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NUEVAS TECNICAS DE DIAGNÓSTICO DE PATÓGENOS QUE AFECTAN AL CULTIVO DE MOLUSCOS BIVALVOS Beatriz Novoa, Sonia Dios y Antonio Figueras GRUPO DE PATOLOGÍA DE ORGANISMOS MARINOS INSTITUTO DE INVESTIGACIONES MARINAS CSIC TRABAJO PRESENTADO AL VI PREMIO JACUMAR DE INVESTIGACIÓN EN ACUICULTURA PREMIO "JACUMAR" DE INVESTIGACIÓN EN ACUICULTURA. AÑO 2005
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NUEVAS TECNICAS DE DIAGNÓSTICO DE PATÓGENOS
QUE AFECTAN AL CULTIVO DE MOLUSCOS BIVALVOS
Beatriz Novoa, Sonia Dios y Antonio Figueras
GRUPO DE PATOLOGÍA DE ORGANISMOS MARINOS
INSTITUTO DE INVESTIGACIONES MARINAS
CSIC
TRABAJO PRESENTADO AL VI PREMIO JACUMAR DE
INVESTIGACIÓN EN ACUICULTURA
PREMIO "JACUMAR" DE INVESTIGACIÓN EN ACUICULTURA. AÑO 2005
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ÍNDICE
Pag
- INTRODUCCIÓN 4
ANTECEDENTES: RESUMEN DE INVESTIGACIONES PREVIAS DEL GRUPO
SOBRE PATOLOGIA DE MOLUSCOS 7
- Mejillón 8
- Ostra plana 8
- Almeja 9
- Referencias 10
- TRABAJO DE INVESTIGACIÓN: DESARROLLO Y VALIDACIÓN DE
TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO MOLECULAR PARA LOS PRINCIPALES
PATÓGENOS DE MOLUSCOS 12
1. INTRODUCCION 12
1.1. Marteilia refringens 12
1.2. Bonamia ostreae 14
1.3. Perkinsus 16
2. MATERIALES Y METODOS 18
2.1.Muestreos 18
2.1.1. Muestreos realizados en ostra y mejillón 18
2.1.2. Muestreos realizados en almeja fina 19
2.2.Técnicas de diagnóstico y caracterización de agentes patógenos 20
2.2.1. Microscopía óptica 20
2.2.2. Microscopía electrónica de transmisión (MET) 20
2.2.3. Diagnóstico de Perkinsus atlanticus (técnica de
incubación en medio fluido de tioglicolato, RFTM) 21
2.3.Diagnóstico basado en técnicas de biología molecular 21
2.3.1. Extracción del ADN 21
2.3.2. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) 22
3
2.3.3. Secuenciación y clonación de los fragmentos amplificados 22
2.3.4. Análisis filogenético 23
2.3.5. Hibridación in situ 24
3. RESULTADOS Y DISCUSION 24
3.1. Diagnóstico molecular de Marteilia refringens 24
3.2. Diagnóstico de Bonamia ostreae 27
3.3. Diagnóstico molecular de Perkinsus 30
4. CONCLUSIONES 31
5. AGRADECIMIENTOS 32
6. BIBLIOGRAFÍA 33
7. TABLAS Y FIGURAS 36
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Este trabajo supone una recopilación de parte de las investigaciones llevadas a cabo
sobre Patología de moluscos durante los últimos 20 años (1986-2005) por el equipo de
investigación dirigido por el Dr. Antonio Figueras del Instituto de Investigaciones
Marinas (CSIC) de Vigo.
INTRODUCCIÓN
La actual situación conflictiva de los distintos caladeros donde nuestra flota
pesquera desarrolla su actividad, hace que una y otra vez los ojos de la opinión pública se
vuelvan hacia la Acuicultura marina que se desarrolla en nuestras rías y bahías. Sus
condiciones físicas, químicas y biológicas permiten la existencia de un microcosmos en el
que viven gran variedad de especies, poseyendo algunas de ellas un elevado valor
económico. La Acuicultura no es ni será una alternativa total a la actividad pesquera, pero
puede llegar a ser una alternativa parcial, tanto ocupacional como de producción, y por lo
tanto ha de procurarse que dicha producción acuícola se mantenga y se incremente.
La Acuicultura española constituye el 3% de la producción mundial y el 25% de la
europea. Esta producción supone alrededor del 24% de la producción pesquera española.
La producción de la Acuicultura de Galicia es aproximadamente el 80% del total de la
producción de la Acuicultura en España. La mayor producción de la Acuicultura en Galicia
es la de mejillón (250.000 toneladas) y supone la segunda producción mundial después de
China.
Uno de los factores limitantes en la producción animal tanto en el medio terrestre
como en el acuático son las enfermedades infecciosas, ya que originan graves pérdidas. Las
altas densidades de cultivo, las importaciones de peces y moluscos no controladas,
permiten que se introduzcan patógenos, favoreciendo la aparición de mortalidades que, en
ocasiones, pueden ser masivas. En el caso de los moluscos bivalvos, desde los años 50, el
protozoo Haplosporidium nelsoni ocasiona pérdidas cercanas al 70 % en la ostra americana
(Crassostrea virginica) en la costa este de los Estados Unidos donde se cultiva. Bonamia
ostreae, parásito de la ostra plana, ocasiona mortalidades cercanas y a veces superiores al
80 %, en los países europeos (entre ellos España) en los que se ha detectado.
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Nuestra acuicultura, y más en concreto la de moluscos bivalvos, se ha encargado
con asiduidad de demostrar que el movimiento de individuos sin controlar su estado de
salud es la manera más rápida y eficaz de introducir enfermedades. Todas las enfermedades
que han causado mortalidades en distintas zonas de producción europeas han sido
introducidas en nuestras aguas. Así, por ejemplo, Marteilia refringens y Bonamia ostreae,
parásitos protozoos causantes de grandes mortalidades en ostra plana, fueron introducidas
con semilla de ostra francesa en los años 70 y 80 respectivamente. Perkinsus atlanticus
acompañó a la almeja fina portuguesa a finales de los 80 y, más o menos en las mismas
fechas, el anillo marrón producido por una bacteria del género Vibrio fue así mismo
introducido con almeja japonesa enferma importada desde Francia. Estos hechos tienen
como denominador común la carencia de una policía sanitaria adecuada. Esta carencia es el
resultado de diversos factores. Por un lado la nula preparación, en aquella época, de los
profesionales encargados de realizar los controles sanitarios de los peces o moluscos, para
diagnosticar este tipo de enfermedades; por otro lado, la ausencia de conocimientos por
parte de los cultivadores sobre los riesgos que corrían, ellos y sus nietos, al introducir
animales enfermos, y por otro la ausencia de una implementación práctica de las
normativas nacionales y autonómicas que, desde que se promulga la Ley de cultivos
Marinos hasta nuestros días, constituyen una de las heridas abiertas por las que, en parte, se
desangra nuestro sector.
También los científicos tenemos nuestra parte de responsabilidad, ya que a la escasa
información sobre aspectos de virulencia y patogenicidad de los agentes patógenos que
causan las disminuciones en rendimiento y las mortalidades en organismos acuáticos, se
suma el casi total desconocimiento sobre su sistema inmune, con lo que es difícil emplearlo
en favor de la producción tal como se hace en la ganadería. En el caso de los moluscos, la
ausencia de anticuerpos o mecanismos de memoria inmunológica determina la
inespecifidad de sus mecanismos de defensa. Este hecho imposibilita el uso de vacunas
como sistemas de prevención. El único método real para luchar contra las enfermedades es
la detección rápida y específica de agentes patógenos.
La Unión Europea, consciente de la importancia de la Acuicultura y de los riesgos que se derivan de la unidad de mercados, ha elaborado una serie de normas encaminadas a proteger estos recursos.
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La normativa comunitaria, supone un nuevo aldabonazo a nuestra administración y
a los sectores productivos y comercializadores sobre la importancia que las enfermedades
tienen en todo proceso de producción animal y más en concreto en la Acuicultura y en este
marco se entiende la acción del Laboratorio Nacional de Referencia de las Enfermedades
de Moluscos Bivalvos en el CSIC.
Nuestra acuicultura, y más en concreto la de moluscos bivalvos, se ha encargado
con asiduidad de demostrar que el movimiento de individuos sin controlar su estado de
salud es la manera más rápida y eficaz de introducir enfermedades. Todas las enfermedades
que han causado mortalidades en distintas zonas de producción europeas han sido
introducidas en nuestras aguas. Así, por ejemplo, Marteilia refringens y Bonamia ostreae,
parásitos protozoos causantes de grandes mortalidades en ostra plana, fueron introducidas
con semilla de ostra francesa en los años 70 y 80 respectivamente. Perkinsus atlanticus
acompañó a la almeja fina portuguesa a finales de los 80 y, más o menos en las mismas
fechas, el anillo marrón producido por una bacteria del género Vibrio fue asímismo
introducido con almeja japonesa enferma importada desde Francia. Estos hechos tienen
como denominador común la carencia de una policía sanitaria adecuada. Esta carencia es el
resultado de diversos factores. Por un lado la nula preparación, en aquella época, de los
profesionales encargados de realizar los controles sanitarios de los peces o moluscos, para
diagnosticar este tipo de enfermedades; por otro lado, la ausencia de conocimientos por
parte de los cultivadores sobre los riesgos que corrían, ellos y sus nietos, al introducir
animales enfermos, y por otro la ausencia de una implementación práctica de las
normativas nacionales y autonómicas que, desde que se promulga la Ley de cultivos
Marinos hasta nuestros días, constituyen una de las heridas abiertas por las que, en parte, se
desangra nuestro sector.
También los científicos tenemos nuestra parte de responsabilidad ya que a la escasa
información sobre aspectos de virulencia y patogenicidad de los agentes patógenos que
causan las disminuciones en rendimiento y las mortalidades en organismos acuáticos se
suma el casi total desconocimiento sobre su sistema inmune, con lo que es difícil emplearlo
en favor de la producción tal como se hace en la ganadería. En el caso de los moluscos, la
ausencia de anticuerpos o mecanismos de memoria inmunológica determina la
inespecifidad de sus mecanismos de defensa. Este hecho imposibilita el uso de vacunas
7
como sistemas de prevención. El único método real para luchar contra las enfermedades es
la detección rápida y específica de agentes patógenos.
ANTECEDENTES: RESUMEN DE INVESTIGACIONES PREVIAS DEL GRUPO
SOBRE PATOLOGÍA DE MOLUSCOS
Al inicio de nuestras investigaciones sobre las enfermedades de los moluscos en los
años ochenta hubo que determinar, ya que hasta el momento apenas se habían realizado
investigaciones sobre este tema en España, cuales eran los patógenos (prevalencias,
intensidades y ciclos de vida) que se encontraban en las diversas especies cultivadas y
cuales eran sus efectos (patogenicidad, mecanismos de defensa, mortalidad) sobre las
mismas.
La estrategia inicial seguida para combatir los diversos patógenos, ha sido la de
establecer cuales son los agentes infecciosos potencialmente virulentos presentes en una
zona de cultivo y, que relación existe entre sus prevalencias y las mortalidades detectadas o
las caídas en rendimiento (crecimiento en longitud y peso), de tal forma que mediante un
muestreo exhaustivo y continuo y, sobre todo, con la ayuda de técnicas de diagnóstico que
permitan detectar la presencia de patógenos de forma rápida y eficaz, se pueda avisar a los
cultivadores antes de que las mortalidades den al traste con la producción, permitiéndoles
por lo tanto, cosechar antes de perder la producción.
En la actualidad nuestro grupo es el Laboratorio Nacional de Referencia de
Enfermedades de Moluscos Bivalvos (R.D. 1043/1997; BOE nº 163), cuya misión consiste
en clarificar la causa(s) de mortalidades anormales detectadas tanto en poblaciones
naturales como cultivadas de estos animales, formar técnicos, realizar tareas de
intercalibración de técnicas de diagnosis con los laboratorios autorizados por las
Comunidades Autónomas, mantener una colección de patógenos y de preparaciones
histológicas y trabajar conjuntamente con el Laboratorio Europeo de Referencia.
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Mejillón.
Los parásitos que hemos detectado en el mejillón gallego hasta la fecha son:
Riquetsias, Haplosporidios, Marteilia sp, Ciliados, Steinhausia mytilovum, Tremátodos,
Mytilicola intestinalis, Copépodos harpacticoides y el turbelario Urastoma cyprinae. Es
interesante señalar que la glándula digestiva es la más parasitada de todos los órganos
examinados, probablemente por ser una zona donde se da un proceso de transferencia
energética aprovechada por los parásitos. Las mortalidades que hemos encontrado no
pueden ser explicadas exclusivamente en base a las condiciones patológicas detectadas.
Probablemente, la combinación de la carga parasitaria, con una menor cantidad de alimento
disponible (para un número cada vez mayor de comensales) y la degradación del medio,
sean la causa de la disminución del rendimiento en carne y en la tasa de crecimiento (14
meses para conseguir mejillones de 9 cm en 1977 frente a los 24 necesarios en 1993)
detectados en los últimos veinte años (Figueras et al., 1991; Figueras, 1991b; Robledo et
al., 1995 a, b, c).
En los trabajos que hemos realizado sobre los mecanismos de defensa del mejillón, es
interesante señalar que su actividad variaba estacional y espacialmente, alcanzando valores
máximos en Julio, que es cuando alimento y temperatura muestran valores bajos y se
considera el fin del ciclo reproductivo (Santarém et al., 1990, 1994). Hemos caracterizado
mecanismos de defensa celular de estos animales como la producción de radicales de
oxígeno y nitrógeno (óxido nítrico) por parte de los hemocitos de mejillón, determinando
los estímulos que provocan una mayor respuesta inmune, así como la interacción con
patógenos (Ordás et al., 1999; Tafalla et al., 2002).
Ostra plana.
La, en otro tiempo, importante ostricultura gallega se ha visto reducida a una
mínima expresión, sin datos fiables de producción. Se ha intentado explicar este fenómeno
acudiendo a la aparición de repetidas mortalidades (80%) achacadas en los años setenta a
Marteilia refringens y a partir de 1980 a Bonamia ostreae, y a un fenómeno de
"sobreexplotación" de los bancos naturales. En los cultivos experimentales de ostra plana
gallega procedente de criaderos artificiales, que hemos realizado en batea, cabe destacar
que las mortalidades se han mantenido por debajo del 10% durante el primer año llegando
9
a alcanzar el 30 % en algunos meses del segundo. La acción sinérgica del parásito
intrahemocitario Bonamia ostreae y el estrés inducido por la puesta parece la causa de
estas altas mortalidades, que se mantienen dentro del nivel descrito por otros autores,
aunque con tendencia al descenso. Es importante señalar que los individuos alcanzaban la
talla comercial sin haberse registrado altas mortalidades, con lo que este cultivo podría ser
económicamente rentable si se realizara un seguimiento de los niveles de parasitación, para
poder asesorar a los cultivadores con el fin de comercializar la ostra antes de que se
produjesen las mortalidades (Figueras, 1991a).
La normativa de la Unión Europea sobre el estado de salud de los animales
procedentes de la Acuicultura, encaminada a favorecer el desarrollo del Mercado Único y a
limitar la extensión y el impacto de las enfermedades, hace especial hincapié en la
identificación de las especies susceptibles y de la especies que, no experimentando
mortalidades, pueden actuar como portadoras de enfermedades, restringiendo el transporte
de animales infectados. En la directiva europea (UE 91/67) se señala a Bonamia ostreae y
Marteilia refringens como los organismos patógenos de moluscos bivalvos en Europa a
controlar, dado el gran impacto negativo que han causado y causan sobre las poblaciones
cultivadas y naturales de moluscos. Por ello, en el marco de un contrato europeo, hemos
realizado experimentos de laboratorio y de campo en los que mediante la cohabitación de
animales infectados y no infectados e inoculación de parásitos purificados, hemos llegado a
la conclusión de que Bonamia ostrae solamente infecta a la ostra plana (Ostrea edulis)
(Culloty et al., 1999). Sin embargo, con la metodología empleada (infecciones
experimentales, inmunodiagnosis y microscopía electrónica de transmisión), fue imposible
aclarar tanto la transmisión como la taxonomía de Marteilia refringens (Berthe et al., 1998,
Longshaw et al., 2001).
Almeja.
Hemos detectado en almeja tres enfermedades, la causada por el protozoo Perkinsus
atlanticus (Figueras et al., 1992), el anillo marrón causado por la bacteria Vibrio P1
(Figueras et al., 1996) y la producida por un virus (Novoa y Figueras, 2000). Intentando
poner a punto un método para cultivar Perkinsus, obtuvimos un cultivo puro de un nuevo
protozoo (Pseudoperkinsus tapetis) muy similar a Perkinsus pero muy diferente a nivel
10
molecular (Ordás y Figueras, 1998; Figueras et al., 2000). Hemos descrito ya como los
productos de secreción de este parásito disminuyen significativamente la fagocitosis de
almeja y mejillón (Ordás et al. 1999). Por otra parte hemos estudiado la enfermedad
conocida como "anillo marrón" causada por Vibrio tapetis, que aparece en la práctica
totalidad de las localidades muestreadas en Galicia y Portugal. Mediante infecciones
experimentales, hemos reproducido la enfermedad y hemos observado como las distintas
cepas son capaces de vencer a los distintos mecanismos de defensa (actividad de la
lisozima, títulos de aglutininas, actividad bactericida, etc.), empleados por las distintas
especies de almeja (Novoa et al., 1998). Recientemente hemos descrito una infección viral
que causa una elevadísima mortalidad y que podría suponer un gravísimo daño al cultivo
de esta especie (Novoa y Figueras, 2000).
En cuanto al estudio del sistema inmune, hasta ahora no se ha detectado la
producción de radicales de oxígeno en esta especie, sin embargo, hemos caracterizado la
producción de óxido nítrico por sus hemocitos (Tafalla et al., 2003) y estamos estudiando
su relación con la resistencia a distintas enfermedades.
Referencias
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TRABAJO DE INVESTIGACIÓN: NUEVAS TECNICAS DE DIAGNÓSTICO DE
PATÓGENOS QUE AFECTAN AL CULTIVO DE MOLUSCOS BIVALVOS
El hecho de que los moluscos carezcan de una respuesta específica y de memoria
inmunológica, nos impide prevenir las enfermedades mediante vacunas. Por ello en este
caso se hace más necesario el desarrollo de sistemas de diagnóstico rápidos y eficaces, para
detectar la infección antes de que se produzcan mortalidades elevadas y evitar la
introducción de animales enfermos.
1. INTRODUCCIÓN
En Galicia, donde los cultivos marinos tienen una gran relevancia, se han detectado
en los últimos años diversos parásitos considerados como agentes patógenos serios, como
son los casos de Bonamia ostreae, Marteilia refringens y Perkinsus olseni/atlanticus. En el
momento actual la Unión Europea incluye como especies de declaración obligatoria a B.
ostreae y M. refringens, incluyéndolas en la Lista II de la Directiva 91/67/CEE, con las
implicaciones que esto tiene para los Estados miembros de la Unión Europea, en relación a
determinar zonas de cultivo afectadas o no por estas enfermedades.
1.1. Marteilia refringens
El Filum Paramyxea engloba un grupo importante de parásitos protozoos de
invertebrados marinos. Actualmente, el Filum Paramyxea está dividido en dos clases:
Marteiliidea con tres géneros Marteilia (Grizel et al., 1974; Perkins, 1976) Paramarteilia
(Ginsburger-Vogel y Desportes, 1979) y Marteilioides (Comps et al., 1987) y Paramixidea
con un sólo género, Paramyxa. Entre ellos, cabe destacar Marteilia refringens (Grizel et al.,
1974; Perkins, 1976), la cual desde su descubrimiento en 1968 ha causado y sigue causando
importantes mortalidades en Ostrea edulis en Europa, y Marteilia sydneyi (Perkins y Wolf,
1976) responsable de la enfermedad conocida como QX y causante de altas mortalidades de
la ostra Saccostrea commercialis en Australia.
13
En 1982, Comps et al. describen una nueva especie del género Marteilia (M. maurini)
considerándola como la única especie de Marteilia capaz de parasitar mejillones. La
diagnosis de las dos especies encontradas en Europa se realizó mediante estudios
estructurales y especificidad de hospedador. Desde que se observó Marteilia refringens,
inicialmente considerada como parásito exclusivo de Ostrea edulis en Mytilus
galloprovincialis, se rechazó la especificidad de hospedador como carácter taxonómico. La
falta de rasgos morfológicos claros que permitan distinguir ambas especies sugieren, pero
no de una forma suficientemente concluyente, que Marteilia maurini no es realmente una
especie diferente de Marteilia refringens. Longshaw et al. (1997) concluyen que Marteilia
maurini, presente en Mytilus edulis y M. galloprovincialis, no puede ser separada de
Marteilia refringens detectada en Ostrea edulis usando los criterios ultraestructurales
tradicionalmente empleados hasta ahora. En la Figura 1 se aprecia la similitud existente en
características ultraestructurales de Marteilia procedente de ostra plana y mejillón.
La especie hospedadora natural de M. refringens es la ostra plana europea (Ostrea
edulis). También se han detectado infecciones naturales cuando se han introducido
experimentalmente en zonas infectadas por Marteilia, ejemplares de O. angassi, O.
densellamellosa y de Tiostrea chilensis. Se ha detectado la presencia de Marteilia spp. en
diversas especies de moluscos bivalvos: Crassostrea gigas, C. virginica, C. echinata, C.
cucullata, Saccostrea comercialis (Marteilia sidneyi), Scrobicularia piperata, Cardium
edule, Tapes pullastra, T. rhomboides, Modiolus modiolus.
Es importante reseñar la presencia de Marteilia maurini y de Marteilia sp. en los
mitilidos Mytilus edulis y M. galloprovincialis.
M. refringens parasita la glándula digestiva induciendo una decoloración de la
misma y una reducción de la cantidad de glucógeno presente en las ostras afectadas. Las
ostras parasitadas aparecen emaciadas con la consiguiente reducción del crecimiento y con
episodios de mortalidad. La parasitosis está acompañada de cambios histopatológicos que
afectan a las células del epitelio del estómago y de los túbulos digestivos, que muchas veces
experimentan cambios necróticos. Con el desarrollo de la infección, pueden observarse
cantidades variables de infiltraciones hemocíticas. Se ha observado la aparición de una
reacción hemocitaria en los túbulos digestivos primarios y secundarios, en el tejido
14
conectivo de la glándula digestiva, así como en el epitelio estomacal y divertículos
digestivos
La presencia de Marteilia en las células de la glándula digestiva, interfiere
directamente con la alimentación del hospedador. La infección por el parásito provoca una
mayor demanda energética lo que conduce a una reorganización de reservas y a la pérdida
de células adipogranulares. Por otra parte, la gametogénesis y el desarrollo gonadal están
retrasados en los mejillones (M. galloprovincialis) y ostras (O. edulis ) infectados, siendo
incapaces de iniciar nuevos ciclos gametogénicos en el año siguiente. En O. edulis
infectadas por M. refringens se ha observado que mantienen sus conchas cerradas durante
períodos anormales de tiempo, conduciendo en los estados terminales a la incapacidad de
cerrar las conchas. En Mytilus galloprovincialis y Ostrea edulis la liberación de esporas al
lumen de los túbulos digestivos produce la destrucción del tejido adyacente. La
combinación de todos estos efectos puede ocasionar la muerte del hospedador.
No se ha conseguido reproducir experimentalmente la enfermedad, por lo que la
hipótesis sobre la existencia de un hospedador intermediario se considera como muy
posible.
La erradicación de este parásito una vez introducido es prácticamente imposible.
Por ello, se debe evitar la introducción de ostras infectadas en zonas libres de esta
enfermedad (Directiva 91/67), o durante el verano en zonas con temperatura del agua
superior a los 17 ºC.
Los métodos de diagnosis reconocidos por la Unión Europea y la Oficina
Internacional de las Epizootías) son el Método citológico y la histología.
1.2. Bonamia ostreae
B. ostreae (Pichot et al., 1980), señalado en un principio como parásito “X” (Comps
et al., 1980), es un parásito intrahemocitario que causa la enfermedad denominada
bonamiasis, también conocida como enfermedad de los hemocitos y enfermedad de las
microcélulas.
Bonamia ostreae se detectó por primera vez en la ostra plana (Ostreae edulis) y
posiblemente, fue introducida en Europa desde los Estados Unidos (costa occidental),
aunque actualmente también se encuentra presente en la costa oriental (Maine). En Europa
15
se detectó por primera vez en la Bretaña francesa en mortalidades acaecidas en ostra plana
(Ostrea edulis) en el verano de 1979, propagándose posteriormente a otros estados de la
Unión Europea. Este parásito tiene una gran repercusión en el cultivo de ostra en Galicia,
debido a las elevadas mortalidades asociadas a esta patología, que han sido puestas de
manifiesto en diversos trabajos (Montes, 1995). Otras especies del género Bonamia son B.
exitiosa, que causa grandes mortalidades en Ostrea chilensis en Nueva Zelanda y Chile
(Hine et al., 2001, Berthe & Hine, 2003, Bower & McGladdery, 2003), B. roughleyi, antes
conocida como Mykrocytos roughleyi (Carnegie & Cochennec-Laureau, 2004), que causa
la enfermedad de invierno en Australia en Saccostrea glomerata (Farley et al., 1988) y
Bonamia sp. de O. angasi en Australia (Hine & Jones, 1994). Las secuencias del gen de la
SSU (Small SUnit) ribosómico y de la región ITS (Internal Transcribed Spacer)
confirmaron la existencia de al menos tres nuevas especies de Bonamia, una de Tiostrea
chilensis de Chile (Campalans et al., 2000) y otra de Crassostrea ariakensis de Carolina del
Norte (Burreson et al., 2004). Filogenéticamente, el género Bonamia está situado en el
filum Haplosporidia, debido a la presencia de haplosporosomas (Pichot et al., 1980; Hine et
al., 2001) y por el análisis molecular del gen de la SSU ribosómico (Cochennec et al., 2000;
Carnegie et al., 2000; Cochennec-Laureau et al., 2003). Es interesante señalar la ausencia
de un estado de esporulación en su ciclo de vida. Este parásito hibridó con sondas
específicas para distintos parásitos del filum Haplosporidia, lo cual sugiere una gran
proximidad filogenética. Es el único miembro de este filum con transmisión directa (Poder
et al., 1982; Tigé et al., 1982; Bachère y Grizel, 1985; Culloty et al., 1999). Este filum
incluye cinco especies de protozoos que causan elevadas mortalidades en moluscos (Wood
y Andrews, 1962; Haskin et al., 1966; Pichot et al., 1980; Farley et al., 1988; Hine et al.,
2001; Bower y McGladdery, 2003).
Las ostras infectadas pueden presentar síntomas clínicos macroscópicos. De hecho,
en las branquias de los animales infectados, se pueden detectar indentaciones y
perforaciones rodeadas de un color verdoso. Estos síntomas no son específicos de la
enfermedad, pero al menos están presentes en su fase inicial.
Las alteraciones histopatológicas consisten fundamentalmente en infiltraciones
hemocitarias detectadas en los órganos infectados, tales como el tejido conectivo de la
glándula digestiva, las gónadas, las branquias y el manto.
16
B. ostrae se multiplica en los hemocitos que han fagocitado el parásito. Cuando los
hemocitos mueren se pueden encontrar muchos restos celulares en la luz de los senos
sanguíneos.
La enfermedad se transmite de ostra a ostra. La fase inicial de la enfermedad puede
afectar a moluscos de todas las edades. En caso de que la enfermedad sea endémica se
detecta una mayor prevalencia en ejemplares de mayor edad. La enfermedad puede estar
presente todo el año y la mortalidad inducida puede llegar al 90%, aumentando durante el
verano.
Se pueden obtener infecciones experimentales mediante inoculación, contacto o
alimentación. Existe una buena correlación entre la densidad de la población de ostras y la
infección. Además, el estrés (turbidez, manipulación) favorece la manifestación de la
enfermedad.
Cada vez que se introducen ostras infectadas en zonas libres de este parásito
(Directiva 91/67/CEE), se transmite la enfermedad de manera más o menos acentuada. Por
tanto para prevenir eficazmente su difusión, es necesario controlar tanto el estado de salud
de las ostras como la especie introducida, sobre todo en las tallas menores. Los métodos de
diagnosis reconocidos por las CEE y la Oficina Internacional de las Epizootías) son los
siguientes: el método citológico (extensión de sangre) y el método histológico.
1.3. Perkinsus
La Perkinsiosis está causada por varios parásitos del género Perkinsus. Las especies
de moluscos marinos, bivalvos y gasterópodos, sensibles son numerosas. En función de la
especie hospedadora y de la morfología del parásito, ha sido posible diferenciar diversas
especies entre las que se encuentran Perkinsus marinus (en un principio clasificado como
Dermocystidium marinum, produce una parasitosis muy peligrosa para la ostra americana
Crassostrea virginica en América del Norte y América Central), P. olseni (en Haliotis ruber,
Haliotis laevigata en Australia), y P. atlanticus (actualmente asimilado a P. olseni, debido a
su identidad, y presente en Ruditapes decussatus, R. philippinarum, R. pullastra en Europa).
17
Normalmente los moluscos infestados no presentan signos clínicos externos evidentes,
solamente en casos de infestaciones graves los individuos afectados pueden presentar aspecto
delgado, coloración pálida de la carne y su consistencia disminuida, branquias grisáceas por
la presencia de nódulos blanquecinos (quistes parasitarios).
La histología de los individuos parasitados muestra desorganización celular
caracterizada por una respuesta inflamatoria masiva. El tejido conectivo de distintos órganos
suele ser el objetivo del parásito (branquia, manto, riñón, gónada, intestino y glándula
digestiva), lo mismo sucede con la musculatura del pie. Esta parasitosis en combinación con
factores ambientales negativos puede causar graves mortalidades.
Las observaciones realizadas empleando el microscopio electrónico de transmisión
permiten distinguir las siguientes fases del ciclo vital del parásito. Los trofozoitos constituyen
la fase vegetativa que se sitúa en el tejido conectivo de la especie hospedadora. Los
trofozoitos se multiplican mediante ciclos repetidos de cariocinesis y citocinesis hasta formar
trofozoitos inmaduros. Con la rotura de la pared celular, los trofozoitos inmaduros se liberan
y sucesivamente se transforman en trofozoitos maduros, que se caracterizan por una gran
vacuola que contiene un vacuoplasto refringente.
Las hipnosporas representan la fase de resistencia del protozoo una vez que se produce
la muerte del molusco hospedador y es anterior a una nueva infección mediante las zoosporas.
Son células delimitadas por una gruesa pared celular y de 10 a 15 µm de diámetro. La parte
central está ocupada por una gran vacuola y el núcleo se sitúa en la periferia. En la Figura 2
pueden observarse diferentes estadíos del ciclo de vida del género Perkinsus.
La última fase del ciclo la constituye la zoospora. Son células biflageladas con las
características del phylum Apicomplexa.
En Europa, Azevedo (1989) detectó diferencias en la ultraestructura del Perkinsus que
encontraba en almeja cuando lo comparaba con P. marinus, y describe la especie P.
atlanticus, actualmente asimilada a P. olseni, observada en almeja fina (Ruditapes
decussatus) en Portugal. En Galicia, se ha detectado tanto en introducciones de almeja fina
procedentes de Portugal (González et al., 1987), como en diversas zonas de cultivo de esta
misma especie, en las rías de Arosa (Villalba et al., 1993) y Vigo (Figueras et al., 1992). En la
actualidad, se tiene constancia de que este parásito está afectando en diversas zonas, al cultivo
18
de almeja fina (Ruditapes decussatus), almeja babosa (Venerupis pullastra) y almeja japonesa
(Ruditapes philippinarum).
2. MATERIAL Y MÉTODOS
2.1. MUESTREOS
2. 1. 1. Muestreos realizados en ostra y mejillón
La procedencia de los moluscos muestredos para estudiar la prevalencia de
enfermedades fue:
Mejillones: Mytilus galloprovincialis
Ría de Vigo (España)
Adriático, Istria (Italia)
Mejillones: Mytilus edulis
Oceáno Atlántico, Bretaña, La Trinité (Francia)
Ostras: Ostrea edulis
Oceáno Atlántico, Bretaña ,Golfe du Morbihan (Francia)
Oceáno Atlántico, Marennes Oléron (Francia)
Mar Mediterráneo, Port Leucat (Francia)
Mar Mediterráneo, Delta del Ebro (España)
Oceáno Atlántico, Huelva (España)
Oceáno Atlántico, Ría de Arosa (España)
En todos los bivalvos muestreados, se realizó un estudio para identificar los animales
infectados con Marteilia y Bonamia, llevando a cabo una aposición de tejidos (glándula
digestiva, hemolinfa o corazón) sobre un portaobjetos, que fue posteriormente teñida con
Hemacolor y observada mediante microscopía óptica.
19
2. 1. 2. Muestreos realizados en almeja fina
En el caso de almejas, se llevaron a cabo numerosos muestreos, ya que las
mortalidades asociadas a su cultivo han sido relativamente frecuentes en los últimos años.
Se realizaron distintos tipos de muestreos: muestreos rutinarios no asociados a
mortalidades (entre los que se incluyen muestreos de importaciones) y muestreos para
detectar la causa de mortalidades (tanto de almejas adultas en parques de cultivo como en
larvas y semilla de criadero).
En la Figura 3 se presenta la ubicación de las rías donde se llevaron a cabo los
muestreos, con el fin de conocer los agentes patógenos presentes en la almeja fina.
Muestreos asociados a mortalidades en parques de cultivo en Galicia (adultos)
Para determinar la causa de las diversas mortalidades ocurridas en adultos de almeja
fina desde 1997, se realizaron varios muestreos en los parques de cultivo donde ocurrieron
estas mortalidades (Tabla 1). Los muestreos se llevaron a cabo cuando los mariscadores
detectaban mortalidades en las almejas cultivadas.
Muestro de larvas y semilla de almeja
En la Tabla 2 se presentan los muestreos realizados desde 1999 hasta el 2002 en
larvas y semilla de almeja fina obtenidas en criadero. Las almejas analizadas de varios lotes
presentaron mortalidades puntuales. Además, paralelamente se llevaron a cabo muestreos
en lotes que no presentaron mortalidades con fines comparativos.
Muestreos rutinarios en ejemplares adultos de almeja fina en parques de cultivo en
Galicia
Se realizaron muestreos rutinarios en ejemplares adultos de almeja fina en diferentes
parques de cultivo para conocer su estado de salud (Tabla 3).
Muestreos de importaciones para repoblación
Se tomaron muestras de importaciones de ejemplares adultos de almeja fina
procedentes de zonas de alta producción de Túnez, a petición de Sanidad Animal (MAPA).
20
Las muestras consistieron en grupos de 30 almejas adultas, que se tomaron antes de que
éstas llegasen a las cofradías para ser repartidas en las zonas de cultivo (Tabla 4).
2.2. TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO Y CARACTERIZACIÓN DE AGENTES
PATÓGENOS
2.2.1. Microscopía óptica
Los tejidos fueron fijados en fijador de Davidson (Shaw y Battle, 1957) durante 24
horas. Posteriormente los tejidos se deshidrataron en alcohol utilizando un sistema
automatizado y se incluyeron en parafina. Una vez obtenidos los bloques, se hicieron cortes
de 5 µm de espesor y se tiñeron con hematoxilina-eosina y Giemsa. Estas secciones
histológicas de almeja fueron examinadas al microscopio óptico (Nikon Optiphot).
En el caso de larvas, también se fijaron en Davidson, cambiando el fijador
frecuentemente durante 24 horas, con el fin de que el ácido acético fuera descalcificando la
concha de los organismos (Howard y Smith, 1983). A continuación los tejidos se
deshidrataron manualmente de acuerdo con los tiempos establecidos y se incluyeron en
parafina, para luego cortar y teñir con hematoxilina-eosina y Giemsa. La semilla se procesó
de igual manera que los ejemplares adultos.
2.2.2. Microscopía electrónica de transmisión (MET)
Piezas pequeñas de tejido (glándula digestiva, branquia y músculo) fueron fijadas en
2% de glutaraldehído durante 1 hora a 4oC. Posteriormente los tejidos se lavaron dos veces
durante 10 minutos con tampón cacodilato sódico 0,2 M (pH=7,4). A continuación se
fijaron en tetróxido de osmio (OsO4) al 2% en tampón cacodilato sódico durante una hora a
4oC y se lavaron de nuevo dos veces durante 10 minutos con tampón cacodilato sódico.
Seguidamente, las muestras se deshidrataron mediante la incubación en una serie creciente
de alcoholes (25, 50, 70, 95 y 100%) y después en series crecientes de alcohol/óxido de
propileno (75:25; 50:50; 25:75 y 100%) para ser embebidas en resina Epon-Araldite.
Posteriormente, se realizaron cortes semifinos (1 µm) usando un ultramicrotomo (Reichert
Jung), que fueron teñidos con 0,5% de azul de toluidina. Los cortes semifinos fueron
observados mediante microscopía óptica. Los cortes ultrafinos se tiñeron con acetato de
21
uranilo y citrato de plomo, y se observaron en un microscopio electrónico de transmisión
Philips CM 100.
2.2.3. Diagnóstico de Perkinsus atlanticus (técnica de incubación en medio fluido de
tioglicolato, RFTM)
La presencia de P. atlanticus en las almejas, se determinó mediante la incubación de
tejido de almeja en medio fluido de tioglicolato descrito por Ray (1954, 1966). Para ello,
las branquias de las almejas se introdujeron en tioglicolato al 3% en agua destilada con un
2% de NaCl y un 0,05% de cloranfenicol. Para evitar la aparición de hongos, se añadió al
medio el antifúngico micostatina (4.000 USP/ml) antes de introducir los tejidos. Las
branquias se incubaron durante 4 a 5 días en oscuridad a temperatura ambiente (21oC) y
posteriormente se tiñeron con yodo de lugol (3% de yoduro potásico y 2% de yodo en agua
destilada) y se observaron al microscopio. El parásito se detectó por la presencia de grandes
esferas de color azul oscuro o negro. La intensidad de la infección se evaluó siguiendo la
escala de Mackin (Ray, 1954)
2.3. DIAGNÓSTICO BASADO EN TÉCNICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR
2.3.1. Extracción del ADN
El ADN de las muestras se extrajo empleando el kit DNAZOL (Gibco Life
Technologies). Los pooles de tejido se colocaron en un eppendorf de 1 ml previamente
autoclavado. Posteriormente, se adicionaron 250 µl de reactivo DNAZOL.
El tejido se homogenizó con un potter para eppendorf y a continuación se
añadieron 750 µl de DNAZOL mezclándolo de nuevo. Luego, la muestra se centrifugó a
10.000 x g (rotor F2402, Beckman GS-15R) durante 10 minutos a 4oC, recogiendo el
sobrenadante y pasándolo a otro eppendorf.
Con el fin de precipitar el ADN se adicionaron 500 µl de alcohol absoluto frío y se
dejó a temperatura ambiente por un tiempo de 3 minutos. Posteriormente, el eppendorf se
centrifugó dos veces a 4.000 x g (rotor F2402, Beckman GS-15R) durante 3 minutos a 4oC,
eliminando el sobrenadante. El precipitado formado se secó a temperatura ambiente durante
22
10 a 15 minutos. Luego, se disolvió en 50 µl de NaOH 8 mM. El ADN obtenido se
cuantificó espectrofotométricamente y se congeló a -80oC hasta su posterior uso.
2.3.2. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
Las reacciones de PCR se realizaron en volúmenes finales de 25 µl, con 2.5 µl de
Tampón de PCR 10X (10mM de Tris, 50 mM de KCl (pH 8.3)), 2 mM de MgCl2, 0.4 mM
de dNTPs, 0.4 µM de cada uno de los cebadores y 1.25U de enzima Taq polimerasa. La
reacción se llevó a cabo en un termociclador Applied Biosystems Gene Amp PCR system
9700.
Las condiciones generales de las PCRs realizadas para amplificar los distintos
fragmentos de la subunidad pequeña ribosómica de los distintos parásitos, fueron
optimizadas empleando distintas parejas de cebadores, variando el número de ciclos y la
temperatura de hibridación fundamentalmente. Un perfil de temperaturas general fue: 5
minutos a 94oC de desnaturalización inicial; 35 ciclos de 1 minuto a 94oC, 1 minuto a 50ºC,
1 minuto a 72oC; y una extensión final de 5 minutos a 72oC.
Todas las amplificaciones incluyeron controles positivos (ADN de moluscos
parasitados) y controles negativos (mezcla de reacción sin ADN). Los productos de PCR
fueron visualizados en un gel de agarosa al 1% (p/v) en tampón TAE (0.04M Tris-acético;
0.001M EDTA) teñido con bromuro de etidio.
2.3.3. Secuenciación y clonación de los fragmentos amplificados
Los productos de PCR se purificaron mediante la digestión durante 1 h a 37 ºC con
los enzimas exonucleasa I y fosfatasa alcalina de camarón (shrimp alkaline phosphatase,
SAP; Amersham Pharmacia Biotech). A continuación se desnaturalizaron los enzimas a 80
ºC durante 15 min.
Para llevar a cabo las reacciones de secuenciación de los productos de PCR
purificados se empleó el kit ABI Prism Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction
Kit, siguiendo las instrucciones del fabricante. El diseño de los cebadores específicos para
los distintos parásitos se realizó una vez amplificado parte del gen 18S mediante cebadores
universales, posterior comparación con las secuencias de otros organismos relacionados y
selección de las regiones más variables que cumplen los requisitos exigidos para esta
23
función. Cada producto de PCR se sometió a la reacción de secuenciación al menos cuatro
veces con el mismo cebador.
Los productos resultantes de las reacciones de secuenciación se purificaron por
precipitación con etanol/ MgCl2 y se resuspendieron en 3-5 µl de formamida: tampón de
carga (incluido en el kit) 5:1 (v: v). La secuenciación se realizó, previa desnaturalización de
las muestras a 94 ºC durante 3 min, en el secuenciador automático ABI PRISM 377
(Perkin- Elmer). Las secuencias nucleotídicas obtenidas se analizaron con los programas
Gene Jockey y Clustal X.
En algunos casos, cada fragmento de PCR se insertó en un vector de clonaje TA
(Invitrogen Corp.) vía los residuos de deoxiadenosina (A) añadidos durante la PCR a los
extremos 3', y la deoxitimidina (T) del vector. Los vectores TA con el inserto se
transformaron en Escherichia coli competentes One Shot TOP 10 F' (Invitrogen Corp.). El
ADN plasmídico de los clones positivos obtenidos, se recuperó con el kit Quantum Prep
Plasmid Miniprep (Biorad). El ADN de los "minipreps" se amplificó de nuevo con la pareja
de cebadores previamente empleada y el producto de la reacción (2,5 µl) se cortó con un
enzima de restricción enzima HhaI (0,25 µl del stock de 10 U/ µl, hasta un volumen final
de 10 µl incluyendo 1 µl de tampón 10 ×) durante 1 h a 37 ºC. Los perfiles de restricción se
visualizaron en un gel de agarosa al 2% en TBE teñido con bromuro de etidio, en el que se
incluyó el patrón de peso molecular 100 Base-Pair Ladder, (Amershan Pharmacia Biotech).
2.3.4. Análisis filogenético
La secuencia de la subunidad pequeña del ARN ribosómico obtenida, se alineó con
las secuencias de este mismo gen de otros organismos disponibles en las bases de datos,
usando el programa Clustal W (Thompson et al., 1994). Para inferir las relaciones
evolutivas entre las secuencias analizadas se empleó el método Neighbor- Joining (Saitou y
Nei, 1987) aplicado a distancias evolutivas considerando tasas de transición/transversión
desiguales y contenidos en guanina + citosina variables entre secuencias (Galtier y Gouy,
1995). La precisión del árbol resultante se midió mediante remuestreo por el método de
Efron ("bootstrap") usando 1000 réplicas.
24
2.3.5. Hibridación in situ
Se cortaron bloques de parafina de los moluscos parasitados en secciones de 7 µm y
se depositaron en portaobjetos tratados con silano “Silane-prep slides” (Sigma). Se
incubaron un mínimo de 24 h a 37ºC.
Las secciones fueron desparafinadas mediante dos inmersiones de 5 minutos en
xileno, seguidas de dos inmersiones de 5 minutos en etanol absoluto y secadas al aire. Luego,
las soluciones fueron tratadas con 75 µg/ml de proteinasa K a 37ºC durante 30 minutos, a
continuación incubadas en un tampón de inactivación de la proteinasa K (0.1M Tris; 0.1 M
NaCl) durante tres minutos a temperatura ambiente. Posteriormente las muestras fueron
deshidratadas en dos pasos de un minuto en etanol 95º primero y en etanol absoluto
después y se dejaron secar al aire. Las secciones fueron prehibridadas durante 30 min a
42ºC con 500 µl de buffer de hibridación (50% de formamida; SSC 4x; 20% dextran-
sulfato; 2.5 mg ARNt de levadura; 1x solución de Denhardt).
Se procedió a la hibridación de cada una de las sondas frente a cada uno de los
distintos moluscos. Para ello cada corte histológico fue cubierto con un Gene Frame® (AB
Gene), en donde se depositó la sonda correspondiente. Luego las muestras fueron
sometidas a desnaturalización a 95ºC durante cinco minutos, enfriadas en hielo durante tres
minutos e incubadas toda la noche a 42ºC para que se produjera la hibridación. Por último,
las secciones fueron lavadas dos veces durante cinco minutos en SSC 2x a temperatura
ambiente y una vez a 42ºC en SSC 0.4x durante diez minutos. La detección de la sonda
marcada fue realizada mediante el DIG Nucleic Acid Detection Kit (Roche) siguiendo las
instrucciones del fabricante.
3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
3.1. Diagnóstico molecular de Marteilia refringens
Se secuenció el gen que codifica el RNA de la unidad ribosómica pequeña 18S
(SSU RNA 18S) de Marteilia sp., que había sido aislada y purificada de Ostrea edulis,
Mytilus edulis y Mytilus galloprovincialis procedente de Francia, España y Croacia. Las
25
secuencias del parásito fueron idénticas independientemente del hospedador y del origen
geográfico de los bivalvos.
Debido a la baja prevalencia de Marteilia en España hubo que analizar más de 1000
mejillones y ostras para conseguir suficiente Marteilia purificada. Muy pocos animales
estaban lo suficientemente parasitados para que su utilización en la purificación mereciera
la pena.
Basándonos en los alineamientos de secuencias con otros parásitos, la secuencia de
Marteilia refringens contenía regiones variables que son específicas para Marteilia
refringens. Los análisis filogenéticos de las relaciones entre la secuencia de SSU rRNA de
Marteilia refringens y las de 26 secuencias de eucariotas homólogos, mostraron que M.
refringens no está relacionada con ningún organismo eucariota cuya secuencia sea
conocida. La región variable de la secuencia, que es específica para M. refringens, se
empleó para diseñar primers o cebadores específicos del parásito, con los que detectar la
presencia del patógeno en las muestras de campo analizadas (Figura 4A). Además, con
dicha secuencia variable se preparó una sonda que utilizamos en los experimentos de
hibridación in situ. Estos experimentos demostraron una fuerte reacción positiva de las
células de M. refringens y confirmaron la identidad de la secuencia obtenida confirmando
que pertenecía a M. refringens. La Figura 5 muestra las diferencias de detección del
patógeno, mediante la técnica histológica clásica y la hibridación in situ con sondas
moleculares.
Regiones ITS de Marteilia. Tipado por PCR de cepas de Marteilia.
Debido a la elevada homología que encontramos entre todas las secuencias 18S de
todas las Marteilia purificadas de una gran variedad de hospedadores y de localidades
geográficas, nos planteamos buscar la existencia de polimorfismos en la región espaciadora
ITS. El objetivo era determinar la existencia de distintas especies de Marteilia en Europa.
Las regiones ITS evolucionan más rápidamente que el SSU rRNA, por lo que comparamos
la secuencia de esta región ITS de parásitos procedentes de distintos hospedadores y
localidades.
El análisis de las secuencias de esta región ITS indicó la existencia de dos grupos
genéticos dentro de Marteilia. La diferencia entre estos dos grupos estaba basada en un
26
valor de bootstrap de 98%. Las secuencias que definen un grupo se obtuvieron
mayoritariamente de Marteilia purificada de mejillones, mientras que las del otro grupo se
obtuvieron de Marteilia aislada de ostras. Esto nos condujo a definir dos grupos de
Marteilia: el tipo “M “(de mejillón) y el tipo “O” (de ostra).
El análisis de los productos de PCR mediante la técnica RFLP (restriction fragment
length polymorphism) de la región ITS, confirmó el polimorfismo de secuencias, ya que en
los geles de agarosa en los que visualizábamos los productos de PCR tratados con los
enzimas de restricción, detectábamos dos perfiles que correspondían a la Marteilia del
mejillón (tipo “M”) y la de la ostra (tipo “O”) (Figura 4B).
En Francia, el tipo “M” de Marteilia siempre se detectaba en mejillones y el tipo
“O” en ostras. Sin embargo, en la zona de La Trinité en la que ambas especies, ostra y
mejillón, estaban infectadas con Marteilia, de quince mejillones infectados con Marteilia y
de 20 ostras, un ejemplar de cada especie estaba infectado simultáneamente por Marteilia
tipo “O” y “M”.
En el caso de Marteilia aislada de Mytilus galloprovincialis en Croacia, el análisis
de su ITS por RFLP en todos los clones, mostró un perfil similar a la Marteilia aislada de
Mytilus edulis de Francia. Los resultados obtenidos en Francia parecían indicar la
existencia de dos especies de Marteilia: una de declaración obligatoria, que parasita a ostra
(Marteilia refringens) y otra que parásita a mejillón (Marteilia maurini) y que no parece
provocar mortalidades.
Sin embargo, en España, los resultados de los análisis realizados empleando la
técnica de RFLP de los distintos aislados de Marteilia, procedentes de varias localidades de
la Península Ibérica, mostraron una mayor complejidad que los de Francia:
- Todos los clones analizados de Marteilia (16) aislada de mejillón de Galicia
fueron clasificados como tipo “M”.
- Se analizaron 16 clones de Marteilia obtenidos de 5 ostras planas infectadas con
Marteilia procedentes del Delta del Ebro (Mar Mediterráneo): 2 clones fueron clasificados
como tipo “M” y 14 como tipo “O”. Tres de estas cinco ostras tenían Marteilia solo del tipo
“O”. Las otras dos tenían ambos tipos “O” y “M”.
- También analizamos 26 clones de Marteilia aislada de 7 ostras planas infectadas
procedentes de Huelva (Atlántico Sur). 16 de estos 26 clones (61,5%) pertenecían al tipo
27
“M” y 9 al tipo “O”. Un clon presentaba un perfil de RFLP totalmente distinto a estos dos
“O” y “M” (Figura 6 calle 2). En las siete ostras infectadas no se detectó coinfección de los
dos tipos genéticos de Marteilia, excepto el nuevo perfil que se detectó en una ostra con
Marteilia tipo “M”.
Mediante estudios de ultraestructura, no se ha conseguido a pesar de los grandes
esfuerzos realizados, encontrar aspectos que permitan separar Marteilia maurini (descrita
originalmente en mejillón y no asociada a mortalidades) y M. refringens (descrita en ostra
plana y asociada a mortalidades) (Longshaw et al., 2001). La secuencia de la unidad
pequeña ribosómica (18S) (SSU rRNA) es también idéntica en todos los aislados
estudiados (Berthe et al., 2000). Sin embargo, los estudios en la region ITS indican un
posible polimorfismo: un tipo “O” que correspondía a M. refringens purificada de ostra
plana y un tipo “M” que correspondía a M. maurini presente en mejillón (Le Roux et al.,
2001).
Nuestros estudios demuestran que aunque hay dos líneas evolutivas diferenciadas
que corresponden más o menos estrictamente con los tipo “M” y “O”, basándonos en la
filogenia esperada, es evidente que algunos tipos “O” habían pasado a tipos “M” y
viceversa. Además, encontramos Marteilia tipo “O” en mejillón y tipo “M” en ostra, lo cual
sugiere que ha habido varias transmisiones entre especies de Marteilia entre mejillones y
ostra (Figura 7).
Los resultados de estos estudios son la base para seguir profundizando sobre este
patógeno y sobre la enfermedad que produce. Las herramientas desarrolladas serán
indispensables para contestar preguntas todavía por responder: ¿Hay dos especies de
Marteilia en Europa, una parasitando al mejillón y otra a la ostra plana? ¿Están
relacionados los dos tipos genéticos de Marteilia con dos organismos de distinta virulencia?
¿Debería la Marteilia que se detecta en el mejillón ser una enfermedad de declaración
obligatoria? ¿Cuál es el hospedador intermediario de este parásito?
3.2. Diagnóstico de Bonamia ostreae
Se ensayaron distintas parejas de cebadores (primers) para optimizar un sistema de
diagnóstico para Bonamia. Como se señaló en la introducción, es vital contar con una
28
técnica suficientemente sensible para detectar este patógeno debido a las mortalidades que
provoca, y que permita además “gestionar” el cultivo, de forma que se pueda comercializar
antes de la aparición de mortalidades.
Los cebadores que se denominaron CF (CGGGGGCATAATTCAGGAAC) y CR
(CCATCTGCTGGAGACACAG) se emplearon en una PCR con una temperatura de
hibridación de 59 ºC. Con esta pareja de cebadores y una vez optimizadas las condiciones,
se llevó a cabo un diagnóstico de la presencia de Bonamia en diferentes localidades de tres
países: Estados Unidos (Maine: Gunt Point Creek y Spinney Creek y Virginia: Great
Wicomico River), Irlanda (Cork Harbour) y España (Ría de Arosa), para comprobar su
aplicación. Tal y como se observa en la Figura 8, en España se obtuvieron las mayores
prevalencias del parásito. Además, en todos las localidades la detección de Bonamia
mediante las técnicas moleculares, fue superior a la técnica de citología.
Además de esta pareja de cebadores se ensayó el diagnóstico con otra pareja de
primers (Bo/Boas) previamente publicados por Cochenec et al. (2000), para determinar el
mejor sistema en cuanto a especificidad y sensibilidad. Este fue el protocolo más sensible,
detectando más ostras infectadas que la histología (Figura 9). En los experimentos de
hibridación in situ, se pudo constatar que el ADN amplificado correspondía
específicamente a Bonamia, ya que la sonda se unía únicamente a este parásito (Figura 10).
Una vez optimizada la técnica molecular para el diagnóstico de Bonamia, se
realizaron estudios de comparación con las técnicas tradicionales de diagnóstico
(histología, citología). Para esto, se realizó un muestreo adicional en 8 zonas distintas de
ostras (30 individuos por zona). En paralelo, se tomaron tejidos de cada molusco tanto para
biología molecular, como para histología (fijación en Davidson) y para la realización de
improntas. Los análisis se realizaron además de forma paralela en dos laboratorios
diferentes: (A) el Instituto de Investigaciones Marinas de Vigo (CSIC) así como en (B) el
Centro de Control de Medio Marino (Xunta de Galicia), para comprobar la repetibilidad de
los ensayos y la solidez de los resultados. Es una tarea, por tanto, compartida con otro
laboratorio, que queremos plasmar en este trabajo, para resaltar la importancia de la
transferencia de resultados a los servicios de la Administración, encargados del control y
seguimiento de enfermedades en estos organismos.
29
En las preparaciones histológicas, detectamos la presencia de Bonamia ostreae
como inclusiones citoplasmáticas con un diámetro de 1 a 3 µm. B. ostreae apareció en un
22% (55/240) y en 22.1% (53/240) de las ostras en los laboratorios A y B, respectivamente.
Cuando utilizamos la técnica citológica, el parásito aparecía con un diámetro
ligeramente superior al que tenía en las preparaciones histológicas. El examen de las
preparaciones al microscopio óptico reveló que el 10.4% (25/240) y el 14.2% (34/240) de
las ostras eran positivas para B. ostreae en los laboratorios A y B, respectivamente (Tabla
5). Combinando los métodos clásicos, B. ostreae se detectó en un 22.9% (55/240) y un
22.5% (54/240) de las muestras analizadas en los laboratorios A y B (Tabla 6). Los análisis
histológicos mostraron que entre un 12.5 y 8.3% (30/240 y 20/240) de las muestras
declaradas negativas por citología, eran de hecho positivas. Entre un 9.6 y 11.7% (23/240 y
28/240) de las muestras diagnosticadas como negativas por histología, eran positivas al
emplear la PCR en el diagnóstico y entre un 20.8 y un 18.8% (50/240 y 45/240) de las
ostras diagnosticadas como negativas por citología de las branquias, fueron diagnosticadas
como positivas al emplear la PCR en los laboratorios A y B, respectivamente. Al comparar
los resultados obtenidos por PCR con los resultados combinados de histología y citología,
observamos entre un 9.6 y 11.7% más de ostras positivas que con los métodos clásicos.
La sensibilidad de la técnica fue superior en el caso de la PCR y el porcentaje de
falsos negativos para la PCR fue el más bajo de todos (7.3 y 7.4%), mientras que para la
histología fue de 31.1 y 35.9% y la citología alcanzó el 67.6 y 57.7% en los laboratorios A
y B, respectivamente.
En resumen, hemos estudiado diferentes muestras tomadas del mismo individuo en
paralelo en dos laboratorios independientes. El porcentaje de similitud entre laboratorios
era de más del 90% con los tres métodos empleados (citología, histología, PCR).
La PCR fue el método que dio el menor número de falsos negativos, el más sensible
y por supuesto el más rápido y barato: el coste de procesar un grupo de treinta ostras para
su diagnóstico por PCR, es la mitad del coste para su procesamiento empleando técnicas de
histología. Se necesitan al menos cinco días para obtener resultados en la técnica de
histología y solo dos en la PCR.
Finalmente, es más fácil entrenar a un técnico para realizar la PCR, que para
detectar los patógenos empleando el microscopio óptico.
30
3.3. Diagnóstico molecular de Perkinsus
Se ensayaron diferentes cebadores (primers) para la PCR, desarrollándose una
Nested-PCR, técnica que eleva la sensibilidad de una PCR normal, realizando dos
reacciones consecutivas, una con los primers previamente descritos por Kotob et al. (1999)
y otra con dos primers internos diseñados en el presente trabajo.
Esta PCR premite detectar de forma inequívoca la presencia de Perkinsus en
almejas.
Uno de los resultados que tiene una mayor repercusión fue la falta de concordancia
entre los resultados obtenidos cuando se utilizó la técnica de tioglicolato para el diagnóstico
de este parásito, con los obtenidos para las mismas muestras cuando empleamos las
técnicas de histología y PCR. Hay que recordar que la incubación de tejidos en tioglicolato
es la técnica, que por su facilidad, se aplica mundialmete para diagnosticar este parásito.
Para profundizar en este aspecto, llevamos a cabo estudios moleculares consistentes
en amplificar un fragmento de la subunidad 18s con primers conservados a partir de tejido
incubado en tioglicolato, en el que se supone que están únicamente hipnosporas de
Perkinsus. Posteriormente llevamos a cabo una clonación de los productos para
individualizarlos y poder secuenciarlos.
Los resultados confirmaron nuestras dudas acerca de la especificidad de la técnica:
se amplificaban al menos dos protozoos totalmente distintos. Perkinsus y un organismo
(Pseudoperkinsus tapetis), Figueras et al. (2000) con morfología similar, pero distinta
secuencia de ADN, ya que mediante análisis filogenéticos hemos establecido que pertenece
a otro plylum.
Aplicando técnicas de restricción de los productos de PCR, pudimos de una forma
sencilla distinguir ambos organismos (Figura 11).
La presencia de Perkinsus se diagnostica rutinariamente empleando la técnica de
Ray del Tioglicolato (RFTM), que ha sido revisada y modificada profundamente en los
últimos años (Gauthier y Fisher, 1990; Bushek et al., 1994; Rodríguez y Navas, 1995;
Fisher y Oliver, 1996; McLaughlin y Faisal, 1999). Es importante señalar que Almeida et
al. (1999) habían señalado que algunos dinoflagelados daba resultados positivos
(hipnosporas), con un aspecto similar a los obtenidos cuando Perkinsus atlanticus estaba
31
parasitando almejas, al incubarlos en las mismas condiciones con el RTFM. Nosotros
hemos puesto de manifiesto que dos organismos diferentes, con secuencias de ADN
distintas pero con aspecto morfológico similar, desarrollan hipnosporas al ser incubados en
RFTM. Como conclusión, el método del tioglicolato de Ray, aunque es un método válido
para el seguimiento rutinario de la presencia de Perkinsus, no puede ser utilizado como
método específico para detectar la presencia de Perkinsus al menos en Galicia, donde se
han descrito la presencia de Pseudoperkinsus tapetis.
4. CONCLUSIONES
Una vez que los patógenos de moluscos han sido introducidos en una zona, su
erradicación es prácticamente imposible. Por ello la necesidad de controles sanitarios en la
transferencia de moluscos vivos entre zonas es incuestionable, ya que la transmisión de
enfermedades ha causado serias mortalidades en el pasado.
Las técnicas de diagnóstico basadas en la biología molecular, como la PCR, son
mucho más sensibles y específicas que los sistemas tradicionales de citología e histología,
que poseen escasa sensibilidad y es necesario un observador entrenado.
El coste de la diagnosis molecular es inferior a la histología y además se obtienen
resultados en un tiempo mucho menor.
Sin embargo, la histología tiene la ventaja de que se pueden detectar otros parásitos y
condiciones patológicas así como el desarrollo gonadal. La citología, por su parte, es barata
y rápida. Es por esto que, en cualquier estudio patológico no debemos dejar de hacer este
tipo de estudios. Sin embargo, para el control rutinario de aquellos patógenos que se
consideran importantes en un cultivo, es imprescindible contar con nuevas herramientas
que permitan una detección rápida, sensible y específica como la PCR.
Hemos desarrollado y optimizado nuevos sistemas de diagnóstico basados en
técnicas de biología molecular, para los tres patógenos más importantes de los moluscos
bivalvos en España. Estas herramientas no solo permiten detectar a Marteilia, Bonamia y
Perkinsus de forma específica y sensible, sino que suponen una importante ayuda en la
investigación sobre cada uno de ellos.
32
Nuestros estudios demuestran que, basándonos en la secuencia de la región ITS-1 en
Marteilia, hay dos tipos distintos de este parásito en Europa. Por lo que hemos encontrado
en su distribución geográfica y asociación con las especies hospedadoras, no parecen
corresponder estrictamente con los parásitos que originalmente se describieron utilizando
características ultraestructurales como las especies de Marteilia de ostra (M. refringens) y
de mejillón (M. maurini). Estas estirpes moleculares de Marteilia podrían ser líneas
evolutivas originalmente asociadas al mejillón y a la ostra plana. Nuestros resultados
sugieren que ha habido varias transmisiones de estas líneas de Marteilia entre mejillones y
ostra, lo cual complica la comprensión de estos hechos. Se desconoce si estos dos tipos
moleculares de Marteilia tienen distinta virulencia.
La sensibilidad de la PCR para detectar Bonamia es superior a la de las técnicas
empleadas hasta ahora para la detección de estos parásitos. El porcentaje de falsos
negativos para la PCR fue más bajo que para histología o citología. La solidez de resultados
obtenidos mediante biología molecular, se puso de manifiesto al compararlos entre dos
laboratorios distintos trabajando en paralelo con las mismas muestras.
Se observó una falta de concordancia entre los resultados obtenidos cuando se utilizó
la técnica de tioglicolato para el diagnóstico de Perkinsus, con los obtenidos para las
mismas muestras cuando empleamos las técnicas de histología y PCR. El método del
tioglicolato de Ray, aunque es un método válido para el seguimiento rutinario de la
presencia de Perkinsus, no puede ser utilizado como método específico para su diagnóstico,
ya que detecta al menos otro microorganismo que interfiere en los resultados.
5. AGRADECIMIENTOS
Esta investigación ha sido posible gracias a la financiación recibida por CICYT
(Planes Nacionales de Investigación, Ministerio de Ciencia y Tecnología, MEC), la Xunta
de Galicia, el MAPA y la UE.
Este trabajo ha sido fruto de la dedicación de un equipo de investigación en el cual han
participado personas que ya no están en el mismo. Sería interminable nombrar a todos los
que nos han ayudado a lo largo de estos años. Queremos agradecer especialmente a Begoña
33
Villaverde y José Ramón Caldas, ayudantes de investigación del Instituto de
Investigaciones Marinas, CSIC.
6. BIBLIOGRAFIA
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36
7. TABLAS Y FIGURAS
Tabla 1. Muestreos realizados durante mortalidades detectadas en almeja fina (Ruditapes decussatus) en diferentes parques de cultivo de Galicia.
Ría Localidad Fecha
O Barqueiro Oct/00 Ortigueira Ortigueira Dic/00
Corme y Laxe Anllóns Jun/ 98 Camariñas Jun/ 97 Camariñas Jul/97
Camariñas Abr/98 Ariño Leis Abr/98 1 Jun/98 2 Jun/98 3 Jun/98 4 Jun/98 Ariño Leis Jul/98 Area Vila Jul/ 98 Ariño Leis Nov/98
Rías Altas
Camariñas
2 Feb/99
Noia Jul/98 Noia Carril Ene/01 Carril Feb/01 Arousa Carril Mar/01 Ameixal Ene/01
Rías Bajas
Pontevedra Ameixal Feb/01
Ría Localidad Fecha
Raxo Jun/01 Pontevedra Arcade Oct/98
Moaña Oct/98 Baiona Jul/98 Baiona Ago/98 Baiona Oct/98 Moaña Dic/00
Rías Bajas
Vigo
Vilaboa Dic/00
37
Tabla 2. Muestreos realizados en un criadero comercial de almeja fina (Ruditapes decussatus) en el que esporádicamente se detectaron mortalidades anormales.
Estadio Mortalidad Fecha
Larvas No Mar/99
Semilla Si Mar/99
Semilla No May/99
Larvas Si Oct/99
Larvas Si Oct/99
Larvas Si Oct/99
Larvas Si Oct/99
Larvas Si Nov/99
Larvas Si Nov/99
Larvas Si Nov/99
Larvas Si Nov/99
Larvas Si Nov/99
Larvas No Nov/99
Semilla Si Sep/00
Semilla Si Sep/00
Larvas Si Nov/01
Larvas Si Nov/01
Semilla Si Nov/01
Semilla Si Nov/01
Larvas No Nov/01
Semilla No Nov/01
Larvas Si Abr/02
Larvas No Abr/02
Semilla Si May/02
Semilla No May/02
Semilla Si Jun/02
Larvas No Jun/02
38
Tabla 3. Muestreos rutinarios realizados en almeja fina (Ruditapes decussatus) en diferentes parques de cultivo de Galicia.
Ría Localidad Fecha
Pontedeume Ago/99 Ares Pontedeume Sep/00
Rías Altas
Camariñas Ariño Leis Ago/99
Noia Noia Sep/99 Testal May/99 Muros Muros May/01 Carril Jun/99 Carril Sep/99 Carril May/00 Carril Oct/00 Carril Jun/01
Arousa
Carril Oct/01 Lourizán Abr/99 Campelo (polvorín) Sep/99 Lourido Sep/99 Placeres (playa) Sep/99 Placeres Sep/99 Campelo Jul/00 Pedra Floxan (Int. ría) Sep/99 Raxó (playa do Laño) Sep/99 Aldan (playa Cibrao) Sep/99 Placeres Ago/00
Rías Bajas
Pontevedra
Ameixal Jun/01 Ameixal Oct/01
Baiona Ago/99 Arcade Oct/00 Baiona Nov/00 Vilaboa Dic/00 Moaña May/01 Baiona Jun/01
Vigo
Moaña Jun/02
39
Tabla 4. Muestras de importaciones de almeja fina (Ruditapes decussatus) procedentes de Túnez.
Zonas Estadio Fecha de importación
1,2,3,4,5,6,7 Adulto Jul/01
1,2,3,4 Adulto Dic/01
40
Histología + A-B
Histología – A-B
Total A-B
Citología + A-B
Citología - A-B
Total A-B
PCR + 52-50 (21.7-20.8)
23-28 (9.6-11. 7)
74-78 (30.8-32.5)
24-33 (10-13.7)
50-45 (20.8-18.8)
74-78 (30.8-32.5)
PCR – 3-3 (1.2-1.2)
163-159 (67.9-66.2)
166-162 (69.2-67.5)
1-1 (0.4-0.4)
165-161 (68.7-67.1)
166-162 (69.2-67.5)
Total 55-53 (22.9-22.1)
185-187 (77.1-77.9)
240-240 (100-100)
25-34 (10.4-14.2)
215-206 (89.6-85.8)
240-240 (100-100)
Tabla 5. Comparación entre los análisis de PCR y los métodos oficiales, histología y citología, por separado, de Bonamia ostreae. En cada celda aparece en la línea superior el número total de muestras y en la línea inferior el porcentaje.
41
Tabla 6. Comparación entre los análisis de PCR y la combinación de los métodos oficiales, histología y citología, de Bonamia ostreae. En cada celda aparece en la línea superior el número total de muestras y en la línea inferior el porcentaje.
Histología/Citología + A-B
Histología/Citología – A-B Total A-B
PCR + 52-50 (21.7-20.8)
23-28 (9.6-11.7)
74-78 (30.8-32.5)
PCR- 3-4 (1.25-1.67)
163-158 (67.9-65.8)
166-162 (69.2-67.5)
Total 55-54 (22.9-22.5)
185-186 (77.1-77.5)
240-240 (100-100)
42
Figura 1. (A) Célula primaria de Marteilia sp. con una célula secundaria (B) Esporangiosoro con 8 preesporangios y esporas inmaduras (C) Espora madura de M. refringens mostrando 3 esporoplasmas, pared engrosada característica de madurez y haplosporosomas esferoides (D) Haplosporosomas esferoides de M. refringens de ostra plana mostrando médula y cortex (E) Haplosporosomas oblongos y esferoides de Marteilia sp de mejillones. Nótese el córtex y la médula y el engrosamiento de la pared. (F) Inclusiones de placa estriada en el citoplasma de los esporangiosoros en desarrollo. Escalas de las figuras indicadas mediante barras: (A) = 1 µm; (B) = 2 µm; (C) = 500 nm; (D) = 100 nm; (E) & (F) = 200 nm.
43
Figura 2. Perkinsus en tejidos de almeja fina. (A) Aspecto de una branquia fuertemente infectada (B) Acúmulo de trofozoitos en el tejido que rodea a los túbulos digestivos (C) Hipnosporas en branquias, incubadas en medio de tioglicolato y teñidas con lugol (200X). A B
C
44
Figura 3. Mapa de Galicia mostrando la localización de las rías y Baiona donde se recogieron las muestras de almeja fina (Ruditapes decussatus).
45
Figura 4. Diagnóstico molecular de Marteilia. (A) Gel de agarosa donde se aprecian las bandas resultantes de la amplificación específica de ADN de Marteilia de la región 18S, M: marcador de peso molecular 100 pb (B) Subtipos “M” (calles 1-4 de M. galloprovincialis y calle 5 de O. edulis y “O” (calles 6-11 de O. edulis), resultantes de la digestión enzimática de la secuencia de la región ITS, M: marcador de peso molecular 100 pb.
A
B
M
46
Figura 5. (A y B) Aspecto de la infección de Marteilia en los túbulos digestivos de mejillón (C) Hibridación in situ específica de una sonda de ADN de Marteilia con tejidos infectados.
A
B
C
47
Figura 6. Diferentes clones de Marteilia de O. edulis de Huelva, mostrando el subtipo “M” (calles 1, 3, 4, 5, 6), el subtipo “O” (calles 7 y 8) y un patrón de restricción diferente a ambos tipos moleculares (calle 2).
1 2 3 4 5 6 7 8
48
Figura 7. Filogenia consenso de Marteilia. El nombre de cada secuencia indica el hospedador (Mu: mejillón, Oy: ostra); el número de clon (7.20 es el clon 20 del individuo 7); el tipo molecular (“M” o “O”) y el origen geográfico de la muestra (* Huelva, Ría de Arosa, Ría de Vigo, Delta del Ebro). Los números sobre las ramas son la probabilidades posteriores (sólo se muestran las superiores al 50%). Se indica también la escala de la longitud de la rama.
0.05 Sustituciones/sitio
49
Figura 8. Prevalencia de Bonamia ostreae en 5 muestras de Ostrea edulis y 1 de Crassostrea virginica (GWR), usando citología clásica y el protocolo C de PCR (primers CF/CR). Grupos enzoóticos para B. ostreae: CH = Cork Harbour, GPC = Gunt Point Creek, RA = Ría de Arosa. Grupos control libres de B. ostreae: GWR = Great Wicomico River, SC = Spinney Creek.
50
Figura 9. Gel de electroforesis que presenta la banda correspondiente a Bonamia ostreae (300 pb) y Ostrea edulis (550 pb). Líneas 1 y 2 son ostras positivas para B. ostreae tanto por histología como por citología; línea 3 es negativa por histología y citología; línea 4 es negativa por todas las pruebas. M: Marcador de 100 pb.
300 pb
550 pb
51
Figura 10. Bonamia ostreae en tejidos de ostra. (A) Imagen de una preparación histológica (B) Resultado de la hibridación in situ de tejidos infectados con una sonda de ADN específica de Bonamia.
A
B
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Figura 11. Patrón de restricción de un fragmento de la subunidad 18S de Perkinsus, que muestra el polimorfismo de secuencia entre Perkinsus olseni (calles 1 y 2) y Pseudoperkinsus tapetis (calles 4 y 5). Calle 3: ADN de almeja.
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