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NORMA TCNICA NTC-ISOCOLOMBIANA 5667-16

2000-12-15

CALIDAD DEL AGUA.MUESTREO. PARTE 16. GUA PARA EL ENSAYOBIOLGICO DE MUESTRAS

E: WATER QUALITY. SAMPLING. PART 16. GUIDANCE ONBIOTESTING OF SAMPLE

CORRESPONDENCIA: esta norma es equivalente (EQV) a laISO 5667-16: 1998

DESCRIPTORES: agua; ensayo biolgico; muestreo;calidad del agua.

I.C.S.: 13.060.01

Editada por el Instituto Colombiano de Normas Tcnicas y Certificacin (ICONTEC)

Apartado 14237 Bogot, D.C. - Tel. 6078888 - Fax 2221435

Prohibida su reproduccin

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PRLOGO

El Instituto Colombiano de Normas Tcnicas y Certificacin, ICONTEC, es el organismonacional de normalizacin, segn el Decreto 2269 de 1993.

ICONTEC es una entidad de carcter privado, sin nimo de lucro, cuya Misin es fundamentalpara brindar soporte y desarrollo al productor y proteccin al consumidor. Colabora con elsector gubernamental y apoya al sector privado del pas, para lograr ventajas competitivas enlos mercados interno y externo.

La representacin de todos los sectores involucrados en el proceso de Normalizacin Tcnicaest garantizada por los Comits Tcnicos y el perodo de Consulta Pblica, este ltimocaracterizado por la participacin del pblico en general.

La norma NTC-ISO 5667-16 fue ratificada por el Consejo Directivo el 2000-12-15.

Esta norma est sujeta a ser actualizada permanentemente con el objeto de que responda entodo momento a las necesidades y exigencias actuales.

A continuacin se relacionan las empresas que colaboraron en el estudio de esta norma quepertenece al Comit Tcnico 000016 Gestin ambiental. Agua, a travs de su participacin enConsulta Pblica

ACEITES Y GRASAS VEGETALESALPINA PRODUCTOS ALIMENTICIOS S.A.AMBIENCOL INGENIEROS LTDA.ANTEK LTDA.ASOCIACIN COLOMBIANA DE INGENIEROSDE PETRLEOSBAVARIA S.A.CARVAJAL S.A.CEMENTOS BOYAC S.A.CERVERIA LEONA S.A.COMPAA NACIONAL DE VIDRIOS S.A.

DAMAECOPETROLEMAC LTDA.EMPRESA DE ACUEDUCTO YALCANTARILLADO DE BOGOTEMPRESAS PBLICAS DE MEDELLNGASEOSAS COLOMBIANAS S.A.GOBERNACIN DE CUNDINAMARCA-SECRETARA DEL MEDIO AMBIENTEGRIFFITH COLOMBIA S.A.ICAIDEAM

INCOLBESTOS S.A.

INGEOMINASINSTITUTO COLOMBIANO AGROPECUARIO-IVON BERNIER LABORATORIOLARKIN LTDA.MINIPAK LTDA.MINISTERIO DE AGRICULTURAMINISTERIO DEL MEDIO AMBIENTEMINISTERIO DE DESARROLLOMINISTERIO DE MINAS Y ENERGAMINISTERIO DE SALUDMINISTERIO DE TRANSPORTE

NESTL DE COLOMBIA S.A.PRODUCTOS ALIMENTICIOS MARGARITAS.A.SIEMENS SOCIEDAD ANNIMASIKA ANDINA S.A.SMURFIT CARTN DE COLOMBIA S.A.SOCIEDAD DE ACUEDUCTO, ALCANTARILLADOY ASEO DE BARRAANQUILLATEFCO LTDA.UNIVERSIDAD DE ANTIOQUIAUNIVERDIDAD DE LA SALLEUNIVERSIDAD JAVERIANA

UNIVERSIDAD JORGE TADEO LOZANO

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UNIVERSIDAD LIBREUNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIAUNIVERSIDAD PONTIFICIA BOLIVARIANA

ICONTEC cuenta con un Centro de Informacin que pone a disposicin de los interesadosnormas internacionales, regionales y nacionales.

DIRECCIN DE NORMALIZACIN

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NORMA TCNICA COLOMBIANA NTC-ISO 5667-16

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CALIDAD DEL AGUA.MUESTREO. PARTE 16. GUA PARA ELENSAYO BIOLGICO DE MUESTRAS

1. OBJETO

Esta norma ofrece una gua prctica acerca del muestreo, tratamiento previo, desempeo yevaluacin de las aguas en el contexto del ensayo biolgico. Se brinda informacin acerca decmo enfrentar los problemas del ensayo biolgico que surjan como consecuencia de lanaturaleza de la muestra de agua y la adaptabilidad del diseo del ensayo.

Se tiene como propsito dar a conocer experiencia prctica en cuanto a las precauciones quese deben tomar por medio de la descripcin de mtodos probados con xito para solucionar oevitar algunos de los problemas experimentales del ensayo biolgico de las aguas.

En la medida de lo posible, se ha hecho referencia a normas internacionales y parmetrosexistentes. Tambin se utiliz informacin extrada de documentos publicados o decomunicacin oral.

Se trataron principalmente problemas relacionados con la sustancia, en cuanto a muestreo,tratamiento previo y preparacin de las muestras de agua para ensayo biolgico y tratamientode las muestras durante el ensayo, en especial al realizar ensayos con aguas y aguasresiduales que contienen ingredientes inestables o removibles. Se delinearon los principiosbsicos de aseguramiento de la calidad, evaluacin de datos y presentacin de resultados.

Se pone especial nfasis en el ensayo ecotoxicolgico con organismos (ensayo biolgicos deespecies nicas). Algunas caractersticas tratadas en esta gua general se aplican lo mismo

para estudios de biodegradacin como de bio-acumulacin en tanto se relacionan con elmuestreo y la preparacin de muestras. Tambin se discute la preparacin de sustancias conpoca solubilidad y el ensayo ms all del lmite de solubilidad del agua.

Esta norma no es aplicable al examen bacteriolgico del agua. En otras normas internacionalesse describen los mtodos adecuados

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2. REFERENCIAS

Las siguientes normas contienen disposiciones que, a travs de la referencia en este texto,constituyen disposiciones de la presente norma. En la fecha de su publicacin, las edicionesindicadas se hallaban vigentes. Todas las normas se encuentran sujetas a actualizacin, y se

invita a las partes que logren a acuerdos con base en la presente norma a indagar sobre laposibilidad de aplicar las ediciones ms recientes de las normas indicadas a continuacin. Losmiembros de la IEC e ISO mantienen registros de las normas internacionales vigentes en laactualidad.

NTC-ISO ISO 5667-3: 1994, Water Quality. Sampling. Part 3: Guidance on the Preservationand Handling of Samples

NTC-ISO 5667-10: 1992, Water Quality. Sampling. Part 10: Guidance on Sampling of WasteWaters

3. MUESTREO

3.1 GENERALIDADES

La escogencia de puntos de muestreo representativos, frecuencia de muestreo, tipo demuestras tomadas, etc. depende del objetivo del estudio. En general, el mtodo de muestreopara anlisis qumico es compatible con el propsito del ensayo biolgico.

No obstante, algunos ensayos requieren de una particular manipulacin y conservacin delagua y agua residual.

De acuerdo con el tipo de investigacin (por ejemplo, ensayos de toxicidad o biodegradacin) yla forma en que se vayan a procesar las muestras, se hace necesario dividir la muestra endiferentes partes que se preservan y/o almacenan bajo diversas condiciones y se procesan devariadas maneras.

Si se han tomado varias muestras (por ejemplo, de diferentes lugares o en diversos tiempos) sepueden combinar a fin de lograr mayor representatividad. Es recomendable mezclar estasmuestras por completo y, de ser necesario, dividirlas en sub-muestras. A fin de obtener sub-muestras de igual calidad, se debera garantizar que la muestra a granel mantenga lahomogeneidad durante el proceso de sub-muestreo, por ejemplo, por medio de sacudida oagitacin. Esto es especialmente vlido en el caso de las mezclas de dos fases, por ejemplo,aguas que contienen partculas suspendidas, suspensiones algales. Se recomienda emplear

aparatos de muestreo de enfriamiento al combinar varias muestras tomadas en diferentestiempos.

3.2 MUESTREADORES/RECIPIENTES/CONTENEDORES

El volumen, la forma y el material de los recipientes depende de la naturaleza de la muestra(por ejemplo, degradabilidad/estabilidad), la cantidad de repeticiones, el volumen requeridopara estos ensayos y la necesidad de preservar y almacenar las muestras antes delprocesamiento adicional.

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Se aconseja reducir al mximo el tiempo requerido para la congelacin y el deshielo por mediode la reduccin del volumen de la muestras, es decir, el tamao del recipiente. En general,resulta adecuado emplear recipientes de un litro para la congelacin. Para ensayos querequieran mayores volmenes, se recomienda dividir la muestra en recipientes que contenganmenos de 10 l.

El volumen total de la muestra tomada debera ser suficiente para cubrir cualquier ensayocomplementario o repetido. Se recomienda guardar las submuestras restantes almacenadascongeladas por separado hasta que se realice la evaluacin final.

El material de los recipientes debera ser qumicamente inerte, de fcil limpieza y resistente alcalentamiento y congelacin. Se recomiendan los recipientes de virio, polietileno opolitetrafluoroetileno (PTFE).

3.3 ESTADO DE LLENADO DE LOS CONTENEDORES

Se aconseja decidir si se llenan los contenedores por completo hasta el borde o slo en forma

parcial, contando con un espacio de aire, teniendo en cuenta el tipo de muestra, el modo depreservacin y el ensayo biolgico contemplado.

Los problemas relacionados con el llenado parcial pueden ser:

- Agitacin intensificada durante el transporte, que conduce a la degradacin de laspartculas adicionadas;

- interaccin con la fase de gas, que conlleva al arrastre;

- oxidacin de sustancias, que conduce, por ejemplo, a la precipitacin decompuestos de metales pesados.

Los problemas relacionados con el llenado completo pueden ser:

- agotamiento del oxgeno, con posible descomposicin, que conduce a laformacin de metabolitos txicos (por ejemplo, nitrito, sulfuro);

- deterioro de la homogenizacin debido a la sacudida o agitacin del volumen total.

Los contenedores de muestras, cuando se contempla la congelacin para la preservacin, nodeberan llenarse por completo a fin de permitir la expansin del volumen.

4. TRANSPORTE

Se recomienda proteger las muestras recogidas de la fragmentacin, incremento de latemperatura y contaminacin externa. Se aconseja evitar la identificacin errnea de lasmuestras transportadas en hielo por medio de marcadores y/o rtulos a prueba de agua.

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5. PRESERVACIN Y ALMACENAMIENTO

Como se establece en la norma ISO 5667-3, resulta imposible emitir reglas absolutas para lapreservacin, por ejemplo, la duracin del posible almacenamiento y la eficiencia de variosmodos, puesto que estos aspectos dependen principalmente de la naturaleza de la muestra, en

especial de su actividad biolgica.

Por lo general, las aguas potables y las freticas son menos susceptibles a las reaccionesbiolgicas y qumicas que las aguas superficiales, aguas residuales crudas o tratadas. Si lacomposicin qumica se puede anticipar en forma aproximada, se recomienda hacer referencia ala norma NTC-ISO 5667-3 para los propsitos del ensayo biolgico. Sin embargo, se debenconsiderar algunas precauciones adicionales como se indica a continuacin.

- Es aconsejable procesar las muestras para ensayo biolgico preferiblemente sindemora luego de la recoleccin a fin de evitar cambios en la composicin originalcomo resultado de las reacciones fsicas y qumicas y procesos biolgicos o

ambos. La duracin mxima de almacenamiento no debera exceder las 12 h atemperatura ambiente (mximo 25 C). Se recomienda conservar las muestras enla oscuridad a fin de evitar el crecimiento de algas.

- Si no es posible realizar el ensayo inmediatamente despus del muestreo (opreparacin de la muestra), por ejemplo, al preparar muestras compuestas, seaconseja el enfriamiento o congelacin.

- La forma ms comn y recomendada de preservar muestras de agua residualconsiste en enfriarlas a una temperatura entre 0 C y 5 C. Al enfriarse en estaescala y almacenarse en oscuridad, la mayora de muestras permanece establede manera normal hasta durante 24 h (vase la norma ISO 5667-10). Elenfriamiento debera comenzar tan pronto como sea posible despus delmuestreo, ya sea en campo, por ejemplo en cajas fras con hielo, o en unrefrigerador en el vehculo de transporte.

- La congelacin debe ser inferior a 18 C, de acuerdo con la norma ISO 5667-10para permitir en general un incremento en la conservacin. Por lo general, losperodos de almacenamiento mximo van de unas cuantas semanas a dos mesesdependiendo de la estabilidad de las muestras.

- La experiencia ha demostrado que la calidad del agua residual puede afectarsedurante la congelacin y el deshielo.

- Se aconseja excluir el uso de preservativos biocidales para el propsito del ensayobiolgico. Tampoco se recomienda la adicin de cidos muy concentrados obases para estabilizar las muestras, por ejemplo, HCl NaOH.

- Se debera enfatizar que, si existe duda, el analista qumico y el tcnico delensayo biolgico deberan consultarse entre s antes de decidir acerca del mtodode manipulacin y preservacin de las muestras. Si no son compatibles lastcnicas de preservacin para el anlisis qumico y para el ensayo biolgico, sedeberan proporcionar submuestras separadas para los diferentes propsitos.

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6. APARATO Y EQUIPO

6.1 SELECCIN DEL APARATO

El tipo, la forma y el material del equipo tcnico dependen del ensayo y la naturaleza de la

muestra. Todos los materiales que entran en contacto con la muestra de ensayo deben ser talesque las interferencias causadas por sorcin o difusin del material de ensayo, por elusin demateria extraa (por ejemplo plastificantes) o por crecimiento de organismos, se mantengan enun nivel mnimo. Resultan convenientes los materiales inertes, por ejemplo, el vidrio, PTFE. Lasconexiones de tubos deberan ser lo ms cortas posibles y se recomienda cambiarlasperidicamente. Se aconseja evitar la contaminacin del material de ensayo, debido por ejemplo,a la grasa de rectificado proveniente de tapones o accesorios. No resultan convenientes los tuboshechos de cobre, aleacin de cobre o plsticos no-inertes.

6.2 SILIZACIN

Con el propsito de reducir al mximo la adsorcin del material de ensayo en los contenedores,

tuberas, vidrios o plsticos se puede silizar (siliconizar) por medio de inmersin o enjuague enuna solucin de fraccin masiva al 5 % de diclorodimetilsilano en cloroformo o heptano. A medidaque el solvente orgnico se evapora, el silano se deposita en la superficie, la cual deberaenjuagarse muchas veces con agua o calentarse a 180 C durante 2 h antes de usarse. Seaconseja emplear la silizacin slo si se van a ensayar ingredientes del agua o sustancias de altaadsorcin y no se encuentra disponible material inerte adecuado (por ejemplo, PTFE).

6.3 LIMPIEZA DE APARATOS Y EQUIPO

Antes de usarse, se recomienda limpiar el aparato y el equipo con adecuados agentes delimpieza, por ejemplo, cido clorhdrico, hidrxido de sodio, detergentes, etanol, cidosulfrico/perxido de hidrgeno y, siempre que sea adecuado, se esterilizan trmica oqumicamente (por ejemplo, con solucin de hipoclorito). No se aconseja emplear cidocromosulfrico.

El enjuague repetido del aparato con agua destilada (o agua con el mismo grado de pureza),garantiza que no hayan quedado vestigios del agente de limpieza o desinfeccin.

A fin de remover los vestigios del uso anterior, se recomienda el lavado con cido antes dellavado final con agua destilada.

7. TRATAMIENTO PREVIO Y PREPARACIN DE MUESTRAS

7.1 GENERALIDADES

El siguiente diagrama de flujo (vase la Figura 1) contiene informacin sobre trminoscomnmente empleados (aunque algunas veces en forma diferente) en las normas y parmetrosdel ensayo biolgico.

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Figura 1. Preparacin de las muestras para bioensayo

La muestra, es decir una sustancia qumica, es una preparacin, slida o en solucin, unamezcla de varias sustancias, agua o agua residual. La muestra de ensayo se elabora a partir de

la muestra por medio de varios pasos especficos de la toma de muestra y el ensayo, porejemplo, por medio de disolucin, homogenizacin, sedimentacin, filtrado, neutralizacin oaeracin. Se adiciona agua de dilucin para preparar una serie de diluciones definidas. El mediode ensayo (incluyendo la muestra de ensayo) se obtiene luego de la adicin del medio nutriente.

El lote de ensayo final se obtiene por medio de la adicin de organismos de ensayo, que en elcaso de microorganismos, se llama inculo. En el lote de control o, en varios lotes paralelos, sepreparan los controles a partir de una mezcla de agua de dilucin y solucin nutriente conorganismos de ensayo sin muestra de ensayo.

Cuando el efecto o el comportamiento de una sustancia se conoce a partir de ensayos previos(sustancia de referencia) y cuando dicha sustancia se examina dentro del marco de una seriede ensayos como muestra de ensayo, esto se denomina lote de referencia.

7.2 DESHIELO

Se aconseja deshelar las muestras almacenadas congeladas antes de su uso. Se recomienda elagua corriente o un bao de agua caliente a una temperatura que no exceda los 25 C, junto conuna suave sacudida, a fin de evitar el sobrecalentamiento local.

Resulta esencial el deshiele de las muestras antes de usarse, puesto que el proceso decongelacin puede tener el efecto de concentrar algunos componentes en la parte interior de lamuestra que se congela en ltimo lugar. El tratamiento con microondas involucra el riesgo de

sobrecalentamiento.

Muestra, (ejemplo: sustancia,agua (residual))

Muestra para ensayo, (ejemplo:sustancia disuelta, agua residual

neutralizada)

Etapa preparatoria, ejemplo: disolucin,homo eneizacin filtrado neutralizacin aeracin

Agua de dilucin

Medio nutriente

Medio de ensayoincluyendo muestra

Medio de controlexcluyendo muestra para

ensayo

Organismos de ensayo,inculo.

Lote de ensayo Lote de control

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7.3 HOMOGENEIZACIN

Es recomendable asegurar una distribucin uniforme de todos los componentes solubles yparticulados. Se puede aplicar una agitacin suave, una sacudida vigorosa, tratamientoultrasnico o dispersin mecnico de alta velocidad, de acuerdo con la naturaleza de las

muestras. Durante este paso del tratamiento, se debera prestar atencin a la prdida potencialde ingredientes voltiles.

Como regla general, se debera tener cuidado de que el estado original de la muestra se restaureo por lo menos se altere lo mnimo posible.

7.4 SEPARACIN DE MATERIA SOLUBLE Y PARTICULADA

En general, los ensayos biolgicos se realizan con la muestra original. Sin embargo, en algunoscasos, grandes cantidades de materia particulada, lodo y sedimento interfieren con los requisitoscomportamentales de los organismos de ensayo (atascamiento de agallas de peces, deterioro delfiltro de alimentacin de dahpnids, limitacin ligera de algas).

Si no se quiere que estos efectos deletreos se reflejen en los resultados del ensayo, se puedenevitar o superar dichas interferencias por diferentes medios.

Las aguas ricas en partculas pueden dar origen a interferencias, por ejemplo, al realizarcuantificacin por medio de un contador de partculas. De igual manera, el conteo microscpicose ve bastante deteriorado. La dosificacin continua se considera poco confiable debido alatascamiento y bloqueo de la tubera.

Sin embargo, la filtracin, la centrifugacin y otros mtodos de separacin involucran el riesgo deque los componentes activos, que se adhieren a las partculas, sean removidos antes delensayo. Adems, se deben tener en cuenta los problemas relacionados con la filtracin, porejemplo la adsorcin y lixiviacin en materiales de filtro. La sedimentacin y centrifugacin evitanestos problemas. Al realizar ensayos en presencia de partculas que causen problemas severos,se recomienda permitir que la muestra se asiente durante de 30 min a 2 h se lleva a cabo unafiltracin gruesa (>50 m), removiendo as solo partculas gruesas. La masa de la partculaseparada puede examinarse por separado.

Algunos de los mtodos de ensayo ofrecen la posibilidad de determinar un factor de correccinpara parmetros tales como la turbidez.

Las aguas ricas en bacterias interfieren en los ensayos relacionados con actividad de bacterias,por ejemplo, la inhibicin de la respiracin. Por lo menos en forma parcial, se puede dar cuenta

de la interferencia debida a la actividad de las bacterias en la muestra, por medio del ejercicio decontroles convenientes. Al ensayar algunas algas, cardmenes de peces pequeos o cultivoscelulares, las infecciones bacteriales pueden causar interferencia. Todos los mtodos deesterilizacin disponibles, tales como el tratamiento trmico o UV o la filtracin de la membrana(0,2 m) involucran un alto riesgo de efectos secundarios. Cuando es necesario el filtrado espreferible la filtracin de fibra de vidrio. Generalmente, la centrifugacin, por ejemplo 10 min a 4 500 g1 500 g, es preferible a la filtracin.

7.5 CONCENTRACIN PREVIA

La concentracin previa de las muestras incrementa la concentracin no solo de sustanciaspeligrosas sino tambin de otros constituyentes del agua, los cuales pueden ser deletreos en

altas concentraciones.

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Adicionalmente resulta esencial tener en cuenta que en cualquier caso la concentracin previa esselectiva segn del procedimiento aplicado, lo cual altera el patrn de composicin original de losingredientes del agua, por ejemplo:

- La extraccin lquido / lquido con solventes orgnicos y la extraccin de faseslida por medio de la adsorcin de slidos (por ejemplo las resinas XAD) resultanparticularmente eficientes para los componentes hidrofbicos del agua. Laintensidad inica y la presin osmtica pueden atenuarse. Se pueden excluir losiones txicos, los qumicos polares y los ingredientes coeficientes de agua (porejemplo, el enmascaramiento), tales como cidos hmicos.

- La evaporacin y la congelacin-secado pueden conllevar a prdida de sustanciavoltiles y aumentar la intensidad y la presin osmtica;

- La ultrafiltracin puede conducir a una prdida especialmente de pequeasmolculas que penetran la membrana.

El incremento en la concentracin por encima del umbral de solubilidad puede conducir a laprecipitacin o floculacin de sustancias disueltas previamente.

La acumulacin biolgica no se puede simular por medio de la concentracin previa de muestras,puesto que los factores de bioconcentracin (BCF) no pueden relacionarse o extrapolarse.

Algunos ingredientes de la muestra de agua que se est concentrando pueden experimentarreacciones qumicas a una tasa superior a la de la muestra original.

Se pueden obtener valores adecuados blancos slo si se encuentran disponibles muestras dereferencia descontaminadas, por ejemplo aguas arriba de la fuente de contaminacin. Espermisible el incremento en la salinidad al preparar blancos con igual osmolaridad y composicininica similar (por ejemplo, la proporcin Na:K).

No es posible extrapolar a partir de ensayos agudos con muestras concentradas previamentehasta los efectos crnicos de la muestra original.

Por consiguiente, es preferible escoger un sistema de ensayo ms sensible o prolongar el tiempode exposicin en vez de realizar previa concentracin de la muestra. Si no existe mtodosensible disponible para ensayar la muestra original y se aplica un procedimiento deconcentracin previa, el resultado es ms discutible entre mayor sea el factor de concentracin.

Por las razones mencionadas anteriormente, por lo general los ensayos para toxicidad aguda ycrnica con muestras concentradas previamente son insignificantes y no se recomiendan. Entodos los casos, los resultados de ensayo obtenidos con muestras de agua previamenteconcentradas deberan interpretarse con extrema precaucin. Las investigaciones preliminaresde este tipo no pueden normalizarse y deberan validarse por medio de investigacionesextensivas adicionales.

7.6 AJUSTE DEL pH

La seleccin del valor del pH al cual se debe ajustar la muestra se rige por el objetivo del ensayo,es decir:

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- El ajuste del pH del agua de recibo producir resultados ms representativos delefecto de los txicos una vez se hallan en el ambiente;

- El ajuste de un pH definido entre 6 y 9 (el cual generalmente es tolerable para labiota) permitir la expresin de txicos ionizables que de otra manera seran

enmascarados por las condiciones de pH por fuera de esta escala.

Por lo general, se neutralizan las muestras con valores pH extremos que exceden los lmites detolerancia de los organismos de ensayo. Se recomienda omitir la neutralizacin si el efecto del pHse va a reflejar en el resultado del ensayo o si se observa modificacin fsica o reaccionesqumicas (por ejemplo, precipitacin) debido al ajuste del pH. La concentracin del cido o baserequerida para la neutralizacin debe ser tal que la modificacin del volumen sea la menorposible. Se aconseja evitar el paso del punto neutral.

No es recomendable que el agente de neutralizacin experimente una reaccin con losingredientes en la muestra, que pudiera, por ejemplo, conducir a la precipitacin o al

acomplejamiento. Adems, no se debera influenciar el organismo de ensayo por medio de laampliacin o inhibicin. Por lo general, se recomiendan las soluciones de cido clorhdrico ohidrxido de sodio.

7.7 PREPARACIN DE SOLUCIONES DE PARTIDA Y LOTES DE ENSAYO

7.7.1 Sustancias solubles en agua

Al preparar la solucin de partida, la porcin pesada de la sustancia no debera exceder lacantidad mxima por disolver (

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de solubilidad de sustancia-especfica. Los mtodos pticos simples (por ejemplo, las medicionesde dispersin luminosa) no permiten ninguna determinacin confiable del grado de dispersin.

Resulta imposible recomendar un mtodo nico para generar una solucin ptima o distribucinde las sustancias en el medio, puesto que el mtodo seleccionado debera corresponder a las

propiedades fsicas de la sustancia. Por tal razn se debe dejar la seleccin de un mtodoadecuado a disposicin del investigador de acuerdo con su experiencia o del fabricante segn lainformacin de la produccin.

La siguiente gua se deriva de la experiencia prctica y contiene sugerencias acerca de lasformas y medios que posibilitan al investigador, luego de sopesar los pros y los contras,seleccionar el mtodo ms conveniente.

7.7.3.2 Ensayo en la escala de solubilidad del agua

Para este propsito, se mezcla una porcin pesada definida de la sustancia (por ejemplo 100 mg)por medio de agitacin o sacudida con 1 litro de agua destilada aproximadamente durante 24 h,

preferiblemente en la oscuridad. Debe indicarse la porcin pesada para preparar el licor departida. Siguiendo la separacin de la fase, se separa por completo la fase no disuelta por mediode filtracin (cuando sea necesario se emplea un filtro de membrana, de tamao de poro de 0.2 m)o por centrifugacin. Se prepara la serie de dilucin con la fase acuosa. De comprobarse necesario,segn las propiedades de la sustancia (por ejemplo, la alta viscosidad o descomposicin en elagua), se deberan considerar tiempos menores o mayores de mezcla, probablementeinvolucrando el empleo de agentes auxiliares.

Nota. Dependiendo de las sustancias por ensayarse, las tcnicas de centrifugacin y filtracin pueden conducir adiferentes resultados.

Si se reduce la solubilidad a travs de la adicin de componentes medios (por ejemplo, salesnutrientes), resulta ventajoso preparar una solucin saturada mezclando la sustancia con elmedio de ensayo. En casos individuales, se debe considerar el remplazo de las sales (porejemplo, iones de Ca Mg) por otros (por ejemplo, iones de Na K), que no se precipitan.

Se puede lograr una distribucin fina de fluidos altamente viscosos por medio de la fragilizacin abajas temperaturas (por ejemplo, empleando nitrgeno lquido) seguida por aplastamientomecnico (por ejemplo en molinos batidores).

Se deben recocer los filtros para la recoleccin de constituyentes no disueltos (filtrosinorgnicos). Los filtros orgnicos, por ejemplo de policarbonato, requieren de tratamientorepetido en agua destilada en ebullicin con el propsito de garantizar que no se transfierancomponentes del material de filtro en la solucin de ensayo. No se recomiendan los filtros deacetato de celulosa. Segn el material del filtro, no solo se puede capturar constituyentes sindisolver por filtracin, sino que la sustancia de ensayo disuelta tambin puede eliminarse pormedio de la sorcin. A concentraciones

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a) Rectificador de velocidad alta/sonicacin (ventaja: mayor velocidad de disolucin;desventajas: separacin de fase ms difcil, posible descomposicin ycalentamiento por medio de la entrada de energa). En la norma ISO 10634 se

ofrecen mayores detalles.

b) Incremento de la temperatura (ventaja: por lo general mayor solubilidad y mayorvelocidad de disolucin; desventajas: incremento de volatilizacin, riesgo dedescomposicin y reacciones de hidrlisis, posibilidad de sobresaturacin con elresultante retraso de precipitacin). No es aconsejable enfriar las solucionessaturadas.

c) Empleo de cidos/basescon la resultante neutralizacin (ventaja: explotacin demayor solubilidad de forma protonada; desventajas: slo es aplicable en casosexcepcionales, cuando existe extremo riesgo de que los valores de pH sufranmodificacin qumica en la muestra de ensayo, por ejemplo por medio de

hidrlisis, algunas veces tal vez muy lento establecimiento de equilibrio siguientea la neutralizacin, por ejemplo, los cidos grasos / jabones).

d) Disolucin de la sustancia en un solvente voltil, no acuoso, miscible (por ejemplo,n-hexano ter de petrleo) que se desactiva despus de mezclar con agua(ventaja: distribucin fina rpida de la sustancia de ensayo; desventajas: lasustancia de ensayo tambin puede arrastrarse, los residuos de solvente lentos enel lote de ensayo no pueden evitarse).

e) Disolucin de la sustancia en un solvente no txico, miscible en agua (por ejemplo,etanol, acetona, acetonitrilo, dimetil sulfxido, dimetil formamida). Al seleccionar elsolubilizador, se deben tener en cuenta su capacidad de solubilizacin, toxicidad,degradabilidad y su volatilidad. Los agentes solubilizantes (concentracin

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a) Dosis directa

Se introduce la sustancia directamente en el lote de ensayo. Las platinas demicroscopio resultan convenientes para la introduccin de sustancias slidas olquidos de alta viscosidad. Los solventes miscibles en agua, no txicos, no

degradables, por ejemplo, dimetil sulfxido, se emplean a menudo comosolubilizadores (vase numeral 7.7.3.2. Esta tcnica se restringe a sustancias deensayo no voltiles.

b) Tratamiento ultrasnico

Con frecuencia, el tratamiento con ultrasonido (por ejemplo, 20 kHz, 30 min)puede conducir a una dispersin mecnica suficientemente estable que, luego deaprox. 15 min a 30 min de sedimentacin, puede distribuirse directamente a lotesde ensayo individuales. Son necesarios mtodos analticos adecuados, porejemplo, el de Carbn Orgnico Total (TOC) o el anlisis especfico paradeterminar la concentracin inicial del lote de ensayo.

c) Adsorcin de la sustancia sobre un portador inerte

Esta debera estar de acuerdo con los procedimientos delineados en el numeral 7.7.3.2(adsorcin de la sustancia sobre un portador inerte). El portador con la sustanciade ensayo aplicada en forma homognea ahora hace parte del lote de ensayo.Este mtodo no es conveniente para sustancias voltiles, puesto que se eliminandurante la aplicacin y subsecuente secado del portador.

d) Dispersin de las sustancia con un agente emulsificante

Los agentes emulsificantes de la concentracin empleada (100 mg/l) deberanser no txicos y estables durante el perodo de ensayo. Se pueden emplear lassiguientes sustancias como agentes emulsificantes:

- monolaurato de sorbitol y polietileno;

- trioleato de sorbitol y polietileno;

- nonilfenol-20 EO-acetal (muy adecuado para ensayos de degradacin);

- aceite de ricino modificado (menos adecuado para ensayos dedegradacin)

- copolmeros de xido de etileno/xido de propileno (adecuado paraensayos de degradacin)

A fin de preparar una emulsin qumicamente estable, se recomienda mezclar la sustancia deensayo con el agente emulsificante antes de introducirla en el agua. En caso de que se empleeun solvente voltil no miscible en el agua adicional (por ejemplo n-hexano o ter de petrleo) parala preparacin de una emulsin, se recomienda arrastrar la muestra de ensayo tratadapreviamente antes de introducir el organismo de ensayo.

Las sustancias slidas con poca solubilidad por lo general no se ensayan por encima de su lmitede solubilidad. Los ensayos de toxicidad por encima de dicho lmite son solo aconsejables para

sustancias slidas de rpida dispersin y sustancias slidas comercializadas como dispersiones oque entran en contacto con agentes emulsificantes cuando se emplean adecuadamente.

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Los estudios de bioacumulacin y los ensayos biolgicos no deberan realizarse por encima del lmite desolubilidad.

La propensin de una sustancia a dispersarse en el agua depende sobre todo de su densidad, suviscosidad y su tensin superficial. Al incrementar la entrada de energa, se puede lograr un

tamao de partcula menor y por lo tanto, a menudo, una mayor estabilidad de la dispersin. Noobstante, existen indicaciones de que el efecto de deterioro de una emulsin tambin se veinfluenciado por el tamao de las gotitas emulsificadas. Es probable que se encuentrendisponibles diferentes recorridos para que los organismos capten las partculas emulsificadas delas sustancias disueltas.

Con frecuencia las dispersiones mecnicas son inestables. Algunas veces la separacin de lafase puede evitarse por medio de la agitacin constante, sacudida u otro modo de mezclar lamuestra de ensayo durante el mismo. Se debera tener cuidado para evitar cualquier daomecnico a los organismos de ensayo.

Nota. Las gotitas de aceite y pelculas superficiales pueden tener efectos deletreos sobre los organismos,especialmente en los daphnids. Es posible evitar el contacto de estos con las pelculas superficiales por medio de laseparacin mecnica mediante redes / tamices u oscurecimiento de la superficie.

Se puede valorar la estabilidad de las emulsiones por observacin visual, anlisis qumico (porejemplo, Carbn Orgnico Disuelto (DOC)/TOC; y por mediciones de turbidez. En principio, se daprioridad a las dispersiones preparadas en forma mecnica sobre las realizadas con agentesemulsificantes.

Existen dos maneras de producir una serie de dilucin a partir de una dispersin de partida conagentes emulsificantes:

- manteniendo una concentracin constante del agente emulsificante;

- manteniendo una proporcin de concentracin constante de sustancia de ensayoa agente emulsificante.

Generalmente, se debera preferir mantener la misma concentracin del agente emulsificante entodos los lotes de ensayo a fin de asegurar que la proporcin concentracin-efecto dependasolamente de la concentracin de la sustancia del ensayo, con lo que se evita la degradacin dela emulsin en diluciones ms altas. Siempre es necesario un lote de control adicional con lamxima concentracin del emulsificador.

Al interpretar los resultados, se debera tener presente que los efectos observados son efectos

combinados, incluso si el emulsificador en s no muestra ningn efecto en el lote de control.

7.7.3.4 Problemas especiales con mezclas de sustancia o productos tcnicos.Al ensayar sustanciascon subingredientes txicos de rpida solubilidad (por ejemplo, el tetrabutil estao contaminado conxido de tributil estao ) y mezclas de sustancias poco solubles (por ejemplo, productos de aceitemineral), se pueden enriquecer los componentes de ms rpida solubilidad en el extracto acuoso.Con frecuencia esto se hace evidente por un alza en el DOC con incremento de porcin masiva en lapresencia de una fase no disuelta ya existente. Con el propsito de registrar efectos de esta clase, serecomienda preparar una solucin acuosa saturada adicional y ensayarla con una proporcin mayorde mezcla (por ejemplo, 0,1 g 1 g de sustancia por litro de agua). La comparacin de los hallazgosobtenidos con varias proporciones de mezcla puede indicar los efectos de componentes de rpidasolubilidad de una mezcla heterognea.

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Como alternativa a este procedimiento, es aconsejable ensayar mezclas de sustancias que nopresenten rpida solubilidad y sustancias con componentes menores de rpida solubilidad pormedio de la preparacin de una serie de extractos acuosos en la que la tasa de carga disminuyageomtricamente. Los extractos acuosos deberan ensayarse de forma no diluida y el resultadodebera referirse no a la concentracin en la fase acuosa sino a las tasas de carga. Es importante

observar que los extractos acuosos no se deberan diluir.

Puesto que la composicin qumica de la fraccin disuelta de las mezclas con frecuencia varaconsiderablemente desde el producto original, es aconsejable examinar los efectos del productooriginal en forma dispersa (vase el numeral 7.7.3.3).

8. TRATAMIENTO DE MUESTRAS DURANTE EL ENSAYO

8.1 AIREACIN

Debera darse cuenta de la demanda de oxgeno de animales de ensayo y microorganismos

heterotrficos por ejemplo por medio de la aireacin continua o intermitente. En casos especiales,por ejemplo en aguas residuales con una demanda de oxgeno bioqumico extremadamente alta(BOD), es necesario suministrar oxgeno puro en vez de aire. Se recomienda evitar lasobresaturacin. Los problemas de arrastre de voltiles y perdidas de sustancias por espumadopueden evitarse mediante mtodos especiales (vase el numeral 10.1.3)

8.2 SUSPENSIN

La materia particulada contenida en el agua puede suspenderse durante el ensayo si no seanticipan interferencias (vase el numeral 7.4). Los microorganismos planctnicos deberanmantenerse en suspensin durante el ensayo mediante mtodos apropiados, por ejemplo, porsacudida, agitacin, rotacin, aireacin.

Se debera tener cuidado a fin de evitar el deterioro mecnico de los organismos de ensayo.

8.3 AJUSTE Y CONTROL DEL pH

En algunas circunstancias (por ejemplo, debido a la aireacin) el pH se desviar incluso si lamuestra se ha neutralizado previamente. El ajuste y control del pH durante el ensayo deberandecidirse de acuerdo con la causa de la desviacin del pH y el objetivo del ensayo. La desviacinabitica del pH puede distinguirse mediante un lote sin organismos.

A partir de la opinin del analista y el regulador puede ser deseable trabajar con un sustancia en

un estatus qumico constante claramente definido. Se debera evitar o contrarrestar el incrementoen el nivel del pH, debido a problemas prcticos, por ejemplo despojamiento de CO2 poraeracin.

Esto es especialmente importante para el cambio dependiente del pH de la toxicidad del pescadocon amonaco ionizado y no ionizado. Otros ejemplos de sustancias que presentan toxicidaddependiente del pH son los sulfuros, cianuros, aminas, fenoles y cidos orgnicos.

Sin embargo, si el cambio en el pH durante el ensayo es un efecto de los procesos vitalesfundamentales tales como la fotosntesis en el crecimiento de las algas, la cual es necesaria juntocon el consumo de CO2, resulta razonable no ajustar el pH.

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Una transicin permitida sobre una amplia escala no slo intensificara la aplicabilidad y el valorindicativo del ensayo, sino que tambin ofrecera la oportunidad de activar el efecto de uncompuesto qumico que, de otra forma, podra no haberse detectado.

El incremento del valor de pH en los ensayos con algas puede reducirse por varios medios, a

saber:

- adicin de amortiguador;

- adicin de carbonato;

- adicin de CO2gaseoso;

- incremento del intercambio de gas mediante aeracin o sacudida, o ambas.

- limitacin de la luz;

- imitacin de nutrientes;

- limitacin de temperatura;

- limitacin de la duracin del ensayo;

- reduccin del inculo

Todas estas opciones tienen efectos y consecuencias secundarios indeseados, por ejemplo, lareaccin con un compuesto de ensayo, la precipitacin, arrastre de voltiles, complicacin deldiseo del ensayo, limitacin de crecimiento, problemas de medicin. En general, el intercambiooptimizado de gas y la conduccin de ensayos en los lmites inferiores de luz y temperaturareducirn el problema.

Se puede lograr el control del valor pH en ensayos de peces mediante la adicin de dixido decarbono o cido clorhdrico o conduciendo ensayos bajo concentraciones de CO2 atmosfricasespecficas. El ajuste del pH durante el ensayo requiere de regulacin de retroalimentacinseparada para cada recipiente de ensayo.

9. GUA GENERAL EN CUANTO AL DISEO DEL ENSAYO

9.1 PREPARACIN DE DILUCIONES

Por razones fisiolgicas, no se pueden llevar a cabo los ensayos biolgicos que empleanorganismos acuticos usando agua desionizada como medio. Dependiendo de la naturaleza delanlisis, se recomienda emplear agua de grifo libre de cloruro, agua fresca sinttica o agua demar (posiblemente con aditivos nutrientes), agua fretica o superficial. Esta ltima es menosadecuada para investigaciones toxicolgicas pero ms indicada para investigaciones ecolgicas,por ejemplo, para valorar la capacidad para soportar carga del agua en relacin con la situacinlocal (adaptacin de carga existente).

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Si no se emplea un medio sinttico estandarizado, ser necesario ajustar la dureza del agua, elpH y, posiblemente, la proporcin molar especfica de iones de calcio a iones de magnesio alrealizar ensayos de toxicidad especfica de la sustancia. Para algunos ensayos con organismosmarinos, es esencial el empleo de agua marina natural.

Se combinan las cantidades definidas de la muestra con los volmenes correspondientes delagua de dilucin con el propsito de brindar la concentracin deseada de la dilucin.

Se emplea como agua de la dilucin el agua especificada en la norma adecuada. Por lo general,se utilizan niveles de concentracin progresiva en series geomtricas.

9.2 ENSAYOS DE LMITE Y DEFINICIN DE LA ESCALA

No es necesaria una serie de dilucin cuando solo se desea averiguar si una concentracindeterminada o nivel de dilucin presenta algn efecto (ensayo de lmite).

Resulta conveniente en un ensayo de definicin de escala preliminar con pocos organismos de

ensayo determinar primero la serie aproximada de concentraciones efectivas, y slo despusconducir el ensayo principal. Las muestras inestables (por ejemplo de agua residual) puedenalterar las propiedades durante el tiempo necesario para el ensayo preliminar. En este caso seaconseja realizar el ensayo principal de inmediato, posiblemente con gradaciones preliminaressobre una amplia serie de concentracin.

9.3 ENSAYOS COMPLEMENTARIOS

Cuando, en casos particulares, las concentraciones seleccionadas no cubren completamente laserie de concentraciones efectivas, se aconseja repetir el ensayo o conformar una serie deensayos complementarios. En este caso, por lo menos dos concentraciones deberan seridnticas con dos de las series de ensayos precedentes. Solo es posible una evaluacin conjuntade las dos series de ensayos si las concentraciones graduadas no presentan variacionesmayores que las existentes entre los lotes paralelos dentro de una serie. Los ensayoscomplementarios no son practicables en el caso de aguas y aguas residuales sujetas aalteracin.

9.4 LOTES DE REFERENCIA Y CONTROL

Para cada ensayo, se recomienda examinar uno o, cuando sea apropiado, varios lotes de controlparalelos (vase el numeral 9.5). Los lotes de control o de referencia deberan ser idnticos al lote deensayo, pero no deberan contener los ingredientes por ensayarse. A fin de identificar lasinterferencias posibles en el curso del ensayo y excluir organismos de ensayo inconvenientes, se

aconseja ensayar una sustancia de efecto conocido (sustancia de referencia) a intervalos regulares.En el caso de los experimentos animales que requieren autorizacin, se debera mantener en elmnimo la cantidad de lotes paralelos y de referencia. Las sustancias que se emplean con frecuenciaen ensayos de toxicidad son, por ejemplo, dicromato de sodio, 3,5-diclorofenol.

9.5 LOTES PARALELOS/RPLICAS

9.5.1 Generalidades

Al ensayar rplicas para cada nivel de concentracin / dilucin, se hace posible obtenerobservaciones independientes bajo condiciones que de otro modo seran idnticas. Lascondiciones marginales tales como la temperatura y luz deberan ser iguales y constantes en la

medida posible. A fin de equilibrar las diferencias restantes, es aconsejable no reorganizar lasrplicas en disposicin colateral.

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Notas:

1) Repeticin de mediciones: Al realizar varias mediciones del mismo lote de ensayo (por ejemplo, diversosconteos de un nico lote en el ensayo de algas), estas no son observaciones verdaderamente independientes(rplicas) y, ms bien, sirven para corregir imprecisiones en la medicin. En dichos casos, es posibledeterminar el valor medio de las repeticiones y emplearlo como el mejor valor nico en clculos estadsticos.

En el caso del ensayo de inhibicin de crecimiento de algas, consecuentemente se pueden considerar loslotes paralelos como rplicas verdaderas, independientemente del nmero de muestras que se tomaron deellos.

2) Pseudorplicas: Si, por ejemplo, en un ensayo de reproduccin de Daphnia, se mantienen varios animales enun recipiente, lo cual si

gnifica que la cantidad de prole generada se puede determinar slo por recipiente ( y no por animal), el nmero deobservaciones independientes (rplicas) corresponde al nmero de recipientes y no al nmero de animales.

La cantidad de lotes paralelos a menudo es restringida debido a la reduccin del tiempo, espacioo recursos financieros. Adicionalmente, en el caso de los ensayos con animales vertebrados, esimperativo que el nmero de animales de ensayo se mantenga en el mnimo por razones ticas.

Un requisito adicional para determinar la cantidad de lotes paralelos por nivel de concentracin y enexperimentos de control es el tipo de la evaluacin propuesta del ensayo (vase el numeral 12).

9.5.2 Concentraciones de umbral (NOEC/LOEC)

En contraste con los ensayos de lmite (vase el numeral 9.2), las concentraciones de umbral(NOEC/LOEC, vase el numeral 12.3.1) se determinan por medio del anlisis de la varianza(ANOVA) (por ejemplo, el ensayo de Dunett) a fin de reconocer si una concentracin especficaproduce un efecto importante.

La cantidad requerida de rplicas depende de la varianza del punto final, la cantidad y la distancia

entre los pasos de concentracin y la magnitud de la diferencia del efecto entre el lote de ensayoy el experimento de control, verificada estadsticamente a un nivel de importancia determinado.Por lo general, se recomienda que el nmero de lotes de control sea mnimo dos veces el derplicas por nivel de concentracin / dilucin o incrementado por p, donde pes el nmero deconcentraciones de ensayo.

9.5.3 Relacin concentracin/respuesta

Al determinar la relacin concentracin/respuesta, resulta de importancia decisiva para el diseodel ensayo el tipo de datos de punto final, es decir, si se determinan variables de respuesta(cualitativas) o mtricas (cuantitativas).

La mortalidad (o inmovilidad) de los organismos de ensayo determinada en el ensayo agudo esuna variable de respuesta comn.

En contraste, las variables mtricas presentan incrementos continuos, es decir un gradiente derespuesta. Las variables mtricas tpicas son, por ejemplo, la longitud del cuerpo o la biomasa,las tasas metablicas, las tasas de produccin o consumo de oxgeno o de transformacinenzimtica. La cantidad de animales jvenes producidos tambin puede considerarse comovariable mtrica aproximada.

En el caso de variables mtricas, se evalan los resultados en cuanto con los niveles deconcentracin/dilucin individual en relacin con los lotes de control. Por lo tanto, se deberaprestar especial atencin a fin de garantizar la confiabilidad estadstica de los controles.

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Al determinar las variables de respuesta, se deben incluir las observaciones relacionadasdirectamente en la relacin de concentracin / respuesta. Por lo tanto, no es necesario que elnmero de rplicas en el experimento de control sea superior a los lotes de ensayo.

Por lo general, al determinar la relacin de concentracin-respuesta, es aconsejable reducir el

nmero de paralelos en los lotes de ensayo e incrementar la cantidad de niveles deconcentracin. Esto es permisible puesto que los puntos de medicin adyacentes en una serie dedilucin de estrecha graduacin pueden apoyarse mutuamente entre s. El mnimo son dosrplicas por nivel de concentracin.

Los pasos adyacentes de concentracin no deberan establecerse con demasiada estrechez, afin de evitar que las concentraciones efectivas sean virtualmente idnticas debido a la variabilidaddel sistema de ensayo.

10. GUA ESPECIAL EN CUANTO A LA REALIZACIN DEL ENSAYO

10.1 PROBLEMAS Y MEDIDAS PREVENTIVAS PARA MUESTRAS QUE CONTENGANINGREDIENTES REMOVIBLES

10.1.1 Generalidades

Los componentes de una muestra de agua pueden perderse en el sistema de ensayo por variasrazones:

- evaporacin de sustancias voltiles;

- biodegradacin;

- degradacin abitica (por ejemplo, hidrlisis, fotlisis);

- sorcin hacia o en materiales del recipiente, en especial en el caso de ingredienteshidrofbicos;

- espumado de agentes superficiales-activos;

- precipitacin;

- floculacin.

En estos casos, las fracciones de sustancia empleadas en los sistemas de ensayo no seencuentran disponibles para los organismos a un nivel constante a lo largo del ensayo.

Un ensayo preliminar con o sin organismos de ensayo puede ayudar a clarificar cul trayecto deeliminacin es el responsable de la prdida de sustancia. Las mediciones comparativas deconcentracin, por ejemplo, de parmetros de suma, pueden revelar los mecanismos de prdida.La comparacin de

- un recipiente abierto con uno cerrado ofrece una indicacin de las prdidas porevaporacin;

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- una muestra expuesta con una no expuesta a la luz indica la extensin de ladegradacin fotoltica;

- un recipiente de ensayo sin tratar con uno salinizado indica perdida de sorcin.

- una muestra contaminada [por ejemplo con cloruro de mercurio (II) u otrocontaminante inorgnico adecuado[ posibilita un clculo de eliminacin por mediode biodegradacin.

Sin embargo, la prdida de sustancia durante el ensayo biolgico puede deberse simplemente ala adsorcin y acumulacin en los organismos de ensayo o adsorcin de partculas de alimentos.En estos casos, los organismos todava se encuentran expuestos en forma sustancial, aunquesolo una fraccin de la sustancia pueda determinarse analticamente en el agua. Se puedeexplicar si ocurren prdidas de sustancia reales o simuladas, mediante anlisis comparativos delotes con o sin organismos y alimentacin.

Estas representan indicaciones de que, en el caso de los microorganismos (por ejemplo,

bacterias de algas), la sensibilidad del sistema de ensayo disminuye con el incremento de ladensidad del organismo. La prdida de sustancias puede compensarse mediante dosissubsecuentes o, mejor, por medio de sistemas semi-estticos o de flujo continuo a fin de evitar laacumulacin de metabolitos en el sistema de ensayo.

Sin embargo, existen lmites, en el caso de sustancias poco solubles a partir de los cuales no sepueden preparar soluciones de partida con suficiente concentracin.

10.1.2 Volatilizacin

Las sustancias voltiles se arrastran con rapidez desde el sistema de ensayo en especial en losmtodos de ensayo que requieren aeracin,. En tales casos, se debera considerar el empleo desistemas de ensayo cerrados o de flujo continuo. Se aconseja tener presente que, por ejemplo enel caso del ensayo de inhibicin de multiplicacin celular con bacterias o algas, se deberagarantizar un intercambio de gas suficiente.

En el caso de sustancias txicas voltiles, se debera asegurar que no exista riesgo para elpersonal que conduce el ensayo.

10.1.3 Espumado

En la superficie de un lquido se acumulan sustancias superficiales-activas y tienden a formarburbujas cuando se airea el lote de ensayo.

Mediante el incremento de la proporcin superficie: volumen (recipientes de ensayo planos) o,siempre que sea apropiado, por medio de un ventilador para airear la superficie, se puedegarantizar el suministro de oxgeno necesario sin formacin de espumado.

El empleo de agentes anti-espumado conduce a una interaccin impredecible con la sustancia deensayo y por lo general se debera evitar excepto en casos especiales (por ejemplo, estudios debiodegradacin).

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10.1.4 Adsorcin

Las sustancias hidrofbicas pueden adsorberse en las paredes del recipiente y luego - enespecial en concentraciones bajas - dejar de ser biodisponibles por completo. A fin de evitarprdidas grandes de sustancia, se recomienda incubar los recipientes durante mnimo 30 min con

la muestra en la concentracin considerada antes del ensayo, la cual es desechada luego, ysubsecuentemente llenar el recipiente con la muestra fresca con el propsito de preparar el lotede ensayo.

La silanizacin de los recipientes puede reducir la capacidad de sorcin de la superficie de lapared. No obstante, slo se puede recomendar si no se cuenta con ningn otro material inerte ysi se puede garantizar que no lixivie ninguna silicona residual (vase el numeral 6.2).

10.1.5 Precipitacin/floculacin

Durante el ensayo puede ocurrir precipitacin del material de ensayo, debido a las reacciones concomponentes del medio nutriente (por ejemplo, iones de calcio) en especial cuando el pH cambia en

el lote de ensayo. Las mediciones para mantener un pH constante (vase el numeral 8.3) puedenayudar a evitar esta interferencia.

10.1.6 Degradacin

Los ingredientes pueden experimentar diferentes tipos de degradacin, a saber biolgica,hidroltica o fotoltica, durante el ensayo. Esto puede conducir a la formacin de productossecundarios (metabolitos) cuya toxicidad es diferente del producto original.

Con frecuencia es difcil evitar la biodegradacin en sistemas de ensayo estticos, puesto que losorganismos de ensayo tales como pescado y otros no se pueden separar de sus bacteriasacompaantes.

En ciertos casos, por ejemplo en el ensayo del pescado, se puede aplicar una temperatura deensayo inferior que conlleve a la reduccin de la biodegradacin si se puede cambiar la especiedel pescado (por ejemplo, trucha arco iris en vez de pez cebra).

En ensayos de bacterias, la biodegradacin a menudo es inherente al sistema y se refleja por losincrementos con respecto al criterio del ensayo (por ejemplo, la tasa de consumo de oxgeno, laproliferacin celular). En algunos casos, se pueden emplear sistemas de flujo continuo.Normalmente, los colectores trmicos evitan la dispersin de la infeccin bacterial de retorno a latubera.

10.1.7 HidrlisisAlgunos ingredientes (por ejemplo, los isocianatos, steres, anhdridos) se hidrolizan en el agua,lo cual significa que en el curso del ensayo, los ensayos se exponen progresivamente aproductos de descomposicin. En caso de hidrlisis, se puede alterar el valor del pH del lote deensayo, lo cual algunas veces conlleva a cambios en la tasa de hidrlisis. Bajo estascircunstancias, se recomienda ajustar el pH incrementar la capacidad de amortiguador. Encasos individuales, mediante la seleccin de otras especies de ensayo, se puede aplicar unatemperatura inferior de ensayo, que conduzca a una reduccin en la tasa de hidrlisis. Al emplearsistemas de ensayo semiestticos o de flujo continuo, se puede examinar con mayor facilidad elefecto de la muestra sin descomponer.

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En el caso de los ensayos de biodegradacin, la hidrlisis del material de ensayo puede originaruna desviacin de las escalas de inhibicin de pH durante el ensayo. Cuando no se puedecontrolar el pH mediante amortiguadores o ajustes, se recomienda preparar una solucin departida acutica, permitir la hidrlisis, por ejemplo durante 24 h, neutralizar la solucin ycomenzar el ensayo de biodegradacin con la muestra hidrolizada.

10.1.8 Fotlisis

Algunos ingredientes (por ejemplo, el hexaclorociclopentadieno, EDTA, hexacianoferrato) sedescomponen por medio de la exposicin a la luz. En el caso de los ensayos con algas, el efectode la luz es inherente al sistema.

En otros ensayos, tales reacciones de descomposicin con frecuencia pueden reducirse oevitarse mediante el trabajo en un ambiente oscurecido (donde sea necesario empleando luzroja). Al igual que con la degradacin biolgica e hidroltica es preferible realizar el ensayo ensistemas de flujo continuo y semiestticos.

10.2 PROBLEMAS Y MEDIDAS PREVENTIVAS CONCERNIENTES A LAS MUESTRASCON COLORACIN O TURBIAS, O AMBAS

En algunos ensayos biolgicos, la determinacin de punto final se basa en una medicinespectromtrica (fotometra, fluorometra). En el caso de las muestras con alta coloracin oturbidez, el efecto inhibidor producido no puede determinarse con confiabilidad. Se pueden llevara cabo los siguientes pasos para superar esta situacin:

- diferente mtodo para la determinacin del punto final (por ejemplo, el conteocelular en vez de la medicin de turbidez en el ensayo de algas);

- medicin de turbidez causada por los organismos mediante el uso de una o doslongitudes de onda diferentes (con frecuencia los tintes cuentan concaractersticas de longitud de onda diferentes a la dispersin luminosa causadapor microorganismos);

- combinacin con otro mtodo adecuado, por ejemplo, medicin de tasa deconsumo o produccin de oxgeno al finalizar un ensayo de inhibicin demultiplicacin celular, en este caso, se recomienda renovar la administracin delmedio nutriente;

- determinacin de la influencia sobre el resultado del tinte o turbidez o ambos conla ayuda de recipientes de medicin / ensayo combinados en los que la muestrade ensayo y los organismos se encuentran separados entre s (por ejemplo laclula de correccin del color en el ensayo de bacteria luminiscente).

En el ensayo de algas, las sustancias con coloracin y turbias pueden impedir directamente elcrecimiento celular como consecuencia de la atenuacin de la iluminacin; esto no deberamalinterpretarse como efectos txicos. La siguientes acciones son adecuadas para diferenciarentre interferencias fsicas y de toxicidad de las sustancias con coloracin en el ensayo de algas:

a) ensayo a diferentes intensidades de luz puesto que la tasa de crecimiento porencima de la saturacin luminosa es casi independiente de la intensidad de la luz;

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b) reduccin de la trayectoria luminosa por medio de la disminucin de la profundidado el volumen;

c) medicin de la reduccin de proliferacin celular en un lote de control cuando laluz pasa previamente a travs de un filtro de transmisin de luz, por ejemplo, un

disco plano que contenga las correspondientes diluciones de la muestra con elcorrespondiente color y grosor de capa;

d) utilizacin de un filtro de transmisin de luz mediante la preparacin de dilucionesrecprocas a la concentracin de exposicin, y de esta forma se mantiene unalongitud de trayecto comn (profundidad constante) y las caractersticas deabsorbancia espectral de la muestra.

11. ENSAYOS BIOLGICOS ESPECIALES

11.1 ENSAYO DE BIODEGRADACIN

La determinacin experimental de degradabilidad de las sustancias y aguas residuales y losestudios de bioacumulacin tambin son ensayos biolgicos. La degradacin puede considerarsecomo la descomposicin de un compuesto orgnico en simples componentes (metabolitos) pormedio de efectos fsico-qumicos (por ejemplo, la degradacin fotoltica mediante luz) y/oactividad biolgica (por ejemplo, degradacin biolgica por medio de microorganismos).

Se realiz una distincin entre:

a) degradacin primaria por medio de la cual la sustancia pierde propiedadesespecficas (identidad, actividad) y se degrada en componentes ms simples;

b) degradacin ltima, es decir, degradacin completa en productos inorgnicosestables termodinmicamente, por ejemplo el dixido de carbono y el agua. Estaconduce a la creacin de nueva biomasa adems del dixido de carbono, el aguay las sales minerales.

Los criterios para la biodegradacin son, por ejemplo:

- la reduccin de componentes de reaccin (por ej. O2) necesarios para labiodegradacin;

- el incremento en los productos de la reaccin que surgen de la degradacin total(por ejemplo CO2);

- la transformacin de la sustancia rotulada 14C en 14CO2;

- la reduccin de la sustancia inicial detectable mediante anlisis especficos;

- la reduccin de la sustancia detectable mediante parmetros de sumainespecficos, (por ejemplo, TOC, DOC).

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Nota 1. Las dos ltimas afirmaciones no ofrecen indicacin de si se trata de biodegradacin o eliminacin fsico qumica(por ejemplo a travs de arrastre) o si han ocurrido cambios estructurales qumicos (por ejemplo, por medio dedegradacin primaria).

Se puede hacer una distincin entre eliminacin por medio de sorcin de lodo y biodegradacincuando se emplea el lodo (adaptado potencialmente) al final del ensayo de degradabilidadinherente como el inculo para un ensayo de degradabiliad rpida, cuando se examinaparalelamente un lote contaminado en el cual no ocurren procesos biolgicos o cuando se haprobado que la ocurrencia de metabolitos es analtica.

Los mtodos de ensayo de biodegradacin pueden clasificarse en los siguientes grupos:

a) Mtodos para medir la biodegradabilidad rpida:

Al medir la biodegradabilidad rpida, se pone en contacto la sustancia de ensayo

con una pequea cantidad de microorganismos polivalentes. Los ensayos sedisean como ensayos discontinuos, es decir, involucran la inoculacin de un solosustrato. Se puede observar el curso de la biodegradacin por medio de diversosparmetros. Cuando las sustancias no pueden reunir los criterios mnimos dedegradabilidad en este sistema de ensayo, se puede examinar su degradabilidaden un sistema de ensayo ms extensivo.

b) Mtodos para determinar la biodegradabilidad potencial (inherente):

En los mtodos para determinar la biodegradabilidad potencial, se hace unadistincin entre sistemas de ensayo de lote y semicontinuos. Ambos presentanuna densidad de inoculacin relativamente alta con microorganismos polivalentes.

Los sistemas de lote estn diseados para funcionar con administracin desustancia e inoculacin nica, mientras que la sustancia de ensayo en el sistemasemiesttico se administra sobre una base diaria.

Nota 2 El uso de los trminos biodegradabilidad rpida e inherente tal como se definen en los parmetros OECDdebera restringirse al ensayo de acuerdo con dichos parmetros. Para detalles adicionales vase la norma ISO 15462.

Adicionalmente la biodegradacin se determina por:

a) Ensayos de simulacin

Los ensayos de simulacin sirven para determinar la biodegradabilidad bajocondiciones ambientales pertinentes. Se requieren modelos validados querepresenten dichas condiciones ambientales. Los mejores modelos hasta elmomento son los de simulacin para plantas de tratamiento de alcantarillado enlos cuales se observa la degradacin de una sustancia de ensayo bajocondiciones de flujo continuo.

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b) Otros mtodos

Estos incluyen, por ejemplo, los mtodos de ensayo en los cuales el lote contienesedimento, y mtodos anaerbicos en los que se observa la conversin de lasustancia de ensayo en CO2 y CH4.

c) Mediciones

Bsicamente, se realiza una distincin entre los parmetros que cubren lamineralizacin de una sustancia de ensayo (medicin de consumo de oxgeno,medicin de emisin de CO2) y los parmetros que registran la desaparicin de lasustancia original o una propiedad caracterstica de la sustancia original o ambas,por ejemplo, el efecto superficial activo en el caso de los surfactantes. En loscasos individuales, por ejemplo al ensayar pesticidas, los ensayos se centrarn nosolo en la degradabilidad de las sustancias mismas sino tambin en los principalesmetabolitos en el suelo, agua y en las plantas. Al ensayar la degradabilidad de lasmezclas y preparaciones de sustancia, se aconseja tener presente que no se

pueden realizar declaraciones acerca de la degradabilidad de componentesmenores y aditivos.

Se pueden encontrar detalles adicionales acerca de la ejecucin y evaluacin de los ensayos dedegradacin por ejemplo en las normas: ISO 7827, ISO 11734, ISO 11733, ISO 10707, ISO 9408,ISO 9439, ISO 9887, ISO 9888, ISO 10634, ISO 10708, ISO 14592, ISO 14593, ISO 15462.

11.2 ENSAYO DE BIOACUMULACIN

La bioacumulacin se puede considerar como la acumulacin de sustancias en organismos vivosdel medio ambiente o por los alimentos. La acumulacin de sustancias en la cadena alimenticiase conoce como bioampliacin. Los procesos bioacumulativos conducen a concentracionesfinales de sustancias en organismos acuticos posiblemente excediendo la concentracin inicialen varias rdenes de magnitud.

La bioacumulacin de sustancias qumicas se ve influenciada por las propiedades de la sustanciatales como la lipofilia, las solubilidad en el agua y la estructura / tamao molecular, por laestabilidad de las sustancias qumicas en el agua y por la actividad metablica del organismo.

El criterio para la bioacumulacin es el factor de bioconcentracin (BCF), el cual describe loscocientes de la concentracin en el organismo (c1) y la concentracin de la sustancia en el medio(por ejemplo, agua) u otro parmetro (por ejemplo alimentos) (c2) a tiempos especficos o bajocondiciones de estado estables (BCFst).

BCF = c1/c2= k1/k2 (1)

Donde:

k1 : es la tasa de captacin;

k2 : es la tasa de eliminacin

Se ha logrado un estado estable o de altiplano cuando tres anlisis subsecuentes a intervalos demnimo 2 d no difieren en 20 %.

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Es posible un clculo preliminar del potencial de bioacumulacin mediante el coeficiente de particinn-octanol-agua, log10Pow,el cual es una medida de la propiedad lipoflica de una sustancia [41]. En laescala de log10Pow3 a 6, a menudo se observa una relacin de BCF = 0,1 Pow.

El log10Powno es adecuado para calcular el potencial de bioacumulacin en el caso de

- iones (por ejemplo metales pesados);

- surfactantes (desestimacin)

- sustancias con pesos moleculares MW > 700 (sobreestimacin debida a la nodisponibilidad de molculas grandes);

- sustancias altamente lipoflicas (log10Pow >6) (sobreestimacin puesto que no semantuvo ms la relacin lineal).

Nota. Los experimentos de acumulacin con sustancias altamente lipoflicas pueden arrojar resultados errneos, o seevitan, por definicin, debido a que las condiciones de estado estable no han sido establecidas an o a que ladeterminacin analtica de la sustancia disuelta en agua permanece incierta, o ambas.

En general, los resultados de los experimentos de bioacumulacin son ms afirmativos que losclculos mediante relaciones log10 Pow. Las determinaciones BCF no deberan realizarse conconcentraciones de sustancia en la escala de efectos txicos a los organismos. Adicionalmente,no se debera exceder la escala de solubilidad en el agua.

Generalmente, en el pescado las sustancias se incorporarn va las agallas y a travs de la piel.

Resulta pertinente una ingestin en la alimentacin en la mayora de los casos solo parasustancias altamente lipoflicas (log10Pow>5 y la mayora >7).

Para una valoracin ms elaborada del potencial de bioacumulacin, adems del BCF, sonfactores indicativos

- la cintica de depuracin

- la altura del altiplano de residuos y

- la distribucin de rganos especficos

Si la eliminacin sigue un modelo de un compartimento de cintica de primer orden, es posiblecalcular un valor CT50 (tiempo para el 50 % de la eliminacin) de la manera siguiente:

250

2

K

LogCT e=

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A menudo se observa una excrecin de dos fases, es decir una eliminacin rpida seguida deuna ms lenta debido a las diferentes tasas de captacin en rganos especficos, procesosmetablicos o diferentes trayectorias de excrecin. Para investigaciones de esta clase, resultanms adecuadas las tcnicas de trazador radioactivo.

La concentraciones de ensayo generalmente muy bajas en un ensayo de acumulacin (1/100 1/1 000 de LC50) imponen requisitos especiales sobre la eficiencia de los mtodos analticos queacompaan el ensayo. En algunas reas (transformacin de sustancias de ensayo) se puedenemplear sustancias radio-etiquetadas.

En el Parmetro 305 de OECD se pueden encontrar detalles adicionales acerca de ladeterminacin de la bioacumulacin.

11.3 ENSAYO DE GENOTOXICIDAD

Los ensayos de genotoxicidad / mutagenicidad sirven como medidas preventivas dentro de unsistema de mantenimiento de salud pblica general. En el tiempo presente existe poco

conocimiento confiable acerca de los efectos de las sustancias mutagenticas en sistemasecolgicos acuticos.

La genotoxicidad puede considerarse como una alteracin del genoma celular bajo la influenciade sustancias. En la medida en que estos cambios se trasmiten a la siguiente generacin celular,es posible hablar de efecto mutagnico de genotipo cambiante. Los efectos txicos desempeanun papel esencial en la etologa del cncer. Sin embargo, no todas las alteraciones genotxicasson heredadas por las clulas hijas, puesto que las clulas cuentan con sistemas de reparacincompensatorios para el cido deoxiribonuclico (ADN) que son capaces de revertir muchasalteraciones adversas. Adicionalmente, a menudo los efectos drsticos conducen a la muertecelular. Se puede considerar la induccin de sistemas de reparacin como prueba de laconcurrencia de efectos genotxicos. Las mutaciones se dividen de tres tipos.

a) Mutaciones genticas, en las cuales la secuencia de base en un gen se modifica atravs del intercambio de una base de ADN (mutacin de punto) o por medio de laintroduccin o extraccin de una o ms bases de ADN (cambios en el cdigo delectura, mutaciones de cambio de estructura)

b) Las mutaciones de cromosomas, en las cuales se altera la estructura delcromosoma visible, por ejemplo a travs de la eliminacin, traslocacin oinversin. Las mutaciones de cromosomas pueden conducir a la formacin deeliminaciones reconocidas como microncleos. La estructura de los cromosomas

puede percibirse especialmente bien durante la metafase del ciclo celular.c) Las mutaciones de genoma en las cuales se cambia la cantidad total de clulas.

En este tipo, la cantidad de las clulas individuales (aneuploidia) o el conjuntoentero de cromosomas (poliploida) puede cambiar.

Las mutaciones de cromosomas y genomas slo pueden observarse en clulas de organismoseucariticos. Los procedimientos de ensayo in vivo e in vitroson distintos. Los procedimientos invitro posibilitan la demostracin del potencial genotxico de un lote de ensayo y resultanapropiados a fin de reducir al mximo los ensayos de animales. No obstante, puesto que losprocedimientos in vitro constituyen sistemas de ensayo suborgnicos, su valor informativo es

limitado.

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Se puede indagar acerca del mecanismo del efecto genotxico en forma diferencial medianteprocedimientos in vitro. Como regla general, estos se realizan con cultivos de clulas provenientes demamferos (por ejemplo clulas de CHO, clulas V79). Su potencial metablico en xenobiticos escomparativamente inferior. Por esta razn las enzimas microsmicas (fraccin S9), por ejemplo detejido de hgado inducidas por bifenilos policlorados (PCBs), se adicionan (activacin metablica)

como serie paralela de ensayo. Aunque la fraccin S9 puede causar una reduccin en la actividadcon algunas sustancias, es posible que primero induzca a un efecto mutagnico con otras numerosassustancias (promutagnico) por medio de la biotransformacin.

Adems la fraccin S9 se adiciona en sistemas de ensayos bacteriales (procariticos) (porejemplo en el procedimiento de ensayo de Ames) en una serie paralela de ensayo. Conbacterias, los potenciales de alteracin de genoma pueden identificarse rpida y fcilmente. Sinembargo, una extrapolacin de los resultados a organismos superiores pone limitantessignificativas.

Al realizar ensayos bacteriales y procedimientos in vitroeucariticos, es conveniente trabajar bajocondiciones estriles. Al igual que el agua, y en especial el agua residual, muy a menudo las

muestras contienen muchas bacterias y dichas muestras generalmente deben filtrarse por mediode un filtro de membrana antes de usarse en la mayora de los sistemas de ensayo. Lasconcentraciones / diluciones empleadas no deberan ser deteriorantes de clulas (citotxicas).Los lotes de referencia (controles positivos) para verificar la reactividad de las clulas deberanprepararse en forma simultnea.

12. EVALUACIN

12.1 GENERALIDADES

La evaluacin de los resultados del ensayo primero involucra la inspeccin crtica de datos y unapresentacin y descripcin de los resultados de ensayo empleando grficos, tablas y parmetrosestadsticos adecuados, por ejemplo valores medios y variaciones (estadsticas prescriptivas).

En muchos casos se sigue un procesamiento estadstico ms extensivo que se dirija adeterminar las relaciones de concentracin o dosis/respuesta a fin de calcular parmetrosadecuados para el quantum de accin y examinar la importancia estadstica (estadsticas declculo y ensayo). Esta evaluacin estadstica ms extensiva es til solo si los datos sonsuficientes para este propsito, lo cual requiere primero que todo de examen crtico de los datos.

12.2 INSPECCIN Y DESCRIPCIN DE DATOS BSICOS

Toda evaluacin debera comenzar con un examen crtico de los resultados de ensayo obtenidos.

Se verifica la credibilidad de todos los datos, lecturas primarias o datos transformados deducidosde las mediciones, en especial en el caso de los anmalos.

Nota. Se recomienda que el evaluador elimine los anmalos solo despus del juicio experto. Los ensayos de anmalospueden emplearse aqu como auxiliares matemticos.

En las consideraciones acerca de la credibilidad resulta til una presentacin grfica,preferiblemente de los valores sin transformar. A menudo es muy conveniente un grficosemilogartmico de los efectos medidos. Cualquier grfico debera presentar en forma clara lasunidades de concentracin, la cantidad de controles y lotes paralelos y los parmetros del efecto.

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Adicionalmente, los grficos ofrecen informacin valiosa acerca del comportamiento de loscomponentes de ensayo y el punto hasta el cual es aconsejable la determinacin de una relacinmatemtica concentracin/respuesta. Tambin puede indicar cul modelo estadstico esprobablemente el ms adecuado.

En el caso de la evaluacin ms avanzada, en principio, se debera dar prioridad a los mtodosaritmticos sobre los puramente grficos puesto que, por lo general, permiten el clculo deescalas de confianza y varianzas . Se aconseja presentar los datos en forma tabular junto con losvalores medios calculados, los coeficientes de variacin y el nmero de observacionesindependientes de los lotes paralelos (rplicas).

En algunos casos en que se van a reportar parmetros definidos simples, por ejemplo lasdiluciones de umbral, no hay necesidad de una evaluacin estadstica ms extensiva. En estoscasos, la evaluacin termina con el clculo del porcentaje de las inhibiciones y la decisin acercade si un efecto medido es superior o inferior que un valor lmite determinado.

12.3 EVALUACIN ESTADSTICA

12.3.1 Generalidades

La evaluacin estadstica ms extensiva se propone

a) presentar una relacin matemtica entre el efecto medido y la concentracinempleada (relacin concentracin / respuesta)

b) calcular los parmetros estadsticos que caracterizan el efecto y

c) realizar ensayos estadsticos o proporcionar escalas de confiabilidad (por ejemplorefirase a la norma ISO 8466)

Se acostumbra proporcionar concentraciones como parmetros estadsticos para el efecto deuna sustancia en la que se observ un quantum de accin especfico (EC: concentracinefectiva, ECx; x: % efecto x).

Por ejemplo, el EC50ofrece la concentracin a la cual el efecto puede observarse en el 50% delos animales de ensayo el 50 % del efecto (por ejemplo la mortalidad, inmovilidad)(concentracin de efecto medio, 50 % de cuantil). Estos parmetros para el quantumdel efectose derivan de la relacin concentracin / respuesta.

En algunos ensayos se determina una concentracin de efecto, por encima de la cual se observun efecto importante estadsticamente, por ejemplo LOEC (Concentracin inferior de efectoobservado) y NOEC (Concentracin de efecto no observado). Estos parmetros puedendeterminarse mediante comparacin de los resultados de ensayo de varios niveles deconcentracin con los resultados de control empleando ensayos estadsticos para el anlisis dela variacin (ANOVA) o, si no se cumplen los prerrequisitos, mtodos no paramtricos (porejemplo ensayos U mltiples).

Nota. Dicha figura, por definicin, ser una de las concentraciones ensayadas. En forma alternativa, el LOEC puede serun clculo de punto, ECX. El valor de x se determina a partir de la experiencia prctica con el mtodo de bioensayoparticular. En muchas situaciones un EC10 ser un clculo LOEC apropiado. Para algunos mtodos de ensayo conmayor variabilidad o ms generalmente en situaciones donde los lmites de confiabilidad alrededor de EC10 sonsuperiores, el EC10 puede remplazarse por un EC20.

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El factor decisivo en la seleccin de una evaluacin estadstica o mtodo de ensayo es laposibilidad de que el criterio del ensayo se relacione con el tipo de variable de respuesta(cualitativo) o mtrico (cuantitativo) de variables (vase el numeral 9.5.3).

12.3.2 Variables de respuesta (cualitativas)

Los mtodos enunciados aqu son adecuados para los bioensayos en los cuales se estudia lavariable mortalidad inmovilidad (por ejemplo, ensayos de toxicidad aguda con peces ydaphnia). El mtodo de clculo clsico para variables cunticas de esta clase se basa en elprincipio de probabilidad mxima. En el caso de la distribucin normal este conduce a anlisisprobit (30), (31), con distribucin logstica para anlisis logit (32) empleando la distribucinWeibull para el anlisis Weibit (33). En el caso de las variables cunticas, los clculos deparmetro que emplean el principio de probabilidad mxima tienen en cuenta la heterogeneidadde la varianza de los valores de medicin. Esto constituye una diferencia muy importante parauna regresin no pesada siguiendo la linealizacin de las curvas de respuesta de laconcentracin (por ejemplo, mediante el uso de papel probit). En esta situacin, no se llega a

escalas de confiabilidad vlidas.

12.3.3 Variables mtricas (cuantitativas)

Los mtodos de anlisis probit, logit o Weibit arriba mencionados no son adecuados paravariables mtricas (cuantitativas). Por lo general, el principio de los mnimos cuadrados de laregresin lineal y no lineal se emplea para los mtodos de clculo. El propsito es seleccionaruna funcin que permita el mejor ajuste a los datos (varianza residual inferior). Si los valores demedicin revelan diferentes varianzas para las concentraciones de ensayo individual, serecomienda realizar los anlisis de regresin con factores de pesaje adecuados (34).

No se recomienda relacionar los efectos medidos en los lotes de ensayo con los controles notratados e ingresarlos contra los logaritmos de la concentracin. Esta transformacin puedeconducir a la heterogeneidad de las varianzas y, por tanto, conlleva mayores desventajas conrespecto a la evaluacin estadstica. Por esta razn, la evaluacin siempre debera realizarse condatos sin transformar.

Se calculan las concentraciones de efecto, siempre que sea posible, a partir de las funciones derespuesta de la concentracin. En el caso de las variables cunticas (por ejemplo del ensayo depeces o daphnia agudos), se acostumbra proporcionar el EC0, EC50 y EC100 que tambin sepueden describir como LC0, LC50y LC100 (LC: concentracin letal).

Donde:

- EC0: concentracin ensayada superior a la cual no se observa ningn efecto enlnea con el criterio del ensayo (LC0: todos los organismos sobreviven);

- EC50: concentracin a la cual existe un efecto sobre el 50% de los organismos enlnea con el criterio del ensayo (LC50: 50% de los organismos mueren);

- EC100: concentracin inferior a la cual existe un efecto sobre el 100% de los organismosen lnea con el criterio del ensayo (LC100: todos los organismos mueren)

- El EC0 y EC100 son parmetros derivados directamente del experimento y noconcentraciones de umbral determinadas estadsticamente. La NEC

(Concentracin sin efecto) se deriva de una relacin concentracin/efectoextrapolada a cero.

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En el caso de variables mtricas, por lo general se calcula el EC50 , algunas veces tambin elEC10(por ejemplo en el ensayo de inhibicin de crecimiento de algas). Se debera tener presenteque, por ejemplo, el EC50 no corresponde a una concentracin de efecto medio, como en el casode las variables cunticas, pero designa la concentracin a la cual una variable mtrica es enpromedio 50 % inferior a la de control.

Nota. IC (concentracin inhibitoria para el efecto x %). La designacin EC50 algunas veces tambin se emplea en casos enlos cuales una variable se inhibe en un 50% en relacin con el control (por ejemplo cantidad de animales jvenes en elensayo de reproduccin de daphnia, biomasa y tasa de crecimiento en el ensayo de inhibicin de algas). Con el propsito dediferenciar estas concentraciones de efecto, determinadas a partir de las variables mtricas de las arriba mencionadas,algunos autores sugieren que se deberan describir como ICx(concentracin inhibitoria para el efecto x%).

El intervalo de confiabilidad puede calcularse empleando el mtodo Fieller (30), (36), (38).

Si la situacin de datos es tal que ninguno de los mtodos arriba mencionados puede aplicarse,la EC50y su escala de confianza puede ser aproximada empleando mtodos alternativos, porejemplo, (Mtodo Promedio de Desplazamiento, Mtodo Krber Sperman Ajustado (30,31) o lasimple interpolacin (de ser necesario de EC0y EC100). Si no se obtiene EC100 con muestras nodiluidas, se debera reportar el mximo EC obtenido.

En muchos ensayos de biodegradacin la cantidad de valores de degradacin medidos en lafase de altiplano no es suficiente para permitir un tratamiento estadstico. Sin embargo, el ltimoresultado de la fase de altiplano a menudo no es representativa de esta fase. En dichos casos, serecomienda indicar el resultado del ensayo en una escala del 10 %, por ejemplo, grado debiodegradacin 70 % a 80 % de la remocin DOC.

12.3.4 Confirmacin estadstica de resultados

12.3.4.1 Generalidades. Los ensayos estadsticos aqu mencionados se emplean para determinarsi en general la sustancia ensayada presenta un efecto importante o a partir de calconcentracin se observa un efecto importante o ambas. Esta concentracin se describe comoFOEC/LOEC (Concentracin de Efecto Observado Primero/Inferior) y la siguiente concentracinms baja (sin efecto importante) como NOEC (Concentracin de Efecto No observado).

Estos parmetros dependen de:

- la varianza del parmetro medido;

- la cantidad de paralelos en las concentraciones de ensayo y controles (rplicas);

- la cantidad de concentraciones ensayadas;

- los incrementos de los niveles de concentracin.

Por tanto, el resultado se ve influenciado en gran medida por el diseo del ensayo. Aqu, ademsla eleccin de un mtodo estadstico adecuado depende de si se examinan variables derespuesta cunticas o cuantitativas (mtricas).

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12.3.4.2 Variables cunticas.Los mtodos mencionados aqu son adecuados para ensayos enlos cuales se examina la variable mortalidad o inmovilidad (por ejemplo, el ensayo detoxicidad aguda con peces y daphnia). Con el propsito de confirmar estadsticamente el efectoobservado, resultan convenientes los ensayos para escalas de datos nominales. Y paradeterminar LOEC/NOEC, es apropiado el ensayo binomial de acuerdo con Fisher.

12.3.4.3 Variables mtricas.La seleccin de un mtodo de ensayo adecuado depende de si elcriterio de ensayo (por ejemplo, biomasas, tasas de crecimiento, produccin de animales jvenesy tasa metablicas) sigue una distribucin normal aproximada y si la varianza es homognea.Entonces, los mtodos estadsticos pueden emplearse como los ms confiables.

En el caso de una distribucin normal y homogeneidad de varianza, se intenta la confirmacinestadstica empleando anlisis de varianza simple (ANOVA). Se determinan NOEC y LOECempleando el ensayo Dunnett o Williams (35).

Si no se cumplen estas condiciones previas, se puede confirmar el efecto empleando el ensayoKruskal-Wallis. En ese caso, resultan adecuados los ensayos U mltiples (por ejemplo de

acuerdo con Bonferroni-Holm (39) ) para determinar las LOEC/NOEC.

Notas:

1) La EC0 no se puede igualar con la NOEC, ya que se determina directamente de los datos sin emplear unmtodo estadstico. Sin embargo, ambos se determinan en un mayor grado mediante el diseo del ensayo(por ejemplo, la cantidad y magnitud de la concentracin incrementan).

2) La determinacin de la NOEC empleando los mtodos estadsticos arriba mencionados se discutecrticamente en la actualidad (40). En forma alternativa, se propone determinar la concentracin umbral deefecto NEC a partir de la relacin concentracin- respuesta (71).

13. PRESENTACIN DE RESULTADOS

13.1 ENSAYOS DE TOXICIDAD

Los ensayos de toxicidad brindan principalmente las concentraciones de umbral o efectivas, porejemplo, NOEC/LOEC, EC10, EC50 y EC90 LC (concentracin letal), respectivamente, cuandoresulte apropiado. Los datos de la concentracin deberan indicar en forma clara si estos sebasan en el in efectivo, en el compuesto o por ejemplo en la etapa de dilucin.

Siempre que sea posible, la curva de respuesta de la concentracin debera presentarse juntocon los resultados del ensayo en un grfico, por ejemplo como se muestra en la Figura 2, donde

se presentan los resultados del ensayo y los valores de ECx. Esta ofrece una clararepresentacin del carcter de la relacin entre la concentracin y la respuesta y el acuerdo delos resultados con respecto al modelo.

Deberan determinarse el criterio de ensayo (punto final), organismo de ensayo, tiempo deexposicin y, siempre que sea posible, las escalas de confianza, por ejemplo para la EC50 (vaseel numeral 12.3.4).

Nota. Al ensayar las aguas residuales por

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