Asma de cercaAsma de cerca

Nuevas aproximaciones

experimentales para el tratamiento

del asmaVictoria del Pozo

El asma se define como una enfermedad inflamatoria de las

vías respiratorias, que se caracteriza por inflamación,

hiperrespuesta bronquial y obstrucción variable al flujo

aéreo.

Es una enfermedad compleja: factores genéticos,

medioambientales y nutricionales

Se desarrolla tras exposiciones ambientales a sustancias

inocuas ajenas al organismo.

Enfermedad heterogénea: Fenotipos

.

- inducido por virus

- alérgico,

- no alérgico,

- intrínseco,

- extrínseco,

-ocupacional,

- persistente,

- estacional,

- inducido por ejercicio,

- nocturno,

- resistente a esteroides

8-10% 5%

PREVALENCIA

Asma es una de las enfermedades crónicas mas comunes en el mundo, especialmente en niños

Red >10.1%

Orange 7.6 – 10.0%

Yellow 5.1 – 7.5%

Green 2.5 – 5.0%

Blue 0 – 2.5%

White No standardized

data available

20%

300 MILLONES

Factores relacionados a la cultura y estilo de vida occidental

contribuyen al desarrollo de asma frente a tolerancia

Tratamiento del asma: objetivos

• Prevenir y tratar los síntomas crónicos

• Mantener la función pulmonar cerca de la normalidad

• Mantener un nivel de actividad normal.

• Prevenir las exacerbaciones, visitas a urgencias y hospitalizaciones

• Tener un control medico optimo sin efectos adversos

Inmunoterapia

Control ambiental

Tratamiento farmacológico

Inmunoterapia

Control ambiental

Tratamiento farmacológico

TRATAMIENTO FARMACOLOGICO

•Tratamientos sintomáticos:•Aliviadores/ corto plazo “alivian” las molestias al dilatar los bronquios, pero no influyen en la inflamación y, por tanto, no mejoran el asma.

Broncodilatadores de acción rápida: son los más utilizados. Su efecto se nota muy pronto (entre los 3 y los 5´), aunque a las pocas horas desaparece. Se usa cuando el asma es muy leve y produce síntomas ocasionales.

Broncodilatadores de efecto prolongado: su efecto dura más, hasta unas 12 horas.

•Antiinflamatorios: disminuyen la inflamación

Inmunoterapia

Control ambiental

Tratamiento farmacológico

“ Es el único tratamiento que puede afectar la evolución natural de las enfermedades alérgicas y también puede prevenir el desarrollo de asma en

pacientes con rinitis alérgica”

Tratamiento etiológico (específico e individualizado) de algunas enfermedades alérgicas, que consiste en la administración, generalmente subcutánea, de dosis progresivamente crecientes del material alergénico(extracto) al que el paciente está sensibilizado.

¿QUÉ ES LA INMUNOTERAPIA?

Inmunoterapia

Control ambiental

Tratamiento farmacológico

• Identificar el alergeno cusante mediante HC, resultados de test de laboratorio

• Evitar o limitar la exposicion a:– Indoors: Tabaco; allergenos, acaros, cucarachas,

mascotas, etc.

– Outdoors: hongos y polenes

– Trabajo: agentes ocupacionales e.j. latex, harina de trigo, enzimas, animales de laboratorio

– Dieta: alergenos alimentarios

EDUCACION DEL PACIENTE

Antinflamatorios glucocorticoides inhalados,

Modificadores de leucotrienos

Broncodilatadores 2 agonistas

5-10% Asma grave de difícil control (resistentes a corticosteroides)

Sólo 2 nuevas dianas identificadas y llevadas a la practica clínica

aunque con restricciones en los últimos 20 años:

Anti-cisteinileucotrienos

Anti-IgE (Omalizumab)

NECESIDAD DE BÚSQUEDA DE NUEVAS TERAPIAS (SEGURAS Y

EFECTIVAS) QUE PROPORCIONEN ALIVIO SINTOMÁTICO A

PACIENTES ASMÁTICOS

La mayoría de los pacientes presentan un asma leve o moderado

Bien controlados

Estudio del Receptor responsable de la inhibición de la IL-5

Del Pozo, Rojo, et al.2002 Am. J. Respir Crit. Care Med.166:732

• Incubación de las células con gal-3 inhibe el ARNm de IL-5

Las funciones de la Galectina-3 apuntaban a un posible papel en las reacciones alérgicas.Por ello estudiamos el efecto de la Galectina-3 en diferentes tipos celulares:

Cortegano, del Pozo et al . 1998. J. Immunol. 161:385.

ANTECEDENTES

Cortegano, del Pozo et al. 2000. Glicobiology 10:237

La administración local de Galectina-3 en un plásmido con un promotor de expresión fuerte y constitutiva, inhibia la síntesis de IL-5 y por lo tanto el reclutamiento de los eosinófilos en el foco inflamatorio, así como su activación en una modelo de asma agudoGalectina-3 como terapia para el asma crónico

Tipos de lectinas animales

GALECTINAS

-Tipo-C (dependientes de Ca2+): Selectinas -Tipo-S (soluble): GALECTINA-3

Chromosome 14 (14q21-q22)

Gen LGALS3 (17 kb)

• Familia de proteínas que contienen un dominio lectina con afinidad por beta-galactósidos

MODELO CRONICO: RATONES A/J CON INFLAMACIÓN ALÉRGICA INDUCIDA POR ANTÍGENO (OVA)

Instilación pEGFP-Gal-3

pEGFPFunciones pulmonaresLBAsExtracción de sangreExtracción de pulmones

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Instilación intranasal OVAGrupo OVA (n=26)Grupo pEGFP-Gal-3 (n=30)Grupo pEGFP

SEMANAS DEL ENSAYO

Puntos de Estudio

2 6 8 124

Grupo salinoInstilación intranasal salino

(3 veces por semana)

RATONES A/J

MCS

pCMV IEGen de Gal-3

pEGFPEGFP

SV40 poly AAntibioti

co r

P SV40 e

A B

C D

EXPRESIÓN DE GALECTINA-3 EN LOS PULMONES

SANGRE PERIFERICA LBA

EOS/ mm3 % EOS

CEL TOT (X106) % EOS

pEGFP-Gal-3 386 150 5.58 1.8 0.420.1 4.38 1.05

OVA 1584 600 13.6 3.7 3.341.1 11.09 2.4

pEGFP 1624 408 11.2 1.5 2.81.8 9.80 2.6

SS 287 100 2.5 0.5 0.40.1 1.88 0.6

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

Re

lati

ve

mR

NA

ex

pre

ss

ion

of

IL-4

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

Re

lati

ve

mR

NA

ex

pre

ss

ion

of

IL-1

0

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

Rela

tive

mR

NA

ex

pre

ss

ion

of

IL-5

*p<0.05

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

Re

lati

ve

mR

NA

ex

pre

ss

ion

of

IL-1

3

** p< 0.01

** p< 0.01

*p<0.05

A B

C D

ESTUDIO DE LA FUNCIÓN PULMONAR(Pletismografía Corporal Total)

Sistema de pletismografía

Registro flujos respiratorios

Cámara de inhalación

***

*

*

SS GROUP OVA GROUP pEGFP-GAL-3 GROUP

A B

pEGFP GROUP

C D

E H

I J K L

F G

CONCLUSION

La terapia génica con Gal-3 inhibe las características patognomónicas del asma crónica en un modelo de ratón.

•E. López, V. del Pozo, T. Miguel, B. Sastre, C. Seoane, E. Civantos, E. Llanes, M.L. Baeza, P. Palomino, B. Cárdaba, S.

Gallardo, F. Manzarbeitia, J.M. Zubeldia and C. Lahoz -Inhibition of chronic airway inflammation and remodeling by gal-3

gene therapy in a murine model. J. Immunol 2006. 176:1943-1950.¿Cómo?

TECNOLOGÍA MICROARRAY

Análisis Microarrays

Mouse Genome 430 2.0 Microarrays (Affymetrix)

ARN total

pulmones

ADNc

Transcripción

reversa

Transcripción

in vitro

ARNc

biotinilado

Fragmentación

Hibridación

Chip génico

de array de

expresión

ARNc biotinilado

y fragmentado

Lavar y

teñir

UNDER-represented

OVER-representedUNDER-represented

OVER-representedOVA GROUP

pEGFP- GAL-3 GROUP

% of annotated genes

1000 20 40 60 80ID NAME PERCENTAGE

ADJUSTED

P-VALUE

GO: 0006954 Inflammatory Response 66.58 2.67E-7

GO: 0002889Regulation of Immunoglobulin

mediated Immune Response78.18 4.02E-4

GO: 0050728Negative Regulation of

Inflammatory Response92.9 6.15E-4

GO: 0042089 Cytokine Biosynthetic Process 65.3 5.37E-3

GO: 0002456 T cell mediated Immunity 78.55 4.46E-3

GO: 0019221Cytokine and Chemokine

mediated Signalling Pathway71.45 5.92E-3

GO :0043299 Leukocyte Degranulation 98 4.48E-2

GO: 00042692 Muscle Cell Differentiation 20.29 2.7E-7

GO: 0030329 Lung Development 30.58 1.58E-2

GO: 0051128Regulation of Biological

Process 40 3.85E-2

PROCESOS BIOLÓGICOS

GENES

Respuesta inflamatoria IDO1, IL17A, IL17B, IL17F, IL25, TGFB1, IL6, IL4, FOXP3, JAK2, SATA5A,

TLR4

Regulación de la

respuesta immune

mediada por

inmunoglobulinas

BCL6, FOXP3, FCG2B, IGH7, TNF, TGFB1, IL4, STAT6, IGH1A, IGH3, IGH7, C3, IL27RA

Regulación negativa de la

respuesta inflamatoria

IL10, FOXP3, TGFB, SOCS3, IL2, TNF1B, AD, FOXF1A, IL2RA, ZFP36

Procesos de biosíntesis

de citocinas

ADAM3, GATA3, IGF2BP1, IL12b, ,AP2K3, IL6, FOXP3, IL10, NFKB1, BCL3,

IFNG, IL1B, TNF, WNT5A, IL21, IL1A, STAT5, IL17F

Inmunidad mediada por

células T

IL4RA, BCL6, TGFB, IL20RB, IL2RA, IDO, FOXP3, CD27, CD74, LAG3,

CASP3

Vias de señalización

mediadas por citocinas y

quimiocinas

ILR1, IL23R, IL2RB, IL3, IL5, JAK1, JAK3, SOCS1, SOCS3, SOCS5, STAT1,

STAT3, STAT5A,

STAT5B, IL6. IL6RA, TNF

Degranulación de

leucocitos

PAK2A, RAB27A, IGH7, HMOX1, FOXF1A, FCER1G, PRAM1

BÚSQUEDA DE EXPRESIÓN DIFERENCIAL DE GENES EN RUTAS

BIOLÓGICAS ENTRE EL GRUPO OVA vs pEGFP – GAL-3

Rela

tive

mR

NA

ex

pre

ss

ion

of

SO

CS

1

0

1

2 OVA

pEGFP

pEFGP-GAL-3

SS

Rela

tive

mR

NA

ex

pre

ss

ion

of

SO

CS

3

Rela

tive

mR

NA

ex

pre

ss

ion

of

SO

CS

5

A B

C

** P < 0.01*** P < 0.001

** P < 0.01

Rela

tive

in

ten

sit

y r

ati

o

SO

CS

3/

-ac

tin

0

0.2.

0.4

0.6

0.8

1pEGFP-Gal-3

SSOVA

SOCS3(38 kDa)

Actin(43 kDa)

OVA Gal-3 SS C+

Inmunohistoquímica de SOCS-3

C. ISOTÍPICO

SS OVA

pEGFP pEGFP-GAL-3

La expresión de SOCS-3, tanto a nivel génico como a nivel proteico,

está más elevada en los ratones asmáticos no tratados frente a los

tratados con el pEGFP-Gal-3.

CONCLUSIONES

Estos datos sugieren que la Galectina-3 está ejerciendo algún efecto

directo o indirecto sobre la transcripción de SOCS-3.

ESTUDIO DE SOCS EN HUMANOS

•López E, Zafra MP, Sastre B, Gámez C, Lahoz C, del Pozo V. Gene expression profiling in lungs of chronic

asthmatic mice treated with galectin-3: down-regulation of inflammatory and regulatory genes . Mediators of

Inflammation. 2011;2011:823279.

SOCS

A. Yoshimura. Frontiersin, 2012

SOCS3 “Supressor Of Cytokine Signaling”

La expresión constitutiva de

SOCS-3 en las células T

incrementa la hiperreactividad

bronquial como resultado de un

incremento en la respuesta Th2.

Es posible que la expresión

específica en las células Th2 de

SOCS-3, tenga un papel

importante en la patofisiología de

las enfermedades alérgicas

mediadas por Th2.

SOCS-1, SOCS-3 y SOCS-5 están implicados en la diferenciación Th1/Th2.

Análisis de la expresión de las proteínas

SOCS : PACIENTES RED RESPIRA

*p<0.05

*p<0.05

*p<0.05

CLASIFICACIÓN DE LA SEVERIDAD DEL ASMA

N

CONTROLES 24

INTERMITENTE 15

PERSISTENTE LEVE 17

PERSISTENTE MODERADO 26

PERSISTENTE GRAVE 60

Análisis de la expresión de las proteínas

SOCS : PACIENTES RED RESPIRA

*p<0.05

*p<0.05

CLASIFICACIÓN DE LA SEVERIDAD DEL ASMA

N

CONTROLES 24

INTERMITENTE 15

PERSISTENTE LEVE 17

PERSISTENTE MODERADO 26

PERSISTENTE GRAVE 60

La principal célula que participa en el daño que se produce en la mucosa bronquial son los eosinofilos.

ASMA Bronquitis eosinofílica

no-asmática (BENA)

Tos, disnea, sibilancias Tos aislada

Obstrucción variable

al flujo aéreo

AUSENTE

Hiperrespuesta

bronquial

AUSENTE

EN COMÚN:

Infiltración eosinofílica en biopsia bronquial

Eosinofilia en el lavado broncoalveolar

Infiltración de los

mastocitos en el

músculo liso

AUSENTE O MUY

ESCASA

Healthy controls Eosinophilic bronchitis Asthma

N 9 8 6

Age 23 (20-30) 40 (31-55) 37(21-61)

Male 4 (44.4 %) 4 (50 %) 3 (50 %)

Atopy 0 5 (62.5%) 3 (50%)

Total IgE (IU/ml) 21.150 (4.52-144) 163 (34.50-605) * 65.2 (57.60-360) *

Eosinophil count 0.14 (0-3.32) 4.40 (1.5-8.39)** 2.66 (1.34-7.92) *

PGE2 (pg/ml) 2.89 (0.78-5.28) 15.582 (3.81-1336) * 33.83 (12.98-54.72)

Results were expressed as median (range)* p<0.05 (versus healthy control; Kruskal Wallis test; post test Dunn’s Multiple comparison Test).** p<0.01(versus healthy control; Kruskal Wallis test; post test Dunn’s Multiple comparison Test).

Table . Clinical characteristics of study subjects

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

4,5

5R

ela

tive

mR

NA

ex

pre

ss

ion

of

SO

CS

3

in p

uri

fie

d C

D4

T c

ell

s

A* P < 0.05

HEALTHY C0NTROLS

ASTHMATICS

0

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1

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2

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NA

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SO

CS

5

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pu

rifi

ed

eo

sin

op

hil

s

D

EOSINOPHILIC BRONCHITIS

† P < 0.01

2 3

ISOCS3

(38 kDa)

1 2 3 4

J

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6

1,8

2

SO

CS

-3 (

AR

BIT

RA

RY

UN

ITS

)

*P < 0.05

ACTIN

(45 kDa)

C

E

A D

G H

B

F

Estos datos indican que SOCS-3 puede ser un posible marcador de

patología respiratoria.

•López E, Zafra MP, Sastre B, Gámez C, Fernández-Nieto M, Sastre J, Lahoz C, Quirce S, del Pozo V.

Suppressors of cytokine signaling 3 (SOCS3) expression in eosinophils: regulation by PGE2 and Th2

cytokines Clinl Dev Immunol. 2011; 2011:917015

Terapia Silenciamiento SOCS3 siRNA

Verde: RSV

Rojo: PIV

44 % INHIBICIÓN EXPRESIÓN SOCS3

NIVEL GÉNICO: RT-PCR CUANTITATIVA

N=50

20

40

60

80

100

120

C-ARNsi SOCS3 ARNsi

Exp

resio

nre

lativa

A

RN

mS

OC

S3

(%

)

SOCS3

Actina

C-ARNsi

SOCS3

ARNsi

+IL-5/GM-CSF 48h

NIVEL PROTEICO: WESTERN BLOT

N=4

26 VECES MENOS DE EXPRESION PROTEICA DE SOCS3

EFECTO DEL SILENCIAMIENTO GÉNICO DE SOCS3 EN EOSINÓFILOS

+IL-5/GM-CSF 48h

Terapia Silenciamiento SOCS3 siSOCS (4 siSOCS3)

Modelo elegido: Modelo II

ARNsi C- ó ARNsi SOCS3 (+4) cc. 20uM (12 dosis)

ESTUDIO “IN VIVO”: CONTINUACIÓN

GRUPO 1: SS

GRUPO 2: OVA

GRUPO 3: OVA + ARNsi C-

GRUPO 4: OVA + ARNsi SOCS3

N=20 (5/grupo)

•Silenciamiento es una buena aproximación terapéutica

para enfermedades respiratorias

•El silenciamiento de SOCS3 mejora las función pulmonar

en un modelo animal de asma crónica

CONCLUSIONES

“Progress in understanding asthma and its underlying mechanisms is slow;

treatment can be difficult and response unpredictable; and prevention or cure

is still a pipedream. Asthma, one of the most important chronic diseases,

remains a genuine mystery”

Lancet 2008

Grupo del IIS-FJD

Dra. Carla Mazzeo. Postdoctoral

Cristina Gámez. I. Predoctoral.

Mª Paz Zafra. I. Predoctoral

Verónica Sanz. TEL.

Ana de Zuloaga. TEL

Dr. Santiago Quirce •Jefe de Alergia•Hospital La Paz

Dr. Joaquin Sastre •Jefe de Alergia •Fundación Jiménez Díaz- CAPIO

AGRADECIMIENTOS

Gracias por

su atención