NCh-ISO 22117-2013-043.pdf

PROYECTO DE NORMA EN CONSULTA PUBLICA - prNCh-ISO 22117

Vencimiento consulta pública: 2013.11.15 i

Microbiología de los alimentos para consumo humano y animal - Requisitos específicos y directrices para los ensayos de aptitud por comparaciones interlaboratorios

Preámbulo

El Instituto Nacional de Normalización, INN, es el organismo que tiene a su cargo el estudio y preparación de las normas técnicas a nivel nacional. Es miembro de la INTERNATIONAL ORGANIZATION FOR STANDARDIZATION (ISO) y de la COMISION PANAMERICANA DE NORMAS TECNICAS (COPANT), representando a Chile ante esos organismos.

Este proyecto de norma se estudió a través del Comité Técnico Análisis microbiológico de alimentos, para establecer los requisitos y las directrices para la organización de esquemas de ensayos de aptitud destinados al análisis microbiológico de: alimentos y bebidas, productos alimenticios para animales, muestreo ambiental en producción alimentaria y de manipulación de alimentos y las etapas primarias de producción.

Este proyecto de norma es idéntico a la versión en inglés de la Norma Internacional ISO/TS 22117:2010 Microbiology of food and animal feeding stuffs - Specific requirements and guidance for proficiency testing by interlaboratory comparison.

Para los propósitos de este proyecto de norma, se han realizado los cambios editoriales que se indican y justifican en Anexo F.

La Nota Explicativa incluida en un recuadro en cláusula 2 Referencias normativas y Anexo E, Bibliografía, es un cambio editorial que se incluye con el propósito de informar la correspondencia con Norma Chilena de las Normas Internacionales citadas en este proyecto de norma.

Los Anexos A, B, C y D no forman parte del proyecto de norma, se insertan sólo a título informativo.

Si bien se ha tomado todo el cuidado razonable en la preparación y revisión de los documentos normativos producto de la presente comercialización, INN no garantiza que el contenido del documento es actualizado o exacto o que el documento será adecuado para los fines esperados por el Cliente.

En la medida permitida por la legislación aplicable, el INN no es responsable de ningún daño directo, indirecto, punitivo, incidental, especial, consecuencial o cualquier daño que surja o esté conectado con el uso o el uso indebido de este documento.


Vencimiento consulta pública: 2013.11.15 1

Microbiología de los alimentos para consumo humano y animal - Requisitos específicos y directrices para los ensayos de aptitud por comparaciones interlaboratorios

0 Introducción

Los requisitos generales para la organización de esquemas de ensayo de aptitud de todo tipo se comunican a través de ISO/CASCO (Committe on Conformity Assessment) en ISO 17043. Además, existen directrices generales disponibles a través de la International Union of Pure and Applied Chemistry (IUPAC, ver [9]) y de International Laboratory Accreditation Cooperation (ILAC, ver [8]). No obstante, estas recomendaciones pueden no resultar aplicables directamente en todos los casos y se deberían interpretar de forma específica para los distintos sectores de laboratorios en los que se organizan esquemas de ensayos de aptitud. Por esta razón, se necesita un documento que establezca los criterios que debe cumplir un proveedor de esquemas de ensayo de aptitud (al igual que sus socios colaboradores) para ser reconocido como proveedor competente de esquemas de ensayo de aptitud para el análisis microbiológico. Se aplica especialmente a los requisitos técnicos específicos necesarios para manipular microorganismos vivos, como la estabilidad y homogeneidad de la muestra, así como la interpretación de los ensayos de presencia/ausencia (detección) no contemplados en un documento existente.

Los esquemas de ensayos de aptitud para los laboratorios se utilizan principalmente para evaluar el funcionamiento, en especial la veracidad (desviación) y en algunos casos la precisión, de los exámenes microbiológicos sobre alimentos en laboratorios específicos.

De forma adicional, los datos de estos esquemas de ensayos de aptitud se pueden utilizar para:

a) proporcionar información a las organizaciones responsables de la aceptación de laboratorios dentro de una organización oficial de control y para permitir un seguimiento continuado;

b) colaborar en la acreditación de los laboratorios en una estructura general de garantía de la calidad;

c) informar a los responsables de calidad de los laboratorios participantes como parte de los elementos educativos de la evaluación externa de la calidad sobre la veracidad (sesgo).

La información de los esquemas de ensayos de aptitud se pueden utilizar también para:

1) identificar posibles fuentes de error, en especial la desviación de un componente de incertidumbre, para mejorar el desempeño;

2) estimar la incertidumbre de la medición en los métodos de recuento, ver ISO/TS 19036 y los límites de detección en los métodos de presencia/ausencia;

3) demostrar la competencia del personal para desarrollar un examen microbiológico específico;



4) evaluar o validar un método determinado mediante el estudio de la veracidad y la precisión;

5) identificar la variabilidad entre laboratorios individuales;

6) asignar un valor “ideal” de un analito en un material para establecer un material de referencia.

Sin embargo, dichos aspectos no se incluyen específicamente en esta norma

Por lo tanto, los esquemas de ensayos de aptitud se organizan para cumplir ciertos criterios, y el programa de ensayos (frecuencia, número de muestras, número de repeticiones, etc.) deben cumplir los requisitos correspondientes al tipo de método utilizado y al producto analizado, para alcanzar el nivel de control deseado por todas las partes participantes.

1 Alcance y campo de aplicación

Esta norma establece los requisitos y las directrices para la organización de esquemas de ensayos de aptitud destinados al análisis microbiológico de:

a) alimentos y bebidas;

b) productos alimenticios para animales;

c) muestreo ambiental en producción alimentaria y de manipulación de alimentos;

d) las etapas primarias de producción.

Esta norma también es potencialmente aplicable para el examen microbiológico del agua, en los casos en los que se utiliza agua para la producción de alimentos o se considera un producto alimenticio por la legislación nacional.

Esta norma se relaciona con la organización técnica y la implementación de esquemas de ensayos de aptitud, así como el tratamiento estadístico de los resultados de los exámenes microbiológicos.

Esta norma está diseñada para ser utilizada con ISO/IEC17043 e ISO 13528 y aborda solamente las áreas en las que se necesitan detalles adicionales o específicos para los esquemas de ensayos de aptitud relacionados con los análisis microbiológicos, dentro de los campos indicados en el primer párrafo.

2 Referencias normativas

Los documentos siguientes son indispensables para la aplicación de esta norma. Para referencias con fecha, sólo se aplica la edición citada. Para referencias sin fecha se aplica la última edición del documento referenciado (incluyendo cualquier enmienda).

ISO 3534-1 Estadística - Vocabulario y símbolos - Parte 1: Términos estadísticos generales y términos empleados en el cálculo de probabilidades.

ISO 3534-2 Estadística - Vocabulario y símbolos - Parte 2: Estadística aplicada. ISO 5725-1 Exactitud (veracidad y precisión) de resultados y métodos de medición - Parte 1:

Principios generales y definiciones. ISO 5725-5 Exactitud (veracidad y precisión) de resultados y métodos de medición - Parte 5:

Métodos alternativos para la determinación de la precisión de un método de medición normalizado.



ISO 7218 Microbiología de los alimentos para consumo humano y alimentación animal - Requisitos generales y guía para el examen microbiológico.

ISO 13528 Métodos estadísticos utilizados en ensayos de aptitud mediante comparaciones interlaboratorios.

ISO/IEC 17043:2010 Evaluación de la conformidad - Requisitos generales para los ensayos de aptitud.

NOTA EXPLICATIVA NACIONAL

La equivalencia de las Normas Internacionales señaladas anteriormente con Norma Chilena, y su grado de correspondencia es el siguiente:

Norma Internacional Norma nacional Grado de correspondencia

ISO 3534-1 NCh2420/1:1998 La Norma Chilena NCh2420/1:1998 es una adopción idéntica

de la Norma Internacional ISO 3534/1:1993.

ISO 3534-2 NCh2420/2:1998 La Norma Chilena NCh2420/1:1998 es una adopción

idéntica de la de la Norma Internacional ISO 33534-2:1993.

ISO 5725-1 NCh2680/1:2002 La Norma Chilena NCh2680/1:2002 es una adopción

idéntica de la de la Norma Internacional ISO 5725-1:1994.

ISO 5725-5 No hay -

ISO 7218 NCh2047:1999 La Norma Chilena NCh2047:1999 es una adopción no

equivalente de la Norma Internacional ISO 7218:1996.

ISO 13528 No hay -

ISO/IEC 17043:2010 NCh-ISO 17043:2011 La Norma Chilena NCh-ISO 17043:2011 es una adopción

idéntica de la de la Norma Internacional ISO 17043.

3 Términos y definiciones

Para los propósitos de esta norma, se aplican los términos y definiciones dados en ISO 3534-1, ISO 3534-2, ISO 5725-1, ISO 13528, ISO/IEC 17043 y adicionalmente los siguientes:

NOTA 1 Algunos términos utilizados en el texto tienen un significado diferente en microbiología y en estadística, como por ejemplo, homogeneidad, heterogeneidad, ensayo, muestra o distribución. El contexto aclara si los términos hacen referencia a las muestras de ensayos microbiológicos o en las series de datos utilizadas en los análisis estadísticos.

NOTA 2 Algunos proveedores de ensayos de aptitud utilizan el término de evaluación externa de la calidad (EQA)1) para indicar esquemas de una aplicación más amplia a todas las áreas de actividad de un laboratorio y para un cometido educativo en particular. Los requisitos de esta norma abarcan las actividades de EQA que cumplen la definición de los ensayos de aptitud.

3.1 cepa de referencia: microorganismo obtenido directamente de una colección de cultivos oficial y definida como mínimo hasta un nivel de género y especie, catalogado y descrito según sus características y preferiblemente procedente de agua o alimentos, según corresponda

[ISO/TS 11133-1:2009, 3.3.2]

3.2 flora acompañante: microorganismos incluidos en una muestra de un ensayo de aptitud que se puede introducir para mimetizar o competir con el microorganismo objetivo

1) En inglés: External Quality Asessment.



3.3 microorganismos objetivo: microorganismos que son el analito designado para una muestra de un ensayo de aptitud

NOTA El término Target organisms también se conoce como organismos diana.

3.4 porcentaje de recuperación: proporción del valor asignado de organismo objetivo recuperada por el participante

NOTA 1 El porcentaje de recuperación se calcula multiplicando por 100 el número de unidades formadoras de colonias (cfu)2)

recuperadas por volumen o por masa.

NOTA 2 El porcentaje de recuperación puede ser significativamente menor que 100% cuando se producen efecto matriz y de flora competitiva sobre una muestra de un ensayo de aptitud.

4 Propósito y diseño del esquema

4.1 Generalidades

Los requisitos generales para el diseño de esquemas ensayos de aptitud se indican en ISO/IEC 17043, en esta cláusula se mencionan sólo las áreas que requieren una consideración especial en los esquemas de ensayos de aptitud microbiológicos dentro del marco de dichos principios generales.

4.2 Objetivos del esquema

Los objetivos básicos de cualquier esquema de ensayos de aptitud es proporcionar información que permita que los laboratorios obtengan confianza en la fiabilidad de sus resultados.

Los requisitos generales de un plan documentado para un esquema de ensayos de aptitud se tratan en ISO ISO/IEC 17043:2010, 4.4.1.3 y el plan debería incluir también una referencia global a toda la legislación aplicable. En Anexo A se muestra un ejemplo del plan de un esquema de examen típico en microbiología de los alimentos.

Los estudios necesarios para establecer un nuevo esquema de ensayos de aptitud son extensivos y se deben definir con claridad en los objetivos del esquema. Se debería incluir como mínimo los requisitos relacionados en cláusula 5. Se deberían establecer también en el diseño del esquema, los requisitos para verificar series individuales de ensayo, incluidos los ensayos de estabilidad y homogeneidad, y deben ser apropiados para los objetivos del esquema.

4.3 Los requisitos generales referente a las instalaciones de los laboratorios adecuados para cubrir todos los aspectos de los esquemas de ensayo de aptitud, se indican en ISO/IEC 17043:2010, 4.3.1, y los requisitos de seguridad en ISO/IEC 17043:2010, 4.6.2.4.

En los esquemas microbiológicos los proveedores deben poseer una capacidad política documentada que alerte a los participantes sobre los riesgos, y que asegure que se proporcionan los consejos de seguridad adecuados (ver cláusula 7). Por ejemplo, los laboratorios de microbiología de los alimentos deben poseer instalaciones donde trabajar con microorganismos de categorías de riesgo 1, 2 y 3, según se necesite (ver ISO 7218:2007, 3.2).

4.4 Selección de las matrices de ensayo

Los requisitos generales para documentar las matrices de ensayo en el plan del esquema se indican en ISO/IEC 17043, 4.4.1.3 y la selección de las matrices para simular los tipos de muestra de rutina en ISO/IEC 17043:2010, 4.4.2.3.

2) En inglés: colony forming units.



Se debería indicar las razones de la elección de un tipo de matriz, por ejemplo, para proporcionar unos niveles de estabilidad y homogeneidad que son adecuados para el propósito al que está destinado el esquema.

La descripción de los objetos de ensayo debe especificar la matriz de la muestra (natural o simulada); si presenta una contaminación natural o artificial; el origen y el país de procedencia para cumplir con las normativas de transporte internacionales; y el método de conservación utilizado, por ejemplo, liofilizado o secado al aire.

4.5 Información sobre los métodos de ensayo utilizados por el proveedor de ensayos de aptitud

Los requisitos generales para los métodos que va a utilizar un proveedor de ensayos de aptitud se indican en ISO/IEC 17043:2010, 4.4.1.3.

Si el esquema está dirigido a uno o más ensayos especificados o requeridos por la legislación, los ensayos de control de calidad de rutina sobre las muestras del esquema (es decir, la homogeneidad y la estabilidad) se deben realizar de acuerdo a los métodos estipulados en dicha legislación, indicando este hecho (ISO/IEC 17043:2010, 4.5.1).

Se debe recomendar encarecidamente, que los participantes utilicen sus propios métodos de rutina, pero cuando se realicen ensayos de acuerdo a la legislación se deben proporcionar algunas indicaciones, por ejemplo, una referencia a los métodos ISO, a los textos legislativos o a publicaciones sometidas a revisión externa (ISO/IEC 17043:2010,4.5.1).

4.6 Diseño estadístico

Los requisitos generales de los diseños estadísticos se indican en ISO/IEC 17043:2010, 4.4.4.

Un esquema del diseño estadístico para los esquemas de ensayos de aptitud en microbiología debe indicar que los ensayos estadísticos que se van a utilizar se ven afectados por el nivel de homogeneidad del material de ensayo, que, a su vez, se ve afectada por la variación aleatoria en la distribución de los microorganismos.

Excepto para números muy bajos, se suele esperar una distribución log-normal en los datos de los ensayos cuantitativos. Se deben utilizar métodos de análisis estadísticos adecuados para dichos datos [ver ISO/IEC 17043:2010, B 3.1.4, ítem d)]

Cuando se necesite evaluar bajos niveles, en métodos de ensayos cuantitativos (por ejemplo, en examen de bebidas o de agua), resulta más aplicable un modelo de Poisson aleatorio, ya que la variación en el número de organismos entre distintas unidades de material llega a ser relativamente grande y puede enmascarar variaciones en el funcionamiento.

La homogeneidad de la muestra debe ser suficiente, normalmente, como para no influir de forma significativa sobre la variación observada entre laboratorios.

Los ensayos de recuento semicuantitativos y los ensayos de detección cualitativa requieren métodos estadísticos diferentes para analizar los datos que se discuten con mayor profundidad en 8.3 y 8.4.

El plan del esquema debe aclarar las distinciones entre los análisis de rendimiento para métodos de detección y los de recuento de microorganismos objetivo.



5 Requisitos técnicos y directrices sobre el contenido y el diseño de las muestras

5.1 Niveles de organismos objetivo

Los organismos objetivo se deben proporcionar a unos niveles adecuados para mostrar que los métodos de ensayo se ajustan a los objetivos y que reflejan unos niveles que se encuentran con probabilidad en las matrices ensayadas (ver ISO/IEC 17043:2010, 4.4.2.3). Cuando el objetivo son bacterias patogénicas, los niveles también deberían considerar y reflejar los niveles que puedan suponer un riesgo probable para la salud humana y, cuando corresponda, los límites descritos por criterios microbiológicos.

NOTA No siempre se conoce con exactitud el nivel que supone un riesgo sobre la salud humana, y depende de la susceptibilidad de cada individuo. El objetivo de un examen de patógenos es prevenir la enfermedad, así como detectar patógenos presentes en niveles muy bajos, antes de que dichos patógenos puedan alcanzar un nivel mayor.

En los métodos cuantitativos (de recuento) el nivel del microorganismo objetivo debe ser adecuado para los niveles presentes de forma rutinaria y en base a las especificaciones reglamentarias aplicables a las matrices de muestras utilizadas. En ocasiones, se debería utilizar también la diana a unos niveles próximos al límite de cuantificación de los métodos de rutina para someter a prueba el comportamiento de los participantes a lo largo de todo el rango de aplicación del método. Sin embargo, las muestras no se deberían enviar con un nivel de organismos tan bajo que, cuando se realizan las diluciones habituales, el número medio esperado de organismos en una muestra sea menor que 10 colonias por placa.

En los métodos cualitativos (de detección) se requiere por lo general que los organismos objetivo estén a un nivel suficientemente bajo como para servir como prueba válida de la metodología y para proporcionar datos para los ejercicios de validación dirigidos a establecer o comprobar los límites de detección en los laboratorios participantes individuales.

5.2 Fuentes, caracterización y trazabilidad de los organismos

Las características de los organismos objetivo se deben establecer con anterioridad a su uso, para poder determinar con seguridad su comportamiento, de forma especial en esquemas en los que se permite que los participantes adopten metodologías diferentes.

Se deberían considerar, tanto cepas típicas como atípicas e incluirse en el programa del esquema para poner a prueba el comportamiento del laboratorio.

Se deberían utilizar cepas de referencia reconocidas procedentes de colecciones internacionales cuando sean las más adecuadas para el objetivo del esquema; no obstante, los aislados de laboratorio o las cepas "salvajes" aisladas de las matrices utilizadas en los esquemas de ensayo de aptitud tienen utilidad para reflejar de forma más exacta las situaciones de rutina.

Cuando se utilicen, deberían estar suficientemente caracterizadas conforme a los métodos de referencia de las correspondientes Normas Internacionales, para asegurar que los organizadores detectan todo tipo de reacciones atípicas antes de su uso.

En todos los casos, los organismos utilizados en las muestras de los esquemas de ensayos de aptitud deberían ser trazables hasta la colección de cultivos correspondiente o a los datos de caracterización válidos conservados por los organizadores.



Bajo determinadas circunstancias, no es posible utilizar cultivos de referencia o materiales procedentes de colecciones reconocidas internacionalmente o cepas de laboratorio cultivadas, por ejemplo, en esquemas de ensayos de aptitud para organismos no cultivables como los norovirus humanos. En estas circunstancias, se puede utilizar un material clínico para contaminar una matriz de ensayo de forma artificial, mediante inmersión, spray o, en el caso de los moluscos bivalvos, mediante bioacumulación. El método de contaminación artificial debería ser lo más parecido posible a la ruta "natural" de contaminación. Se debería prestar un cuidado extremo cuando se manipula material clínico humano, muestras de heces o de vómito, y se deberían rastrear en busca de otros patógenos antes de su uso. Los virus objetivo se deberían caracterizar de forma completa hasta el nivel de cepa mediante reacción de la polimerasa en cadena convencional seguida de secuenciación.

5.3 Flora acompañante y competitiva

Se debe escoger la flora completa de las muestras, contaminadas de forma natural o artificial, para determinar la capacidad de los participantes para detectar y/o enumerar los organismos objetivo en presencia de flora de fondo no-objetivo (típica de la matriz de la muestra) y los presuntos organismos objetivo que, a falta de ensayos de confirmación adecuados, pueden causar resultados falsos positivos.

Todas las cepas utilizadas para simular a la flora de base deben cumplir los requisitos de 5.2 respecto a caracterización y trazabilidad. En las muestras contaminadas de forma natural, se debe determinar el efecto de toda la flora de base sobre los organismos objetivo.

5.4 Efectos y selección de la matriz

Se deben evaluar todas las matrices antes de su uso, para comprobar los efectos de las floras objetivo y de base, por ejemplo, cuando las matrices reducen la tasa de recuperación de los organismos contaminados artificialmente.

Se debe alertar a los participantes sobre la naturaleza de la matriz alimentaria cuando se conozca que dichas matrices afectan negativamente la tasa de recuperación de microorganismos (por ejemplo, las que unen y retienen células, como los materiales grasas) o tienen propiedades bactericidas o bacteriostáticas. Se deben incluir procedimientos de preparación adecuados y validados como información de los participantes.

Las matrices de muestras utilizadas en esquemas de ensayos de aptitud microbiológicos se esterilizan con frecuencia, aunque no necesariamente, de manera previa a su uso. Cuando se distribuyen muestras naturales no esterilizadas, los organizadores deben determinar el efecto de la microflora de base sobre las muestras.

6 Verificación de las muestras por parte del proveedor

6.1 Generalidades

Los requisitos generales para la verificación de las muestras se indican en ISO/IEC 17043 e ISO 13528 (para mayor información, ver Bibliografía, [9]); esta cláusula amplía los requisitos específicos y los problemas de los ensayos de homogeneidad y estabilidad en materiales que contienen microorganismos vivos.

6.2 Ensayo de homogeneidad de las muestras. Consideraciones generales

(Ver ISO/IEC 17043:2010, 4.4.3 y cláusula B.5).

Los ensayos de aptitud pueden suponer la preparación de un material de ensayo a granel, que se subdivide después en porciones individuales, tan similares unas a otras como sea posible, para su distribución a los participantes. Alternativamente, las porciones de ensayo se pueden inocular de forma individual para su distribución.



Sea cual sea el método de preparación utilizado, se debe comprobar la homogeneidad del material de ensayo, normalmente antes, pero también a la vez, que se ensayan materiales perecederos inestables.

Se debería realizar un ensayo de homogeneidad sobre cada serie de muestras, basado en principios estadísticos relevantes (ver ISO/IEC 17043:2010, 4.4.3.2 y cláusula B.5). Dichos ensayos se muestran en ISO 13528 o alternativamente en Anexo B.

También es necesario ensayar la homogeneidad si los materiales se van a almacenar durante períodos de tiempo prolongados, para asegurar que los criterios se siguen cumpliendo antes de su uso. El número de muestras que se va a ensayar de cada lote debería ser también, suficiente para obtener información actualizada sobre la homogeneidad del lote, se recomienda utilizar 10 muestras (analizadas en duplicado si es necesario).

Un material de ensayo, de homogeneidad insuficiente, se puede llegar a utilizar en una ronda de ensayos de aptitud (ver ISO/IEC 17043:2010, 4.4.3.1, Nota 3) siempre que se utilicen principios estadísticos adecuados que tengan en cuenta la mayor varianza entre las muestras (ver ISO 13528). Se debería utilizar un plan estadístico para materiales heterogéneos, que incluya réplicas de análisis de varias muestras (ver ISO 5725-5) para minimizar los efectos de la falta de homogeneidad sobre la evaluación del comportamiento de los participantes.

6.3 Ensayo de homogeneidad para muestras cuantitativas (recuento)

Los requisitos generales y los procedimientos de ensayo de la homogeneidad de los materiales para ensayos de aptitud cuantitativos se indican en ISO/IEC 17043:2010, 4.4.3 y cláusula B.5 y en ISO 13528.

Los materiales que muestran una variación entre unidades suficientemente grande como para afectar significativamente la evaluación del comportamiento de un laboratorio no se deberían utilizar en estudios interlaboratorios, salvo que se apliquen métodos de procesamiento de datos y requisitos especiales, como por ejemplo, en el caso de números pequeños de microorganismos en el agua de consumo y otras muestras.

El criterio de "suficientemente homogéneo" viene definido por los requisitos de la comparación interlaboratorios (ver ISO 13528 y Anexo B). Sin embargo, en general se considera suficientemente homogéneo un material en el que la desviación estándar entre unidades (en la escala transformada adecuada) es menor o igual que 0,3 , donde es la desviación estándar ideal utilizada para evaluar el comportamiento de los laboratorios (ver ISO 13528).

Cualquier otro ensayo alternativo de homogeneidad debería cumplir los criterios siguientes (ver Bibliografía [9]):

a) la probabilidad de rechazar un material de ensayo suficientemente homogéneo debería ser menor o igual que 5%;

b) la probabilidad de rechazar un material de ensayo en el que la variación entre unidades es de 1,5 , siendo la variación entre laboratorios aceptable (expresada como desviación estándar ideal), es mayor o igual

que 80%.

El 80% de probabilidad de rechazar un material en el que la variación entre unidades es de 1,5 se basa en estudios de simulación de análisis por duplicado de 10 unidades de ensayo utilizando un método con una desviación estándar analítica de 0,50 (es decir, de 0,125 unidades logarítmicas) y un valor crítico para (ver Anexo B) que cumpla el criterio a) del párrafo anterior. Representa lo que se puede conseguir con una cantidad razonable de esfuerzo analítico.



Los ensayos de homogeneidad se basan en estimaciones de la varianza entre unidades y de la varianza analítica (repetibilidad) obtenida en condiciones de repetibilidad. En Anexo B se indican métodos adecuados para estudiar dicha variación.

La varianza analítica (repetibilidad) se debería estimar mediante réplicas de análisis de las suspensiones iniciales procedentes de las porciones de ensayo (ver Bibliografía [15] y [16]). Esta varianza analítica también se puede calcular a partir del número de colonias contadas y de la precisión de los materiales analíticos utilizados (ver Bibliografía [10]).

En microbiología, la varianza entre unidades se debe estimar bajo condiciones de repetibilidad (simultáneamente). Si resulta imposible, la varianza entre unidades incluye la repetibilidad interlaboratorio y puede ocasionar tal vez un rechazo incorrecto de un material satisfactorio.

Cuando el número de colonias contadas es suficientemente alto (más de 35 a 40 colonias por placa), la desviación estándar analítica, , suele resultar satisfactoria.

0,5

donde es la desviación estándar ideal. Se debería utilizar el ensayo de homogeneidad suficiente propuesto en Bibliografía [11] (ver Anexo B). Si el número de colonias contadas es bajo (menos de 35 a 40 colonias por placa), se recomienda el ensayo (ver Anexo B).

Cuando se proporcionan réplicas de unidades de ensayo a los laboratorios participantes, el proveedor debería examinar la variabilidad entre unidades obtenida por los participantes, para determinar la homogeneidad del material. Aunque esta variabilidad incluye la reproducibilidad interlaboratorios, cuanto mayor sea el número de laboratorios participantes mayor será el poder estadístico del análisis y puede ser un buen indicador para rondas sucesivas.

Cuando el número de colonias contadas es bajo (menor que 20), la varianza analítica (repetibilidad) es alta. En ese caso, el proveedor debería recomendar que los laboratorios participantes repliquen los recuentos de las porciones de ensayo para satisfacer la condición (ver ISO 13528):

√0,3

en que:

= desviación estándar de la repetibilidad;

= desviación estándar ideal;

= número de réplicas.

Si no resultara posible, el comportamiento del laboratorio se debería considerar con prudencia.

Cuando el material de un ensayo de aptitud contiene un número reducido de ufc (menor que 20) se debe medir la variación entre unidades (es decir, entre réplicas de muestras) para demostrar que no sobrepasa la variación aleatoria (de Poisson) y proporcionar una evaluación significativa. El ensayo del índice de dispersión realizado sobre muestras (donde es un mínimo de 10) no debería sobrepasar el valor para una probabilidad de 0,05.



6.4 Ensayo de homogeneidad para métodos cualitativos

En los ensayos de homogeneidad para métodos cualitativos (presencia/ausencia) se aplican los mismos principios, pero se requiere hacer una consideración especial cuando el nivel de contaminación artificial es bajo (ver 8.4).

La homogeneidad de las muestras cualitativas se puede estudiar mediante un recuento del contaminante añadido. También se puede determinar el nivel de contaminación utilizando la técnica del número más probable, NMP3). Si se puede realizar el recuento, se pueden utilizar los ensayos de homogeneidad descritos en 6.3, en función de cómo se ha realizado la contaminación artificial y cómo se realiza el recuento del contaminante añadido.

6.5 Ensayo de estabilidad realizado por el proveedor

6.5.1 Generalidades

Las muestras que se van a utilizar en ensayos de aptitud deben ser estables al menos desde el momento de su preparación (por parte del proveedor) hasta la fecha del estudio o el final del período de tiempo permitido (ver ISO/IECD 17043:2010, 4.4.3).

Si se utiliza siempre el mismo tipo de muestra con la(s) misma(s) cepa(s) de ensayo, es suficiente realizar solamente una comprobación (por ejemplo, después de la preparación y en la fecha del estudio) sobre las muestras subsiguientes.

El proveedor debería examinar también los resultados obtenidos por los laboratorios participantes, para comprobar la estabilidad del material durante el período permitido para el estudio.

6.5.2 Estabilidad referida a las condiciones de almacenamiento

Para las muestras estables que se almacenan siempre a bajas temperaturas (por ejemplo -70°C, -20°C, 5°C), la estabilidad se debe determinar comprobando el nivel de analito y la homogeneidad de cada lote a intervalos regulares a lo largo de su período de almacenamiento. El período mínimo del ensayo de estabilidad debería corresponder al tiempo entre la preparación de los materiales y la fecha indicada o el período de análisis.

La frecuencia de ensayo depende de la información ya disponible para el lote de muestras y el período de tiempo total a lo largo del cual se requiere información sobre la estabilidad. Si el tiempo total de almacenamiento es, por ejemplo, solamente de dos semanas, puede ser necesario hacer un ensayo cada dos días, pero si el tiempo de almacenamiento requerido es de un año puede ser suficiente un ensayo mensual. Para lotes grandes de muestras, se debería ensayar en cada ocasión un mínimo de tres muestras, para mostrar la estabilidad continuada a lo largo de todo el lote (ver ISO 13528, Anexo B). Cualquiera que sea la frecuencia de ensayo, se debe justificar y validar como aceptable por los organizadores del esquema.

6.5.3 Estabilidad referida a las condiciones de transporte

Además de la información sobre estabilidad referida a las condiciones de almacenamiento, recogida a lo largo de los estudios de validación para un esquema nuevo, es importante ensayar el efecto de las "condiciones forzadas" sobre las muestras, debidas, por ejemplo, a tiempos de transporte prolongados a temperaturas elevadas (ver ISO/IEC 17043, 4.6.3.2).

3) En inglés: MPN, Most Probable Number.



Se debe realizar en primer lugar un ensayo de estabilidad a diferentes temperaturas para reflejar las condiciones de transporte en el "caso más desfavorable" y con el máximo retraso posible, para ensayar el efecto de dichas condiciones forzadas sobre las muestras de ensayo. Por ejemplo, las muestras de un lote se almacenan a la temperatura de almacenamiento indicada (por ejemplo -20°C), pero también a 5°C, 15°C y 25°C. Todos los días se analizan cinco muestras mantenidas a cada temperatura de almacenamiento durante un período total de una o dos semanas.

El diseño de dichos experimentos de estabilidad es variable, pero debería ser el adecuado para obtener información sobre el efecto de las distintas temperaturas de almacenamiento sobre las muestras, y para establecer el límite de temperatura máxima de recepción por parte del laboratorio. La información recogida se puede utilizar para escoger las condiciones óptimas de distribución de las muestras del esquema, por ejemplo, si es necesario refrigerar las muestras durante el transporte con hielo seco o con paquetes de hielo, o si resulta aceptable la distribución a temperatura ambiente.

En el caso de distribuciones donde la temperatura es crítica, que requieren una refrigeración controlada con criterios de aceptación estrictos, como los esquemas relacionados con el ensayo legislado de E. coli en moluscos bivalvos, se recomienda incluir registradores de temperatura individuales en cada caja de muestras para registrar la temperatura de las muestras en tránsito. La comprobación de los datos de temperatura puede permitir que el proveedor del esquema pueda explicar unos resultados anómalos emitidos por los participantes.

7 Manipulación de las muestras

7.1 Generalidades

Los requisitos sobre la manipulación de las muestras en general se describen en ISO/IEC 17043; y en esta cláusula solamente se ofrece información adicional relacionada con las muestras microbiológicas.

7.2 Instrucciones a los participantes

En cada estudio, todos los laboratorios participantes deben recibir un conjunto claro de instrucciones que incluya:

a) las condiciones de almacenamiento para las muestras de todos los tipos, en especial la información sobre temperatura de almacenamiento, que debería aparecer también en el exterior del embalaje de transporte;

b) la temperatura máxima de las muestras al ser recepcionadas por parte del laboratorio participante, cuando corresponda;

c) instrucciones sobre cómo manipular las muestras, si se necesita reconstituir, diluir o realizar otro tipo de procesamiento sobre las muestras, se debería describir con claridad para cada serie y tipo de muestras:

d) documentos de datos de seguridad adecuados, que se deberían incluir dentro de cada distribución (en Anexo D se muestra un ejemplo del grado de detalle requerido);

e) otras instrucciones suplementarias, como:

- las fechas límite en las que se deberían realizar los exámenes y enviar los resultados a los organizadores;

- el (los) método(s) de examen (prescritos o a elección del participante, según corresponda);

- cómo proporcionar el informe de resultados a los organizadores, en particular las unidades de medida;

- los organizadores pueden solicitar detalles sobre los materiales, métodos, condiciones de incubación, etc. en plantillas de informe, en este caso, se deberían proporcionar instrucciones para completar dichas plantillas.



8 Evaluaciones de rendimiento

8.1 Generalidades

Siempre que sea posible, los principios estadísticos utilizados para evaluar el comportamiento de los esquemas de ensayos de aptitud se deberían basar en los indicados en ISO 13528 e ISO 17043:2010 (ver Bibliografía [9] para mayor información), aunque los esquemas de ensayos de aptitud de microbiología pueden adoptar procedimientos diferentes de los utilizados normalmente en otros sectores, si resultan adecuados para sus esquemas en particular.

8.2 Consideraciones preliminares

Los ensayos de aptitud suponen la distribución regular de materiales de ensayo a los laboratorios participantes para que ellos examinen mesurandos específicos (en la mayoría de los casos, microorganismos) en los materiales de ensayo. Los resultados del examen se comparan con los de otros participantes. Los ensayos de aptitud suponen por consiguiente una forma independiente de ensayar y comparar el comportamiento individual.

Un comportamiento satisfactorio mantenido en rondas de ensayos de aptitud puede proporcionar confianza a los participantes sobre los procesos de sus laboratorios, incluidos los métodos de ensayo, el entrenamiento de los analistas, el equipamiento, los reactivos, los procedimientos de control de la calidad, la interpretación de los resultados y las técnicas de emisión de informes.

Sin embargo, unos resultados no satisfactorios implican que el comportamiento de un participante individual es débil en comparación con el valor consenso, lo cual puede hacer surgir múltiples preguntas. Entre ellas están: ¿eran iguales todas las muestras de ensayo?, ¿cómo trabajaron otros participantes?, ¿la metodología puede haber distorsionado los resultados? y ¿se han interpretado correctamente los resultados? Por lo tanto, los organizadores de esquemas deberían emplear sistemas adecuados de evaluación del comportamiento para ayudar a los participantes a resolver dichas preguntas.

Hay muchas formas diferentes de interpretar los datos de los ensayos de aptitud, pero los métodos de interpretación deben ser objetivos.

La mayoría de los participantes que forman parte de esquemas de ensayos de aptitud microbiológicos no están familiarizados con la estadística y deben confiar en que los procedimientos utilizados por los organizadores de esquemas de ensayos de aptitud sean robustos.

Se deben abordar las siguientes consideraciones sobre los principios estadísticos aplicados:

a) la validez;

b) una información explicativa para los participantes;

c) los motivos de la selección;

d) la consistencia.

Se debe proporcionar una información clara y no sesgada a los participantes, que permita la autoevaluación e interpretación de los resultados y que maximice los beneficios de la participación.



8.3 Métodos cuantitativos

8.3.1 Generalidades

El diseño estadístico para los esquemas de ensayos de aptitud de métodos de recuento en microbiología está relacionado con el grado de homogeneidad del material de ensayo, que a su vez se ve afectado por la variación aleatoria en la distribución de los organismos. Además, es probable que aparezcan diferencias sustanciales entre los participantes sobre la precisión requerida o esperada en un ensayo.

La elección del método estadístico debe considerar los factores referidos en 8.1 y 8.2, junto con otras consideraciones, como el número de participantes de un esquema en concreto. Los parámetros que contribuyen a decidir qué ensayos estadísticos se van a utilizar se deberían dejar establecidos. Por ejemplo, los esquemas especializados pueden tener menos de 30 participantes; los resultados de 30 participantes se pueden analizar de forma diferente que los esquemas más grandes, por ejemplo, de más de 100 participantes.

El método de análisis estadístico escogido debe ser adecuado, no sólo para el número de participantes que realizan un determinado ensayo, sino también para el método utilizado. Por ejemplo, los resultados de un ensayo que utiliza métodos de recuento de colonias se analizan de forma distinta que los métodos que necesitan determinar el NMP, debido a que la variación inherente al método de NMP tiende a ser mayor que la de los métodos de recuento de colonias. De hecho, se pueden necesitar distintos parámetros estadísticos para evaluar el comportamiento de los participantes para distintos ensayos dentro de un mismo esquema (ver ISO/IEC 17043:2010, 4.5.2). Dicha información se debe establecer en los documentos del diseño del esquema y se deben hacer referencia a criterios microbiológicos aceptados de forma universal en el plan del esquema.

Los análisis estadísticos adecuados y la asignación de una calificación a los participantes está señalada en ISO/IEC 17043, Anexo B.

8.3.2 Distribución de los datos

Cuando se repite varias veces un ensayo de recuento bajo condiciones de repetibilidad, se esperaría que la distribución de la frecuencia de los resultados siguiera una forma de campana, denominada distribución normal.

Los recuentos microbiológicos suelen seguir una distribución log-normal y los datos se convierten a su logaritmo en base 10 para obtener una curva de distribución normal. Sin embargo, si el número de bacterias es reducido se puede aplicar directamente el valor del recuento o su transformación a la raíz cuadrada.



Aunque el material sometido a ensayo es el mismo, los resultados no son todos idénticos debido a que se espera que se vayan a producir numerosas variaciones pequeñas independientes durante las distintas manipulaciones que supone la realización de los ensayos.

En los ensayos de aptitud los ensayos no se suelen realizar en condiciones de repetibilidad ni incluso de reproducibilidad. Los ensayos se desarrollan por parte de analistas distintos, en distintos lugares y en momentos diferentes, utilizando una gran variedad de equipos, medios, reactivos y métodos analíticos, lo cual resulta en una variabilidad adicional que se podría describir como condiciones de "superreproducibilidad" o "metarreproducibilidad", ya que el término reproducibilidad se utiliza normalmente en el contexto de un solo método.

A pesar de dichas variaciones en las condiciones de ensayo, se suele observar una distribución (log)-normal de los resultados y se debería utilizar los principios estadísticos adecuados a las distribuciones (log)-normales para interpretar los datos, siempre que la distribución sea aproximadamente simétrica y unimodal.

Si la distribución de datos no presenta una apariencia (log)-normal, se deberían determinar las posibles razones y los datos se deberían interpretar en concordancia utilizando otros ensayos adecuados.



8.3.3 Determinación del valor asignado

El objetivo de los ensayos de aptitud es evaluar el grado de capacidad con que cuentan los participantes para conseguir el resultado "correcto". Sin embargo, en muchos esquemas de ensayo de capacitación no es posible conocer el resultado "correcto", ya que numerosos analistas pueden examinar el mismo material de ensayo y cada uno proporcionar un resultado ligeramente diferente.

Por el contrario, se debería hacer una estimación del valor "correcto" o "verdadero", al que se hace referencia como "valor asignado". El valor asignado se puede determinar de varias maneras, como se describe en ISO/IEC 17043:2010, B.2 e ISO 13528.

El método más habitual en los esquemas de ensayos de aptitud microbiológicos es el valor consensuado entre los laboratorios participantes. El valor asignado se determina a partir de la media robusta o la mediana de los resultados de todos los participantes. El uso de métodos robustos tiene por objeto minimizar la influencia de los valores discrepantes de forma que dichos resultados no se necesitan eliminar de la serie de datos porque los discrepantes "verdaderos" pueden ser difíciles de detectar.

El valor asignado presenta una incertidumbre mayor que otros métodos, lo cual se toma en consideración cuando se evalúa el comportamiento. El valor asignado se considera acertado porque los resultados de todos los participantes contribuyen a su cálculo.

Si se obtiene una mediana global baja cuando se establecen los valores asignados a partir del consenso de los participantes (por ejemplo, porque un gran número de participantes ha encontrado dificultades en aislar o identificar un organismo en particular), los organizadores del esquema deberían discutirlo, de forma que el comportamiento de los participantes cuyos resultados no se han visto afectados se juzguen de forma correcta.

8.3.4 Incertidumbre del valor asignado

El valor asignado representa la mejor estimación del valor real. Viene acompañado de una incertidumbre normalizada que indica el nivel de confianza de esta estimación. Si la incertidumbre normalizada del valor asignado es demasiado grande en comparación con la desviación estándar de la serie de ensayos, algunos participantes recibirán evaluaciones de aviso y de acción, no por motivo de su comportamiento, sino por la gran incertidumbre del valor asignado.

Por consiguiente, se deberían establecer los criterios de aceptación de un valor asignado en términos de su incertidumbre. Existen muchos métodos para estimar esta incertidumbre y determinar la aceptabilidad, que se describen en ISO 13528.

8.3.5 Métodos para evaluar el comportamiento

El organizador de un esquema de ensayos de aptitud debe determinar el valor asignado y evaluar en qué magnitud el (los) resultado(s) de cada participante individual se desvía(n) del valor asignado en comparación con los resultados de todos los demás participantes. Por consiguiente, el comportamiento de un participante no se juzga respecto al resultado "correcto" sino respecto a la estimación estadística del resultado "correcto" obtenido a partir de todos los datos sometidos. Cuando mayor sea el número de datos, mayor probabilidad de que sea más exacta la estimación estadística.

Los métodos habituales de evaluar el comportamiento y asignar calificaciones se detallan en ISO/IEC 17043:2010, cláusula B.3 e ISO 13528.



8.3.6 Uso de los índices-z

8.3.6.1 Generalidades

Un método habitual y ampliamente aceptado utilizado en los ensayos de aptitud es el sistema del índice-z, ya que es relativamente sencillo de calcular e interpretar (ver ISO/IEC 17043:2010, cláusula B.3). El índice-z indica cuántas desviaciones estándar se aleja de la media un valor determinado, es decir un índice-z de 2 representa a valor situado a 2 de la media, donde es la desviación estándar.

Como se representa en Figura 1, los datos con una distribución normal estandarizada contienen un 95% de sus valores dentro de un intervalo de 2 veces alrededor de la media, y un 99,7% dentro de un intervalo de 3 . Los resultados con un índice-z mayor que 2 se consideran por lo tanto cuestionables debido a que cabe esperar que el 5% de las medidas correctas muestren esa diferencia respecto al valor asignado. Los resultados con un índice-z mayor que 3 se consideran no satisfactorios debido a que se espera que solamente un 0,3% de las medidas correctas muestren esa diferencia respecto al valor asignado (ver ISO/IEC 17043:2010, cláusula B.4).

8.3.6.2 La desviación estándar objetivo para los cálculos de índice-z

El cálculo de índice-z utiliza un valor ideal de desviación estándar. Esta desviación estándar ideal define la escala de variación aceptable entre laboratorios para un ensayo en particular. Se debería utilizar la misma desviación estándar ideal a lo largo de rondas de ensayo sucesivas del ensayo de aptitud, de forma que las calificaciones sean comparables de serie a serie. Hay varios métodos para establecer la desviación estándar ideal, detallados en [9], ver ISO/IEC 17043:2010, cláusula B.3 e ISO 13528.

8.3.6.3 Resultados múltiples en sistemas de índice-z

Las diferencias entre los resultados de los participantes provienen de la variación entre laboratorios así como de la variación entre laboratorios. La variación dentro de un laboratorio o varianza entre laboratorios es la variación entre medidas realizadas en el mismo laboratorio sobre la misma muestra y es una característica inherente de los exámenes microbiológicos. La variación entre laboratorios se mide mediante la varianza de la repetibilidad.

Cuando un laboratorio participante proporciona múltiples resultados de un único material de ensayo, puede sesgar potencialmente el resto de los datos de los demás participantes. Por ejemplo, si todos los 10 analistas de un mismo laboratorio ensayan una misma muestra que se ha diluido incorrectamente al principio, todos los 10 resultados serían incorrectos. Este número de resultados incorrectos se convierte en un subgrupo dentro del global de los datos y puede sesgar todos los demás resultados. Para evitar dicho sesgo, solamente se debería incluir un resultado de cada laboratorio para el análisis global de los datos de una distribución.

Cuando un laboratorio participante ha obtenido múltiples resultados de una sola muestra de ensayo de aptitud, dichos resultados se deben proporcionar por separado y no como un valor medio. Cuando los organizadores del esquema permiten un solo resultado por participante, el resultado individual que se va a proporcionar se debe escoger antes de realizar el examen y conocer los resultados.

8.3.7 Otros métodos de evaluación del comportamiento


Aunque los índices-z se utilizan con mucha frecuencia para la evaluación de los resultados de esquemas de ensayos de aptitud en los métodos de recuento, otros métodos de calificación pueden resultar adecuados para esquemas concretos.



Por ejemplo, en muestras en las que se buscan recuentos reducidos (como en el agua de consumo), la evaluación estadística se puede basar en un modelo que prediga la variación aleatoria. De esta manera, los recuentos de las colas finales "bajas" o "altas" se definen utilizando la fórmula de Poisson. Ocasionalmente se pueden encontrar por azar unos resultados altos o bajos en cualquier laboratorio, pero una acumulación de resultados con colas finales indica un comportamiento deficiente. Las ventajas y desventajas de un modelo respecto a una aproximación de percentiles para la evaluación estadística se discuten en Bibliografía [17].

En el caso de esquemas en los que se esperan recuentos elevados, se puede utilizar la aproximación de percentiles o la regla de 0,5 log10 pero se requiere el método de la desviación absoluta de la mediana para esquemas con un bajo número de participantes. Se describen brevemente en 8.3.7.2 a 8.3.7.4.

8.3.7.2 Uso de la regla de 0,5 log10

Se puede utilizar un sistema de calificación basado en la regla de 0,5 log10 para el recuento de colonias (adaptado de Bibliografía [13). En resumen, los intervalos de confianza al 95% alrededor de un valor medio de recuento de colonias no suelen ser mayor que ± 0,5 log10 cfu. Los procedimientos de control interno de la calidad en los laboratorios de microbiología normalmente necesitan que las réplicas de los recuentos queden incluidas dentro de un margen menor que 0,5 log10 para demostrar un buen control. Esto se aplica a los resultados de los participantes de forma que todos los resultados incluidos dentro de un intervalo de ± 0,5 unidades log10 de la mediana de los participantes se consideren aceptables y se les asigna la máxima calificación. Esta regla permite que las calificaciones de los participantes mejoren a lo largo del tiempo si la calidad de los recuentos de los participantes también mejora.

La regla de 0,5 log10 se basa en criterios microbiológicos, pero también, es válida estadísticamente porque si el recuento esperado para una placa es de 10 colonias y los organismos se distribuyen de forma aleatoria, el 95% de los resultados se deberían encontrar entre 3 y 17 colonias. En una escala logarítmica decimal, el recuento medio esperado es de 1, el límite menor es de 0,47 y el límite mayor de 1,23, es decir, los límites mayores y menores están incluidos dentro del rango de 0,5 unidades de log10. Por consiguiente, un resultado incluido dentro del rango de ± 0,5 unidades de log10 del valor esperado se debería considerar aceptable.

8.3.7.3 Uso de los percentiles

Los percentiles se pueden utilizar para identificar valores de recuento discrepantes cuando hay un número mayor o igual que 50 participantes que desarrollan un procedimiento de recuento de colonias. Esto permite calcular los percentiles 5º, 10º, 90º y 95º de la distribución de los resultados de los participantes (C5, C10, C90 y C95, respectivamente). Los valores C5 y C10 se deberían redondear hacia abajo al valor más cercano en unidades de 0,05 log10 (por ejemplo, 2,23 se redondea a 2,20), mientras que los valores de C90 y C95 se deberían redondear hacia arriba (por ejemplo, 3,36 se redondea a 3,40). A continuación se representa cómo se pueden asignar las calificaciones (para un recuento de colonias aeróbicas):

- Resultados entre C10 y C90 (rango aceptable): Calificación = 2

- Resultados entre C5 y C10 o entre C90 y C95: Calificación = 1

- Resultados menores que C5 o mayores que C95: Calificación = 0

La aplicación de la regla de 0,5 log10 puede extender el rango aceptable y por lo tanto mejorar las calificaciones asignadas a algunos resultados en C5, C10, C90 y C95.

El método de percentiles es robusto y no depende de que la distribución real del logaritmo decimal del recuento sea normal. Permite una interpretación clara de la evaluación del comportamiento.



Si el número de participantes de un esquema de ensayos de aptitud establecido está por debajo de 50 laboratorios o el número de participantes que proporcionan resultados de recuento para un parámetro en particular cae por debajo de 50, se deberían utilizar los valores de la desviación absoluta de la mediana (MAD)4); (ver 8.3.7.4) en lugar de los percentiles.

8.3.7.4 Uso de los valores de desviación absoluta de la mediana

El método de MAD se utiliza para identificar valores discrepantes cuando hay menos que 50 participantes que realizan un recuento. No se deberían utilizar los percentiles ya que menos de 50 resultados proporcionan unos datos insuficientes como para calcular valores válidos de C5, C10, C90 y C95. Los valores de MAD proporcionan un método robusto para calcular el rango aceptable a la hora de evaluar los resultados de los participantes y asignar calificaciones. El análisis requiere calcular la diferencia de la mediana respecto a la mediana de todos los resultados, que se multiplica por 1,4826, obteniéndose una estimación robusta de la desviación estándar (valor MAD), .

A continuación se describe un ejemplo de cómo se podrían asignar las calificaciones utilizando los valores de MAD:

- Resultados incluidos dentro de la mediana de los participantes ± 2 : Calificación = 2

- Resultados comprendidos entre ± 2 y ± 2,58 : Calificación = 1

- Resultados fuera de ± 2,58 : Calificación = 0

Al igual que en el caso de los percentiles, los límites inferiores se deberían redondear hacia abajo hasta el valor más cercano en unidades de 0,05 log10, mientras que los límites superiores se deberían redondear hacia arriba hasta el valor más cercano en unidades de 0,05 log10.

Notar que, salvo que se aplique la regla de 0,5 log10, aproximadamente el 5% de los laboratorios deberían quedar fuera del rango de ± 2 y un 1% fuera del rango de ± 2,58 (asumiendo normalidad en el logaritmo decimal de los recuentos, sin discrepantes extremos).

El método MAD se debería utilizar para nuevos esquemas de ensayos de aptitud cuando haya menos de 100 participantes.

8.3.7.5 Consideraciones especiales sobre los métodos del número más probable

El método de ensayo utilizado para determinar el valor de NMP presenta una variabilidad inherente superior que los métodos de recuento de colonias y por lo tanto se suele considerar que es simplemente semicuantitativo. No obstante, en ocasiones se requiere para la detección y estimación de niveles cuando se esperan niveles bajos de microorganismos, y especialmente cuando los microorganismos se han sometido a un estrés (por ejemplo, como resultado del procesamiento o de la congelación). Además, la legislación estipula métodos de NMP o criterios para el examen microbiológico de ciertos productos como los productos lácteos y los moluscos bivalvos vivos y otros mariscos.

Cualquier método de evaluación de los resultados de los participantes para determinar los valores de NMP debería permitir la variabilidad inherente del NMP y asumir que la muestra está bien mezclada antes de su ensayo.

En el método de tres-por-cinco tubos, la desviación estándar del resultado del log10 NMP es aproximadamente de 0,24, siempre que los resultados no muestren unas combinaciones de tubos "extremas", por ejemplo, combinaciones de 3, 0, 0 a 5, 5 y 2 (ver ISO 7218).

4) En inglés: Median Absolute Deviation.



En el método de tres-por-tres tubos, la desviación estándar del resultado del NMP es aproximadamente de 0,32, siempre que los resultados no muestren unas combinaciones de tubos "extremas", por ejemplo, combinaciones de 2, 0, 0 a 3, 3 y 1.

Esto significa que en una situación perfecta, sin una excesiva variabilidad entre laboratorios, un 95% de los resultados debería quedar incluido dentro de ± 2 y no más del 99% dentro de ± 3 , donde es la desviación estándar.

Sin embargo, en la práctica sí hay cierta variabilidad entre laboratorios. Se ha demostrado que el análisis de varias series de datos aumenta la varianza en un factor de aproximadamente 2,5 veces (y por consiguiente la desviación estándar en 1,58 veces aproximadamente).

Por consiguiente, los límites de aceptabilidad para los resultados de los participantes en las determinaciones de NMP se deberían aumentar a ± 3 y ± 5 (ver Tabla 1).

Tabla 1 - Límites de aceptabilidad

Límite de aceptabilidad Método de tres-por-tres Método de tres-por-cinco

± 3 ± 0,96 log10 (9,1 veces) ± 0,72 log10 (5,2 veces)

± 5 ± 1,60 log10 (39,8 veces) ± 1,20 log10 (15,8 veces)

No se debería necesitar aplicar nunca la regla de 0,5 log10 a los resultados de NMP debido a la variabilidad inherente del método.

Para el método de NMP también es posible comprobar que las combinaciones de tubos y diluciones indicadas son consistentes con el NMP proporcionado basado en el uso de las tablas (ver ISO 7218).

Si el esquema de ensayos de aptitud o la legislación en la que se basa requieren que la determinación de los valores de NMP se realice por duplicado, los resultados se pueden comparar y, si las combinaciones de los tubos son de confianza, la diferencia entre los dos resultados no se deberían diferenciar, en unidades logarítmicas decimales, en más de 2,58 √2 0,24 0,88 para el método de tres-por-cinco tubos y de 2,58 √2 0,32 1,17 para el método de tres-por-tres tubos.

Si se comparan dos distribuciones con dos réplicas por distribución, las medias de las dos no se deberían diferenciar, en unidades logarítmicas decimales, en más de 2,58 0,24 0,62 para el método de tres-por-cinco tubos y de 2,58 0,32 0,83 para el método de tres-por-tres tubos.

8.3.8 Evaluación del comportamiento a largo plazo


La evaluación del comportamiento en los esquemas de ensayos de aptitud por lo general queda restringida a la evaluación de resultados procedentes de rondas individuales, aunque hay situaciones en las que puede resultar beneficioso la evaluación a largo plazo. Aun cuando se aplica generalmente a los esquemas de evaluación externa de la calidad, se ofrecen algunas directrices para su finalización.

Cualquier método de evaluación del comportamiento a largo plazo debe asegurar que los laboratorios que realizan los exámenes microbiológicos no se identifiquen como "de comportamiento deficiente" por azar debido al número de organismos en las muestras que reciben.



Los recuentos "altos" o "bajos" se deberían definir en base a reglas objetivas (por ejemplo, una definición basada en modelos de Poisson para recuentos bajos, percentiles u otros métodos para recuentos altos) utilizadas para identificar a los laboratorios que proporcionan este tipo de resultados con más frecuencia a lo largo del tiempo de la que se podría esperar por casualidad.

Los organizadores de esquemas deberían animar a los participantes a ejercitar su propio criterio profesional al evaluar la información incluida en los informes, y por lo tanto a autoevaluar su propio comportamiento. Los organizadores pueden sugerir a sus participantes diversas formas de realizar la autoevaluación del laboratorio, pero no deberían dictar criterios para la autoevaluación por parte de un laboratorio individual; por el contrario, se deberían establecer por parte de cada laboratorio participante individual, en base a lo que se considere microbiológicamente significativo en el contexto de su propia rutina de trabajo y los requisitos de sus clientes.

8.3.8.2 Evaluación de recuentos bajos

Si el azar es el único factor implicado, los recuentos de las "colas finales" se deberían distribuir de forma aleatoria. Se pueden revisar los resultados para determinar la dispersión entre laboratorios de los resultados en las colas finales a lo largo de una serie de muestras (por ejemplo, utilizando el ensayo de Cochran).

Si no se distribuyen de forma aleatoria, se puede realizar una segunda ronda de análisis para determinar la distribución esperada de los recuentos en las colas finales entre todos los laboratorios que los proporcionan, si se debe simplemente a la variación natural entre muestras y no es efecto del comportamiento del laboratorio. Comparando los valores esperados de laboratorios con el valor encontrado en realidad quedan señalados los laboratorios que pueden haber sufrido problemas. En Tabla 2 se muestra un ejemplo de la evaluación del comportamiento para muestras que contienen valores bajos.

Tabla 2 - Valores esperados y encontrados en series de resultados que asumen una distribución aleatoria para resultados bajos (a partir de una distribución de niveles bajos de Clostridium perfringens

en muestras de agua de consumo, donde la variación en valores entre los objetos de ensayo pueden superar necesariamente la variación debida al comportamiento del laboratorio)

Número de “bajos” Encontrados Esperados

0 58 58

1 32 48,56

2 18 16,94

3 14 3,15

4 3 0,33

5 2 0,02

Total 127 127

Uno o dos resultados bajos se podría deber a la casualidad; tres probablemente no se deben a la casualidad; es probable que cuatro o más se deban a la casualidad y se deberían comprobar los procedimientos.

8.3.8.3 Evaluación de recuentos altos

La evaluación de recuentos altos se basa en principios semejantes, pero se espera una variación menor en los resultados de los participantes, debido a la variación en el contenido de las muestras.



El comportamiento a largo plazo con, por ejemplo, el método de evaluación de percentiles, se puede evaluar para 12 muestras, permitiendo una calificación máxima de 24 puntos. Los participantes se imponen un objetivo de funcionamiento de como mínimo el 70%. Si no se cuenta con la regla de 0,5 log10 y se asume que todos los participantes son capaces de desarrollar un funcionamiento semejante, se puede demostrar mediante la teoría multinomial que la probabilidad de que un participante obtenga un índice acumulado menor al 70% de la máxima calificación posible es del 5,2%. Esto significa que en esas circunstancias aproximadamente uno de cada 20 participantes puede ser identificado de forma incorrecta como "de comportamiento deficiente". En realidad, el comportamiento no es equivalente y algunos laboratorios tienen dificultades con los exámenes que realizan, de forma que la probabilidad de que un correcto comportamiento se asigne de forma incorrecta como "deficiente" es muy menor. Además, el uso de la regla de 0,5 log10 reduce esta probabilidad a un valor menor que 0,1%.

En Anexo C se muestra un ejemplo práctico de la evaluación a largo plazo utilizando hojas de cálculo.

8.4 Evaluación de métodos cualitativos

8.4.1 Generalidades

En los estudios de comparación entre laboratorios en los que se utilizan uno o más métodos cualitativos, los resultados son de hecho blanco o negro, sí o no, detectado o no detectado.

Los métodos de análisis estadísticos para este tipo de resultados son limitados, pero se han propuesto diversas opciones, como el LOD5, la evaluación de la concordancia o conformidad y la exactitud en el porcentaje; está aún considerándose la mejor opción.

8.4.2 Funcionamiento de los laboratorios individuales

Un método sencillo de autoevaluación por parte de los laboratorios participantes es registrar el número de resultados positivos y negativos hallados, junto con el número de resultados positivos y negativos esperados. Esta información se debería asociar a los registros de niveles de los organismos objetivo en las muestras, para evaluar el comportamiento, así como para proporcionar datos actualizados sobre el límite de detección del método en los laboratorios individuales.

Como el resultado de un ensayo de presencia/ausencia es un sí o no, se necesita ensayar muchas muestras para evaluar el comportamiento de los laboratorios individuales en un esquema de ensayo de aptitud. Cada participante debería ensayar como mínimo 18 muestras en total. Dichas 18 muestras consisten en seis réplicas de tres niveles de contaminación diferentes de las muestras. Los tres niveles son: negativo (comprobación de la aparición de resultados falsos positivos debido, por ejemplo, a contaminación cruzada); nivel bajo [que quiere decir muestras contaminadas a un nivel igual o ligeramente superior al límite de detección del método utilizado, que idealmente debería ser el nivel para el que el 50% de las muestras se detectan como positivas y 50% negativas (LOD50)] y nivel alto (este nivel debería ser 10 veces más alto que el nivel bajo y representa el nivel en el que todas las muestras analizadas se deberían detectar como positivas).

La interpretación de los datos se sencilla:

a) para las negativas: todas las muestras se deberían detectar como negativas;

b) para el nivel alto: todas las muestras se deberían detectar como positivas;

c) para el nivel bajo: se puede calcular (ver Tabla 3) utilizando la distribución binomial y el porcentaje de muestras que se detectan como positivas (se puede obtener a partir del valor de referencia proporcionado por el organizador o como la estimación óptima obtenida a partir de los resultados de todos los participantes) para un nivel de confianza del 95%.



Tabla 3 - Posibilidad de encontrar un cierto número de positivos en seis muestras analizadas en función del porcentaje medio de muestras positivas (distribución binomial)

N° de positivos entre las muestras

Porcentaje medio positivos

10 20 30 40 50 60 70 80 90

% % % % % % % % %

0 53,1 23,2 11,8 4,7 1,6 0,4 0,1 0,0 0,0

1 35,4 39,3 30,3 18,7 9,4 3,7 1,0 0,2 0,0

2 9,8 24,6 32,4 31,1 23,4 13,8 6,0 1,5 0,1

3 1,5 8,2 18,5 27,6 31,3 27,6 18,5 8,2 1,5

4 0,1 1,5 6,0 13,8 23,4 31,1 32,4 24,6 9,8

5 0,0 0,2 1,0 3,7 9,4 18,7 30,3 39,3 35,4

6 0,0 0,0 0,1 0,4 1,6 4,7 11,8 26,2 53,1

EJEMPLO Para utilizar Tabla 3, es necesario conocer con antelación el porcentaje medio de positivos. En este caso se asume que es del 30%, lo cual quiere decir que aproximadamente una de cada tres muestras contiene el organismo objetivo. Como solamente el 30% de las muestras contienen el organismo objetivo, es probable que alguna de las muestras pueda no contener al objetivo cuando se ensayan, por ejemplo, seis muestras.

La Tabla 3 muestra que la posibilidad de conseguir una serie de seis muestras consistente en cuatro positivas y dos negativas es del 6%. Esto no es probable que ocurra, pero aún llega a ser aceptable cuando se asume un nivel de confianza del 95%. La suma de las posibilidades de encontrar 0, 1, 2, 3 o 4 positivos es del 99,0% (11,8 + 30,3 + 32,4 + 18,5 + 6,0). En este caso, el 99% es el valor menor, que es mayor del 95% (el límite de confianza). Dejar cuatro positivos resulta en el 93%, que es menor al límite de confianza del 95%.

Otro razonamiento es que la posibilidad de encontrar seis de seis positivos es sólo del 0,1%. Esto es muy poco probable que ocurra simplemente por azar. Como la incertidumbre está establecida a un máximo del 5% (100% a 95% del intervalo de confianza), queda dentro del límite. Lo mismo ocurre con la situación en la que se detectan como positivas cinco o seis muestras de un total de seis. La suma de dichas posibilidades es del 1,1%, todavía menor al límite del 5%. Solamente cuando se añade la situación en la que cuatro de seis son positivos (6%), la incertidumbre supera el límite del 5%. Como el máximo está establecido al 5%, la situación de cinco o seis positivos de un total de seis ensayos se considera como un resultado inesperado.

NOTA En el LOD50, el 50% de las muestras se determinan como positivas. En teoría (tomando en consideración que el método utilizado es capaz de detectar un solo microorganismo en una muestra y asumiendo una distribución homogénea de Poisson entre las muestras) se espera que el nivel de contaminación medio de las muestras sea de 0,7 microorganismos por muestra para alcanzar el LOD50. En la práctica, no se suele alcanzar la distribución homogénea ideal y hay relativamente más muestras que no contienen ningún microorganismo (viable) de las que habría de esperar para una distribución verdaderamente homogénea. Para obtener un 50% de muestras positivas, se requiere un aumento en el nivel medio de contaminación, basado en la experiencia con el material utilizado en el estudio.

8.4.3 Comparaciones de esquemas del comportamiento de los laboratorios

Para comparar el comportamiento de un laboratorio respecto a otros laboratorios participantes, los organizadores de esquemas pueden calcular los números (o porcentajes) de positivos obtenidos para cada nivel de contaminación con el organismo objetivo por muestra de ensayo para cada laboratorio (enviado con un código de laboratorio). En Figura 2 se muestra un ejemplo de dichos datos. En este estudio participaron 28 laboratorios (señalados como códigos de laboratorio en el eje-NL de Figura 2). Cada laboratorio analizó 22 muestras de heces de pollo contaminadas artificialmente con materiales de referencia que contenían dos variantes séricas diferentes de Salmonella a cuatro niveles de contaminación distintos (desde 10 hasta 500 cfu por muestra). En Figura 2 se resumen los resultados para la muestra con el nivel de contaminación bajo (n = 14). El número de positivos encontrados en los laboratorios participantes osciló entre 0 y 11 muestras (eje-n+, de Figura 2).



Además, de esta forma más descriptiva de presentar los resultados, es posible calcular el grado de especificidad, el grado de sensibilidad y el grado de exactitud referidas al nivel de contaminación de las muestras (ver ISO 16140 [4]). Estas propiedades se pueden calcular para cada laboratorio y para los resultados procedentes de todos los laboratorios.

El grado de especificidad, , viene determinado por:

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en que:

= número de resultados negativos encontrados;

= número total de muestras negativas esperadas.

El grado de sensibilidad, , viene determinado por:

100%

en que:

= número de resultados positivos encontrados;

= número total de muestras positivas esperadas.



El grado de exactitud, , viene determinado por:

100%

en que:

= número total de muestras.

Esta valoración solamente tiene significado si está asociado al número de organismos objetivo presentes.



Anexo A (informativo)

Ejemplo de los detalles que se incluyen en un plan de esquema de ensayos de aptitud

Plan de esquema de ensayos de aptitud. Resumen del esquema

Nombre del esquema: Esquema de ensayos de alimentos

Tipo de esquema: Microbiología de los alimentos

Objetivos: Proporcionar muestras de evaluación externa de la calidad para ensayos generales de rutina realizados por laboratorios de microbiología de los alimentos

Criterios para la selección de los participantes: Laboratorios de microbiología de los alimentos con instalaciones de laboratorio adecuadas para la manipulación de microorganismos patógenos de riesgos de categoría 1 y 2

Participantes objetivos: Laboratorios de microbiología de los alimentos de los sectores públicos y privados

Legislación: Regulación UE 88212004 referida al control oficial de los productos alimenticios

Tipo de muestra: Microorganismos liofilizados en viales de vidrio a vacío

Exámenes: Presencia/ausencia:

Campylobacter spp.

Escherichia coli 0157

Salmonella spp.

Recuentos:

Recuento de colonias aeróbicas

Bacillus cereus

Clostridium perfringens

Coliformes

Enterobacteriaceae

Escherichia coli

Listeria monocytogenes

Estafilococos coagulasa positivos

Criterios sobre el contenido de las muestras: Microflora real que simula a la de los alimentos reales proporcionando una comparación real de los procedimientos de rutina en microbiología de los alimentos

Número de participantes previstos: Más de 200

Número de distribuciones por año: Seis

Número de muestras por distribución: Dos

Subcontratados externos: Ninguno

Expertos técnicos Nombre de los individuos

Ensayo de control de calidad de lote de muestras: Nombre del laboratorio proveedor y métodos normalizados utilizados 25 muestras de cada lote examinadas en todos los ensayos

Métodos estadísticos: Mediana consenso (recuentos)

Percentiles para identificar discrepantes

Asignación de calificaciones: Sí

(continúa)



Plan de esquema de ensayos de aptitud. Resumen del esquema (conclusión)

Nombre del esquema: Esquema de ensayos de alimentos

Criterios de calificación: Tres calificaciones asignadas para cada muestra sobre

i) ensayos patógenos;

ii) recuento de colonias aeróbicas;

iii) organismos indicadores.

Evaluación continua del comportamiento: Sí

Criterios para identificar el comportamiento: Menor que 70% de la máxima calificación posible a lo largo de seis distribuciones

Acciones proactivas de los organizadores sobre el “comportamiento deficiente”:

Sí

Evaluación del método: Si, solamente para los indicadores

Esquema para la firma/fecha del coordinador encargado

Aprobado por el grupo de dirección: Fecha

Literatura promocional autorizada: Fecha

Costo aprobado: Fecha

Fecha de acreditación: Fecha

Otros comentarios: Revisión en reunión del grupo director

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= 1,268 + 0,904 + 0,034

= 2,206

La variación aceptada para el lote es: /(I-1) ≤ 2

En este caso /(I-1)=2,206/(3-1)=1,103 que por lo tanto cumple los criterios de aceptabilidad de este lote.

B.2 Ensayo de homogeneidad suficiente

Se recomienda este ensayo para los casos en los que las porciones del material de ensayo presentan un alto número de organismos (más de 35 a 40 cfu por placa) y existe una desviación estándar ideal, , que describe el comportamiento esperado por parte de los participantes en el esquema de ensayos de aptitud. Se basa en el ensayo de "homogeneidad suficiente" de Bibliografía [11].

Dada una serie de porciones de materiales de ensayo analizadas por duplicado con los resultados expresados en unidades logarítmicas, el ensayo queda aprobado si la varianza entre porciones de ensayo , satisface la condición (B.5):

0,3 (B.5)

Donde es la varianza analítica. Comparado con , es menos probable que este ensayo cause el rechazo de un material de ensayo que no sea perfectamente homogéneo (los resultados analíticos siguen la distribución de Poisson), pero es suficientemente homogéneo como para utilizarse en una ronda de ensayos de capacitación con una desviación estándar ideal de . La razón es que los materiales se aceptan a no ser que se demuestre con una alta confianza (95%) el criterio conforme a los objetivos > 0,3 , donde es la desviación estándar, de la que es una estimación.



EJEMPLO

Dados los resultados cuantitativos procedentes del análisis por duplicado de 10 porciones de material de ensayo, se calcula la diferencia y la suma y el cuadrado de del logaritmo decimal de cada serie de resultados (ver Tabla 1).

Porción Análisis 1 Análisis 2 Log análisis 1 Log análisis 1

1 35 51 1,544 1 1,707 6 -0,163 5 3,251 6 0,026 733

2 52 46 1,716 0 1,662 8 0,053 2 3,378 8 0,002 835

3 35 33 1,544 1 1,518 5 0,025 6 3,062 6 0,000 653

4 53 38 1,724 3 1,579 8 0,144 5 3,304 1 0,020 878

5 30 40 1,477 1 1,602 1 -0,124 9 3,079 2 0,015 610

6 33 30 1,518 5 1,477 1 0,041 4 2,995 6 0,001 713

7 41 60 1,612 8 1,778 2 -0,165 4 3,390 9 0,027 346

8 35 55 1,544 1 1,740 4 -0,196 3 3,284 4 0,038 532

9 68 67 1,832 5 1,826 1 0,006 4 3,658 6 0,000 041

10 52 60 1,716 0 1,778 2 -0,062 1 3,494 2 0,003 862

Se calcula la suma de y se divide por el doble del número de porciones. Esto corresponde a la suma media de los cuadrados de la variación dentro de una muestra, ̅ .

En este caso, ̅ 0,138 0,00691

Se calcula la varianza de ̅ y se divide por dos. Esto es igual a ̅ .

En este caso, ̅,

0,02112

Por lo tanto, ̅ ̅ ̅ /2

En este caso, 0,00691 , ,

0,007104

Los valores para y dependen del número de porciones examinadas en el ensayo. Para 10 porciones, = 1,88 y = 1,01 (en Bibliografía [11], se pueden encontrar los valores para un número distinto de

porciones).

Si la desviación estándar ideal que se va a aplicar a los resultados de ensayos de capacitación, , es igual a 0,25 unidades log10, entonces:

0,3 1,88 0,3 0,25 1,01 0,00691 0,01755

Este valor es mayor que (0,007104). Por consiguiente, se satisface la condición (B.5) y el material de ensayo es suficientemente homogéneo.



Anexo C (informativo)

Método práctico para evaluar el comportamiento a largo plazo de los participantes en esquemas de ensayos de aptitud utilizando métodos de recuento

C.1 Preparación de los datos para su análisis

Se requieren cuatro columnas de una hoja de cálculo para analizar los resultados de un recuento.

a) el recuento, tal como lo proporciona el participante (recuento nR);

b) el recuento que se va a utilizar para las gráficas e histogramas y/o para la calificación (recuento ns);

c) el recuento para el análisis (recuento nA);

d) una columna con comentarios (campo de texto) (recuento nc) para registrar todo tipo de notas sobre los resultados de los participantes.

El recuento nR se debería introducir normalmente como un campo numérico (por ejemplo, 1 100) o como número en formato científico (por ejemplo, 1.1e3). Si el resultado se proporciona como un valor censurado con anotaciones, se debe utilizar un campo de texto e incluir un símbolo de "menor que" o "mayor que" delante del número (por ejemplo < 10, > 1 100, etc.).

El recuento nR también se puede introducir con un texto diferente como NE (no examinado; not examined), ND (no detectado; not detected) y UA (indeterminable; unassessable). Se deben realizar entradas para todos los campos de la columna.

Si el recuento nR no se puede analizar (por ejemplo, introducido como NE), no se realiza un análisis posterior ni la asignación de calificaciones.

Si el recuento de nR no se puede incluir en el análisis estadístico, por ejemplo, porque el resultado se ha proporcionado como un valor censurado con anotaciones, pero se debe asignar una calificación y/o se va a representar el resultado, se debe asignar un valor numérico al recuento ns.

Este valor debe asegurar que se asigna una calificación correcta y que el resultado se representa de forma correcta. Por ejemplo, no se pueden asignar calificaciones a resultados emitidos como "no detectados" pero puede resultar útil incluir dichos resultados en una gráfica. En este caso, el recuento ns se puede incluir como -99 y el recuento nA: se debería dejar en blanco.

Si se va asignar un resultado emitido, se tiene que incluir una calificación en los cálculos estadísticos; en ese caso, recuento de nA = recuento ns.

C.2 Uso de datos censurados

Todos los resultados bajos censurados se analizan mediante una de las formas siguientes:

a) Se asigna a todos los resultados un valor en el recuento ns de 0,2, pero no se incluye en el análisis (recuento nA= 0). Esto ocurre cuando los informes consistentes en valores bajos censurados o los informes con valores nulos o "no detectados" están causados claramente por un error del laboratorio, debido a que el nivel del grupo o del organismo diana en la muestra es relativamente alto.



b) Se asigna un recuento ns = 0,25) a todos los valores censurados y a los resultados nulos o "no detectados", y se incluyen en el análisis debido a que el nivel del grupo u organismo diana era relativamente bajo y esos resultados se pueden haber producido por casualidad (recuento ns = recuento nA = 0,2). Hay excepciones, como cuando el valor bajo censurado proporcionado (< x) no presenta un nivel de detección apropiado y el valor de x es realmente mayor que la mediana (en su cálculo inicial). En estos casos excepcionales, el recuento nA se debería dejar en blanco.

c) No se asignan calificaciones a los valores bajos censurados. En general, se deberían asignar calificaciones, salvo que haya una razón microbiológica para no hacerla. En este caso, los campos del recuento nA y del recuento ns se dejan en blanco.

Los valores altos censurados se introducen como 1,0 log10 por encima del máximo valor encontrado. Si, por cualquier razón, los resultados se van a excluir de las gráficas y de los análisis y no se van a asignar calificaciones, los campos del recuento nA y del recuento ns se deberían dejar en blanco. Si un resultado se expresa como > x, donde el valor x es menor a la mediana, el campo del recuento nA se debería dejar en blanco.

C.3 Representación de los resultados

Las gráficas se basan en los valores del recuento ns. Hay dos tipos fundamentales de gráficas utilizadas con los resultados de esquemas de ensayos de aptitud: los histogramas (o las gráficas de barras) y las gráficas de dispersión. Los aspectos a considerar cuando se escoge el tipo de gráfica que se va a utilizar incluyen el tipo de examen (NMP, recuento de colonias, etc.) y el número de participantes que realizan los exámenes.

Los histogramas se preparan utilizando el valor del logaritmo decimal del recuento nR agrupados de la manera siguiente:

< 0, (0 a 0,05), (0,05 a 0,1), (0,1 a 0,15), (máx. log10 del recuento nR), (máx. log10 del recuento nR + 0,05).

Todos los valores no numéricos o los casos especiales que se van a representar (por ejemplo, -99) se deberían disponer en su propia barra.

Alternativamente, el histograma se puede preparar utilizando el valor del logaritmo decimal del recuento nR redondeado al valor de 0,05 más próximo. En este caso, los agrupamientos se realizan de la manera siguiente:

0, 0,05, 0,1, 0,15 ... máx. (log10 del recuento nR).

En este caso, la barra de 0,1 incluye todos los resultados desde 0,075 hasta 0,124.

Las gráficas de dispersión se pueden preparar utilizando directamente los valores del recuento ns y convirtiendo el eje y a la escala logarítmica decimal. Los datos no numéricos se excluyen de las gráficas de dispersión.

Se utilizan normalmente bloques (grupos) de un tamaño de 0,05 log10 para los histogramas, de forma que los rangos para la asignación de las calificaciones también se redondea a 0,05 log10.

5) Se utiliza el valor 0,2 en lugar de 0 porque no se puede calcular su logaritmo decimal.



C.4 Asignación de calificaciones

Cuando los resultados de los esquemas de ensayos de aptitud se determinan mediante calificaciones, los criterios de asignación de calificaciones se deberían relacionar en los informes o protocolos de los esquemas. La calificación del resultado del recuento se introduce en un campo de calificación (recuento nc); en caso necesario, se pueden corregir manualmente.

Se debe notar que la calificación final de un resultado se puede obtener mediante el recuento nc, pero otros factores pueden necesitar también ser tomados en consideración.



Anexo D (informativo)

Ejemplo de una hoja de datos de seguridad

Documento de datos de seguridad para muestras de un esquema de IC en alimentos – Liofilizados

Fecha efectiva: dd-mm-aa

Fecha de revisión: dd-rnm-aa

Enviado a: Todos los participantes del esquema

Identificación de los productos y del personal

Producto: Muestras simuladas de alimentos para exámenes microbiológicos generales

Personal: Dirección completa y detalles de los contactos del organizador del esquema

Composición o información sobre los ingredientes

Viales de vidrio de material liofilizado que contienen una mezcla de bacterias de grupo de riesgo 2 según queda definido por la legislación nacional e internacional. Un organismo del grupo de riesgo 2 puede causar enfermedades a humanos y suponer un riesgo para los trabajadores del laboratorio, pero no es probable que se extienda a la comunidad.

Identificación de riesgos:

Riesgo físicoquímico: No aplicable

Riesgos para la salud: Mínimo riesgo de infección siempre que se observen buenas prácticas de laboratorio

Riesgos ambientales: No aplicables

Medidas de primeros auxilios

Si se produce un contacto accidental con el material, el personal del laboratorio debe seguir los procedimientos locales de primeros auxilios que se aplican normalmente tras la exposición a una muestra de alimentos equivalente. Tras la exposición al material, se debe buscar atención médica.

Medidas de lucha contra el fuego

No aplicable.

Medidas contra una caída accidental

Se cubre la zona con material absorbente y se empapa con un desinfectante adecuado. Se debe dejar un área inalterada durante 30 min antes de absorber el vertido con un exceso de material absorbente. Se utiliza un equipamiento de protección personal adecuado.



Manipulación y almacenamiento

Se almacena a temperatura ambiente en la oscuridad. Las muestras se deben procesar en un entorno de laboratorio que, según queda definido en las directrices o normativas nacionales, resulta adecuado para la práctica de la microbiología.

El personal que manipula el material se debería haber capacitado en la manipulación de material biológico infeccioso.

El material se debería tratar con el mismo cuidado con que el que se tratarían muestras de alimentos equivalentes. Se debería evitar todo tipo de contacto de mano-a-boca mientras se trabaje con las muestras y se deben observar también con las muestras de ensayos de aptitud los procedimientos normales de lavado de manos durante la manipulación de muestras rutinarias.

Controles de exposición y protección personal

Se emplean unas buenas prácticas de laboratorio y se utilizan protectores de ojos, guantes y batas adecuadas. La retirada de los viales de sus envases y embalajes y su reconstitución se debería realizar en una cabina de protección con salida de gases.

Propiedades físicas y químicas

Material seco inerte inodoro

Estabilidad y reactividad

No es probable que el almacenamiento aumente o reduzca el riesgo de infección asociado con la manipulación del material.

Información toxicológica

No aplicable.

Información ecológica

No aplicable.

Consideraciones sobre eliminación de residuos

El material utilizado se debe eliminar utilizando un autoclave, igual que para los productos alimenticios que contienen microorganismos infecciosos y en conformidad con todas las normativas locales y nacionales.

Información sobre el transporte

Consultar las normativas nacionales e internacionales para el transporte de bacterias del grupo de riesgo 2 (sustancia biológica, categoría B; NU 3373, según NCh382).

Información reglamentaria

EC Agente biológico, grupo de riesgo/categoría 2

PRECAUCION Este documento de datos de seguridad no constituye la declaración propia del usuario sobre los riesgos asociados a su lugar de trabajo, requeridas por la legislación de seguridad y salud.



Otra información

Si se produce un accidente que suponga la exposición del personal al material contenido en las muestras, se contacta con los organizadores de esquemas de ensayo de aptitud.

Para una mayor información de seguridad relacionada con este producto, se aconseja a los participantes que lean los documentos de instrucciones que acompañan a las muestras.



Anexo E (informativo)

Bibliografía

[1] ISO 5725-2 Accuracy (trueness and precision) of measurement methods and results – Part 2: Basic method for the determination of repeatability and reproducibility of a standard measurement method.

[2] ISO 5725-4 Accuracy (trueness and precision) of measurement methods and results – Part 4: Basic methods for the determination of the trueness of a standard measurement method.

[3] ISO/TS 11133-1 :2009 Microbiology of food and animal feeding stuffs. Guidelines on preparation and production of culture media - Part 1: General guidelines on quality assurance for (the preparation of culture media in the laboratory.

[4] ISO 16140 Microbiology of food and animal feeding stuffs - Protocol for the validation of alternative methods.

[5] ISO/IEC 17025 General requirements for the competence of testing and calibration laboratories.

[6] ISO/TS 19036 Microbiology of food and animal feeding stuffs - Guidelines for the estimation of measurement uncertainty for quantitative determinations.

[7] ISO/IEC Guide 99 International vocabulary of metrology - Basic and general concepts and associated terms (VIM).

[8] ILAC-GI3 ILAC Guidelines for the requirements for the competence of providers of proficiency schemes Available (2010-02-10) at: http://www.ilac.org/documents/ILAC G13 08 2007.pdf.

[9] THOMPSON, M., ELLISON, L.R., WOOO, R. for IUPAC. The international harmonized protocol for the proficiency testing of analytical chemistry laboratories. Pure App. Chem. 2006, 78, pp. 145-196. Available (2010-10-08) at: http://www.iupac.org/publications/pac/2006/pdf/7801x0145 .pdf.

[10] AUGUSTIN, lC., CARLIER, V. Lessons from the organization of a proficiency testing program in food microbiology by interlaboratory comparison: Analytical methods in use, impact of methods on bacterial counts and measurement uncertainty of bacterial counts. Food Microbiol. 2006, 23, pp. 1-38.

[11] FEARN, T., THOMPSON, M. A new test for "sufficient homogeneity". Analyst 2001, 126, pp. 1414-1417.

[12] HEISTERKAMP, S.H., HOEKSTRA, J.A., VAN STRlJP-LOCKEFEER, N.G.W.M., HAVELAAR, A.H., MOOIJMAN, K.A., IN 'T VELD, P.H., NOTERMANS, S.H.W., MAIER, E. A.; GRIEPINK, B. Statistical analysis of certification trials for microbiological reference materials. Luxembourg: Commission of the European Communities, 1993. 41 p. (Report EUR 15008 EN).



[13] JARVIS, B. Sampling for microbiological analysis. In: LUNO, B.M., BAIRD-PARKER, A.C., GOULO, G.W., editors. The microbiological safety and quality of food, Vol. 2, pp. 1691-1734. Gaithersburg, MD: Aspen, 2000.

[14] JARVIS, B. Statistical aspects of the microbiological examination of foods, 2nd edition. Amsterdam: Academic Press, 2008. 306 p.

[15] JARVIS, B., HEOGES, AJ., CORRY, J.E.L. Assessment of measurement uncertainty for quantitative methods of analysis: Comparative assessment of the precision (uncertainty) of bacterial colony counts. Int. J. Food Microbiol. 2007, 116, pp. 44-51.

[16] JARVIS, B., CORRY, J.E.L., HEOGES, AJ. Estimates of measurement uncertainty from proficiency testing schemes, internal laboratory quality monitoring and during routine enforcement examination of foods. J. Appl. Microbiol. 2007, 103, pp. 462-467.

[17] TILLETT, H.E., LIGHTFOOT, N.F. EATON, S., PLACE, B.M. External quality assessment of microbial counts from water: To score or not to score for proficiency. J Chart. Inst. Water Environ. Manage. 2000, 14, pp. 304-308.

NOTA EXPLICATIVA NACIONAL

La equivalencia de las Normas Internacionales señaladas anteriormente con Norma Chilena, y su grado de correspondencia es el siguiente:

Norma Internacional Norma nacional Grado de correspondencia

ISO 5725-2 NCh2680/2:2002 La Norma Chilena NCh2680/2:2002 es una adopción idéntica de la

versión en inglés de la Norma Internacional ISO 5725-2:1994.

ISO 5725-4 No hay -

ISO/TS 11133-1:2009 No hay -

ISO 16140 NCh3128:2008 La Norma Chilena NCh3128:2008 es una adopción idéntica de la

versión en inglés de la Norma Internacional ISO 16140:2003.

ISO/IEC 17025 NCh-ISO 17025:2005 La Norma Chilena NCh-ISO 17025:2005 es una adopción idéntica de

la versión en español de la Norma Internacional NCh-ISO 17025:2005.

ISO/TS 19036 NCh3084:2007 La Norma Chilena NCh3084:2007 es una adopción idéntica de la

versión en inglés de la Norma Internacional ISO 19036:2006.

ISO/IEC Guide 99 No hay -



Anexo F (informativo)

Justificación de los cambios editoriales

Tabla F.1 - Cambios editoriales

Cláusula/subcláusula Cambios editoriales Justificación

En toda la norma Se reemplaza “esta especificación técnica” por “esta norma”

La norma es de alcance nacional.

2 y Anexo D Se agrega Nota Explicativa Nacional. Para detallar la equivalencia y el grado de correspondencia de las Normas Internacionales con las Normas Chilenas.

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