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FACULTAD DE MEDICINA Grupo Inmunovirología
Universidad de Antioquia: Carrera 51D No. 62 – 29
Conmutador: 2196000 – Fax:2630253 Nit: 890980040-8 Apartado: 1226 Correo electrónico: [email protected] http://medicina.udea.edu.co. Medellín, Colombia
Correo del grupo: [email protected] Teléfono: 219 64 82 Ubicación: Calle 62 #52-59, torre 2, piso 5, lab. 532
Informe final
Proyecto "Cuantificación de la actividad antiviral in vitro de compuestos
naturales sobre el SARS-COV-2"
Fecha de presentación: 21 de agosto del 2020
1. ANTECEDENTES
La empresa PIDEKA SAS envió 2 compuestos al laboratorio del Grupo
Inmunovirología de la Universidad de Antioquia, denominados: EX001-27M20 y
EX002-27M20 (Fotografia 1). Los compuestos fueron usados para determinar el
potencial antiviral contra el Virus SARS-CoV-2, aislado en la Universidad de
Antioquia.
2. METODOLOGÍA.
Materiales y reactivos
Se analizó la actividad antiviral de los compuestos enviados y se utilizó el virus
SARS-COV-2 aislado en el Grupo Inmunovirología de la UdeA en la línea celular
VERO E6. Las células VERO E6 se mantuvieron en medio de cultivo DMEM,
suplementado con SFB (Suero fetal bovino) al 5%, en una atmósfera de CO2 al 5%
y a una temperatura de 37ºC. El título del virus SARS-COV-2 aislado en el
laboratorio se determinó mediante la técnica de plaqueo y TCID50 (del inglés,
Tissue Culture Infectious Doses 50) en células VERO E6, siguiendo un protocolo
descrito previamente en la literatura (1) *. El título obtenido fue de 4.2x106 UFP
(unidades formadoras de placa) /mL.
*1. Fan H.H., et al., Repurposing of clinically approved drugs for treatment of coronavirus disease 2019 in a
2019-novel coronavirus (2019-nCoV) related coronavirus model. Chin. Med. J. 2020;6. doi:
10.1097/CM9.0000000000000797.
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Ensayo de citotoxicidad
La citotoxicidad (CTX) se determinó mediante el ensayo de MTT, el cual se basa en
la reducción metabólica del Bromuro de 3-(4,5- dimetiltiazol-2-ilo)-2,5-difeniltetrazol
realizada por la enzima mitocondrial succinato-deshidrogenasa en un compuesto de
color azul (formazán), permitiendo determinar la funcionalidad mitocondrial de las
células tratadas. Este método ha sido ampliamente usado para medir la
supervivencia, la proliferación celular y actividad antiviral; de esta manera, la
cantidad de formazán es directamente proporcional a la viabilidad celular (2).
Inicialmente, las células se sembraron a una densidad de 1x105 células/pozo en una
placa de 96 pozos en 200 µL de DMEM con 10% de FBS y se cultivaron durante 24
horas a 37°C con 5% de CO2. Luego, las células se trataron con diferentes
concentraciones del compuesto por triplicado. Cuarenta y ocho horas después del
tratamiento, se retiró el sobrenadante y se adicionó la solución de MTT (0.5 mg/mL).
Después de 2h de incubación se adicionaron 130 µL/pozo de DMSO. Las placas se
dejaron en agitación durante 15 minutos y finalmente se leyeron en un
espectrofotómetro a 550nm. Se incluyeron además controles sin tratamiento, en los
cuales la viabilidad celular se asumió como del 100%. Cada condición experimental
se evaluó por triplicado en 2 experimentos independientes (n=6). Para los ensayos
antivirales se evaluaron las concentraciones de los compuestos que mostraron
menos del 20% de citotoxicidad.
2. Shen L., et al. High-throughput screening and identification of potent broad-spectrum inhibitors of
coronaviruses. J. Virol. 2019;93(12).
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Ensayo de Actividad antiviral
Las células VERO E6 fueron sembradas en platos de 96 pozos, a una densidad de
1x105 células/pozo en 100uL/pozo de DMEM, 2% de SFB, 5% de CO2 y 37ºC, 24h
antes de ser usadas en este experimento. El día del ensayo, diluciones no
citotóxicas de cada compuesto fueron adicionadas a las células VERO E6, en
réplicas de 3 pozos, por 1 hora. Luego de este tiempo, el compuesto fue retirado y
las células fueron infectadas con el virus SARS-CoV-2 a una MOI de 0.1 por 1h.
Después de este tiempo, el remanente de virus que no logró ingresar a las células
fue retirado y reemplazado por medio de cultivo fresco y nuevas diluciones de cada
compuesto. Las células fueron cultivadas por 48h, al cabo de este tiempo, un
ensayo de MTT, descrito arriba, fue realizado para determinar la actividad antiviral.
Para este experimento se realizaron los siguientes controles: controles negativos
(células+DMEM) y controles positivos (células+DMEM+virus).
Para calcular la actividad antiviral se utilizó la siguiente fórmula:
% AAV= 100 x [(A-B) / (C-B)]
Donde A corresponde a la DO de las células infectadas y tratadas con el compuesto,
B a la DO de células infectadas sin tratamiento con los compuestos (control positivo
de infección) y C a la DO de células no infectadas (control negativo de infección).
Adicionalmente, la dilución más alta en la que se observó actividad antiviral
comparando células infectadas y tratadas con el compuesto vs células infectadas
sin tratamiento con los compuestos, y en la cual la citotoxicidad del desinfectante
fuera menor al 20%, fueron usadas para determinar el título del virus en un ensayo
de plaqueo.
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El ensayo de plaqueo, es una técnica considerada como gold standard para
determinar el título viral; por lo tanto, es la técnica de elección para determinar de
manera eficiente la reducción en el título viral y por tanto la actividad antiviral en
este tipo de experimentos.
Finalmente, los análisis estadísticos para todos los ensayos muestran la media con
la respectiva desviación estándar en cada dilución. Se realizaron pruebas
estadísticas paramétricas o no paramétricas, para encontrar diferencias entre las
condiciones de cada experimento. Un valor de p<0.05 fue considerado
estadísticamente significativo.
3. RESULTADOS
Los compuestos enviados al laboratorio del Grupo Inmunovirología presentaron una
consistencia difícil de homogenizar y mezclar con el medio acuoso; sin embargo, se
utilizaron todas las medidas y protocolos necesarios para asegurar la menor
variabilidad posible durante el procesamiento de los compuestos.
El estudio comenzó con la evaluación de la citotoxicidad de los compuestos,
haciendo diluciones en base 2, como lo sugirió el solicitante; sin embargo, los
compuestos fueron demasiado citotóxicos, mostrando valores superiores al 80% de
citotoxicidad. Por lo tanto, se procedió a realizar los ensayos de citotoxicidad con
dilución en base 10; los resultados se muestran a continuación.
Respecto al ensayo de viabilidad celular con el compuesto EX001-27M20, en la
figura 1 se puede observar que las diluciones 10-1 y 10-2, resultaron altamente
citotóxicas, con una viabilidad celular media del 15% y 12%, respectivamente.
Mientras que las diluciones iguales o superiores a 10-3 mostraron una viabilidad
celular media del 100%; por lo tanto, esta y diluciones posteriores, fueron
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seleccionadas para realizar los ensayos antivirales del compuesto EX001-27M20
(Figura 1).
El ensayo de viabilidad celular realizado con el compuesto EX002-27M20, mostró
que las diluciones 10-1, 10-2 y 10-3 fueron altamente citotóxicas con valores de
viabilidad celular media de 21%, 8% y 6%, respectivamente. Mientras que las
diluciones iguales o superiores a 10-4 alcanzaron niveles de viabilidad celular media
del 100%, lo que significa que dichas diluciones poseen muy baja o nula
citotoxicidad (Figura 1). Por lo tanto, las diluciones no citotóxicas que se pueden
evaluar para determinar la actividad antiviral del compuesto EX002-27M20, son las
diluciones iguales o superiores a 10-4.
Respecto al ensayo de actividad antiviral medido por MTT, usando el virus SARS-
CoV-2 con una MOI de 0.1, se puede observar en la figura 2 que el compuesto
EX001 en la dilución 10-3 alcanzó una actividad antiviral media de 10,7%, las demás
diluciones mostraron poca o nula actividad antiviral; además se observó una
diferencia estadísticamente significativa entre estas diluciones y el control positivo
de inhibición de la replicación viral usado en este experimento, la Cloroquina, la cual
mostró una inhibición media del 73% (Figura 2).
A partir del sobrenadante de la dilución 10-3 del compuesto EX001, obtenido en el
ensayo de actividad antiviral, se determinó el título del virus por ensayo de plaqueo.
Se puede observar que el título viral en presencia del tratamiento con el compuesto
fue en promedio de 3,25x105 UFP/mL, mientras que, en el control de virus sin
tratamiento, el título viral fue en promedio de 4,25x105 UFP/mL, lo que significa una
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inhibición del 25.3% de las partículas virales infecciosas de SARS-CoV-2 por el
compuesto EX001 (Figura 3).
El ensayo de actividad antiviral medido por MTT del compuesto EX002 mostró que
la dilución 10-4 alcanzó una actividad antiviral, con una media del 32,2%, las demás
diluciones del compuesto EX002 no mostraron actividad antiviral significativa; se
observó diferencia estadísticamente significativa entre estas diluciones y el control
positivo de inhibición, la Cloroquina, la cual mostró una inhibición media del 73%
(Figura 4).
A partir del sobrenadante de la dilución 10-4 obtenido en el ensayo de actividad
antiviral, se determinó el título del virus por ensayo de plaqueo. Se puede observar
que el título viral en presencia del compuesto EX002 fue en promedio de 2,25x105
UFP/mL, mientras que, en el control de virus sin tratamiento, el título viral fue en
promedio de 6x105 UFP/mL, lo que significa una inhibición del 62,5% de las
partículas virales infecciosas de SARS-CoV-2 (Figura 5).
4. CONCLUSION
Podemos concluir que los compuestos EX001 inhibe el 32,2% de las partículas
virales infecciosas de SARS-CoV-2; mientras que el EX002, inhibe el 62,5% de las
partículas virales infecciosas de SARS-CoV-2.
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Fotografía 1.
Compuestos enviados al laboratorio del Grupo Inmunovirología de la Universidad
de Antioquia.
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Figura 1.
Ensayo de viabilidad celular medido por MTT, en el que se muestra el porcentaje de
células vivas, después del tratamiento con las diferentes concentraciones de los
compuestos y posterior a 48h de cultivo celular. La gráfica muestra la media de cada
medición y la desviación estándar. Se realizaron 2 experimentos con 4 réplicas cada
uno.
10-1
10-2
10-3
10-4
10-5
10-6
10-1
10-2
10-3
10-4
10-5
10-6
0
25
50
75
100
125
Dilución de los compuestos
% d
e v
iab
ilid
ad
celu
lar
Citotoxicidad de los compuestos en células VERO E6
Ext001
Ext002
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10-3
10-4
10-5
10-6
CLQ
-20
0
20
40
60
80
100
% A
cti
vid
ad
An
tiv
iral
Actividad antiviral del compuesto Ex001 durante
la infección con el virus SARS-CoV-2
Diluciones del compuesto Ex001
Figura 2
Porcentaje de actividad antiviral calculada a partir del ensayo MTT de viabilidad
celular. La gráfica muestra el porcentaje de actividad antiviral del compuesto EX001
en las diferentes diluciones cuando se usó el virus SARS-CoV-2 a una MOI de 0.1.
La gráfica muestra la media de cada medición y la desviación estándar. Se
realizaron 2 experimentos con 4 réplicas cada uno. CLQ: Cloroquina, control positivo
de inhibición de la replicación viral.
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Figura 3.
Ensayo de plaqueo en el cual se muestran las placas formadas por el SARS-CoV-
2 obtenido del sobrenadante del control de virus sin tratamiento y del tratamiento
con el compuesto EX001, del ensayo antiviral. Se observan las diluciones desde 10-
1 hasta 10-4. El resultado se expresa en unidades formadoras de placa (UFP)/mL.
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10-5
10-6
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CLQ
-20
0
20
40
60
80
100
% A
cti
vid
ad
An
tiv
iral
Actividad antiviral del compuesto Ex002 durante
la infección con el virus SARS-CoV-2
Diluciones del compuesto Ex002
Figura 4.
Porcentaje de actividad antiviral calculada a partir del ensayo MTT de viabilidad
celular. La gráfica muestra el porcentaje de AAV del compuesto EX002 en las
diferentes diluciones cuando se usó el virus SARS-CoV-2 a una MOI de 0.1. La
gráfica muestra la media de cada medición y la desviación estándar. Se realizaron
2 experimentos con 4 réplicas cada uno. CLQ: Cloroquina, control positivo de
inhibición de la replicación viral.
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Figura 5.
Ensayo de plaqueo en el cual se muestran las placas formadas por el SARS-CoV-
2 obtenido del sobrenadante del control de virus sin tratamiento y del tratamiento
con el compuesto EX002, del ensayo antiviral. Se observan las condiciones sin diluir
y las diluciones desde 10-1 hasta 10-4. El resultado se expresa en unidades
formadoras de placa (UFP)/mL. CC: control de células sin infectar.
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Informe elaborado y revisado por: Wildeman Zapata Builes. Investigador Asociado.
Informe revisado por: Juan Carlos Hernández López. Investigador Asociado.
Informe revisado por: María Teresa Rugeles López. Coordinadora del Grupo
Inmunovirología.
Datos de contacto: Grupo Inmunovirología. Universidad de Antioquia. Calle 62 # 52-
59, torre 2, laboratorio 532. Medellín. Colombia. Tel: 2196482. E-mail: