado para cuantificar azúcares reductores, particularmente aquellos generados

por la ruptura de la celulosa. Este método esta basado en la presunta reducción del

ácido 3,5 dinitrosalicílico por el azúcar a 3-amino-5-ácido dinitrosalicílico. El reactivo

DNS está compuesto de (además del ácido 3,5 dinitrosalicílico) tartrato de potasio

sódico (Sal de Rochelle) usado para prevenir la reacción con oxigeno disuelto, fenol

para incrementar la formación de color, metabisulfito de sodio para estabilizar éste

color e hidróxido de sodio que adecua el pH para la reacción reducción azúcar-DNS.

Las mayores desventajas del método son, la respuesta no lineal para bajas

concentraciones de azúcares reductores (menos de 0,1 g/L glucosa), la inhabilidad

para diferenciar entre los tipos de azúcares reductores (hexosas y pentosas

incluyendo monómeros u oligómeros) por lo que puede ser difícil interpretar los

resultados de la hidrólisis de la celulosa, y es influenciado por otras sustancias (por

ejemplo, ácido cítrico, carboxilmetilcelulosa) (Miller, 1959). La ventaja del método es

su simplicidad y la reproducibilidad de los resultados.

Reactivos

DNS: el orden de adición de los reactivos ha sido encontrado importante.

1. Disuelva 19,8 g de NaOH en 1416 mL de agua destilada.

2. Agregue 10.6 g de ácido dinitrosalicílico y agite hasta disolución completa.

3. Agregue 306 g de Na-K tartrato (sal de Rochelle) y 8,3 g de metabisulfito de

sodio. Agitar hasta disolución completa.

4. Fundir fenol a 50-60 °C y agregar 7,6 mL de fenol al reactivo. El fenol es un

agente cancerigeno. Sea extremamente cuidadoso. (Use guantes de

seguridad y mascara de gas con filtro para vapores orgánicos).

5. Mantener el reactivo en una botella color ámbar y refrigerar.

69

Curva Patrón:

1. Preparar una solución Patrón de Glucosa de 2,0 mg/mL

2. Preparar de los estándares de glucosa de acuerdo a la Tabla 8.

Tabla F-1. Estándares de Glucosa

Concentración (mg/mL)

Volumen Patrón (mL)

Volumen agregado de agua (mL)

0,0 0,0 1,0

0,2 0,1 0,9

0,6 0,3 0,7

1,0 0,5 0,5

1,4 0,7 0,3

1,8 0,9 0,1

2,0 1,0 0,0

Muestras:

Las muestras deben ser filtradas usando una membrana de 0,22 μm y diluidas

apropiadamente antes de realizar el método DNS.

1. Tomar 0,25 mL de muestra.

2. Agregar 0,75 mL del reactivo DNS a todos los tubos de ensayo.

3. Agitar bien el tubo.

4. Colocar los tubos en un baño de agua hirviendo durante 5 minutos.

5. Inmediatamente después introducirlos durante 5 minutos más en un baño de

agua fría.

6. Preparar otro juego de tubos debidamente etiquetados con 8 mL de agua

destilada cada uno y diluir 0.8mL de cada muestra con la ayuda de una

micropipeta.

7. Medir la absorbancia a cada tubo en el espectrofotómetro a 550nm.

8. Prepare una curva estándar de concentración de glucosa vs. absorbancia y

realice un análisis de regresión lineal (Figura 19).

9. Usando la ecuación de regresión lineal, calcule el equivalente de

concentración de glucosa para las muestras.

70

Figura F-1. Concentración de glucosa (mg/mL) vs absorbancia (nm)

Tabla F-2. Curva de calibración del DNS

Concentración (mg/mL)

0,2 0,6 1,0 1,4 1,8 2,0

Absorbancia (nm)

0,06 0,178 0,324 0,468 0,556 0,618

73

APÉNDICE E

DETERMINACIÓN DE COMPUESTOS FENÓLICOS

72

APÉNDICE F

CURVAS DE CALIBRACIÓN PARA LA DETERMINACIÓN DE COMPUESTOS

FENÓLICOS, ÁCIDO ACÉTICO, FURFURAL E HIDROXIMETILFURFURAL (HMF)

Figura F-1. Concentración de compuestos fenólicos (mg/L) vs absorbancia (nm)

Tabla F-1. Curva de calibración de Compuestos fenólicos

Conc. 2,0 3,0 6,0 8,0 10 20

Abs 0,223 0,361 0,671 0,916 1,122 2,005

73

Figura F-2. Concentración de acido acético (ppm) vs área de pico

Figura F-3. Concentración de furfural (mg/mL) vs área de pico

Tabla F-3. Curva de calibración del furfural

Concentración 0,05 0,1 1,0 1,5

Área 11060,4 20633,1 82580,1 117545,0

74

Figura F-4. Concentración de HMF (mg/mL) vs área de pico

Tabla F-4. Curva de calibración del HMF

Conc. 0,025 0,05 0,5 1,0

Área 4195,7 15138,0 69377,0 125990,0

75

APÉNDICE G

CROMATOGRAMAS

Figura G-1. Cromatograma del ácido acético para la primera etapa (T= 140ºC)

Figura G-2. Cromatograma del ácido acético para la segunda etapa (T=180ºC)

76

APENDICE H

RESULTADOS EXPERIMENTALES

Tabla H-1. Contenido de Solubles, Celulosa, Hemicelulosa y Lignina del bagazo de caña de azúcar sometido a hidrólisis ácida diluida con H2SO4 al 1%, relación líquido–sólido de 15:1 y diferentes temperaturas

SUSTRATO

Solubles (%) Celulosa (%) Hemicelulosa (%) Lignina (%)

PROM DS PROM DS PROM DS PROM DS

BSH

17,25 17,28 0,04 61,62 62,25 0,89 8,70 7,99 1,01 12,43 12,49 0,08

17,31 62,88 7,27 12,54

BH1E-100

14,76 14,55 0,30 59,79 60,15 0,50 4,49 5,20 1,00 20,96 20,11 1,21

14,34 60,50 5,91 19,25

BHIE-120

16,06 15,18 1,24 59,64 60,92 1,81 4,66 4,58 0,12 19,64 19,33 0,45

14,30 62,20 4,49 19,01

BHIE-140

14,06 16,01 2,76 58,21 58,21 0,01 4,94 4,66 0,39 20,60 20,35 0,35

17,96 58,20 4,39 20,10

BHIE-160

14,91 15,55 0,91 57,83 57,12 1,00 3,14 2,83 0,44 24,12 24,50 0,54

16,19 56,41 2,52 24,88

BH2E-160

12,67 12,39 0,40 40,61 40,31 0,43 3,51 3,51 0,01 41,21 41,21 0,01

12,10 40,00 3,50 41,20

BH2E-180

21,58 20,79 1,12 33,04 33,02 0,03 3,95 3,95 0,01 41,43 41,37 0,09

20,00 33,00 3,94 41,30 Nota: BSH: Bagazo sin hidrolizar, BH1E- xxx: Bagazo hidrolizado primera etapa a 100, 120, 140 y 160 °C. BH2E- xxx: Bagazo hidrolizado segunda etapa a 160 y 180 °C

77

Tabla H-2. Concentración de azúcares reductores producto de la 1ª Etapa de la hidrólisis ácida diluida del bagazo de caña de azúcar con H2SO4 al 1%, relación líquido–sólido de 15:1 y diferentes temperaturas

Hidrólisis pHi pHf ABSORBANCIAS

Concentración de azucares reductores (mg/mL)

Promedio SD

H1-100 1,62 4,69 0,054 0,055 0,054 1,68 1,72 1,68 1,70 0,02

H2-100 1,43 4,76 0,037 0,038 0,037 1,14 1,17 1,14 1,15 0,02

H3-100 1,35 4,68 0,038 0,050 0,051 1,17 1,56 1,59 1,44 0,23

H1-120 1,55 4,64 0,358 0,352 0,350 11,40 11,21 11,15 11,25 0,13

H2-120 1,38 4,68 0,300 0,310 0,304 9,55 9,87 9,68 9,70 0,16

H3-120 1,34 4,38 0,321 0,322 0,312 10,22 10,25 9,93 10,14 0,18

H1-140 1,76 4,65 0,450 0,463 0,459 14,34 14,76 14,63 14,58 0,21

H2-140 1,44 4,50 0,461 0,478 0,436 14,70 15,24 13,90 14,61 0,68

H3-140 1,39 4,56 0,416 0,408 0,441 13,26 13,00 14,06 13,44 0,55

H1-160 1,35 4,43 0,358 0,365 0,352 11,40 11,63 11,21 11,41 0,21

H2-160 1,32 4,79 0,332 0,339 0,336 10,57 10,80 10,70 10,69 0,11

H3-160 1,33 4,87 0,282 0,277 0,312 8,97 8,81 9,93 9,24 0,61 H1, H2, H3: muestras de hidrolizado de cada experiencia. Hi-xxx: Hidrólisis i a xxx °C: 100,120,140,160,180

78

Tabla H-3. Concentración de azucares reductores producto de la 2ª Etapa de la hidrólisis ácida diluida del bagazo de caña de azúcar con H2SO4 al 1%, relación líquido–sólido de 15:1 y Temperatura de 160°C

Hidrólisis pHi pHf

ABSORBANCIAS

Concentración de azucares reductores (mg/mL)

Promedio SD

H1-160 1,72 4,66 0,071 0,064 0,058 5,20 4,97 4,77 4,98 0,21

H2-160 1,61 4,66 0,061 0,059 0,057 4,87 4,80 4,74 4,80 0,07 H1, H2: muestras de hidrolizado de cada experiencia.

Tabla H-4. Concentración de azucares reductores producto de la 2ª Etapa de la hidrólisis ácida diluida del bagazo de caña de azúcar con H2SO4 al 1%, relación líquido–sólido de 15:1 y Temperatura de 180°C

Hidrolisis pHi pHf

ABSORBANCIAS

Concentración (mg/mL)

Promedio SD

H1-180 1,71 4,92 0,076 0,079 0,079 5,36 5,46 5,46 5,43 0,06

H2-180 1,55 4,71 0,074 0,076 0,075 5,30 5,36 5,33 5,33 0,03 H1, H2: muestras de hidrolizado de cada experiencia.

79

Tabla H-5. Contenido de compuestos fenólicos en el hidrolizado producido en la 1ª Etapa de la hidrólisis ácida diluida del bagazo de caña de azúcar con H2SO4 al 1%, relación líquido–sólido de 15:1 y diferentes temperaturas

Hidrólisis pHi pHf ABSORBANCIAS

Compuestos fenólicos (mg/mL)

Promedio SD

H1-100 1,62 4,69 0,203 0,206 0,214 0,16 0,16 0,17 0,16 0,01

H2-100 1,43 4,76 0,174 0,174 0,172 0,12 0,12 0,12 0,12 0,00

H3-100 1,35 4,68 0,204 0,192 0,193 0,16 0,14 0,14 0,15 0,01

H1-120 1,55 4,64 0,468 0,463 0,472 0,49 0,49 0,50 0,49 0,00

H2-120 1,38 4,68 0,435 0,436 0,422 0,45 0,45 0,43 0,45 0,01

H3-120 1,34 4,38 0,409 0,404 0,412 0,42 0,41 0,42 0,42 0,00

H1-140 1,76 4,65 0,662 0,667 0,701 0,74 0,75 0,79 0,76 0,02

H2-140 1,44 4,50 0,761 0,789 0,845 0,87 0,90 0,97 0,91 0,04

H3-140 1,39 4,56 0,638 0,621 0,617 0,71 0,69 0,68 0,69 0,01

H1-160 1,35 4,43 1,239 1,291 1,368 1,47 1,54 1,64 1,55 0,07

H2-160 1,32 4,79 1,161 1,419 1,455 1,37 1,70 1,75 1,61 0,17

H3-160 1,33 4,87 1,434 1,533 1,472 1,72 1,85 1,77 1,78 0,05 H1, H2, H3: muestras de hidrolizado de cada experiencia. Hi-xxx: Hidrólisis a xxx °C: 100,120,140,160,180

80

Tabla H-6. Contenido de compuestos fenólicos en el hidrolizado producido en la 2ª Etapa de la hidrólisis ácida diluida del bagazo de caña de azúcar con H2SO4 al 1%, relación líquido–sólido de 15:1 y Temperatura de 160°C

Hidrólisis pHi pHf

ABSORBANCIAS

Concentración de azucares reductores (mg/mL)

Promedio SD

H1-160 1,72 4,66 0,963 0,953 0,996 2,16 2,14 2,24 2,18 0,05

H2-160 1,61 4,66 0,974 0,948 0,996 2,19 2,13 2,24 2,19 0,05 H1, H2: muestras de hidrolizado de cada experiencia.

Tabla H-7. Contenido de compuestos fenólicos en el hidrolizado producido en la 2ª Etapa de la hidrólisis ácida diluida del bagazo de caña de azúcar con H2SO4 al 1%, relación líquido–sólido de 15:1 y Temperatura de 180°C

Hidrolisis pHi pHf

ABSORBANCIAS

Concentración (mg/mL)

Promedio SD

H1-180 1,71 4,92 1,205 1,241 1,283 2,69 2,77 2,86 2,77 0,08

H2-180 1,55 4,71 1,203 1,232 1,253 2,69 2,75 2,80 2,74 0,05 H1, H2: muestras de hidrolizado de cada experiencia.

81

Tabla H-8. Contenido de furfural e hidroximetilfurfural (HMF) en el hidrolizado producido en la 1ª Etapa de la hidrólisis ácida diluida del bagazo de caña de azúcar con H2SO4 al 1%, relación líquido–sólido de 15:1 y diferentes temperaturas

Hidrólisis Furfural (mg/mL)

Promedio SD Hidroximetilfurfural, HMF (mg/mL)

Promedio SD

H1-100 0,224 0,227 0,227 0,226 0,002 ND ND ND ND ND

H2-100 0,229 0,226 0,213 0,223 0,008 ND ND ND ND ND

H3-100 0,054 0,053 0,053 0,053 0,001 ND ND ND ND ND

H1-120 0,441 0,442 0,442 0,442 0,001 ND ND ND ND ND

H2-120 0,531 0,519 0,531 0,527 0,007 ND ND ND ND ND

H3-120 0,079 0,079 0,079 0,079 0,000 ND ND ND ND ND

H1-140 1,103 1,118 1,107 1,109 0,008 0,0509 0,0519 0,0218 0,042 0,017

H2-140 1,219 1,242 1,232 1,231 0,012 0,0515 0,0531 0,0520 0,052 0,001

H3-140 0,703 0,752 0,742 0,732 0,026 0,0142 0,0155 0,0165 0,015 0,001

H1-160 1,640 1,682 1,702 1,675 0,032 0,275 0,277 0,278 0,277 0,002

H2-160 1,548 1,632 1,651 1,610 0,055 0,224 0,227 0,223 0,225 0,002

H3-160 1,614 1,629 1,661 1,635 0,024 0,288 0,282 0,253 0,274 0,019

82

Tabla H-9. Contenido de ácido acético en el hidrolizado producido en la 1ª y 2ª Etapa de la hidrólisis ácida diluida del bagazo de caña de azúcar con H2SO4 al 1%, relación líquido–sólido de 15:1 y diferentes temperaturas

Hidrolisis

Concentración de ácido acético (mg/ml)

1ª ETAPA T (°C) 2ª ETAPA T (°C)

100 120 140 160 160 180

H1 0,020 0,068 0,058 0,098 0,197 0,155

H2 0,018 0,063 0,041 0,081 0,092 0,072

H3 0,032 0,059 0,057 0,077 0,149 0,102

Tabla H-10. Contenido de subproductos producidos en la 1ª y 2ª Etapa de la hidrólisis ácida diluida del bagazo de caña de azúcar con H2SO4 al 1%, relación líquido–sólido de 15:1 y diferentes temperaturas

Hidrolizado Furfural (mg/mL) Hidroximetilfurfural (mg/ml) Acido acético (mg/mL) Compuestos fenólicos

(mg/ml)

H1E-100 0,227 ±0,001 ND

0,019 ±0,008a 0,155 ±0,003

H1E-120 0,487 ±0,060 ND

0,061 ±0,005b 0,451 ±0,003

H1E-140 1,168 ±0,089 0,047 ±0,008 0,058 ±0,011b 0,727 ±0,006

H1E-160 1,671 ±0,018 0,276 ±0,002 0,079 ±0,011c 1,646 ±0,062

83

Tabla H-11. Análisis de varianza (ANOVA) de un solo factor para los resultados obtenidos en la primera etapa de hidrólisis

Origen de las variaciones

Variable dependiente

Suma de cuadrados

Grados de libertad

Promedio de los cuadrados

F Pr

Azúcares reductores

187,41 3 62,47 282,62 0,00

Compuestos fenólicos

4,19 3 0,76 640,01 0,00

Temperatura Furfural 6,12 3 0,81 282,12 0,00

HMF 0,11 3 0,04 5778,37 0,00

Ácido acético 0,00 3 0,00 226,45 0,00

84